CN109082448A - 一种大肠杆菌及其在发酵生产1,5-戊二胺中的应用 - Google Patents
一种大肠杆菌及其在发酵生产1,5-戊二胺中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号为NT1006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年05月23日，保藏编号为CCTCC NO:M 2018305，还公开了大肠杆菌在发酵生产1,5‑戊二胺中的应用。本发明采用紫外诱变和ARTP诱变相结合，筛选获得一株高产1,5戊二胺的大肠杆菌NT1006：以葡萄糖作为碳源，经过48h的发酵1,5戊二胺产量达到了50g/L，而同等条件培养的出发菌株1,5戊二胺产量仅有12.27g/L。NT1006连续传代7次后发酵液中1,5戊二胺的含量仍维持在50g/L左右，遗传稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌，具体涉及一种大肠杆菌及其在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。
背景技术
1,5-戊二胺是一种广泛存在于生物体中、具有多种生物活性的生物多胺，广泛应用于农业、医疗和工业产品中，特别是用于合成生物基聚酰胺产品。
目前合成戊二胺的方法有化学合成法、生物合成法。化学合成法条件苛刻、污染环境，不适合大规模推广。而生物法合成1,5-戊二胺具有原料来源广、生产条件温和、环境友好等优势。
生物法合成戊二胺主要有三种方式：酶转化法、微生物发酵法、全细胞催化。但有研究表明，在3g/L的1,5-戊二胺溶液中，赖氨酸脱羧酶的活力会降低50％。产物抑制现象严重制约了纯酶催化生产1,5-戊二胺的应用，因而对于1,5-戊二胺的生物合成研究主要集中在利用微生物直接发酵生产或添加前体L-赖氨酸通过全细胞催化生产。
全细胞催化生产1,5-戊二胺具有原料成本高、细胞重复利用率低等问题。发酵法生产1,5-戊二胺虽然相对原料成本较低，然而其产量和生产强度均较低，目前报道的最高1,5-戊二胺产量仅9.61g/L，生产强度为0.32g/L/h，葡萄糖转化率为0.12g(1,5-戊二胺)/(g葡萄糖)。
发明内容
发明目的：本发明第一方面提供了一种大肠杆菌，本发明第二方面提供了所述大肠杆菌在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。
技术方案：本发明第一方面提供一种大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号为NT1006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年05月23日，保藏编号为CCTCC NO:M 2018305，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。菌株NT1006采用紫外诱变和ARTP诱变相结合筛选得到，出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)NT1003ΔMetΔThr，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2013年5月30日，保藏编号为CCTCC NO:M 2013239，该菌株已公开于中国专利201310285525X中。
本发明第二方面提供大肠杆菌NT1006在发酵生产1,5-戊二胺中的应用；优选地，所述大肠杆菌利用葡萄糖或蔗糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺。
大肠杆菌NT1006发酵生产1,5-戊二胺的步骤如下：
(1)将活化的菌株NT1006接种于种子培养基中，33-37℃扩大培养8-12h，
(2)将步骤(1)得到的种子液以体积比10-20％的接种量接种于发酵培养基中，33-37℃发酵培养36-48h。
步骤(1)中，大肠杆菌NT1006活化的步骤如下：将大肠杆菌NT1006接种于LB固体平板上，37℃下活化24h；种子培养基按质量百分比包括如下组分：碳源0.5-3％、有机氮源0.5-3％、无机氮源0.5-2％、无机盐0.5-1％、余量为水，pH6.8-7.2；所述种子培养基中碳源为葡萄糖、蔗糖中的任意一种或两种的组合；所述有机氮源为蛋白胨、酵母提取物中的任意一种或几种的组合；所述无机氮源为硫酸铵；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐和钙盐中的任意一种或几种的组合。优选种子培养基按质量百分比包括如下组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2。
步骤(2)中，发酵在发酵罐中进行，控制溶氧为15-20，所述发酵培养基按质量百分比包括如下组分：碳源1-5％、有机氮源0.5-3％、无机氮源0.5-2％、无机盐0.1-1％、余量为水，pH为6.8-7.2；发酵过程中采用氨水调控发酵液的pH。
