CN112852695B - 一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明的发明人以大肠埃希氏菌Sval031为出发菌，将编码来源于Streptomyces viridifaciens的L‑缬氨酸脱羧酶的基因整合至出发菌，并通过在染色体上调控基因表达强度的技术使用M1‑93启动子提高缬氨酸脱羧酶的表达强度，得到了异丁胺高产菌株ISO‑001，异丁胺产量可达52.7g/L，转化率可达0.92mol/mol。为了进一步的提高异丁胺的生产效率，本发明的发明人使用RBS文库调控技术优化了VlmD基因的表达强度，获得了异丁胺生产效率更高的菌株ISO‑I，异丁胺的产量进一步的提高了66.4g/L。本发明实现异丁胺的工业化发酵生产，具有非常强大的工业应用潜力。

Description

一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

异丁胺是一种低级脂肪族伯胺，具有低级脂肪族伯胺的基本性质，在医药、农药、化妆品、石油、电子等产业中有的非常广泛的用途。首先，异丁胺的化学性质丰富，可在硫酸锌催化下脱氢合成异丁腈并用作农药二嗪磷的关键原料；还可用于合成抗病毒药物安普那韦、地瑞那韦、夫沙那韦、咪喹莫特；还可用于合成抗菌药盐酸莫西沙星、利福布汀；胃药来明拉唑；还可用于合成化妆品功能成分辛酰异丁胺、肉桂酰异丁胺等异丁酰胺类衍生物；还可用于合成氨基甲酸酯类农药；以及用于制造水性聚氨酯固化剂的氨基磺酸类衍生物等等。其次，异丁胺是一种伯胺，具有弱碱性，可用于石油管道的缓蚀剂、精密电路的碱性蚀刻剂的配制。再次，异丁胺是一种双亲性小分子，可用作稳定剂，避免溶液分层。例如，在甲醇汽油中添加异丁胺可以有效避免汽油分层，维持甲醇汽油的稳定，在胶粘剂如丙烯酸酯胶粘剂中添加异丁胺可以有效的延迟单体的聚合，增强胶粘剂的存储稳定性。因此，开发一种绿色廉价的异丁胺生物合成方法，在扩展异丁胺的应用，以及降低下游产品的生产成本上有很强的推动作用，具有较大的产业化价值。

目前，异丁胺主要使用异丁醇催化氨化法制备。化学工业上采用异丁醇在临氢的状态下，通过催化剂的催化与氨加压气相反应生产异丁胺。根据国内对异丁胺、二异丁胺、三异丁胺生产总量的统计，异丁胺、二异丁胺、三异丁胺的市场需求比例约为7:3:0。虽然生产异丁胺的原料成本不高，但由于目前的异丁醇胺化生产异丁胺的合成工艺为链式串级反应，理论上无法单独合成异丁胺，存在二异丁胺、三异丁胺副产物。导致异丁胺的价格居高不下。工业级异丁胺的价格在3万元/吨左右，较高的价格限制了异丁胺的广泛应用。

目前国际与国内上尚无可用于生产异丁胺的工业菌株。

异丁胺是L-缬氨酸的下游产品，以L-缬氨酸细胞工厂为基础做深入开发，利用合成生物学为主导的技术体系在现有的细胞工厂基础上快速高效的构建衍生产品的合成途径，不仅将大大降低新型细胞工厂在构建过程中的时间资金成本，还在保护环境，拓展市场，填补产业链空缺方面具有很重要的战略意义，对相关产业将产生革命性的影响。理论上，以葡萄糖为原料发酵法生产异丁胺的转化率可达1mol_异丁胺/mol_葡萄糖，原料成本预计约7500元/吨。异丁胺为液态有机胺，沸点仅68℃，便于用蒸馏法提取，下游分离成本较低，预计总体生产成本不超过10000元/吨，与化学法相比有较强的市场竞争优势，生产过程绿色环保，可为化工产业绿色转型提供技术支撑。由此可见，发酵法合成异丁胺的相关研究在国际上尚属空白，具有极强的创新性和开发价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

本发明提供了一株重组大肠杆菌，是在出发菌中过表达编码来源于Streptomycesviridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因得到的重组菌；所述出发菌为生产L-缬氨酸的大肠杆菌。

所述生产L-缬氨酸的大肠杆菌为大肠埃希氏菌Sval031。

示例性的，所述重组大肠杆菌是在所述出发菌中导入特异DNA分子得到的重组菌；所述特异DNA分子中具有编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因。

所述特异DNA分子中，由特异启动子启动L-缬氨酸脱羧酶基因的表达。

具体的，所述特异DNA分子通过同源重组整合至出发菌的基因组。

所述整合位点位于出发菌的基因组中如下两个区段之间：序列表的序列4中第1-50位核苷酸所示区段，序列表的序列4中第3354-3403位核苷酸所示区段。

更具体的，所述同源重组的上游同源臂如序列表的序列4中第1-50位核苷酸所示，所述同源重组的下游同源臂如序列表的序列4中第3354-3403位核苷酸所示。

本发明还保护以上任一所述重组大肠杆菌在制备L-缬氨酸脱羧酶中的应用。

本发明还保护以上任一所述重组大肠杆菌在生产异丁胺中的应用。

所述应用中，底物为葡萄糖。

所述应用中，通过发酵所述重组大肠杆菌生产异丁胺。

示例性的，所述发酵的具体条件如下：接种所述重组大肠杆菌至培养基，完成接种的初始体系的OD₅₅₀nm值＝0.08-0.12；厌氧(即发酵过程不通气)、35-40℃、200-300rpm发酵培养。

