KR100806991B1 - 신규 니트릴 히드라타아제 - Google Patents

신규 니트릴 히드라타아제 Download PDF

Info

Publication number
KR100806991B1
KR100806991B1 KR1020057023755A KR20057023755A KR100806991B1 KR 100806991 B1 KR100806991 B1 KR 100806991B1 KR 1020057023755 A KR1020057023755 A KR 1020057023755A KR 20057023755 A KR20057023755 A KR 20057023755A KR 100806991 B1 KR100806991 B1 KR 100806991B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
protein
seq
subunit
activity
Prior art date
Application number
KR1020057023755A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060016115A (ko
Inventor
가오루 후루야
아끼라 다마끼
신이찌로 나가사와
아야노 스즈끼
Original Assignee
아사히 가세이 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아사히 가세이 가부시키가이샤 filed Critical 아사히 가세이 가부시키가이샤
Publication of KR20060016115A publication Critical patent/KR20060016115A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100806991B1 publication Critical patent/KR100806991B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명의 목적은 열 안정성에 부가해서, 또한 기질인 니트릴 화합물이나 생성물인 아미드 화합물의 고농도 존재하에서도 높은 활성을 유지하는 니트릴 히드라타아제를 이용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서는 자연계에서 목적하는 니트릴 히드라타아제를 발현하는 신규 미생물을 탐색하여, 상기 미생물 균체 및 그 균체 처리물을 제조에 이용하는 동시에, 상기 유전자를 클로닝하여 이종 미생물로 발현하는 재조합 미생물을 제작했다. 본 발명에 의하면 고온 조건 하, 및 고농도의 니트릴 화합물 또는 고농도의 아미드 화합물의 존재하의 반응에서도 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 효율적으로 변환시키는 것이 가능해진다.
열 안정성, 미생물 균체, 균체 처리물, 재조합 미생물, 염기 서열, 형질전환, 니트릴 히드라타아제, 니트릴 화합물, 아미드 화합물

Description

신규 니트릴 히드라타아제{NOVEL NITRILE HYDRATASE}
본 발명은 자연계에서 새롭게 단리한 미생물로부터 유래된 신규 니트릴 히드라타아제의 효소 촉매 작용에 의해 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하는 기술에 관한 것이다.
니트릴 화합물의 니트릴기를 수화하여 아미드기로 변환해서 대응하는 아미드 화합물을 제조하는 기술에 있어서는 종래의 구리촉매에 의한 화학적인 방법 대신에 미생물의 효소를 촉매로서 이용할 방법이 주류를 이루어가고 있다. 그러한 효소는 일반적으로 니트릴 히드라타아제라고 불리는데, 최초의 보고 이래, 다수의 효소가 여러 가지 미생물로부터 발견되고 있다. 예를 들면 아르스로박터(Arthrobacter)속(Agricultural and Biological Chemistry Vol.44 p.2251－2252, 1980) 아그로박테리움(Agrobacterium)속(일본 특허공개 평05－103681), 아시네토박터(Acinetobacter)속(일본 특허공개 소61－282089), 에어로모나스(Aeromonas)속(일본 특허공개 평05－030983), 엔테로박터(Enterobacter)속(일본 특허공개 평05－236975), 에르위니아(Erwinia)속(일본 특허공개 평05－161496), 크산토박터(Xanthobacter)속(일본 특허공개 평05－161495), 클레브시엘라(Klebsiella)속(일본 특허공개 평05－030982), 코리네박테리움(Corynebacterium)속(일본 특허공개 소 54－129190, 후에 로도코커스속으로 판명), 슈도모나스(Pseudomonas)속(일본 특허공개 소58－86093), 시트로박터(Citrobacter)속(일본 특허공개 평05－030984), 스트렙토마이세스(Streptomyces)속(일본 특허공개 평05－236976), 바실루스(Bacillus)속(일본 특허공개 소51－86186, 일본 특허공개 평7－255494), 푸자리움속(일본 특허공개 평01－086889), 로도코커스(Rhodococcus)속(일본 특허공개 소63－137688, 일본 특허공개 평02－227069, 일본 특허공개 2002－369697, 일본 특허공개 평2－470), 리조비움(Rhizobium)속(일본 특허공개 평05－236977), 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속(일본 특허공개 평8－56684) 등을 들 수 있다. 이들 효소는 그 아미노산 서열의 다양성에 근거하여 그 이화학적 성질도 다양하고, 각종 목적에 따라 연구가 진행되어 왔다. 이화학적 성질 중에서도 열, 또는 아미드 화합물 및 니트릴 화합물 등에의 안정성에 관한 해명이 진행되고 있는 예로서는 로도코커스·로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1주에 관한 문헌(European Journal of Biochemistry Vol.196 p.581－589, 1991. Applied and Microbiology Biotechnology Vol.40 p.189－195, 1993.), 슈도노카르디아·서모필라(Pseudonocardia　thermophila) JCM3095주에 관한 문헌(일본 특허공개 평8－187092, Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.83 p.474－477, 1997), 바실루스(Bacillus)속 BR449주에 관한 문헌(WO99/55719. Applied Biochemistry and Biotechnology Vol.77－79 p.671－679, 1999.), 바실루스(Bacillus)속 RAPc8주에 관한 문헌(Enzyme and Microbial Technology Vol.26 p.368－373, 2000. Extremophiles Vol.2 p.347－357, 1998), 바실루스·팔리다스(Bacillus palidus) Dac521주에 관한 문헌(Biochimica et Biophysica Acta Vol.1431 p.249－260, 1999), 바실루스·스미시(Bacillus　smithii) SC－J05－1주에 관한 문헌(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Vol.20 220－226, 1998)을 들 수 있다.
한편, 이들 독특한 니트릴 히드라타아제를 이용해서 니트릴 화합물로 아미드 화합물을 공업적으로 제조할 때에는 아미드 화합물의 제조 비용에서 차지하는 상기 효소의 제조 비용이 중요한 문제이며, 이미 공업 수준으로 배양법을 확립한 숙주를 이용해서 생산을 하는 것이 바람직하다. 그래서, 유전자 공학의 수법에 의해 니트릴 히드라타아제를 대량으로 발현시키는 것을 목적으로, 유전자를 클로닝하는 시도가 검토되고 있다. 예를 들면 슈도모나스속(일본 특허공개 평3－251184), 로도코커스속(일본 특허공개 평2－119778, 일본 특허공개 평4－211379, 일본 특허공개 평09－00973, 일본 특허공개 평07－099980, 일본 특허공개 2001－069978), 리조비움속(일본 특허공개 평6－25296), 클레브시엘라속(일본 특허공개 평6－303971), 아크로모박터속(일본 특허공개 평08－266277), 슈도노카르디아속(일본 특허공개 평9－275978), 바실루스속(일본 특허공개 평09－248188) 등을 들 수 있다.
효소의 이화학적 성질로서는 열 안정성이나 기질인 니트릴 화합물이나 생성물인 아미드 화합물의 고농도 존재하에서도 높은 활성을 유지하는 니트릴 히드라타아제가 바람직하고, 그 목적도 보고되어 있는데, 반응에 이용하는 효소의 실시 형태, 니트릴 화합물의 종류에 따라 그들의 절대치가 변동되는 수도 있어, 모든 것을 겸비한 효소는 발견되지 않았다. 또 향후의 진화 공학 등을 이용한 이화학적 성질의 개량의 소재로서도 지금까지 기원이 없으며 다양한 효소의 개발이 요망된다.
진화 공학을 이용한 이화학적 성질의 개량에 유전자의 클로닝과 발현이 필요한 것은 말할 필요도 없고, 전술한 아미드 화합물 제조에 있어서의 효소의 생산과 관계되는 비용적인 제약으로부터도 배양법이 확립된 숙주를 이용한 유전자 재조합균의 제작이 요망된다.
