CN102732449B - 产琥珀酸放线杆菌菌株yh123及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）YH123，保藏号为CCTCC NO：M2012072。本发明还涉及所述产琥珀酸放线杆菌YH123在发酵生产琥珀酸中的应用。该菌株能高效地利用不同碳源发酵制备丁二酸，糖的转化率高；葡萄糖为碳源时，在3L发酵罐中丁二酸的产量和产率分别达到了33.2g/L和66.7%，分别比出发菌提高了18.2%和10.3%。
Description
技术领域
本发明涉及一株产琥珀酸放线杆菌YH123及其应用，具体是其在琥珀酸发酵工业中的应用，属于工业微生物及其发酵技术领域。
背景技术
琥珀酸（又称丁二酸（Succinic acid））是一种常见的天然有机酸， 广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。作为一种重要的化工原料，它在医药、食品以及表面活性剂等行业也有着广泛的用途。琥珀酸可作为合成复杂有机化合物的中间体，也可以作为C4平台化合物用于合成大宗化学品以及生物可降解材料，因此丁二酸被认为是继柠檬酸后最具市场潜力的发酵有机酸产品。
传统的琥珀酸化学合成法采用丁烷经顺丁烯二酸酐通过电解生产，存在成本高和环境污染等问题，限制了其作为基本化工原料的广泛应用。
生物法生产丁二酸是以可再生碳源（如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等）和CO2作为主要原料，通过菌株发酵生产丁二酸，因此新工艺本身不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了对温室气体CO2利用的新途径。一旦实现了丁二酸发酵的大规模生产，就可以以丁二酸取代一些石油化工产品，而成本的降低更有利于该产品的广泛应用，社会、环境效益更加显著。
天然菌株的产丁二酸能力比较低，发酵产物多种多样，对糖或丁二酸的耐受性比较差而使其基本不具有使用价值。因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行诱变和改造，以期获得能够利用可再生碳源、廉价无机氮源、以培养、高转化率、高生产强度的突变菌株。
发明内容
本发明的技术目的之一是提供一株高产琥珀酸放线杆菌。
本发明的技术目的之二是提供所述高产琥珀酸放线杆菌在发酵生产琥珀酸中的应用。
本发明的技术目的通过以下技术方案来实现。
一、一种产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123，保藏编号为CCTCC NO：M2012072。
本发明所述的产琥珀酸放线杆菌YH123将产琥珀酸放线杆菌出发菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113 CGMCC NO.1716经等离子体诱变后，利用溴百里麝香酚蓝得到变色圈较大的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得丁二酸产量高的产琥珀酸放线杆菌目标菌株。
具体的筛选步骤如下：
a） 等离子诱变：将产琥珀酸放线杆菌原始菌株活化培养，培养温度35～37℃，100mL的厌氧瓶装液量为40～60mL，充二氧化碳2～3min，培养时间8～10h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD660=0.2～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，射频功率为80～120W，气体流量10～30LM，辐照时间为10s～300s。
b） 溴百里麝香酚蓝平板初筛：将诱变后的载片置于装有0.5～2mL生理盐水的具塞试管中，充分震荡，将载片上的菌体洗脱，稀释成不同浓度涂布于含溴百里麝香酚蓝（0.10～0.25g/L）的培养基平板上，35～37℃厌氧培养12～36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落。
c） 溴百里麝香酚蓝平板复筛：将步骤b）筛选的菌株接种于100mL血清瓶，装液量30～50mL，厌氧培养10～12h，无菌生理盐水制成OD=0.1的菌悬液，吸取10μL涂布于含有溴百里麝香酚蓝（0.10～0.25g/L）的常规固体培养基平板上，在35～37℃下厌氧培养12～36h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落。
d） 血清瓶发酵筛选：将步骤c）筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度35～37℃，厌氧培养时间10～12h，然后在发酵培养基中发酵，接种量6%～10%（V/V），发酵温度35～37℃，厌氧发酵时间24～48h；考察步骤c)筛出的菌落发酵产丁二酸的能力，同时选出丁二酸产量和产率最高的菌株。
在上述筛选方法中：步骤a）中所述的等离子诱变方法中，优选100W作为射频功率，10SLM作为气体流量，60s作为辐照时间。
在上述筛选方法中：步骤b）和c）所采用的常规培养基配方为：葡萄糖10～20g/L，酵母膏 5～10 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 ～15.5g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5～21.4 g/L，NaHCO3 10～18 g/L，玉米浆 5～10 g/L，溴百里麝香酚蓝0.10～0.25g/L， pH 6.0～8.0。固体培养基中添加琼脂15 g/L。
在上述筛选方法中：步骤d）所采用的种子培养基配方为：葡萄糖10～20g/L，酵母膏 5～10 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 ～15.5g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5～21.4 g/L，NaHCO3 10～18 g/L，玉米浆 5～10 g/L， pH 6.0～8.0。步骤d）所采用的发酵培养基：葡萄糖10～100 g/L， 乙酸钠1.36～2.8 g/L，NaCl 1～2.2 g/L，CaCl2 0.2～0.4 g/L，MgCl2 0.2～0.5 g/L，Na2HPO4 0.31～0.65 g/L，NaH2PO4 1.6～3.5 g/L，K2HPO4 3～6.1 g/L，酵母膏10～20g/L，pH6.0~8.0。