示例性的，所述发酵的具体条件如下：接种所述重组大肠杆菌至培养基，完成接种的初始体系的OD₅₅₀nm值＝0.1；厌氧(即发酵过程不通气)、37℃、250rpm发酵培养。

发酵培养过程中流加0.5mol/L硫酸铵水溶液，控制体系的游离胺含量在0.05-0.1g/L之间。

发酵培养过程中流加中和剂(即25％的氨水)，控制体系pH为7。

所述发酵的时间可为24-72小时，具体可为36-60小时，更具体可为48小时。

发酵采用的培养基由以下成分组成：

大量元素：葡萄糖、(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄、MgSO₄·7H₂O；

微量元素：FeCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O、ZnCl₂、Na₂MoO₄·2H₂O、H₃BO₃和MnCl₂·4H₂O₂；

水。

以上成分在培养基中的浓度可分别为：

大量元素：葡萄糖50g/L-150g/L或50g/L或100g/L或150g/L，NH₄H₂PO₄0.5g/L-5g/L或0.5g/L或1g/L或5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 1g/L-10g/L或1g/L或3g/L或10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L；

微量元素：FeCl₃·6H₂O 0.2μg/L-5μg/或0.2μg/L或1.5μg/L或5μg/L，CoCl₂·6H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，CuCl₂·2H₂O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，ZnCl₂ 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，H₃BO₃ 0.01μg/L-1μg/L或0.01μg/L或0.1μg/L或1μg/L，MnCl₂·4H₂O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.2μg/L或5μg/L；

发酵采用的培养基具体可为：葡萄糖106g/L、NH₄H₂PO₄ 1g/L、(NH₄)₂HPO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、FeCl₃·6H₂O 1.5μg/L、CoCl₂·6H₂O 0.1μg/L、CuCl₂·2H₂O 0.1μg/L、ZnCl₂ 0.1μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1μg/L、H₃BO₃ 0.1μg/L、MnCl₂·4H₂O 0.2μg/L，余量为水。pH值为7.0。

本发明还保护特异DNA分子和出发菌的应用；

所述特异DNA分子中，由特异启动子启动L-缬氨酸脱羧酶基因的表达；

所述L-缬氨酸脱羧酶为来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶；

所述出发菌为生产L-缬氨酸的大肠杆菌；

所述应用为如下(c1)或(c2)：

(c1)制备L-缬氨酸脱羧酶；

(c2)生产异丁胺。

所述应用具体可为特异DNA分子和pKD46质粒和出发菌的应用。

本发明还保护一种试剂盒，包括特异DNA分子和出发菌；

所述特异DNA分子中具有编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因；

所述出发菌为生产L-缬氨酸的大肠杆菌；

所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：

(c1)制备L-缬氨酸脱羧酶；

(c2)生产异丁胺。

所述特异DNA分子中，由特异启动子启动L-缬氨酸脱羧酶基因的表达；

所述试剂盒还包括pKD46质粒。

所述生产L-缬氨酸的大肠杆菌为大肠埃希氏菌Sval031。

以上任一所述来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶为如下(a1)或(a2)：

(a1)如序列表的序列1所示的蛋白质；

(a2)来源于Streptomyces viridifaciens且与(a1)具有98％以上同一性的蛋白质。

以上任一所述编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因为如下(b1)或(b2)：

(b1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(b2)来源于Streptomyces viridifaciens且与(b1)具有98％以上同一性的DNA分子。

示例性的，以上任一所述特异启动子为如下(d1)或(d2)：

(d1)如序列表的序列5所示的DNA分子；

(d2)如序列表的序列3中第1480-1567位核苷酸所示的DNA分子。

示例性的，以上任一所述特异DNA分子为如下(e1)或(e2)或(e3)或(e4)：

(e1)如序列表的序列4中第51-3353位核苷酸所示的DNA分子；

(e2)如序列表的序列4所示的DNA分子；

(e3)如序列表的序列3中第51-3352位核苷酸所示的DNA分子；

(e4)如序列表的序列3所示的DNA分子。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Sval031，已于2020年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.19456。

为提高发酵法生产异丁胺的产量及转化率，实现异丁胺的工业化发酵生产，本发明的发明人选取大肠埃希氏菌Sval031为出发菌(该菌L-缬氨酸产量可达82g/L，转化率可达0.93mol_缬氨酸/mol_葡萄糖，几乎不产杂质)，将编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因(VlmD基因)整合至出发菌，并通过在染色体上调控基因表达强度的技术使用M1-93启动子提高缬氨酸脱羧酶的表达强度，得到了异丁胺高产菌株ISO-001。

异丁胺高产菌株ISO-001可在无机盐培养基中培养，并在厌氧发酵条件下将葡萄糖高效的转化为异丁胺，异丁胺产量可达52.7g/L，转化率可达0.92mol/mol。与异丁醇催化氨化法相比，菌株ISO-001可专一生产异丁胺，且具有如下优势：在原理上避免了二异丁胺以及三异丁胺杂质的产生；发酵过程在常温常压下进行，避免了高温高压的反应过程；并且，发酵法生产的异丁胺在生产成本上与化学法相比有着巨大的优势，具有非常强大的工业应用潜力。

为了进一步的提高异丁胺的生产效率，本发明的发明人使用RBS文库调控技术优化了VlmD基因的表达强度，获得了异丁胺生产效率更高的菌株ISO-I，异丁胺的产量进一步的提高了66.4g/L，扩大了发酵法生产异丁胺的技术优势。