즉, 본 발명의 목적은 열이나 고농도 화합물에 대한 안정성이 높은 니트릴 히드라타아제를 자연계에서 단리하고, 상기 효소의 생산 방법 및 상기 효소를 이용한 니트릴 화합물로부터의 대응하는 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한 그 효소의 아미노산 서열 및 유전자 서열을 제공하고, 상기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환 균주, 상기 형질전환 균주를 이용한 상기 효소의 생산 방법 및 상기 형질전환 균주를 이용한 니트릴 화합물로부터의 대응하는 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또 상기 재조합체의 니트릴 히드라타아제 효소를 보다 활성화하는 작용을 가지는 단백질의 아미노산 서열 및 유전자 서열도 제공한다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 사이타마현의 온천 근방에 있는 토양에서 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 미생물로서 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)를 발견했다. 또한 지오바실루스속의 미생물이 니트릴 히드라타아제를 가지고, 니트릴 히드라타아제 활성을 나타내는 것은 지금까지 알려져 있지 않고, 또한 본 미생물의 배양에 통상 이용하는 65℃라고 하는 온도는 종래의 니트릴 히드라타아제를 가지는 호열균의 통상의 배양 온도(45℃ 내지 60℃)를 넘는 것이다.
또 상기 미생물로부터 니트릴 히드라타아제 효소를 정제하고, 그 니트릴 히드라타아제 활성이 열이나 고농도의 니트릴 화합물 및 아미드 화합물에 대해서 높은 안정성을 겸비하는 것을 나타냈다. 또 정제한 효소의 각 서브유닛의 N말단의 아미노산 서열을 기초로 상기 미생물의 염색체 DNA로부터 니트릴 히드라타아제 유전자를 단리하고, 그 아미노산 서열 및 유전자 서열을 처음으로 분명히 한 결과, 기지의 니트릴 히드라타아제와의 상동성은 매우 낮은 것이 판명되었다. 또 그 유전자 하류에 존재하는 활성화 단백질로 추정되는 유전자 서열을 동시에 발현함으로써 상기 효소를 대량으로 발현하는 유전자 재조합 균주를 작출하는 것에도 성공하여 본 발명을 달성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하를 제공하는 것이다.
(1) 하기의 이화학적 성질을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가진다.
(b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타낸다.
(c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.
서브유닛 α　분자량　　　　 25000±2000
서브유닛 β　분자량　　　 　28000±2000
(d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존한다.
(e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않는다.
(f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가진다.
(2) 하기의 (A) 또는 (B) 중 어느 하나의 DNA.
(A) 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 α서브유닛 유전자를 함유하는 염기 서열과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 β서브유닛 유전자를 함유하는 염기 서열의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
(B) 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 함유하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 함유하는 β서브유닛 중 어느 한쪽, 또는 양쪽 각각에 있어서, 하나 또는 복수 개의 아미노산에 치환, 결손, 부가, 번역 후 수식이 되어 있고, 그 개변되거나 개변되지 않은 α서브유닛과, 개변되거나 개변되지 않은 β서브유닛을 함유하고, 또 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA.
(3) 하기의 (C) 또는 (D) 중 어느 하나의 DNA.
(C) 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위의 서열을 포함하는 DNA와, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위의 서열을 포함하는 DNA의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
(D) 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위의 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화한 DNA 중 어느 하나의 DNA가 코딩하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위의 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화한 DNA 중 어느 하나의 DNA가 코딩하는 β서브유닛을 함유하고, 또 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA. 단, 상기 (C)가 되는 경우는 제외한다.
(4) 서열 목록의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 아미노산 서열 중의 하나 또는 복수 개의 아미노산에 치환, 결손, 부가, 번역 후 수식이 되어 있고, 또한 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 것을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 DNA 중 어느 하나의 DNA가 추가로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항 기재의 DNA.
(5) 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1325－1663위의 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화하고 또한 니트릴 히드라타아제 활성화에 관여하는 것을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 DNA 중 어느 하나의 DNA가 추가로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항 기재의 DNA.
(6) 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 니트릴 히드라타아제의 α서브유닛 유전자를 함유하는 DNA.
(7) 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 니트릴 히드라타아제의 β서브유닛 유전자를 함유하는 DNA.
(8) 서열 목록의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 것을 특징으로 하는 유전자를 함유하는 DNA.
(9) 상기 DNA가 지오바실루스(Geobacillus)속 유래인 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항 기재의 DNA.
(10) 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)종 유래인 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항 기재의 DNA.
(11) 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)　Q－6주(FERM　BP－08658) 유래인 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항 기재의 DNA.
(12)　(1) 내지 (11) 중 어느 한 항 기재의 DNA를 조립한 재조합 벡터.
(13)　(1) 내지 (11) 중 어느 한 항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물, 또는 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)　Q－6주(FERM　BP－08658) 및 그 변이체 중 어느 하나의 미생물.
(14)　(1) 내지 (11) 중 어느 한 항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
(15) 지오바실루스속에 속하고 하기의 이화학적 성질을 가지는 단백질을 생산할 수 있는 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
(a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가진다.
(b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타낸다.
(c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.
서브유닛 α　분자량　　　　25000±2000
서브유닛 β　분자량　　　　28000±2000
　(d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존한다.
　(e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않는다.
　(f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가진다.
(16)　(14) 또는 (15)에 기재된 것 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해 배양된 미생물로부터 취득된, 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물.
(17) 하기의 이화학적 성질을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
　(a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가진다.
　(b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타낸다.
　(c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.
서브유닛 α　분자량　　　　25000±2000
서브유닛 β　분자량　　　　28000±2000
　(d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존한다.
　(e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않는다.
　(f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가진다.
(18) 하기의 (A) 또는 (B) 중 어느 하나의 단백질.
　(A) 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 함유하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 함유하는 β서브유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질.
　(B) 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 함유하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 함유하는 β서브유닛 중 어느 한쪽, 또는 양쪽 각각에 있어서, 하나 또는 복수 개의 아미노산의 치환, 결손, 부가, 번역 후 수식이 되어 있고, 그 개변되거나 개변되지 않은 α서브유닛과, 개변되거나 개변되지 않은 β서브유닛을 함유하고, 또 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 단백질.
(19) 하기의 (C) 또는 (D) 중 어느 하나의 단백질.
　(C) 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위의 서열을 포함하는 DNA가 코딩하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위의 서열을 포함하는 DNA가 코딩하는 β서브유닛을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질.
(D) 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위의 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화한 DNA 중 어느 하나의 DNA가 코딩하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위의 서열을 포함하는 DNA, 또는 그 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화한 DNA 중 어느 하나의 DNA가 코딩하는 β서브유닛을 함유하고, 또 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 단백질. 단, 상기 (C)가 되는 경우는 제외한다.
(20) 적어도 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열인 α서브유닛을 함유하는 폴리펩티드 또는 번역 후 수식된 것과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열인 β서브유닛을 함유하는 폴리펩티드 또는 번역 후 수식된 것 중 어느 한쪽, 또는 양쪽을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질.
(21) 하기의 이화학적 성질을 가지는 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물을 니트릴 화합물에 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
　(a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가진다.
　(b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타낸다.
　(c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.
서브유닛 α　분자량　　　　25000±2000
서브유닛 β　분자량　　　　28000±2000
　(d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존한다.
　(e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않는다.
　(f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가진다.
(22)　(1) 내지 (11) 중 어느 한 항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물, 또는 지오바실루스속에 속하고 하기의 이화학적 성질을 가지는 단백질을 생산할 수 있는 미생물 중 어느 하나를 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물인 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
　(a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가진다.
　(b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타낸다.
　(c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.
서브유닛 α　분자량　　　　25000±2000
서브유닛 β　분자량　　　　28000±2000
　(d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존한다.
　(e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않는다.
　(f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가진다.
도 1은 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6(Geobacillus thermoglucosidasius Q－6)주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛, α서브유닛 및 하류 유전자군의 유전자 구성 및 제한 효소 지도를 나타낸다. 콜로니
혼성화로 취득한 단편(Hin 2.3) 및, 대장균에서의 발현에 이용한 단편(βα, βα1, βα12)의 위치를 나타냈다.
<발명의 실시하기 위한 최선의 형태>
우선 본 발명의 니트릴 히드라타아제를 설명한다. 본 발명에 있어서 니트릴 히드라타아제 활성을 가진다는 것은 아세토니트릴에서는 아세트아미드, n－프로피오니트릴에서는 n－프로피오아미드, 아크릴로니트릴에서는 아크릴아미드와 같이 니트릴 화합물에 수분자를 부가시켜 아미드 화합물로 변환시키는 활성을 가진다는 것이다. 또 생성한 화합물은 액체 크로마토그래피로 분취한 후, 가스 크로마토그래피/질량 분석(GC/MS), 적외 흡수스펙트럼(IR) 및 핵자기 공명 스펙트럼(NMR) 등을 이용해서 분류한다.