二、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的方法包括如下步骤：
1）种子培养：将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123接种至种子培养基中，100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2～3min，培养温度35～37℃，培养时间10～12h；
2）发酵产丁二酸：将种子液接种到发酵培养基中，接种量6%～10%（V/V），充CO2 2～3min，发酵温度35～37℃，发酵时间为24～48h。
上述的种子培养基和发酵培养基应理解为现有技术中任何可以被产琥珀酸放线杆菌利用的培养基成分。在本发明的实施例中，所述种子培养基组分为：葡萄糖10～20g/L，酵母膏 5～10 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 ～15.5g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5～21.4 g/L，NaHCO3 10～18 g/L，玉米浆 5～10 g/L，pH 6.0～8.0。
所述发酵培养基组分为：碳源10～100 g/L，乙酸钠1.36～2.8 g/L，NaCl 1～2.2 g/L，CaCl2 0.2～0.4 g/L，MgCl2 0.2～0.5 g/L，Na2HPO4 0.31～0.65 g/L，NaH2PO4 1.6～3.5 g/L，K2HPO4 3～6.1 g/L，酵母膏10～20g/L，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖中的一种或多种，pH6.0~8.0。
采用上述技术方案的积极效果：本发明采用等离子体诱变产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113 CGMCC NO.1716，利用溴百里麝香酚蓝筛选出高产丁二酸的菌株，较出发菌株，该菌株能高效地利用不同碳源发酵生产丁二酸，糖的转化率高、丁二酸的产量高；在3L发酵罐中，以葡萄糖为碳源，丁二酸的产量和产率分别达到了33.2g/L和66.7%，分别比出发菌提高了18.2%和10.3%，具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1是本发明中产琥珀酸放线杆菌YH123的等离子体存活率曲线。
本发明的生物材料分类命名为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123，保藏日期为2012年3月9日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为 CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M2012072。
具体实施方式
实施例1：将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113进行第一步等离子体诱变的方法
本发明所使用的出发菌株产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113的来源：在中国专利局或国际专利组织承认的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了专利程序保藏（保藏编号：CGMCC No. 1716）的，并在本申请日之前已授权（专利号200610085415.9，授权公告日2009年9月9日，授权公告号CN100537744
C）的生物材料。
将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113原始菌株活化培养，培养温度35～37℃，100mL血清瓶装液量为40～60mL，充CO2 2～3min，培养时间8～10h，得到生长旺盛处于对数生长期的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD660=0.2～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10～300s作为辐照时间对菌体进行等离子诱变，诱变后，将载片上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示，其中，横坐标为辐照时间，纵坐标为存活率。
实施例2：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123的筛选方法
筛选步骤：
1、溴百里麝香酚蓝平板初筛
将诱变后的载片置于装有0.5~2mL生理盐水的具塞试管中，充分震荡，将载片上的菌体洗脱，取适量涂布于含溴百里麝香酚蓝（0.10～0.25g/L）的培养基平板上，35~37℃厌氧培养12～36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落45株。
2、溴百里麝香酚蓝平板复筛
将筛选的菌株接种于100mL的血清瓶，装液量50mL，充CO2 2min，35～37℃，厌氧培养10～12h，无菌生理盐水制成浓度OD=0.1的菌悬液，吸取10μL涂布到含有溴百里麝香酚蓝的固体培养基上，35～37℃下厌氧培养12～36h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落；最终菌株YH104和YH123显示了较强的产酸能力。
3、摇瓶发酵筛选
将菌株YH104、YH123和出发菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度37℃，100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2min，培养时间12h。然后在发酵培养基中发酵，接种量6%（V/V），37℃下发酵，100mL血清瓶厌氧发酵，装液量30mL，发酵时间36h后检测各菌株的产丁二酸量，如表1所示：