附图说明

图1为重组大肠杆菌ISO-001的VlmD*Ⅰ基因簇(表达盒)的结构示意图。

图2为重组大肠杆菌的VlmD*Ⅱ基因簇(表达盒)的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明书，实施例中的DNA分子均为5’→3’方向。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。将序列表的序列2所示的DNA分子克隆至pUC57质粒，得到重组质粒，即为质粒pUC57-VlmD。序列表的序列1所示的蛋白质为来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶(VlmD蛋白)。序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质，为经过密码子优化后的L-缬氨酸脱羧酶基因(VlmD基因)。

pKD46质粒记载于如下文献：Datsenko,K.A.,and B.L.Wanner.2000.One-stepinactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci USA,97:6640-6645。

重组菌M1-93是《利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法》(专利号：ZL201110155176.0，授权公告号：CN102286517B)构建的大肠埃希氏菌信使RNA稳定区文库1(M-Lib1)中的重组菌株，其人工调控元件为启动子M1-93。

实施例1、底盘菌的选取

底盘菌的性能非常重要，L-缬氨酸是异丁胺的直接前体物，必须在一个高产L-缬氨酸的底盘菌上构建L-缬氨酸脱羧产异丁胺的途径才能获得一株高产异丁胺的菌株。

大肠埃希氏菌Sval031记载于申请号为202010466347.0的专利申请文件中。大肠埃希氏菌Sval031是生产L-缬氨酸的重组大肠杆菌，产量为82g/L，转化率达0.93mol_缬氨酸/mol_葡萄糖，几乎不产杂质，符合工业生产要求。本发明选择大肠埃希氏菌Sval031为出发菌。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Sval031，已于2020年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.19456。

实施例2、重组大肠杆菌ISO-001的构建

一、VlmD插入及组成型表达同源重组片段的扩增

1、以重组菌M1-93的基因组DNA为模板，采用VlmD*kana frt up和VlmD*kana frtdown组成的引物对进行PCR扩增，然后回收扩增产物，将得到的扩增产物命名为VlmD*1。扩增程序：先98℃预变性3分钟；然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。

VlmD*kana frt up：

GTAACTCCGGGTTGATTTATGCTCGGAAATATTTGTTGTTGAGTTTTTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；

VlmD*kana frt down：

CTCGCGCTGCTGGTACTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAACGTAC。

VlmD*1中，第1-50位核苷酸为一步法同源重组上游同源臂(cadB基因启动子上游50位)，第51-1479位核苷酸为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT区段，第1480-1567位核苷酸为M1-93启动子，第1568-1587位核苷酸为重叠延伸PCR同源臂(VlmD基因中第1至20位)。

2、以质粒pUC57-VlmD为模板，采用VlmD up和VlmD down组成的引物对进行PCR扩增，然后回收扩增产物，将得到的扩增产物命名为VlmD*2。扩增程序：先98℃预变性3分钟；然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸100秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。

VlmD up：ATGAGTACCAGCAGCGCGAG；

VlmD down：CTTATGAGCAAAAAAGGGAAGTGGCAAGCCACTTCCCTTGTACGAGCTAATTAGCTGCCGCCGCCAT。

VlmD*2中，第1-1785位核苷酸为VlmD基因(优化后基因序列)，第1786-1835位核苷酸为一步法同源重组下游同源臂(cadA基因下游50位)。

3、同时将VlmD*1和VlmD*2为模板，采用VlmD*kana frt up和VlmD down组成的引物对进行重叠延伸PCR，然后回收扩增产物，将得到的扩增产物命名为VlmD*Ⅰ。扩增程序：先98℃变性3分钟，然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸220秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。

经测序，VlmD*Ⅰ为3402bp的双链DNA分子，如序列表的序列3所示。

序列表的序列3中，第1-50位核苷酸为一步法同源重组上游同源臂，第51-1479位核苷酸为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT区段(第431-1225位核苷酸为卡那霉素抗性基因)，第1480-1567位核苷酸为M1-93启动子，第1568-3352位核苷酸为VlmD基因(优化后基因序列)，第3353-3402位核苷酸为一步法同源重组下游同源臂。

实际应用中，也可以直接人工合成VlmD*Ⅰ，即合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。

二、构建重组大肠杆菌ISO-001

通过Red同源重组技术将VlmD基因表达片段整合至大肠杆菌基因组。

1、将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至大肠埃希氏菌Sval031感受态细胞，得到具有pKD46质粒的Sval031感受态细胞。

2、将VlmD*Ⅰ电转至具有pKD46质粒的Sval031感受态细胞，然后去除pKD46质粒，得到重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌ISO-001。

(1)将50μL步骤1制备的感受态细胞置于冰上，加入50ng VlmD*Ⅰ，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv；电击后迅速将1mL LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，30℃、200rpm孵育2小时。

(2)取步骤(1)得到的菌液100μL，涂布于含50ng/ml卡那霉素的LB培养基平板上，39℃培养过夜，得到去除pKD46质粒的重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌ISO-001。

重组大肠杆菌ISO-001的VlmD*Ⅰ基因簇(表达盒)的结构示意图见图1，为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT——M1-93启动子——VlmD基因。

三、缬氨酸脱羧酶的酶活测定

供试菌株分别为：大肠埃希氏菌Sval031或重组大肠杆菌ISO-001。

1、在装液量为20mL的100mL三角瓶中培养供试菌株，37℃、220rpm、12小时，采用液体LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠)。

2、将完成步骤1的体系作为种子液，接种至装有50mL液体LB培养基的250mL三角瓶中(初始OD_550nm值为0.1)，37℃、220rpm培养6小时。

3、完成步骤2后，4℃、12000g离心20min，收集全部细胞沉淀，使用100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)清洗一次，然后用5mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)重悬。