본 발명에 있어서 니트릴 히드라타아제 활성을 측정함에 있어서는 예를 들면 0.1중량％의 니트릴 화합물 용액(0.05M－인산 완충액 pH7.7) 1㎖에 니트릴 히드라타아제 효소 용액 10㎕를 가하고, 반응 온도 27℃ 내지 60℃에서 1분 내지 60분간 보온한 후, 0.1㎖의 1N　HCl를 가함으로써 반응을 정지시키고, 반응액의 일부를 액체 크로마토그래피로 분석해서 아미드 화합물의 생성의 유무를 검정할 수 있다.
본 발명에 있어서 기질이 되는 니트릴 화합물이란, 예를 들면 아세토니트릴, n－프로피오니트릴, n－부티로니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－헥산니트릴 등의 지방족 니트릴 화합물, 2－클로로프로피오니트릴 등의 할로겐 원자를 포함하는 니트릴 화합물, 아크릴로니트릴, 크로토노니트릴, 메타크릴로니트릴 등의 불포화 결합을 포함하는 지방족 니트릴 화합물, 락토니트릴, 만델로니트릴 등 의 히드록시니트릴 화합물, 2－페닐글리시노니트릴 등의 아미노니트릴 화합물, 벤조니트릴, 시아노피리딘 등의 방향족 니트릴 화합물, 말로노니트릴, 숙시노니트릴, 아디포니트릴 등의 디니트릴 화합물 등 및 트리니트릴 화합물을 들 수 있다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제의 기질 특이성은 전술한 측정 조건에 있어서 각종 기질을 변경해서 각각의 기질에 대해 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는지의 여부를 측정함으로써 판단할 수 있다. 기질 특이성이 넓으면 제조할 수 있는 대응하는 아미드 화합물의 종류도 증가해서 바람직하지만, 본 효소는 적어도 아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 할 수 있다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제는 환원형 SDS(소디움도데실설페이트)－폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 분자량 25000±2000과 분자량 28000±2000의 2개의 서브유닛이 쿠마시 브릴리안트 블루에 의한 염색에 의해 검출되고, 전자를 α서브유닛, 후자를 β서브유닛이라고 부른다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제는 활성 측정에 앞서 유기산 등의 안정화제를 포함하지 않는 수용액 중의 상태로 70℃로 30분간 가열 처리한 후에도, 가열 전의 활성의 35％의 활성을 유지할 수 있다.
또 고농도의 니트릴 기질은 화학적으로 효소를 실활시키는 것이 보고되어 있는데, 본 발명의 니트릴 히드라타아제는 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로서 이용해도 그러한 현상이 관찰되지 않는다.
또한 고농도의 반응 산물인 아미드 화합물이 반응을 저해하는 것이 보고되어 고농도의 반응 산물을 얻을 때에 큰 문제가 되지만, 본 발명의 니트릴 히드라타아제는 35중량％의 아크릴아미드를 활성 측정 용액에 가해도 기질인 아크릴로니트릴 농도의 감소가 유의하여 활성을 유지한다.
또 본 발명으로서는 상기 (18)에 기재된 것을 예시할 수 있다. 즉, 본 발명의 니트릴 히드라타아제로서는 서열 목록의 서열 번호 1에 나타내어지는 205개의 아미노산의 서열에 의해 나타내어지는 α서브유닛 및 서열 목록의 서열 번호 2에 나타내어지는 226개의 아미노산의 서열에 의해 나타내어지는 β서브유닛에 의해 구성되는 것을 바람직한 예로서 들 수 있다. 이 2개의 서브유닛 이외에도 금속이나 다른 펩티드 등을 함유할 수 있다. 금속으로서는 특히 철이나 코발트를 함유하는 것이 많다. 또한 이 서브유닛 중 어느 한쪽을 함유하는 단백질일 수 있다. 또 개개의 서브유닛의 아미노산 서열로서는 다른 서브유닛과 복합체를 형성해서 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 한, 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수 개의 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입을 가지고 있을 수 있고, 숙주의 종류에 따라 번역 후에 수식을 받는 것도 당연히 예상된다. 특히 니트릴 히드라타아제의 α서브유닛에 있어서는 시스테인 잔기가 번역 후, 시스테인술핀산 또는 시스테인술펜산으로 수식되는 경우가 많다. 상기 아미노산 서열 중 1 내지 30개 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 번역 후 수식되어 있는 아미노산 서열도 바람직한 예로서 들 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1 내지 3개이다. 또한 이러한 치환, 결실, 또는 삽입을 가지는 아미노산 서열을 가지는 니트릴 히드라타아제 효소는 공지의 부위 특이적 변이 도입법, 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재된 방법에 의해 염기 서열의 대응하는 부위에 치환, 결실, 또는 삽입을 도입시킨 DNA를 이용해서 후술하는 바와 같이 숙주 미생물에 도입해서 발현시킴으로써 얻을 수 있고, 열 안정성이나 유기용매 내성의 향상이나 기질 특이성의 변화 등의 산업상 바람직한 성질을 부가한 변이 효소를 작출하는 시도도 가능하다. 이러한 기술 수준을 감안하여 그것들이 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고 있는 경우는 본 발명에 포함되는 것으로 한다.
또 본 발명으로서는 상기 (19)에 기재된 것을 예시할 수 있지만, 이것은 본 발명의 DNA의 설명에서 상세하게 설명한다.
상기와 같은 이화학적 성질을 가지는 니트릴 히드라타아제는 예를 들면 지오바실루스속에 속하는 미생물을 배양함으로써 취득할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 미생물은 지오바실루스속에 속하고, 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 수화 활성을 가지는 미생물이면 어떠한 것이라도 괜찮다. 지오바실루스속에 속하는 미생물로서는 지오바실루스·칼독실로실리티커스(Geobacillus caldoxylosilyticus), 지오바실루스·카우스토필러스(Geobacillus kaustophilus), 지오바실루스·리투아니커스(Geobacillus lituanicus), 지오바실루스·스테아로서모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 지오바실루스·서브테라네우스(Geobacillus subterraneus), 지오바실루스·서모카테눌라터스(Geobacillus thermocatenulatus), 지오바실루스·서모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans), 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius), 지오바실루스·서몰레오보란스(Geobacillus thermoleovorans), 지오바실루스·토에비(Geobacillus toebii), 지오바실루스·유제넨시스(Geobacillus uzenensis)를 들 수 있다. 또 지오바실루스속 유래의 미생물로 특히 한정되는 것은 아니고, 다른 미생물주 유래의 니트릴 히드라타아제 유전자도 포함된다. 그러한 미생물주로서는 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 에어로모나스(Aeromonas)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 크산토박터(Xanthobacter)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 시노리조비움(Sinorhizobium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 바실루스(Bacillus)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 리조비움(Rhizobium)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속등을 들 수 있다. 구체적으로는 본 발명에서는 하기의 수법으로 스크리닝을 했다. 우선, 여러 가지 장소에서 채취한 토양을 소량 취하여 물 또는 생리 식염수를 넣은 시험관 안에 넣고, 2일 내지 14일간, 65℃의 진탕 배양기 안에서 진탕 배양한다. 이 배양액의 일부를 취하여 범용적인 미생물 생육용 배지, 예를 들면 글리세롤, 폴리펩톤, 효모 엑기스 등을 주성분으로 한 액체 배지에 넣고, 65℃의 배양 온도에서 1일 내지 7일간 정도 동안 배양한다. 이것에 의해 얻어지는 배양액의 일부를, 전술한 미생물 생육용 배지 성분을 포함하는 한천 평판 배지에 펴고 65℃로 다시 배양하여 콜로니를 형성시킴으로써 미생물을 단리할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어 진 미생물을, 상기 배지 성분에 다시 n－발레로니트릴 등의 니트릴 화합물 또는 메타크릴아미드 등의 아미드 화합물을 가한 액체 배지를 넣은 시험관 또는 플라스크를 이용하여 적당한 기간, 예를 들면 약 12시간 내지 7일 정도 동안, 65℃의 배양 온도로 진탕 배양함으로써 증식시키고, 상기의 니트릴 히드라타아제 활성 측정용 통상법에 근거하여 목적하는 미생물을 선택한다. 그러한 미생물의 대표적 균주의 분류를 16 SrRNA 및 하기의 생화학적 성질로 행한 바, 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)인 것이 판명되어, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6(Geobacillus thermoglucosidasius Q－6)의 명칭으로, 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소(일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오다이 6)에 번호 FERM P－19351(수리일 2003년 5월 16일)로서 기탁되어 FERM　BP－08658로서 부다페스트 조약에 근거하는 기탁에 이관되었다(수령일 2004년 3월 11일). 여러 가지 특허·문헌 조사를 했으나, 지오바실루스·서모글루코시데시우스에 속하는 미생물에 관해서, 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 것에 관해서는 아무 기재도 없었다. 이러한 점에서 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주는 신균주라고 인정된다. 또 이 신균주의 변이체, 즉, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 유도된 돌연변이체, 세포 융합주 및 유전자 조작주를 이용해도 아미드 화합물의 제조가 가능하다. 또한 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 성질은 하기와 같다.