优选地，所述发酵培养基中碳源为葡萄糖、蔗糖中的任意一种或两种的组合；所述有机氮源为蛋白胨、酵母提取物中的任意一种或几种的组合；所述无机氮源为硫酸铵；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐和钙盐中的任意一种或几种的组合。
更优选地，所述发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖或蔗糖1-3％、蛋白胨1-2％、硫酸铵0.5-2％、磷酸氢二钾0.5-1％、硫酸锰0.02-0.08％、硫酸亚铁0.02-0.08％、硫酸镁0.1-0.3％、余量为水，pH为6.8-7.2。当发酵过程中葡萄糖或蔗糖、硫酸铵因消耗含量降低时，补加葡萄糖或蔗糖、硫酸铵，保证葡萄糖或蔗糖在发酵培养基中的质量百分比维持在0.3-1％，硫酸铵在发酵培养基中的质量百分比维持在0.1-0.4％。
有益效果：本发明采用紫外诱变和ARTP诱变相结合，最终筛选获得一株高产1,5戊二胺的大肠杆菌NT1006：以葡萄糖作为碳源，经过48h的发酵，在7.5L发酵罐中1,5戊二胺产量达到了50g/L，而同等条件培养的出发菌株NT1003ΔMetΔThr 1,5戊二胺产量仅有12.27g/L。且菌株NT1006连续传代7次后发酵液中1,5戊二胺的含量仍维持在50g/L左右，无显著变化，遗传稳定性好。
附图说明
图1为菌株NT1003ΔMetΔThr的紫外诱变致死率；
图2为菌株NT1003ΔMetΔThr的ARTP诱变致死率。
具体实施方式
实施例1筛选菌株NT1006
以大肠杆菌(Escherichia coli)NT1003ΔMetΔThr作为出发菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2013年5月30日，保藏编号为CCTCC NO:M2013239。筛选大肠杆菌(Escherichia coli)NT1006的具体步骤如下：
(1)菌悬液的制备
取37℃恒温培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)NT1003ΔMetΔThr菌落，转接于250mL摇瓶中培养，摇瓶中装有LB培养基，摇瓶装液量为50mL，在37℃、200rpm下培养12-14h，得到处于对数生长期的菌液，用生理盐水洗涤2次，然后用生理盐水制成菌悬液，调整细菌浓度在107-108个/mL。
(2)紫外诱变
将步骤(1)得到的菌悬液转入含有磁力转子的无菌空平板中，在100rpm搅拌速度下置于30w紫外灯下25cm处进行紫外照射诱变，照射时间为20-120s，诱变结束后取菌悬液涂布于LB平板中，在33-37℃下避光培养24-40h。实验结果如图1所示，由图可知，60s为最佳的紫外诱变时间。
(3)ARTP诱变
将步骤(2)中60s诱变后的的菌株转接到LB平板上进行培养，转接于500mL的LB摇瓶中培养，装液量为100mL，在37℃、200rpm下培养12-14h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细菌稀释至OD600为0.1-1.0，然后滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，对菌株进行等离子体诱变，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以20-100s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变；将诱变后的载片置于装有1-2mL生理盐水的离心管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于LB平板上，33-37℃培养24-40h。实验结果如图2所示，由图可知，50s是最佳的诱变时间。
(4)初筛
将步骤(3)50s诱变得到的单菌落接种至LB平板培养基中活化，33-37℃下倒置培养24-40h，然后从活化后的平板中挑取一环菌株接种至种子培养基中33-37℃，200rpm培养12h，将种子培养基中若干培养好的菌落按1-2％(v/v)的接种量，接种到500mL摇瓶发酵培养基中，33-37℃，200rpm，培养24-36h，检测发酵液中1,5戊二胺的含量，初筛出1,5戊二胺含量大于8g/L的菌落。
(5)复筛
将步骤(4)初筛的菌落接种至LB平板培养基中活化，33-37℃下倒置培养24-40h，然后从活化后的平板中挑取一环菌株接种至种子培养基中33-37℃，200rpm培养12h，将种子培养基中若干培养好的菌落按1-2％(v/v)的接种量，接种到7.5L发酵罐中，33-37℃培养48-60h，控制发酵罐溶氧15-20。检测发酵液中1,5戊二胺的含量，筛选出1,5戊二胺产量高的菌株。其中，发酵过程采用氨水控制发酵液的pH。