4、取步骤3得到的细胞悬液，进行超声破碎，然后4℃、12000g离心30min，收集上清液，即为粗酶液。

5、检测步骤4得到的粗酶液的酶活以及缬氨酸脱羧酶含量(缬氨酸脱羧酶含量以粗酶液中的蛋白总量计，采用BradFord法检测蛋白量)，计算缬氨酸脱羧酶的比活力。

酶活测定体系(0.5mL)：粗酶液的含量为10μL，L-缬氨酸的浓度为10mM，磷酸吡哆醛的浓度为0.1mM，余量为100mM的磷酸盐缓冲液(pH6.0)。反应条件：37℃反应30min，然后100℃处理5min以终止反应。酶活定义：37℃条件下每分钟催化产生1μmol的异丁胺的酶量为1单位(U)。

大肠埃希氏菌Sval031制备的粗酶液中的缬氨酸脱羧酶的比活力为0.00U/mg。

重组大肠杆菌ISO-001制备的粗酶液中的缬氨酸脱羧酶的比活力为0.5U/mg。

实施例3、重组大肠杆菌ISO-001生产异丁胺硫酸盐

一、制备培养基

种子培养基和发酵培养基均由以下成分组成：

大量元素：葡萄糖、(NH₄)₂HPO₄、NH₄H₂PO₄、MgSO₄·7H₂O；

微量元素：FeCl₃·6H₂O、CoCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O、ZnCl₂、Na₂MoO₄·2H₂O、H₃BO₃和MnCl₂·4H₂O₂；

水。

种子培养基和发酵培养基可采用相同的培养基。

以上成分在培养基中的浓度可分别为：

大量元素：葡萄糖50g/L-150g/L或50g/L或100g/L或150g/L，NH₄H₂PO₄0.5g/L-5g/L或0.5g/L或1g/L或5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 1g/L-10g/L或1g/L或3g/L或10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L-5g/L或0.1g/L或1g/L或5g/L；

微量元素：FeCl₃·6H₂O 0.2μg/L-5μg/或0.2μg/L或1.5μg/L或5μg/L，CoCl₂·6H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，CuCl₂·2H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，ZnCl₂ 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.1μg/L或5μg/L，H₃BO₃ 0.01μg/L-1μg/L或0.01μg/L或0.1μg/L或1μg/L，MnCl₂·4H₂O 0.05μg/L-5μg/L或0.05μg/L或0.2μg/L或5μg/L；

本实施例下述实验中具体采用的培养基的组分具体如下：葡萄糖106g/L、NH₄H₂PO₄1g/L、(NH₄)₂HPO₄ 3g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、FeCl₃·6H₂O 1.5μg/L、CoCl₂·6H₂O 0.1μg/L、CuCl₂·2H₂O 0.1μg/L、ZnCl₂ 0.1μg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1μg/L、H₃BO₃ 0.1μg/L、MnCl₂·4H₂O 0.2μg/L，余量为水。pH值为7.0。该培养基既作为种子培养基，也作为发酵培养基。

1、发酵生产异丁胺硫酸盐

种子培养：250mL三角瓶中装有50mL培养基，115℃灭菌15min。冷却后接种重组大肠杆菌ISO-001，接种量为1％(V/V)，37℃、250rpm培养16小时，得到种子液。

发酵培养：发酵罐中装有3000mL培养基，接种种子液，完成接种的初始体系的OD₅₅₀nm值＝0.1；厌氧(即发酵过程不通气)、37℃、250rpm发酵培养。发酵培养过程中流加0.5mol/L硫酸铵水溶液，控制体系的游离胺含量在0.05-0.1g/L之间。发酵培养过程中流加中和剂(即25％的氨水)，控制体系pH为7。每隔24h取样，检测发酵体系中的组分含量。分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵体系中的组分进行HPLC分析，测定L-缬氨酸、异丁胺、葡萄糖和赖氨酸。HPLC分析中，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量。发酵体系中的葡萄糖、有机酸等浓度测定采用伯乐公司(Biorad)的Aminex HPX-87H有机酸分析柱。异丁胺的检测分为衍生化和检测两部分：1)衍生化反应：0.8mL样品(<0.25g/L)+0.24mL碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5，现配)+0.8mL丹磺酰氯溶液(5g/L，溶于丙酮，-20℃冰箱保存)，混匀1min，避光60℃反应15min，加入0.1mL氨水终止反应，室温下静置30min，最后用乙腈定容到4mL，过滤后上机测试。2)液相检测：C18色谱柱，流动相由水和乙腈组成，其中水和乙腈的体积比为25:75，254nm检测。

产量计算：由于发酵过程中添加了大量的硫酸铵溶液，导致发酵体积变大，发酵液被稀释，故此计算产量时将发酵体积折算回原始发酵体积，按照公式(1)计算：

产量＝实测产量×(发酵体系终体积/发酵体系初始体积)(1)

重组大肠杆菌ISO-001厌氧发酵48h，发酵体系中的异丁胺含量为0.72mol/L，相当于52.7g/L，转化率0.92mol/mol，为理论最大转化率的92％，具有较大的经济价值。

实施例4、产异丁胺的重组大肠杆菌的构建

L-缬氨酸的脱羧效率与异丁胺的生产速率直接相关。因此，为了进一步的提高异丁胺的产量，需要对VlmD的表达强度进行更进一步的精确调控，从而进一步的提高异丁胺的生产效率。为了进一步的提高VlmD基因的最优表达强度，准备对VlmD基因启动子的RBS区进一步调控。对RBS区的调控方法可见《利用人工调控元件及其文库调控微生物染色体上基因表达强度的方法》(专利号：ZL201110155176.0，授权公告号：CN102286517B)。