(a) 형태적 성질
배양 조건:영양 한천(영국 잉글랜드 옥소이드) 배지　60℃
1. 세포의 형태 및 크기
형태:간균
크기:0.8×2.0 내지 3.0㎛
2. 세포의 다형성의 유무:－
3. 운동성의 유무:＋
편모의 착생 상태:주모(peritrichous)
4. 포자의 유무:－
　포자의 부위:단립
(b) 배양적 성질
배양 조건:영양 한천(영국 잉글랜드 옥소이드) 배지　60℃
1. 색:크림색
2. 광택:＋
3. 색소 생산:－
배양 조건:영양 브로쓰(영국 잉글랜드 옥소이드) 배지　60℃
1. 표면 발육의 유무:－
2. 배지 혼탁의 유무:＋
배양 조건:젤라틴 천자 배양　60℃
1. 생육 상태:＋
2. 젤라틴 액화:＋
배양 조건:리트머스·밀크　60℃
1. 응고:－
2. 액화:－
(c) 생리학적 성질
1. 그램 염색:일정하지 않음
2. 질산염의 환원:－
2. 탈질반응:－
3. MR 테스트:－
4. VP 테스트:－
5. 인돌의 생성:－
6. 황화수소의 생성:－
7. 전분의 가수분해:－
8. 시트르산의 이용
코서(Koser):－
크리스텐센(Christensen):－
9. 무기 질소원의 이용
질산염:－
암모늄염:＋
10. 색소의 생성:－
11. 우레아제 활성:－
12. 옥시다아제:＋
13. 카탈라아제:＋
14. 생육의 범위
pH:5.5 내지 8.0
온도:45℃ 내지 72℃
15. 산소에 대한 태도:통성 혐기성
16. O－F 테스트:－/－
(d) 당류로부터의 산 생산/가스 생산
1. L－아라비노오스　－/－
2. D－크실로오스　＋/－
3. D－글루코오스　＋/－
4. D－만노스　＋/－
5. D－프룩토오스　＋/－
6. D－갈락토오스　－/－
7. 말토오스　＋/－
8. 수크로오스　＋/－
9. 락토오스　－/－
10. 트레할로오스　＋/－
11. D－소르비톨　－/－
12. D－만니톨　＋/－
13. 이노시톨　－/－
14. 글리세린　－/－
(e) 그 외의 성질
1. β－갈락토시다아제 활성:－
2. 아르기닌 디히드롤라아제 활성:－
3. 리신 데카르복실라아제 활성:－
4. 트립토판 데아미나아제 활성:－
5. 젤라티나아제 활성:＋
본 발명 방법에 있어서 사용하는 미생물의 배양 방법은 일반적인 미생물 배양 방법에 준해서 행해지고, 고체 배양 또는 액체 배양 모두 가능하다. 바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)는 통성 혐기성의 미생물이기 때문에, 통상의 통성 혐기성 미생물과 같은 배양 조건으로 배양할 수 있다. 배양 온도는 미생물이 생육하는 범위에서 적당히 변경할 수 있지만, 예를 들면 40℃ 내지 75℃의 범위이다. 배지의 pH는 예를 들면 4 내지 9를 들 수 있다. 특히 바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6(Geobacillus thermoglucosidasius Q－6)의 경우, 45℃ 내지 72℃, 바람직하게는 55℃ 내지 70℃의 범위의 배양 온도로, 5 내지 8의 배지 pH를 들 수 있다. 배양 시간은 여러 가지 조건에 따라 다르지만, 통상, 약 1일 내지 약 7일간 정도가 바람직하다. 한편, 배지로서는 일반적인 미생물에 이용하는 통상의 탄소원, 질소원, 유기 내지 무기 염 등을 적당히 포함하는 각종 배지를 이용한다. 탄소원으로서 글리세롤, 글루코오스, 수크로오스, 당밀, 유기산, 동식물유 등을 사용할 수 있다. 질소원으로서 효모 엑기스, 펩톤, 맥아 엑 기스, 고기 엑기스, 요소, 질산 나트륨 등을 들 수 있다. 유기 내지 무기 염으로서 염화 나트륨, 황산 마그네슘, 염화 칼륨, 황산 제1철, 황산 망간, 염화 코발트, 황산 아연, 황산 구리, 아세트산 나트륨, 탄산 칼슘, 인산 2수소 1칼륨, 인산 수소 2칼륨 등을 이용할 수 있다. 본 발명 방법에 있어서는 사용하는 미생물이 가지는 니트릴 히드라타아제 활성을 높이기 위해서 n－발레로니트릴, 이소발레로니트릴, 크로토노니트릴 등의 니트릴 화합물, 메타크릴아미드 등의 아미드 화합물을 배지에 첨가하는 것이 바람직하다. 첨가량으로서 예를 들면 배지 1ℓ에 대해서 0.01g 내지 10g의 범위의 적량을 첨가할 수 있다. 또 바람직하게는 Fe이온 또는 Co이온은 0.1㎍/㎖ 이상 존재할 수 있다.
본 발명의 효소의 아미노산 서열 정보를 취득하기 위해서는 본건 발명의 효소를 정제한 후, 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 각 서브유닛을 분리한 후, 겔로부터 각 밴드를 잘라내고, 단백질 서열에 의해 아미노산 서열의 일부를 결정할 수 있다.
또한 본 발명은 니트릴 히드라타아제를 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 구체적으로는 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위를 포함하는 DNA와 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위를 포함하는 DNA가 예시되고, 각각이 α서브유닛과 β서브유닛을 코딩하는데, 이것으로 한정되는 것은 아니고, 이 염기 서열을 포함하는 DNA이면 된다. 또 이들 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 DNA여도 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 한 본 발명에 포함된다. 즉, 이들 DNA를 이용해서 본 발명의 니트릴 히드라타아제를 발현할 수 있다. 엄격한 조건으로서는 예를 들면 ECL 직접 핵산 표지 및 검출 시스템(아마샴 파마시아 바이오테크사제)을 이용하여 매뉴얼에 기재된 조건(세척:42℃, 0.5xSSC를 포함하는 일차 세척 완충액)을 예시할 수 있다. 엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 DNA로서는 예를 들면 전술한 엄격한 조건 하에서 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위를 포함하는 DNA와 또는 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위를 포함하는 DNA에 있어서의 상보적인 염기 서열 중 임의의, 통상은 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 특히 바람직하게는 100개 이상이 연속한 염기 서열을 검출 시료로 하고, 이것에 혼성화한 DNA을 예시할 수 있다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제를 코딩하는 DNA는 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 본 명세서에 있어서 특별히 기재가 없는 한 당해 분야에서 공지된 유전자 재조합 기술, 재조합 단백질의 생산 기술, 분석법이 채용된다.
