CN111139231A - 一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分区定向固定化双细胞制备1,5‑戊二胺的方法。该方法基于固定化微生物的角度，以固定化微生物进而生成生物膜提高发酵过程中的可控性和耐受性。其次本研究基于分区的定向特异性固定化技术，提高混菌发酵之间的耦合作用，进而提升1,5‑戊二胺的产量。该方法对于投放的菌体数量可以精确控制，并且显著提升了发酵过程中的菌体耐受性，大大提高了产率，降低了资源浪费。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵、微生物固定化领域，具体涉及一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法。
背景技术
1,5-戊二胺，又名尸胺，是一种具有生物活性的含氮碱，广泛存在于生物体内。主要应用于农业、医药以及工业等领域。现阶段生物法合成戊二胺主要包括全细胞转化法和直接发酵法，全细胞转化法以赖氨酸为原料生产戊二胺成本较高，且在生产过程中需要获得大量菌体操作比较复杂；直接发酵法产量和产率较低，这在一定程度上制约了生物法制备戊二胺在工业生产中的应用。
混菌发酵是利用两种以上的菌株进行混合培养的过程。不同菌株都具有各自独立的代谢系统，只有两株菌的生长和生产状况都处于最优，才能实现混菌发酵的顺利进行，即将 L-赖氨酸发酵和 1,5-戊二胺全细胞催化过程进行耦合，以实现利用葡萄糖作为原料的1,5-戊二胺发酵生产。然而混菌发酵过程中两种菌体的比例因为菌体生长情况不同而难以精确控制，进而影响混菌发酵耦合作用。并且混菌发酵体系中容易因为环境的改变，如温度、pH的影响，导致整体混菌催化活性明显下降。因此，急需要研发一种既可以耦合菌株发酵，提高1,5-戊二胺的产量的方法。
发明内容
本发明主要解决的问题是混菌发酵过程中的菌体比例的不可控性和菌体耐受性低的问题，提供一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法，该方法对于投放的菌体数量可以精确控制，并且显著提升了发酵过程中的菌体耐受性，大大提高了产率，降低了资源浪费。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
步骤1，将聚合物溶于缓冲溶液中，搅拌均匀后，浸入多孔固定化材料，洗涤后，干燥得特异性吸附固定化材料；
步骤2，分别用平板培养E. coli NT1003和E. coli CAD03菌株，再制备各自的种子培养液，备用；
步骤3，将特异性吸附固定化材料分别浸入E. coli NT1003菌株的种子液和E. coliCAD03菌株的种子液中继续培养，富集菌株后，得固定化材料A和固定化材料B；
步骤4，将固定化材料A和固定化材料B按照数量比混合后固定在发酵罐的内壁上，加入发酵培养基培养2小时后，加入IPTG进行诱导反应；
步骤5， 诱导反应完成后，将含ITPG 的发酵培养基去除，补加发酵培养基并维持通气量和转速进行发酵生产1,5-戊二胺。
设计原理：利用微生物与甘露糖、半乳糖特异性吸附的原理，利用聚合物涂层将甘露糖、半乳糖结合在多孔固定化材料表面，进而提高固定化材料对于微生物菌体的附着能力，进而在微生物培育过程中促进微生物生成生物膜，提高菌体的耐受性；不同种类的微生物菌体可以单独培育、固定在多孔固定化材料上，进而形成附着微生物生物膜的固定化材料，并将这些含有微生物生物膜的材料按照实验或生产需求加装在常规发酵罐中的任意区域，以提高混菌发酵的耦合效果，进而提升1,5-戊二胺产量。
作为改进的是，步骤1中所述聚合物为聚氨酯、聚多巴胺或聚吡咯中的一种或者多种组合。
作为改进的是，步骤1中所述多孔固定化材料为聚氨酯、聚乙烯、尼龙、碳毡、树脂或橡胶中的一种或多种组合。
作为改进的是，步骤4中固定化材料A和固定化材料B按照数量比18:4。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法具有如下优势：
1.构建了低成本、细胞特异性结合、高耐用性的固定化多孔材料复合体系；
2.通过固定化细胞的策略，提高了细胞的在催化体系中的耐受性；
3.适用范围广，简单改造及可在发酵罐系统或细胞催化系统中加装固定化多孔材料；
4.划分区域进行固定化细胞，操作简单，组合性高，可设计性强，可以定向设计不同细胞的固定化区域，降低了不同菌种间的生长影响，提高整体催化效率。
附图说明
图1本发明实施例2中带有固定化材料的发酵罐，其中，（a）为实施例2发酵罐的侧视图，（b）为实例2发酵罐的俯视图，其中，1-固定化材料A，2,-固定化材料B，3-搅拌桨，4-固定化材料A，5-固定化材料B，6-发酵罐体；