一、VlmD插入及文库调控同源重组片段的扩增

1、以重组菌M1-93的基因组DNA为模板，采用VlmD*kana frt up和VlmD*kana frtRBSL down组成的引物对进行PCR扩增，然后回收扩增产物，将得到的扩增产物命名为VlmD*RBSL。扩增程序：先98℃预变性3分钟；然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸90秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。

VlmD*kana frt up：

GTAACTCCGGGTTGATTTATGCTCGGAAATATTTGTTGTTGAGTTTTTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；

VlmD*kana frt RBSL down：

CTCGCGCTGCTGGTACTCATNNNNNNRCTCCTGGTTTAAACGTACATGCTAA。

N代表A/T/C/G，R代表A/G。

VlmD*RBSL中，第1-50位核苷酸为一步法同源重组上游同源臂(cadB基因启动子上游50位)，第51-1479位核苷酸为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT区段，第1480-1568位核苷酸为M1-93启动子RBSL文库，第1569-1588位核苷酸为重叠延伸PCR同源臂(VlmD基因中第1至20位)。

2、同实施例2的步骤一的2。

3、同时将VlmD*RBSL和VlmD*2为模板，采用VlmD*kana frt up和VlmD down组成的引物对进行重叠延伸PCR，然后回收扩增产物，将得到的扩增产物命名为VlmD*Ⅱ。扩增程序：先98℃变性3分钟，然后98℃变性10秒，55℃复性30秒，72℃延伸220秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。

经测序，VlmD*Ⅱ为3403bp的双链DNA分子，如序列表的序列4所示。

序列表的序列4中，第1-50位核苷酸为一步法同源重组上游同源臂，第51-1479位核苷酸为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT区段，第1480-1568位核苷酸为M1-93启动子RBSL文库，第1569-3353位核苷酸为VlmD基因(优化后基因序列)，第3354-3403位核苷酸为一步法同源重组下游同源臂。

实际应用中，也可以直接人工合成VlmD*Ⅱ。

二、构建VlmD表达文库

通过Red同源重组技术将VlmD文库调控片段整合至大肠杆菌基因组。

1、将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至大肠埃希氏菌Sval031感受态细胞，得到具有pKD46质粒的Sval031感受态细胞。

2、将VlmD*Ⅱ电转至具有pKD46质粒的Sval031感受态细胞，然后去除pKD46质粒，得到重组大肠杆菌。

(1)将50μL步骤1制备的感受态细胞置于冰上，加入50ng VlmD*Ⅱ，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯；使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv；电击后迅速将1mL LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，30℃、200rpm孵育2小时。

(2)取步骤(1)得到的菌液100μL，涂布于含50ng/ml卡那霉素的LB培养基平板上，39℃培养过夜，得到去除pKD46质粒的重组大肠杆菌，挑取10个克隆，分别命名为重组大肠杆菌ISO-A、ISO-B、ISO-C、ISO-D、ISO-E、ISO-F、ISO-G、ISO-H、ISO-I、ISO-J。

重组大肠杆菌的VlmD*Ⅱ基因簇(表达盒)的结构示意图见图2，为FRT-卡那霉素抗性基因-FRT——M1-93启动子RBSL文库——VlmD基因。

三、缬氨酸脱羧酶的酶活测定

供试菌株分别为：重组大肠杆菌ISO-A、ISO-B、ISO-C、ISO-D、ISO-E、ISO-F、ISO-G、ISO-H、ISO-I、ISO-J，重组大肠杆菌ISO-001。

检测方法同实施例2的步骤三。

结果见表1。

四、生产异丁胺硫酸盐

方法同实施例3，结果见表1。

表1 L-缬氨酸脱羧酶酶活和异丁胺发酵产量

菌株	缬氨酸脱羧酶酶活(U/mg)	异丁胺产量(mol/L)
			ISO-01	0.5	0.72
ISO-A	0.31	0.56
			ISO-B	0.42	0.66
ISO-C	0.19	0.22
			ISO-D	0.54	0.68
ISO-E	0.43	0.51
			ISO-F	0.16	0.20
ISO-G	0.33	0.14
			ISO-H	0.23	0.16
ISO-I	1.01	0.91
			ISO-J	0.23	0.31

五、根据表1的结果，重组大肠杆菌ISO-I具有更高的异丁胺盐产量，异丁胺的生产效率有了进一步的提高，进一步的降低了生产成本，减少了碳损失，也使得工艺流程更加环保。经测序，重组大肠杆菌ISO-I中，用于启动VlmD基因表达的的启动子如序列表的序列5所示。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株生产异丁胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<130> GNCYX202926

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> PRT

<213> Streptomyces viridifaciens

<400> 1

Met Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Gly Pro Asp Leu Pro Phe Gly Pro

1 5 10 15

Glu Asp Thr Pro Trp Gln Lys Ala Phe Ser Arg Leu Arg Ala Val Asp

20 25 30

Gly Val Pro Arg Val Thr Ala Pro Ser Ser Asp Pro Arg Glu Val Tyr

35 40 45

Met Asp Ile Pro Glu Ile Pro Phe Ser Lys Val Gln Ile Pro Pro Asp

50 55 60

Gly Met Asp Glu Gln Gln Tyr Ala Glu Ala Glu Ser Leu Phe Arg Arg

65 70 75 80

Tyr Val Asp Ala Gln Thr Arg Asn Phe Ala Gly Tyr Gln Val Thr Ser

85 90 95

Asp Leu Asp Tyr Gln His Leu Ser His Tyr Leu Asn Arg His Leu Asn

100 105 110

Asn Val Gly Asp Pro Tyr Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Leu Asn Ser Lys