본 발명의 니트릴 히드라타아제를 코딩하는 DNA는 본원 명세서에 있어서 개시되는 염기 서열, 또는 아미노산 서열, 경우에 따라서 상기한 정제 효소로 결정한 아미노산 서열 등의 서열 정보에 따라, 본 발명의 니트릴 히드라타아제를 함유하는 미생물, 예를 들면 서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 취득할 수 있다. 아미노산 서열에 따라 합성된 올리고 뉴클레오티드를 프로브로서 이용하여 니트릴 히드라타아제를 함유하는 미생물의 염색체 DNA를 제한 효소에 의해 소화시킨 DNA 단편을 파지나 플라스미드에 도입하고, 숙주를 형질전환해서 얻어지는 라이브러리로부터, 플라크 혼성화나 콜로니 혼성화 등에 의해 본 발명의 니트릴 히드라타아제를 코딩하 는 DNA를 얻을 수도 있다. 또 올리고 뉴클레오티드를 프로브로 하지 않고, 상기한 정제 효소로 결정한 양 서브유닛의 N말단의 아미노산 서열 정보 등에 따라 프라이머를 제작하고, 니트릴 히드라타아제 유전자의 일부를 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭한 것을 프로브로 하여 같은 과정에 의해 취득할 수도 있다. 얻어진 DNA는 플라스미드 벡터, 예를 들면 pUC118에 삽입해서 클로닝하고, 디데옥시·터미네이터법(Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74:5463－5467, 1977) 등의 주지의 방법에 의해 염기 서열을 결정할 수 있다. 이와 같이 해서 제조된 유전자는, 상기 유전자를 이용해서 형질전환한 대장균 숙주 중의 발현 산물을 상기에서 기재한 활성 측정용 통상법에 적용함으로써 니트릴 히드라타아제를 코딩하는 DNA인 것을 확인할 수 있다.
또한 본 발명은 상기의 DNA가 벡터에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서의 재조합 벡터란 숙주 미생물에 적합한 프로모터 영역의 하류에, 상기 방법으로 얻어진 DNA의 5＇말단측이 기능할 수 있도록 연결하고, 필요에 따라 그 하류에 전사 종결 서열을 삽입하고, 적절한 발현용 벡터에 조립하여 제조할 수 있다.
적절한 발현 벡터로서는 숙주 미생물 내에서 복제 증식 가능하면 특별히 제한되지 않는다. 또 염색체에 유전자 삽입이 가능한 숙주이면 상기 숙주에 있어서의 자율 복제 가능한 영역을 가질 필요는 없다. 예를 들면 숙주로서 대장균을 이용하는 것이면 강력한 프로모터, 예를 들면 lac, trp, tac, trc, T7, PL이나 피루 브산 옥시다아제 유전자의 프로모터(일본 특허공보 제2579506호) 등을 포함하는 pUC계, pGEX계, pET계, pT7계, p블루스크립트(pBluescript)계, pKK계, pBS계, pBC계, pCAL계 등을 포함하는, 통상 대장균으로 사용되는 임의의 벡터로부터 선택할 수 있다. 또 α서브유닛 유전자 및 β서브유닛 유전자가 각각의 프로모터로부터 독립적인 시스트론으로서 발현될 수 있고, 공통의 프로모터에 의해 폴리시스트론으로서 발현될 수 있다. 나아가서는 독립의 시스트론의 경우, 각각의 서브유닛 유전자가 다른 벡터 위에 있을 수 있다.
또한 본 발명에 있어서는 상기의 니트릴 히드라타아제의 재조합 벡터에, 본 발명의 니트릴 히드라타아제 유전자의 하류에 있는 유전자를 발현하는 DNA를 조립함으로써 니트릴 히드라타아제의 활성이 보다 상승하는 것을 발견하고, 이러한 벡터도 제공한다. 구체적으로는 상기와 마찬가지로 발현에 필요한 프로모터나 전사 종결 인자 등을 포함하는 플라스미드 벡터를 이용하여 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자, 니트릴 히드라타아제의 α서브유닛 유전자 및 β서브유닛 유전자가 각각 독립의 시스트론으로서 발현되어 있을 수 있고, 공통의 제어 영역에 의해 폴리시스트론으로서 발현되어 있을 수 있다. 마찬가지로 각각의 유전자가 다른 벡터 상에 있을 수 있다.
그러므로, 본 발명은 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질을 코딩하는 DNA를 제공한다. 구체적으로는 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1325－1663위를 예시할 수 있는데, 이것으로 한정되는 것은 아니고, 이 염기 서열을 포함하는 DNA이면 된다. 또 이들 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA에 대해서 엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 DNA이며, 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 한 본 발명에 포함된다. 즉, 이들 DNA를 이용해서 본 발명의 니트릴 히드라타아제를 보다 활성화할 수 있다. 엄격한 조건으로서는 예를 들면 ECL 직접 핵산 표지 및 검출 시스템(아마샴 파마시아 바이오테크사제)을 이용하여 매뉴얼에 기재된 조건(세척:42℃, 0.5xSSC를 포함하는 일차 세척 완충액)을 예시할 수 있다. 엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있는 DNA로서는 예를 들면 전술한 엄격한 조건 하에서 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1325－1663위를 포함하는 DNA에 있어서의 상보적인 염기 서열 중 임의의, 통상은 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 특히 바람직하게는 100개 이상이 연속한 염기 서열을 검출 시료로 하고, 이것에 혼성화한 DNA을 예시할 수 있다. 또 본 발명의 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질은 서열 목록의 서열 번호 4에 나타나는 112개의 아미노산의 서열에 의해 나타내어지는 단백질인데, 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 능력을 가지는 한 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수 개의 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입을 가지는 아미노산 서열을 가지고 있을 수 있고, 숙주의 종류에 따라 번역 후에 수식을 받는 것도 당연히 예상된다. 상기 아미노산 서열 중 1 내지 25개 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 번역 후 수식되어 있는 아미노산 서열도 바람직한 예로서 들 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1 내지 3개이다.
또 본 발명은 상기의 DNA가 숙주 세포에 도입되어 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체를 제공한다.
형질전환체는 상기 방법으로 작성한 발현 벡터를 이용해서 숙주 세포를 형질전환함으로써 취득할 수 있다. 숙주 세포로서는 미생물, 포유류 세포, 및 식물세포 등이 포함되는데, 미생물을 이용하는 것이 바람직하다. 미생물의 예로서는 후술의 실시예와 같이 대장균을 들 수 있는데, 특별히 그것으로 한정되지 않고, 바실루스속, 슈도모나스속, 코리네박테리움속, 브레비박테리움속, 스트렙토코커스속, 로도코커스속, 방선균이나 효모 등을 예시할 수 있다.
숙주 미생물로의 유전자의 도입법으로서는 예를 들면 형질전환, 형질 도입, 접합 전달, 또는 전기충격법 등의 당 기술분야에서 주지된 임의의 통상법에 따라 바람직한 숙주에 도입할 수 있다.
또한 본 발명의 니트릴 히드라타아제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법으로서는 상술한 바와 같이 상기 니트릴 히드라타아제를 생산할 수 있는 미생물, 예를 들면 지오바실루스속의 미생물, 특히 바람직하게는 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 배양물로부터 공지의 정제 방법을 적절히 조합해서 상기 효소를 취득할 수 있지만, 또한 상술한 바와 같이 니트릴 히드라타아제의 유전자를 이용해서 형질전환된 형질전환체로부터 취득할 수도 있다.
상기 효소를 취득함에 있어서 지오바실루스속의 미생물의 배양 방법은 전술한 대로이지만, 상기 형질전환체는 통상 이들 미생물이 자화 가능한 영양원을 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 예를 들면 효소나 항생 물질 등을 생산하는 통상의 방법으로 배양할 수 있다. 배양은 통상, 액체 배양이거나 고체 배양일 수 있다. 예를 들면 글루코오스, 수크로오스 등의 탄수화물; 소르비톨, 글리세 롤 등의 알코올; 시트르산, 아세트산 등의 유기산; 콩기름 등의 탄소원 또는 이들의 혼합물; 효모 엑기스, 고기 엑기스, 황산 암모늄, 암모니아 등의 함질소 무기 유기 질소원; 인산염, 마그네슘, 철, 코발트, 망간, 칼륨 등의 무기 영양원; 및 비오틴, 티아민 등의 비타민류를 적당히 혼합한 배지가 이용된다. 보다 바람직하게는 그러한 배지 성분에 Fe 이온 또는 Co 이온을 0.1㎍/㎖ 이상 존재시킬 수 있다. 배양 조건은 통상, 호기 조건 하에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 숙주 미생물을 생육할 수 있는 온도이면 특별히 제한은 없지만, 통상, 5℃ 내지 80℃, 바람직하게는 20 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 42℃로 행하는 것을 예시할 수 있다. 또 배양 도중의 pH는 숙주 미생물을 생육할 수 있는 pH이면 특별히 제한은 없지만, 통상, pH 3 내지 9, 바람직하게는 pH 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 7로 행하는 것을 예시할 수 있다.