再将步骤(5)复筛得到的菌落重复步骤(1)-步骤(5)，优选紫外诱变时间为60s，ARTP诱变时间为50s。当检测到发酵液中1,5戊二胺产量为50g/L及以上时，所对应的菌株为目标菌株大肠杆菌(Escherichia coli)NT1006。
其中，本实施例使用的培养基的配方如下：
(1)LB平板的培养基，包含如下质量百分比组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、琼脂粉2％、余量为水。
(2)LB培养基，包含如下质量百分比组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、余量为水。
(3)种子培养基，包含如下质量百分比组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2。
(4)摇瓶发酵培养基，包含如下质量百分比组分：葡萄糖3％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、余量为水，pH6.8-7.2。
(5)7.5L发酵培养基，包含如下质量百分数组分：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、余量为水，pH6.8-7.2。发酵罐中通入空气，以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在15-20，发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％，发酵过程中采用氨水控制发酵过程的pH在6.8-7.2。
实施例2菌株NT1006的遗传稳定性
以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测实施例1获得的突变株大肠杆菌(Escherichia coli)NT1006的遗传稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1，发酵液中的1,5戊二胺含量由Ailgent1290液相色谱仪测定。
菌株传代发酵试验具体步骤如下：
(1)菌株传代
将实施例1中获得的突变株大肠杆菌(Escherichia coli)NT1006，从平板中挑取单菌落接种到50mL摇管中，摇管装有LB培养基，装液量5mL，培养温度33-37℃，转速200rpm，培养8-10h，取出一部分菌液进行菌株保存，作为突变菌株的第一代。然后将剩下的菌液按照1-2％(v/v)的接种量转接新的摇管中，摇管装有新鲜LB培养基，装液量5mL，培养温度33-37℃，转速200rpm，培养8-10h，取出一部分菌液进行菌株保存，作为突变菌株的第二代。以此类推，分别得到突变菌株的第三代至第七代。
(2)发酵试验
将步骤(1)获得的突变菌株的第一代接种至LB平板培养基中活化，33-37℃下倒置培养24-40h，然后从活化后的平板中挑取一环菌株接种至种子培养基中33-37℃培养，200rpm，12h，从种子培养基中按10-20％(v/v)的接种量，接种到7.5L发酵罐中，33-37℃培养48-60h。发酵罐中通入空气，以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在15-20，发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。发酵过程中采用氨水控制发酵过程的pH在6.8-7.2。检测发酵液中1,5戊二胺的含量。其中，发酵过程采用氨水控制发酵液的pH在6.8-7.2。
按照步骤(2)依次验证突变菌株的第二代至第七代1,5戊二胺的产量。
其中，本实施例使用的培养基的配方如下：
(1)LB平板培养基，按质量百分比包括如下组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、琼脂粉2％、余量为水。
(2)种子培养基，包含如下质量百分比组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2。
(3)7.5L发酵培养基，包含如下质量百分数组分：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、余量为水，pH6.8-7.2。
表1
由表1可知，经过7次传代，大肠杆菌(Escherichia coli)NT1006的1,5戊二胺产量稳定，具有较好的遗传稳定性。
实施例3菌株NT1006以葡萄糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺
(1)平板培养
将实施例1筛选得到的大肠杆菌(Escherichia coli)NT1006接种于LB固体培养基中，37℃下活化24h；
(2)种子培养
将步骤(1)活化的大肠杆菌NT1006接种于种子培养基中，500mL摇瓶中装液量为50mL，培养温度为37℃，200rpm摇床转速下培养8-12h；
(3)发酵培养