115 120 125

Val Leu Glu Arg Ala Val Leu Asp Tyr Phe Ala Ser Leu Trp Asn Ala

130 135 140

Lys Trp Pro His Asp Ala Ser Asp Pro Glu Thr Tyr Trp Gly Tyr Val

145 150 155 160

Leu Thr Met Gly Ser Ser Glu Gly Asn Leu Tyr Gly Leu Trp Asn Ala

165 170 175

Arg Asp Tyr Leu Ser Gly Lys Leu Leu Arg Arg Gln His Arg Glu Ala

180 185 190

Gly Gly Asp Lys Ala Ser Val Val Tyr Thr Gln Ala Leu Arg His Glu

195 200 205

Gly Gln Ser Pro His Ala Tyr Glu Pro Val Ala Phe Phe Ser Gln Asp

210 215 220

Thr His Tyr Ser Leu Thr Lys Ala Val Arg Val Leu Gly Ile Asp Thr

225 230 235 240

Phe His Ser Ile Gly Ser Ser Arg Tyr Pro Asp Glu Asn Pro Leu Gly

245 250 255

Pro Gly Thr Pro Trp Pro Thr Glu Val Pro Ser Val Asp Gly Ala Ile

260 265 270

Asp Val Asp Lys Leu Ala Ser Leu Val Arg Phe Phe Ala Ser Lys Gly

275 280 285

Tyr Pro Ile Leu Val Ser Leu Asn Tyr Gly Ser Thr Phe Lys Gly Ala

290 295 300

Tyr Asp Asp Val Pro Ala Val Ala Gln Ala Val Arg Asp Ile Cys Thr

305 310 315 320

Glu Tyr Gly Leu Asp Arg Arg Arg Val Tyr His Asp Arg Ser Lys Asp

325 330 335

Ser Asp Phe Asp Glu Arg Ser Gly Phe Trp Ile His Ile Asp Ala Ala

340 345 350

Leu Gly Ala Gly Tyr Ala Pro Tyr Leu Gln Met Ala Arg Asp Ala Gly

355 360 365

Met Val Glu Glu Ala Pro Pro Val Phe Asp Phe Arg Leu Pro Glu Val

370 375 380

His Ser Leu Thr Met Ser Gly His Lys Trp Met Gly Thr Pro Trp Ala

385 390 395 400

Cys Gly Val Tyr Met Thr Arg Thr Gly Leu Gln Met Thr Pro Pro Lys

405 410 415

Ser Ser Glu Tyr Ile Gly Ala Ala Asp Thr Thr Phe Ala Gly Ser Arg

420 425 430

Asn Gly Phe Ser Ser Leu Leu Leu Trp Asp Tyr Leu Ser Arg His Ser

435 440 445

Tyr Asp Asp Leu Val Arg Leu Ala Ala Asp Cys Asp Arg Leu Ala Gly

450 455 460

Tyr Ala His Asp Arg Leu Leu Thr Leu Gln Asp Lys Leu Gly Met Asp

465 470 475 480

Leu Trp Val Ala Arg Ser Pro Gln Ser Leu Thr Val Arg Phe Arg Gln

485 490 495

Pro Cys Ala Asp Ile Val Arg Lys Tyr Ser Leu Ser Cys Glu Thr Val

500 505 510

Tyr Glu Asp Asn Glu Gln Arg Thr Tyr Val His Leu Tyr Ala Val Pro

515 520 525

His Leu Thr Arg Glu Leu Val Asp Glu Leu Val Arg Asp Leu Arg Gln

530 535 540

Pro Gly Ala Phe Thr Asn Ala Gly Ala Leu Glu Gly Glu Ala Trp Ala

545 550 555 560

Gly Val Ile Asp Ala Leu Gly Arg Pro Asp Pro Asp Gly Thr Tyr Ala

565 570 575

Gly Ala Leu Ser Ala Pro Ala Ser Gly Pro Arg Ser Glu Asp Gly Gly

580 585 590

Gly Ser

<210> 2

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagtacca gcagcgcgag tagtggccca gatctgccat tcggtccaga agatacgcca 60