图2为实施例1与实施例2的1，5-戊二胺产量的对比图；
图3为实施例1与实施例2在不同温度下产1，5-戊二胺的相对活性的对比图；
图4为实施例1与实施例2在不同pH下产1，5-戊二胺的相对活性的对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1 混菌培养产 1,5-戊二胺的过程
1.1 菌种
高产赖氨酸大肠杆菌工程菌株（E. coli NT1003），该菌株保存在中国典型培养物保藏中心（No.M 2013239），属于现有菌株。
产赖氨酸脱羧酶大肠杆菌工程菌株（E. coli CAD03）的构建过程，步骤如下：E. coli MG1655感受态细胞购买自全式金公司，以质粒pCDF-Trc-B34-pel-CadBA为模板，使用引物T7 Terminator Primer和Asse-Trc-B34-F扩增获得片段Trc-B-CadBA-4A；以质粒pET22b为模板，使用引物Fuse-pCDF-F和Fuse-pCDF-R扩增获得22b-4A片段，而后使用ClonExpress克隆方法将片段Trc-B-CadBA-4A和片段22b-4A拼接构建得到质粒pAmp-Trc-B34-pel-CadBA，转化菌株MG1655感受态细胞，构建得到产赖氨酸脱羧酶大肠杆菌工程菌株（E. coli CAD03）。
1.2 培养基配方
1.2.1 混菌发酵培养基
Na2HPO4•12H2O 17.1g/L；KH2PO4 3g/L；NH4SO4 10g/L； KCl 0.5g/L；丙酮酸钠 0.5g/L；Peptone 0.6g/L；Betaine 2g/L；MgSO4 1.6g/L； FeSO4 0.032g/L；MnSO4 0.032g/L；ZnSO40.086g/L；CuSO4 0.077g/L；L-苏氨 酸 0.3g/L；L-甲硫氨酸 0.1g/L；葡萄糖 30g/L；甘油4g/L；硫胺素 0.02g/L；生物素 2mg/L；烟酰胺 0.01g/L；氨苄青霉素 0.1g/L。
1.2.2 补料培养基
400g/L 的葡萄糖和甘油混合液，葡萄糖与甘油的体积比为 8:1；400g/L的硫酸铵溶液。
1.3 发酵培养过程
1.3.1 平板培养
分别取出放置于-80℃冰箱里的冻存甘油管中的E. coli NT1003和E. coli CAD03，并在含有固体 LB 的平板上划线，然后把平板放置于 37 ℃的培养箱中过夜培养。
1.3.2 种子液培养
从冻存甘油管里吸取E. coli NT1003菌液接种于液体种子培养基，在 37℃的摇床中以 200r/min 培养 6h。
从冻存甘油管里吸取E. coli CAD03菌液接种于液体种子培养基，在 37℃的摇床中以 200r/min 培养 6h。
1.3.3 发酵罐培养
按10% 接种量将种子培养液转接至终体积为4L发酵罐培养基中,37℃培养，待 OD600约为 4-5 时加入 IPTG 进行诱导，诱导培养12h后收集菌体。
1.3.4 补料发酵
7.5L 发酵罐装液量为 3L，温度控制为37 ℃，初始接种量为10%接种比（体积比）按 E. coli NT1003：E. coli CAD03 = 10:1，pH 6.8±0.1，利用 25%的氨水进行调控，初始转速和通气量控制为 200rpm、0.6vvm，后期并通过调整转速和通气量将溶氧（DO）控制在10%左右。初始培养基中葡萄糖耗尽时，开始补加补料培养基，发酵48h。
实施例2 分区固定化混菌产 1,5-戊二胺的过程
2.1 特异性吸附固定化材料制备
将长5cm、宽3cm、厚1cm的多孔碳毡浸泡在Tris-Hcl缓冲液中（缓冲液含：甘露糖 4g/L；半乳糖1g/L；多巴胺2.5g/L）24h后，洗涤干燥备用。
2.2 菌种
参见实施例1中1.1菌种。
2.3 培养基
参见实例1中1.2培养基配方。
2.4 菌体特异性吸附固定化材料生物膜的制备
2.4.1 平板培养
分别取出放置于-80℃冰箱里的冻存甘油管中的E. coli NT1003和E. coli CAD03，并在含有固体LB 的平板上划线，然后把平板放置于37℃的培养箱中过夜培养；
2.4.2 种子液培养
从冻存甘油管里吸取E. coli NT1003菌液接种于液体种子培养基，在 37℃的摇床中以 200r/min 培养 3h。
从冻存甘油管里吸取E. coli CAD03菌液接种于液体种子培养基，在 37℃的摇床中以 200r/min 培养 3h。
2.4.3 特异性吸附过程
将2.1中制备好的特异性吸附固定化材料别放入2.4.1中培养3h的E. coli NT1003和E. coli CAD03培养瓶中继续培育4h，此时由于甘露糖、半乳糖和微生物的特异性吸附作用存在，大肠杆菌将在固定化材料上富集，最终得到具有E. coli NT1003的固定化材料A和具有E. coli CAD03的固定化材料B。