将步骤(2)培养的大肠杆菌NT1006接种于发酵培养基中，接种量为20％(v/v)，7.5L发酵罐中装液量为3L，培养温度为33-37℃，同时通入空气以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在15-20，发酵过程中不断根据糖耗补加葡萄糖、硫酸铵，葡萄糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％。发酵过程中采用氨水控制发酵过程的pH在6.8-7.2。发酵时间为48h，经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的含量为51g/L。
其中，本实施例使用的培养基的配方如下：
(1)LB平板培养基，按质量百分比包括如下组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、琼脂粉2％、余量为水。
(2)种子培养基，包含如下质量百分比组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2。
(3)7.5L发酵培养基，包含如下质量百分数组分：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、余量为水，pH6.8-7.2。
实施例4菌株NT1006以蔗糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺
平板培养、种子培养、发酵培养的方法同实施例3，不同的是步骤(3)的发酵培养使用的发酵培养基中由蔗糖替代葡萄糖，发酵时间为48h，经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的含量为50.3g/L。
其中，本实施例使用的发酵培养基的配方如下：
7.5L发酵培养基，包含如下质量百分数组分：蔗糖2％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、余量为水，pH6.8-7.2。发酵罐中通入空气，以保持发酵罐中适宜的溶氧环境，溶氧保持在15-20，发酵过程中不断根据糖耗补加蔗糖、硫酸铵，蔗糖浓度维持在0.3-1％，硫酸铵浓度维持在0.1-0.4％，发酵过程中采用氨水控制发酵过程的pH在6.8-7.2。
对比例1
平板培养、种子培养、发酵培养的方法同实施例3，不同的是使用的菌株为原始菌株大肠杆菌(Escherichia coli)NT1003ΔMetΔTh。发酵时间为48h，经Ailgent1290液相色谱仪测得发酵液中戊二胺的含量为12.27g/L。
Claims (8)
1.一种大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号为NT1006，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年05月23日，保藏编号为CCTCC NO:M2018305。
2.权利要求1所述大肠杆菌在发酵生产1,5-戊二胺中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌利用葡萄糖或蔗糖为碳源发酵生产1,5-戊二胺。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化的菌株NT1006接种于种子培养基中，33-37℃扩大培养8-12h；
(2)将步骤(1)得到的种子液以体积比10-20％的接种量接种于发酵培养基中，33-37℃发酵培养36-48h。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)的发酵在发酵罐中进行，控制溶氧为15-20，所述发酵培养基按质量百分比包括如下组分：碳源1-5％、有机氮源0.5-3％、无机氮源0.5-2％、无机盐0.1-1％、余量为水，pH为6.8-7.2。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中碳源为葡萄糖、蔗糖中的任意一种或两种的组合；所述有机氮源为蛋白胨、酵母提取物中的任意一种或几种的组合；所述无机氮源为硫酸铵；所述无机盐为钾盐、镁盐、铁盐、锰盐、钠盐和钙盐中的任意一种或几种的组合。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖或蔗糖1-3％、蛋白胨1-2％、硫酸铵0.5-2％、磷酸氢二钾0.5-1％、硫酸锰0.02-0.08％、硫酸亚铁0.02-0.08％、硫酸镁0.1-0.3％、余量为水，pH为6.8-7.2。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)发酵过程中补加葡萄糖或蔗糖、硫酸铵，保证葡萄糖或蔗糖在发酵培养基中的质量百分比维持在0.3-1％，硫酸铵在发酵培养基中的质量百分比维持在0.1-0.4％。
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