经过平板组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中酸的总产量均明显高于出发菌株，其中YH104的乙酸产量过高而丁二酸产量较低，而YH123具有较高的丁二酸收率。
其中，培养基的配方为：
选择培养基：葡萄糖10～20g/L，酵母膏 5～10 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 ～15.5g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5～21.4 g/L，NaHCO3 10～18 g/L，玉米浆 5～10 g/L，溴百里麝香酚蓝0.10～0.25g/L， pH 6.0～8.0。固体培养基中添加琼脂15 g/L。
种子培养基配方为：葡萄糖10～20g/L，酵母膏 5～10 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 ～15.5g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5～21.4 g/L，NaHCO3 10～18 g/L，玉米浆 5～10 g/L， pH 6.0～8.0。
发酵培养基：葡萄糖10～100 g/L， 乙酸钠1.36～2.8 g/L，NaCl 1～2.2 g/L，CaCl2 0.2～0.4 g/L，MgCl2 0.2～0.5 g/L，Na2HPO4 0.31～0.65 g/L，NaH2PO4 1.6～3.5 g/L，K2HPO4 3～6.1 g/L，酵母膏10～20g/L，pH6.0~8.0。
优选配方为：
（1）固体平板培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，NaHCO 310 g/L，NaCl 1.0 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0 ~ 7.2。
（2）选择平板培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，NaHCO 3 10 g/L，NaCl 1.0 g/L，溴百里香酚蓝0.1 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0 ~ 7.2。
（3）种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 5 g/L，pH 7.0 ~ 7.2。
（4）摇瓶发酵筛选培养基配方为：葡萄糖50 g/L， 乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L， MgCO3 45 g/L，pH7.0~7.2。
需要特别注意的是，上述范围值是发明人每次实验采用的基于上述范围值端点值和中间值的所有数据的统计，而最后得到的菌株是上述无数次采用不同范围中各点数值后进行的实验中筛选得到的其中的一只。
实施例3：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123的传代稳定性
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株YH123的传代稳定性，菌株YH123传代发酵试验结果如表2所示：
从实验结果可知，经过7次连续传代，产琥珀酸放线杆菌YH123的丁二酸产量和产率较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例4：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的工艺
将产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123接种到种子培养基中， 100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2min，培养温度37℃，培养时间10h；将种子接种到发酵培养基中，接种量6%（V/V），发酵温度37℃，100mL血清瓶装液量30mL，充CO2 2min，发酵培养48h后检测丁二酸产量，比同等培养条件下的出发菌提高了18.8%，产率达到了74.5%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 5 g/L，pH 7.0。
发酵培养基配方为：葡萄糖50 g/L， 乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L， pH7.0。
实施例5：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的应用
将产琥珀酸放线杆菌YH123接种到种子培养基中， 100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2min，培养温度37℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量6%（V/V），发酵温度37℃，100mL血清瓶装液量30mL，充CO2 2min，发酵培养48h后检测丁二酸产量，比同等培养条件下的出发菌提高了17.9%，产率达到了76.4%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 5 g/L，pH 7.2。
发酵培养基配方为：蔗糖50 g/L， 乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L， pH7.2。
实施例6：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的应用
将产琥珀酸放线杆菌YH123接种到种子培养基中， 100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2min，培养温度37℃，培养时间10h；将种子接种到发酵培养基中，接种量6%（V/V），发酵温度37℃，100mL血清瓶装液量30mL，充CO2 2min，发酵培养48h后检测丁二酸产量，比同等培养条件下的出发菌提高了17.9%，产率达到了76.4%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 5 g/L，pH 7.0。