2.5 发酵罐中培育过程
将具有E. coli NT1003的固定化材料A和具有E. coli CAD03的固定化材料B按数量比18：4安装进7.5L常规发酵罐系统的内管壁上，见示意图1（a），其中固定化材料A和固定化材料B以间隔90°的角度固定在常规发酵罐内管壁上，见示意图1（b）。继续加入3L发酵培养基37℃培养2h后，加入IPTG 进行诱导，诱导培养12h 后将含IPTG的发酵培养基溶液去除。
2.6 补料发酵
7.5L 发酵罐装液量为 3L，温度控制为37℃，pH 6.8±0.1，利用 25%的氨水进行调控，初始转速和通气量控制为200rpm、0.6vvm，后期并通过调整转速和通气量将溶氧（DO）控制在 10%左右。初始培养基中葡萄糖耗尽时，开始补加补料培养基，发酵48h。
实施例3 分析方法进行比较
使用 SBA-40E 双通道生物传感仪测定 L-赖氨酸浓度，1,5-戊二胺浓度测定采用安捷伦 1290液相色谱系统和安捷伦TC-C18 色谱柱（4.6×250mm)。柱温40 ±1℃，流速1.0mL·min-1; 进样量10μl;荧光检测器激发波长为350nm, 发射波长为520nm。紫外检测器波长250nm。
、发酵生产1,5-戊二胺产量
比较实施例1中的传统双菌混合发酵策略与实施例2中的分区固定化混菌发酵策略进行生产1,5-戊二胺，比较两者在催化过程中关于最终产量、热稳定性、pH耐受性方面的性能比较。
图2结果表明实施例1中传统双菌混合发酵生产1,5-戊二胺最终的产量为28.5g/L，，而实施例2中的分区固定化混菌发酵生产1,5-戊二胺最终产量为40.2g/L。
2、发酵生产1,5-戊二胺耐受性方面
对于温度的耐受性检测，控制反应温度在 25 ℃-45 ℃之间，探究不同温度对转化产1,5-戊二胺的影响，其中的相对活性分别取实施例1和实施例2在37℃的1,5-戊二胺产量为各自的100%催化活性。
图3结果表明在热稳定性方面，实施例2中的分区固定化混菌发酵策略较实施例1中的传统双菌混合发酵策略有了明显的提升，在42℃时仍能保持自身90%的催化活性。
对于pH的耐受性检测，控制反应pH在 2~8之间，探究不同pH对转化产1,5-戊二胺的影响，其中的相对活性分别取实例1和实例2在pH 6.8时为各自的100%催化活性。
图4结果表明在pH耐受性方面，实施例2中的分区固定化混菌发酵策略较实施例1中的传统双菌混合发酵策略有了明显的提升，在pH 5时仍能保持自身89%的催化活性，在pH8时能保持自身65%的催化活性。
综上所述，本发明一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法基于固定化微生物的角度，以固定化微生物进而生成生物膜提高发酵过程中的可控性和耐受性。其次本研究基于分区的定向特异性固定化技术，提高混菌发酵之间的耦合作用，进而提升1,5-戊二胺的产量。
Claims (4)
1.一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将聚合物溶于缓冲溶液中，搅拌均匀后，浸入多孔固定化材料，洗涤后，干燥得特异性吸附固定化材料；
步骤2，分别用平板培养E. coli NT1003和E. coli CAD03菌株，再制备各自的种子培养液，备用；
步骤3，将特异性吸附固定化材料分别浸入E. coli NT1003菌株的种子液和E. coliCAD03菌株的种子液中继续培养，富集菌株后，得固定化材料A和固定化材料B；
步骤4，将固定化材料A和固定化材料B按照数量比混合后固定在发酵罐的内壁上，加入发酵培养基培养2小时后，加入IPTG进行诱导反应；
步骤5，诱导反应完成后，将含ITPG 的发酵培养基去除，补加发酵培养基并维持通气量和转速进行发酵生产1,5-戊二胺。
2.根据权利要求1所述的一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法，其特征在于，步骤1中所述聚合物为聚氨酯、聚多巴胺或聚吡咯中的一种或者多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法，其特征在于，步骤1中所述多孔固定化材料为聚氨酯、聚乙烯、尼龙、碳毡、树脂或橡胶中的一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的一种分区定向固定化双细胞制备1,5-戊二胺的方法，其特征在于，步骤4中固定化材料A和固定化材料B按照数量比18:4。
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