tggcagaaag cgttcagtcg tctccgcgcc gttgatggtg tgccgcgtgt tacggcgcca 120

agcagtgatc cacgcgaagt gtacatggac atcccggaaa tcccgttcag caaggtgcaa 180

attccgccag atggcatgga tgagcagcag tacgcggaag cggagagtct gttccgccgc 240

tacgtggacg cccagacccg taactttgcc ggttatcaag ttaccagcga tctggattac 300

cagcatctca gccattacct caaccgccat ctgaacaacg tgggtgaccc atacgagagt 360

agcagctaca cgctgaacag caaagtgctc gaacgtgcgg tgctggatta tttcgcgagt 420

ctgtggaacg cgaaatggcc acacgatgcc agcgacccgg aaacgtactg gggctatgtt 480

ctcaccatgg gcagcagcga aggtaatctg tatggtctgt ggaatgcgcg cgattatctc 540

agcggcaaac tgctgcgccg tcagcatcgt gaagccggtg gcgataaggc gagcgttgtg 600

tatacccaag cgctgcgtca cgaaggtcag agcccacatg cgtacgagcc ggttgcgttc 660

tttagccaag atacccacta cagtctgacg aaagcggtgc gtgttctcgg catcgatacg 720

ttccacagca tcggtagcag ccgctaccca gacgaaaacc cactgggtcc gggcacccca 780

tggccaacgg aagtgccaag tgtggacggt gccatcgacg tggataaact ggccagtctg 840

gttcgcttct tcgccagcaa aggctatccg attctggtga gtctgaacta cggcagcacg 900

ttcaaaggtg cctacgatga cgttccggcg gttgcgcaag ccgttcgcga tatctgtacg 960

gaatacggtc tggatcgccg ccgcgtgtat cacgaccgca gcaaggacag tgactttgat 1020

gagcgcagcg gtttctggat ccacatcgat gccgcgctgg gtgccggtta tgcgccatat 1080

ctgcagatgg cgcgtgacgc gggcatggtt gaagaagccc cgccagtttt cgatttccgt 1140

ctgccggagg ttcacagcct caccatgagc ggccataagt ggatgggtac gccatgggcg 1200

tgcggtgttt atatgacccg cacgggtctg cagatgaccc caccgaaaag cagtgagtac 1260

atcggcgcgg ccgataccac ctttgcgggt agccgcaacg gctttagcag tctgctgctg 1320

tgggactacc tcagccgtca cagttacgat gatctggtgc gtctcgccgc cgattgtgat 1380

cgcctcgccg gctatgcgca tgatcgtctg ctgacgctgc aagataagct gggcatggat 1440

ctgtgggtgg cccgcagtcc acagagtctg accgtgcgct ttcgccagcc atgtgccgac 1500

attgtgcgca agtatagtct gagctgcgaa acggtgtatg aggacaatga gcagcgcacc 1560

tacgtgcatc tgtacgcggt tccgcatctg acccgcgaac tggttgatga actggtgcgt 1620

gatctgcgtc agccgggcgc gttcaccaat gcgggtgcgc tggaaggtga agcgtgggcc 1680

ggcgttattg acgcgctggg tcgcccggat ccagacggta cgtatgcggg tgcgctgagt 1740

gcgccagcca gtggcccgcg tagtgaagat ggcggcggca gctaa 1785

<210> 3

<211> 3402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaactccgg gttgatttat gctcggaaat atttgttgtt gagtttttgt gtgtaggctg 60

gagctgcttc aagatcccct cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag 120

gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag 180

ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 240

tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 300

gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 360

cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 420

atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 480

gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 540

ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 600

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 660

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 720

gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 780

tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 840

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 900

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 960

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1020

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1080

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1140

tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1200

tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg 1260

acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 1320

ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 1380

gagttcttcg cccaccccag cttcaaaagc gctctgaagt tcctatactt tctagagaat 1440

aggaacttcg gaataggaac taaggaggat attcatatgt tatctctggc ggtgttgaca 1500

agagataaca acgttgatat aattgagccc gtattgttag catgtacgtt taaaccagga 1560

aacagctatg agtaccagca gcgcgagtag tggcccagat ctgccattcg gtccagaaga 1620

tacgccatgg cagaaagcgt tcagtcgtct ccgcgccgtt gatggtgtgc cgcgtgttac 1680

ggcgccaagc agtgatccac gcgaagtgta catggacatc ccggaaatcc cgttcagcaa 1740

ggtgcaaatt ccgccagatg gcatggatga gcagcagtac gcggaagcgg agagtctgtt 1800

ccgccgctac gtggacgccc agacccgtaa ctttgccggt tatcaagtta ccagcgatct 1860

ggattaccag catctcagcc attacctcaa ccgccatctg aacaacgtgg gtgacccata 1920

cgagagtagc agctacacgc tgaacagcaa agtgctcgaa cgtgcggtgc tggattattt 1980

cgcgagtctg tggaacgcga aatggccaca cgatgccagc gacccggaaa cgtactgggg 2040

ctatgttctc accatgggca gcagcgaagg taatctgtat ggtctgtgga atgcgcgcga 2100

ttatctcagc ggcaaactgc tgcgccgtca gcatcgtgaa gccggtggcg ataaggcgag 2160

cgttgtgtat acccaagcgc tgcgtcacga aggtcagagc ccacatgcgt acgagccggt 2220

tgcgttcttt agccaagata cccactacag tctgacgaaa gcggtgcgtg ttctcggcat 2280

cgatacgttc cacagcatcg gtagcagccg ctacccagac gaaaacccac tgggtccggg 2340

caccccatgg ccaacggaag tgccaagtgt ggacggtgcc atcgacgtgg ataaactggc 2400

cagtctggtt cgcttcttcg ccagcaaagg ctatccgatt ctggtgagtc tgaactacgg 2460

cagcacgttc aaaggtgcct acgatgacgt tccggcggtt gcgcaagccg ttcgcgatat 2520

ctgtacggaa tacggtctgg atcgccgccg cgtgtatcac gaccgcagca aggacagtga 2580

ctttgatgag cgcagcggtt tctggatcca catcgatgcc gcgctgggtg ccggttatgc 2640

gccatatctg cagatggcgc gtgacgcggg catggttgaa gaagccccgc cagttttcga 2700

tttccgtctg ccggaggttc acagcctcac catgagcggc cataagtgga tgggtacgcc 2760

atgggcgtgc ggtgtttata tgacccgcac gggtctgcag atgaccccac cgaaaagcag 2820

tgagtacatc ggcgcggccg ataccacctt tgcgggtagc cgcaacggct ttagcagtct 2880

gctgctgtgg gactacctca gccgtcacag ttacgatgat ctggtgcgtc tcgccgccga 2940

ttgtgatcgc ctcgccggct atgcgcatga tcgtctgctg acgctgcaag ataagctggg 3000

catggatctg tgggtggccc gcagtccaca gagtctgacc gtgcgctttc gccagccatg 3060

tgccgacatt gtgcgcaagt atagtctgag ctgcgaaacg gtgtatgagg acaatgagca 3120

gcgcacctac gtgcatctgt acgcggttcc gcatctgacc cgcgaactgg ttgatgaact 3180

ggtgcgtgat ctgcgtcagc cgggcgcgtt caccaatgcg ggtgcgctgg aaggtgaagc 3240

gtgggccggc gttattgacg cgctgggtcg cccggatcca gacggtacgt atgcgggtgc 3300

gctgagtgcg ccagccagtg gcccgcgtag tgaagatggc ggcggcagct aattagctcg 3360

tacaagggaa gtggcttgcc acttcccttt tttgctcata ag 3402

<210> 4

<211> 3403

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaactccgg gttgatttat gctcggaaat atttgttgtt gagtttttgt gtgtaggctg 60