发酵培养基配方为：果糖50 g/L， 乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L， pH7.0。
实施例7：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的应用
将产琥珀酸放线杆菌YH123接种到种子培养基中， 100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2min，培养温度37℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量6%（V/V），发酵温度37℃，100mL血清瓶装液量30mL，充CO2 2min，发酵培养48h后检测丁二酸产量，比同等培养条件下的出发菌提高了19.6%，产率达到了78.5%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖10 g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 5 g/L，pH7.2。
发酵培养基配方为：甘蔗糖蜜50 g/L， 乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L， pH7.2。
实施例8：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123在3L发酵罐中发酵生产丁二酸的应用
将产琥珀酸放线杆菌YH123接种到种子培养基中， 150mL血清瓶装液量90mL，充CO2 2min，培养温度37℃，培养时间12h；将种子接种到装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，接种量6%（V/V），发酵温度37℃，发酵过程中连续通入CO2，流速为0.3L/min，发酵培养48h后检测丁二酸产量和产率分别达到33.2g/L和66.7%，分别比同等培养条件下的出发菌提高了18.4%和10.3%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 5 g/L，pH7.2。
发酵培养基配方为：木糖50 g/L，乙酸钠1.36 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏10 g/L，pH7.2。
实施例9：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的工艺
将产琥珀酸放线杆菌YH123接种到种子培养基中， 100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 3min，培养温度35℃，培养时间10h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10%（V/V），发酵温度35℃，100mL血清瓶装液量30mL，充CO2 3min，发酵培养24h后检测丁二酸产量，比同等培养条件下的出发菌提高了19.6%，产率达到了78.5%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母膏 5 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 15.5 g/L，K2HPO4 ·3H2O 21.4g/L，NaHCO3 10 g/L，玉米浆 10 g/L，pH6.0。
发酵培养基配方为：葡萄糖10 g/L， 乙酸钠1.36 g/L，NaCl 2.2 g/L，CaCl2 0.2 g/L，MgCl2 0.5 g/L，Na2HPO4 0.65g/L，NaH2PO4 1.6 g/L，K2HPO4 3 g/L，酵母膏20 g/L， pH6.0。
实施例10：产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123发酵生产丁二酸的工艺
将产琥珀酸放线杆菌YH123接种到种子培养基中， 100mL血清瓶装液量50mL，充CO2 2min，培养温度37℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量6%（V/V），发酵温度37℃，100mL血清瓶装液量30mL，充CO2 2min，发酵培养48h后检测丁二酸产量，比同等培养条件下的出发菌提高了17.9%，产率达到了76.4%。
其中，种子培养基配方为：葡萄糖10 g/L，酵母膏 10 g/L， NaH2PO4 ·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4 ·3H2O 15.5 g/L，NaHCO3 18g/L，玉米浆 5 g/L，pH8.0。
发酵培养基配方为：葡萄糖100 g/L， 乙酸钠2.8g/L，NaCl 1 g/L，CaCl2 0.4 g/L，MgCl2 0.2 g/L，Na2HPO4 0.31 g/L，NaH2PO4 3.5 g/L，K2HPO4 6.1g/L，酵母膏10 g/L， pH8.0。
Claims (3)
1. 一种产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）YH123，保藏编号为CCTCC NO：M2012072。
2. 根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌YH123在发酵生产琥珀酸中的应用。
3. 根据权利要求2所述的产琥珀酸放线杆菌YH123在发酵生产琥珀酸中的应用，其特征在于包括如下步骤：
种子培养：将产琥珀酸放线杆菌YH123接种至种子培养基中，充CO2 2～3min，培养温度35～37℃，培养时间10～12h；
发酵产丁二酸：将种子液接种到发酵培养基中，接种量体积比6%～10%，充CO2 2～3min，发酵温度35～37℃，发酵时间为24～48h。
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