또 본 발명에 있어서는 본 발명의 효소를 이용해서 니트릴 화합물을 제조할 수 있다. 이 발명에 있어서 전술한 효소를 이용함에 있어서는, 본 발명의 효소의 작용을 저해하지 않는 한 특별히 정제 정도 등은 한정되지 않고, 정제된 본 발명의 효소 외에, 그 효소 함유물을 이용할 수 있고, 나아가서는 그 효소를 생산하는 미생물이나 그 효소의 유전자를 도입해서 형질전환된 형질전환체 등을 사용할 수 있다. 미생물이나 형질전환체 등을 사용하는 경우에는 균체를 이용할 수 있고, 균체로서는 생균체, 또는 아세톤이나 톨루엔 등의 용매 처리 또는 동결건조 등의 처리를 해서 화합물의 투과성을 증가시킨 균체를 사용할 수 있다. 경우에 따라서는 균체 파쇄물이나 균체 추출물 등의 효소 함유물이 되어 있을 수 있다. 상기 효소를 함유하는 균체 처리물의 작성 방법을 예시하면, 우선 배양물을 고액분리하고, 얻어지는 습균체를 필요에 따라 인산 완충액이나 트리스 염산 완충액 등의 완충액에 현탁시키고, 그 다음에 초음파 처리, 프렌치 프레스 처리나 유리 비드를 이용하는 분쇄 처리, 또는 리소자임이나 프로테아제 등의 세포벽 용해 효소에 의한 처리 등의 균체 파쇄처리를 적당히 조합하고, 균체 내에서 상기 효소를 추출하여 조 니트릴 히드라타아제 함유액을 얻을 수 있다. 이 조 효소 함유액을, 필요에 따라 공지의 단백질, 효소 등의 단리, 정제 수단을 이용함으로써 다시 정제할 수 있다. 예를 들면 조 효소 함유액에, 아세톤, 에탄올 등의 유기용매를 가하여 분별 침전시키거나, 황산 암모늄 등을 가하여 염석시키거나 해서, 수용액으로부터 니트릴 히드라타아제를 함유하는 분획을 침전시켜 회수하는 방법을 예시할 수 있다. 또한 음이온 교환, 양이온 교환, 겔 여과, 항체나 킬레이트를 이용한 친화성 크로마토그래피 등을 적절히 조합해서 정제할 수 있다. 물론, 효소나 균체, 효소를 함유하는 균체 처리물 등은 공지의 방법에 의해 컬럼에 충전되어 있을 수 있고, 담체에 고정화되어 있을 수 있고, 특히 균체의 경우는 폴리아크릴아미드 겔 등의 고분자 중에 포매될 수 있다. 균체 또는 균체 처리물을 물 또는 인산 완충액 등의 완충액 등의 수성 수용액에 현탁하고, 이것에 니트릴 화합물을 가함으로써 반응을 진행시킨다. 사용하는 균체 또는 균체 처리물의 농도는 0.01중량％ 내지 20중량％, 바람직하게는 0.1중량％ 내지 10중량％이다. 반응 온도의 상한은 바람직하게는 90℃, 더욱 바람직하게는 85℃, 더 한층 바람직하게는 70℃를, 반응 온도의 하한은 예를 들면 1℃, 바람직하게는 4℃, 더욱 바람직하게는 10℃를, 반응 pH는 예를 들면 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8을, 반응 시간은 예를 들면 1분간 내지 72시간을 들 수 있다. 또 니트릴 화합물을 서서히 적하함으로써 아미드 화합물을 고농도로 생성 축적시킬 수도 있다. 반응액으로부터의 아미드 화합물을 회수하려면 균체나 균체 처리물 등을 여과나 원심분리 등으로 제거한 후, 결정화 등의 수법으로 꺼내는 방법 등이 있다.
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1:균체 분리
사이타마현의 온천 근방에서 채취한 토양을 소량(약 1g) 취하여 생리 식염수를 5㎖ 넣은 시험관 안에 넣고, 3일간, 65℃의 진탕 배양기 안에서 진탕 배양했다. 이 배양액의 일부(0.5㎖)를 취하여 글루코오스 1.0중량％, 폴리펩톤 0.5중량％, 효모 엑기스 0.3중량％를 포함하는 배지(pH7.0)에 가하고 2일간 65℃로 왕복 진탕 배양했다. 이것에 의해 얻어지는 배양액의 일부(0.1㎖)를, 전술한 배지 성분을 포함하는 한천 평판 배지에 펴고 65℃로 다시 2일간 배양하여 콜로니를 형성시킴으로써 미생물을 단리했다. 단리한 미생물을, 상기와 동일 조성의 배지에 0.1중량％의 n－발레로니트릴을 첨가한 액체 배지에 접종한 후, 65℃로 24시간 배양함으로써 니트릴 자화성이 높은 미생물을 가지는 배양액을 얻었다. 이 배양액 1㎖를 9㎖의 1.1중량％의 아크릴로니트릴 용액(0.05M－인산 완충액 pH7.7)에 가하고, 반응 온도 27℃에서 반응을 개시했다. 10분 후, 1㎖의 1N　HCl를 가함으로써 반응을 정지시 켰다. 반응액의 일부를 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석해서 아크릴아미드 생성의 유무를 검정함으로써 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 미생물을 스크리닝했다. 이와 같이 해서 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 수화 활성을 가지는 미생물로서 지오바실루스·서모글루코시데시우스　Q－6주를 얻었다.
(액체 크로마토그래피 분석 조건)
본체:히다찌(HITACHI) D－7000(히타치사제)
컬럼;이너트실(Inertsil) ODS－3(GL사이언스사제)
길이;200㎜
컬럼 온도;35℃
유량;1㎖/min
샘플 주입량;10㎕
용액:0.1wt％ 인산 수용액
실시예 2:균체 배양의 생육 상한 온도
실시예 1에 의해 얻어진 지오바실루스·서모글루코시데시우스　Q－6주를, 실시예 1에서 사용한 배지 성분을 포함하는 한천 평판 배지에 도포하고, 복수개의 다른 온도로 배양을 하여 균체의 생육 상황을 조사했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 지오바실루스·서모글루코시데시우스　Q－6주는 70℃까지는 통상의 증식을 나타내고, 72℃에서도 생육이 가능했다.
평가 기준:－ 증식하지 않았다, ＋ 증식했다, ＋＋ 잘 증식했다
배양온도(℃) 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6의 증식도
20 －
30 －
40 －
50 ＋＋
60 ＋＋
65 ＋＋
70 ＋＋
72 ＋
75 －
실시예 3:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 균체 내의 니트릴 히드라타아제 활성의 측정과 그 온도 의존성
글리세롤 0.2중량％, 시트르산 3나트륨 2수화물 0.2중량％, 인산 2수소 칼륨 0.1중량％, 인산 수소 2칼륨 0.1중량％, 폴리펩톤 0.1중량％, 효모 엑기스 0.1중량％, 염화 나트륨 0.1중량％, n－발레로니트릴 0.1중량％, 황산 마그네슘 7수화물 0.02중량％, 황산철(Ⅱ) 7수화물 0.003중량％, 염화 코발트 6수화물 0.0002％를 포함하는 멸균필 배지(pH7.0) 100㎖를 500㎖ 삼각 플라스크에 넣은 것에 미리 동 배지에서 배양한 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 배양액 1㎖를 식균했다. 이것을 65℃로 1일간, 200타/min으로 회전 진탕 배양하여 균체 배양액을 얻었다. 이 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 균체 배양액 300㎖로부터 원심분리(10000×g, 15분)에 의해 균체를 모아 0.05M 인산 완충액(pH7.5)으로 세정한 후, 동 완충액 50㎖에 현탁했다. 이렇게 해서 제조한 균체 현탁액에 대해, 전술한 방법으로 5분간 반응시켜 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 수화 활성을 측정했다. 효소 활성의 단위(유닛)를, 1분간에 1μ㏖의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 활성을 1유닛(이하, U라고 적는다)으로 정하면, 27℃에 있어서의 습균체 중량 당 니트릴 히드라타아제 활성(U/㎎)은 9.37U/㎎이었다. 또한 10℃에 있어서 5U/㎖가 되도록 0.5중량％의 아크릴로니트릴을 포함하는 균체 현탁액을 제조하고, 이 균체 현탁액을 이용하여 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃의 조건으로 마찬가지로 니트릴 히드라타아제 활성을 구해 표 2에 나타냈다. 그 결과, 균체를 반응에 이용했을 때의 최적 온도는 60℃ 근방에 있고, 고온 지역에 있어서 특히 높은 활성을 나타냈다.