gagctgcttc aagatcccct cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag 120

gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag 180

ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag 240

tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 300

gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt 360

cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 420

atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 480

gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 540

ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 600

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 660

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt 720

gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 780

tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 840

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 900

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 960

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 1020

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 1080

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 1140

tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 1200

tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg 1260

acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 1320

ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 1380

gagttcttcg cccaccccag cttcaaaagc gctctgaagt tcctatactt tctagagaat 1440

aggaacttcg gaataggaac taaggaggat attcatatgt tatctctggc ggtgttgaca 1500

agagataaca acgttgatat aattgagccc gtattgttag catgtacgtt taaaccagga 1560

gynnnnnnat gagtaccagc agcgcgagta gtggcccaga tctgccattc ggtccagaag 1620

atacgccatg gcagaaagcg ttcagtcgtc tccgcgccgt tgatggtgtg ccgcgtgtta 1680

cggcgccaag cagtgatcca cgcgaagtgt acatggacat cccggaaatc ccgttcagca 1740

aggtgcaaat tccgccagat ggcatggatg agcagcagta cgcggaagcg gagagtctgt 1800

tccgccgcta cgtggacgcc cagacccgta actttgccgg ttatcaagtt accagcgatc 1860

tggattacca gcatctcagc cattacctca accgccatct gaacaacgtg ggtgacccat 1920

acgagagtag cagctacacg ctgaacagca aagtgctcga acgtgcggtg ctggattatt 1980

tcgcgagtct gtggaacgcg aaatggccac acgatgccag cgacccggaa acgtactggg 2040

gctatgttct caccatgggc agcagcgaag gtaatctgta tggtctgtgg aatgcgcgcg 2100

attatctcag cggcaaactg ctgcgccgtc agcatcgtga agccggtggc gataaggcga 2160

gcgttgtgta tacccaagcg ctgcgtcacg aaggtcagag cccacatgcg tacgagccgg 2220

ttgcgttctt tagccaagat acccactaca gtctgacgaa agcggtgcgt gttctcggca 2280

tcgatacgtt ccacagcatc ggtagcagcc gctacccaga cgaaaaccca ctgggtccgg 2340

gcaccccatg gccaacggaa gtgccaagtg tggacggtgc catcgacgtg gataaactgg 2400

ccagtctggt tcgcttcttc gccagcaaag gctatccgat tctggtgagt ctgaactacg 2460

gcagcacgtt caaaggtgcc tacgatgacg ttccggcggt tgcgcaagcc gttcgcgata 2520

tctgtacgga atacggtctg gatcgccgcc gcgtgtatca cgaccgcagc aaggacagtg 2580

actttgatga gcgcagcggt ttctggatcc acatcgatgc cgcgctgggt gccggttatg 2640

cgccatatct gcagatggcg cgtgacgcgg gcatggttga agaagccccg ccagttttcg 2700

atttccgtct gccggaggtt cacagcctca ccatgagcgg ccataagtgg atgggtacgc 2760

catgggcgtg cggtgtttat atgacccgca cgggtctgca gatgacccca ccgaaaagca 2820

gtgagtacat cggcgcggcc gataccacct ttgcgggtag ccgcaacggc tttagcagtc 2880

tgctgctgtg ggactacctc agccgtcaca gttacgatga tctggtgcgt ctcgccgccg 2940

attgtgatcg cctcgccggc tatgcgcatg atcgtctgct gacgctgcaa gataagctgg 3000

gcatggatct gtgggtggcc cgcagtccac agagtctgac cgtgcgcttt cgccagccat 3060

gtgccgacat tgtgcgcaag tatagtctga gctgcgaaac ggtgtatgag gacaatgagc 3120

agcgcaccta cgtgcatctg tacgcggttc cgcatctgac ccgcgaactg gttgatgaac 3180

tggtgcgtga tctgcgtcag ccgggcgcgt tcaccaatgc gggtgcgctg gaaggtgaag 3240

cgtgggccgg cgttattgac gcgctgggtc gcccggatcc agacggtacg tatgcgggtg 3300

cgctgagtgc gccagccagt ggcccgcgta gtgaagatgg cggcggcagc taattagctc 3360

gtacaaggga agtggcttgc cacttccctt ttttgctcat aag 3403

<210> 5

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cctagccgta 60

aattataggt ttaaaccagg agtacgtag 89

Claims (5)

1.重组大肠杆菌在生产异丁胺中的应用；

所述重组大肠杆菌是在出发菌中过表达编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因得到的重组菌；所述出发菌为大肠埃希氏菌Sval031，其保藏登记号为CGMCC No.19456；

所述应用中，通过发酵所述重组大肠杆菌生产异丁胺；

所述发酵的条件如下：接种所述重组大肠杆菌至培养基，完成接种的初始体系的OD₅₅₀nm值＝0.08-0.12；厌氧、35-40℃、200-300rpm发酵培养。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶为如序列表的序列1所示的蛋白质。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因为编码区如序列表的序列2所示的DNA分子。

4.如权利要求1至3中任一所述的应用，其特征在于：所述重组大肠杆菌是在所述出发菌中导入特异DNA分子得到的重组菌；所述特异DNA分子中具有编码来源于Streptomyces viridifaciens的L-缬氨酸脱羧酶的基因。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述特异DNA分子通过同源重组整合至出发菌的基因组。

Images