반응 온도(℃) 니트릴 히드라타아제 활성(U/㎖)
10 5.0
30 19.2
40 39.4
50 49.2
60 50.6
70 42.4
실시예 4:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 균체 중의 니트릴 히드라타아제의 열 안정성
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 균체 내에 있는 니트릴 히드라타아제의 활성의 열 안정성을 조사하기 위해서 실시예 3의 배양법으로 얻은 균체를 10U/㎖가 되도록 증류수에 현탁하고, 30분 동안 소정 온도에서의 보온 처리를 하여 잔존 활성을 측정했다. 0.5㎖의 1중량％ 아크릴로니트릴 용액(0.05M 인산 칼륨 완충액, pH7.5)에 0.5㎖의 보온 처리 후의 균체액을 가하고, 27℃로 교반하면서 반응을 개시했다. 5분 후, 100μL의 1규정 염산을 가함으로써 반응을 정지시켰다. 보존 처리 전의 활성에 대한 보존 처리 후의 활성을 산출하여 보존 처리 전의 활성을 기준(100)으로 한 환산치로서 표 3에 나타낸다. 이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 균체 중의 니트릴 히드라타아제의 효소 활성은 고온 하에서도 안정적으로 유지된다고 할 수 있고, 70℃라고 하는 고온 하에서도 80％ 이상의 활성을 유지할 수 있고, 80℃의 고온 하에서도 30％ 이상의 활성을 유지할 수 있다.
처리 온도(℃) 활성(U/㎖) 잔존 활성(％)
30 5 100
40 4.8 96
50 4.5 90
60 4.4 88
70 4.2 84
80 1.6 32
실시예 5:각종 니트릴 화합물을 기질로 한 반응
하기 표 4에 기재하고 있는 각종 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 변환시키는 니트릴 히드라타아제 활성에 대해 조사했다. 9㎖의 1.1％ 니트릴 용액(0.05M 인산 칼륨 완충액, pH7.5)에 1㎖ 균체 현탁액을 가하고, 반응 온도 30℃에서 반응을 개시했다. 10분 후, 1㎖의 1N　HCl를 가함으로써 반응을 정지시켰다. HPLC에 의한 분석 조건은 실시예 1과 같지만, 용액을 10wt％ 아세토니트릴을 포함하는 증류수로 했다. 그 결과, 표 4에 기재한 모든 니트릴 화합물을 기질로 해서 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고 있었다.
공시 니트릴 화합물
아디포니트릴 n－부티로니트릴
아세토니트릴 헥산니트릴
이소부티로니트릴 벤조니트릴
n－발레로니트릴
실시예 6 이후에 기재된 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛(ORF2), β서브유닛(ORF1) 및 니트릴 히드라타아제 활성화 인자(ORF3)의 아미노산 서열 및 염기 서열을 해명하기 위한 본 발명의 흐름을 이하에 요약했다.
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주를 배양하여 얻어진 균체를 파쇄한 후, 황산 암모늄에 의한 침전, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, DEAE 컬럼, 하이드록시 어퍼타이트 컬럼에 제공하고, 겔 여과 크로마토그래피, 투석을 하여 니트릴 히드라타아제 효소를 정제했다.
정제한 니트릴 히드라타아제의 α서브유닛 및 β서브유닛의 N말단 약 30 잔기의 아미노산 서열을 결정하고, 상기 균의 속에 근거하는 아미노산의 코돈 사용을 고려하여 유전자 증폭용 올리고 뉴클레오티드 축퇴성(degenerate) 프라이머를 제작하고, 상기 균체로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 해서 축퇴성 PCR을 하여 증폭 DNA 단편을 취득했다. 증폭된 DNA 단편을 클로닝하고, 삽입 단편의 염기 서열을 결정했다. 상기 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열과 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛의 N말단 아미노산 서열을 비교하여 클로닝된 서열이 니트릴 히드라타아제를 코딩하고 있는 것을 확인했다.
그 결과, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주에 있어서 5＇말단측 상류에서 니트릴 히드라타아제 유전자는 β서브유닛, α서브유닛의 순서로 인접해서 존재하는 것이 밝혀졌다.
공지의 여러 가지 니트릴 히드라타아제 α서브유닛의 하류 유전자에 있어서의 상동성이 높은 서열로 유전자 증폭용 올리고 뉴클레오티드 축퇴성 프라이머를 제작하고, 상기 균체로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로 해서 축퇴성 PCR을 하여 증폭 DNA 단편을 취득했다. 얻어진 상기 균의 α서브유닛 부분의 증폭 DNA 단편을 클로닝해서 염기 서열을 결정했다.
이상으로부터 취득된 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛을 적당한 발현 벡터에 도입했다. 구축한 발현 플라스미드를 이용하여 적당한 숙주균을 형질전환했다. 숙주의 예로서는 로도코커스속, 코리네속, 대장균 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아미다아제를 가지지 않은 숙주가 좋다. 또한 얻어진 형질전환체를 배양하여 얻은 균체와 아크릴로니트릴을 수성 매체 중에서 접촉시킴으로써 아크릴아미드가 생성되는 것을 확인하고, 그 생성 효율 및 니트릴 히드라타아제 활성을 비교했다.
다음에, 상기로부터 얻어진 DNA 단편을 프로브로서 콜로니 혼성화하여 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛의 하류 유전자를 포함하는 주변 유전자를 클로닝했다.
하류 유전자를 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛과 공발현시켜 니트릴 히드라타아제 활성을 비교했다. 그 결과, 하류 유전자가 니트릴 히드라타아제 활성을 현저하게 상승시키는 활성화에 관여하는 유전자인 것을 발견했다.
실시예 6:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래 니트릴 히드라타아제 효소의 정제
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주를 배양하여 여러 가지 컬럼에 제공함으로써 니트릴 히드라타아제 활성 분획을 정제했다.
크로마토그래피에 있어서의 니트릴 히드라타아제 활성 분획의 측정 방법은 이하와 같이 했다. HEPES 완충액(100mM, pH7.2)에 의해 희석한 각 분획의 용출액에 1중량％의 아크릴로니트릴을 첨가하고 27℃로 1분간 반응시켰다. 1N　HCl를 10액량％반응액에 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 생성한 아크릴아미드 농도를 실시예 1에 기재된 HPLC 분석법에 의해 측정했다.
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래 니트릴 히드라타아제 효소를 정제하기 위해서 우선 0.1중량％의 n－발레로니트릴을 함유하는 V/F배지(글리세롤 0.2중량％, 시트르산 3나트륨 2수화물 0.2중량％, 인산 2수소 칼륨 0.1중량％, 인산 수소 2칼륨 0.1중량％, 폴리펩톤 0.1중량％, 효모 엑기스 0.1중량％, 염화 나트륨 0.1중량％, n－발레로니트릴 0.1중량％, 황산 마그네슘 7수화물 0.02중량％, 황산철(Ⅱ) 7수화물 0.003중량％, 염화 코발트 6수화물 0.0002중량％)에 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주를 식균하고, 65℃로 24시간 배양했다. 배양에는 96 웰 2㎖의 심저 플레이트(코스타르(COSTAR)사)를 이용했다. 배양 종료 후, 8000g, 10분간의 원심분리에 의해 집균하고, 얻어진 습균체 3g을 20mL의 HEPES 완충액(100mM, pH7.2)에 재현탁했다. 균체를 냉각하에서 초음파 파쇄기를 이용해서 파쇄하고, 균체 파쇄액에 황산 암모늄(30％ 포화 농도)을 가하여 4℃로 30분간 완만하게 교반하고, 20000g, 10분간의 원심분리를 해서 상청을 얻었다. 원심 상청액에 황산 암모늄(70％ 포화 농도)을 가하여 4℃로 30분간 완만하게 교반한 후, 20000g, 10분간의 원심분리에 의해 얻어진 침전물을 9㎖의 HEPES 완충액(100mM, pH7.2)에 재용해하고, 1L의 동일액 중에서 4℃로 24시간 투석해서 음이온 교환 크로마토그래피(아마샴 바이오 사이언세스사;하이트랩(HiTrap)　DEAE　FF(컬럼 체적 5mL×5개))에 제공했다. 전개액은 HEPES 완충액(100mM, pH7.2)를 이용해서 염화 칼륨 농도를 0.0M에서 0.5M까지 직선적으로 증가시킴으로써 분획을 용출시켜 니트릴 히드라타아제 활성을 포함하는 분획을 얻었다. 그 분획을 어퍼타이트 컬럼 크로마토그래피(바이오－라드(BIO－RAD)사제;CHT2－I(컬럼 체적 2mL))에 제공했다. 0.01M 인산 칼륨 수용액(pH7.2)을 전개액으로 하고, 인산 칼륨을 0.01M에서 0.3M까지 직선적으로 증가시킴으로써 분획을 용출시켜 니트릴 히드라타아제 활성을 포함하는 분획을 얻었다. 그 분획을 0.15M　NaCl을 포함하는 0.05M 인산 나트륨 수용액(pH7.2)을 전개액으로 한 겔 여과 크로마토그래피(아마샴 바이오 사이언세스사;수퍼덱스(Superdex)　200　HR　10/30)에 제공하고, 니트릴 히드라타아제 활성 분획을 취득했다. 이렇게 해서 얻어진 겔 여과 크로마토그래피의 니트릴 히드라타아제 활성 분획을 이용해서 이하의 실시예를 실시했다.
실시예 7:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제 활성 분획에 있어서의 니트릴 히드라타아제의 반응 온도 의존성
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제 활성 분획 용액(3.2mg/mL, 0.05M 인산 완충액(pH7.5))에 대해서, 표 5에 나타낸 반응 온도로 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 니트릴 히드라타아제 활성을 측정했다. 1mL의 0.5중량％ 아크릴로니트릴 용액(0.05M 인산 칼륨 완충액, pH7.5)에 니트릴 히드라타아제 활성 분획용액을 가하고, 각 온도에서 교반하면서 반응을 개시했다. 2분 후, 100μL의 1N　염산을 가함으로써 반응을 정지시켰다. 효소 활성의 단위(유닛)는 1분간에 1μ㏖의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 활성을 1유닛(이하, U라고 적는다)으로 정하고, 효소 중량 당의 수화 활성(U/㎎)을 표 5에 나타냈다. 이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제 활성 분획에 있어서의 니트릴 히드라타아제의 활성은 60℃라고 하는 고온까지, 반응 온도의 상승에 따라 상승하고 있다. 최적 온도는 균체를 반응에 이용했을 때와 마찬가지로 60℃ 근방에 있다고 생각되고, 70℃라고 하는 고온 하에서도 대단히 높은 니트릴 히드라타아제 활성을 나타내고 있다.
반응 온도(℃) 활성(U/mg)
20 210.4
27 550.7
40 1135.3
50 2228.8
60 2823.3
70 2781.1
실시예 8:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제의 열 안정성
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제의 활성의 열 안정성을 조사하기 위해서 니트릴 히드라타아제 활성 분획용액(3.2mg/㎖, 0.05M 인산 완충액(pH7.5))을 30분, 소정 온도에서의 보온 처리를 하여 잔존 활성을 측정했다. 1mL의 0.5중량％ 아크릴로니트릴 용액(0.05M 인산 칼륨 완충액, pH7.5)에 보온 처리 후의 니트릴 히드라타아제 용액을 5㎕ 가하고, 27℃로 교반하면서 반응을 개시했다. 2분 후, 100㎕의 1N　HCl를 가함으로써 반응을 정지시켰다. 보존 처리 전의 활성에 대한 보존 처리 후의 활성(잔존 활성)을 산출하여 보존 처리 전의 활성을 기준(100)으로 한 환산치로서 표 6에 나타낸다. 이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제 활성 분획에 있어서의 수용액 중의 니트릴 히드라타아제의 효소 활성은 고온 하에서도 안정적으로 유지된다고 할 수 있고, 60℃라고 하는 고온 하에서도 60％ 이상의 활성을 유지할 수 있고, 70℃의 고온 하에서도 35％ 이상의 활성을 유지할 수 있다.
처리 온도(℃) 잔존 활성(％)
20 89.2
27 85.6
40 82.3
50 78.9
60 66.9
70 38.8
실시예 9:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제의 아크릴로니트릴 농도 의존성과 농도 내성
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제에 관해서, 기질인 아크릴로니트릴 농도에의 의존성과 내성을 조사하기 위해서 4㎕의 니트릴 히드라타아제 활성 분획용액(3.2mg/mL, 0.05M 인산 완충액(pH7.5))을 각종 중량％의 아크릴로니트릴을 포함하는 5㎖용액(0.05M 인산 칼륨 완충액, pH7.5)에 가하고, 27℃로 교반하면서 반응을 개시했다. 5분, 10분, 20분, 40분 후에 1㎖씩을 꺼내고, 100μL의 1N　HCl를 가함으로써 반응을 정지시키고, 생성한 아크릴아미드의 농도를 HPLC에 의해 정량해서 표 7에 나타냈다. 이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제 활성 분획에 있어서의 수용액 중의 니트릴 히드라타아제의 효소 활성은 높은 아크릴로니트릴 농도에 있어서도 안정적으로 유지된다고 말할 수 있다. 6％라고 하는 고농도의 아크릴로니트릴 용액 중에서 40분 반응시켜도 보다 낮은 아크릴로니트릴 농도의 경우에 비해 활성의 저하는 관찰되지 않고, 반대로 기질 농도의 상승에 따라 활성은 상승했다.
반응 개시 시의 아크릴로니트릴 농도(중량％) 5분 경과 후의 아크릴아미드 농도 (중량％) 10분 경과 후의 아크릴아미드 농도 (중량％) 20분 경과 후의 아크릴아미드 농도 (중량％) 40분 경과 후의 아크릴아미드 농도(중량％)
0.5％ 0.018 0.032 0.052 0.087
2.0％ 0.023 0.042 0.070 0.107
4.0％ 0.026 0.046 0.077 0.137
6.0％ 0.030 0.051 0.082 0.169
실시예 10:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제의 아크릴아미드 농도 내성
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제에 관해서, 생성물인 아크릴아미드에 의한 저해를 조사하기 위해서 10㎕의 니트릴 히드라타아제 활성 분획용액(3.2mg/mL, 0.05M 인산 완충액(pH7.5))을 0.5중량％ 아크릴로니트릴과 35중량％ 아크릴아미드를 포함하는 용액(0.05M 인산 칼륨 완충액, pH7.5) 1㎖에 가하고, 27℃로 교반하면서 10분간 반응시키고, 반응 후의 액 중의 아크릴로니트릴 농도를 HPLC로 정량한 바, 모든 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 변환되어 있었다. 이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 정제한 니트릴 히드라타아제 활성 분획에 있어서의 수용액 중의 니트릴 히드라타아제의 효소 활성은 35％라고 하는 높은 아크릴아미드 농도에 있어서도 활성이 유지된다고 말할 수 있다.
실시예 11:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛 및 α서브유닛 부분의 유전자의 클로닝
(1) 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제 효소의 확인 및 N말단 아미노산 서열 결정
실시예 6에 의해 얻어진 겔 여과 크로마토그래피에서의 니트릴 히드라타아제 활성 분획 용출액을 환원 조건 하에서 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 제공했다. 영동 후, 쿠마시 브릴리안트 블루(CBB)에 의한 단백질 염색을 하여 탈색한 결과, 약 25K달톤 및 약 28K달톤의 분자량을 가지는 2개의 주요한 밴드가 확인되었다. 이 2개의 주요한 정제 단백질을, 블롯팅 장치(바이오－라드사)를 이용해서 PVDF막(밀리포어(MILLIPORE)사제)에 전사하여 CBB 염색하고, 목적하는 2개의 밴드가 흡착되어 있는 부분을 PVDF막으로부터 잘라냈다. 다음에, 전자동 단백질 일차 구조 분석 장치 PPSQ－23A(시마즈 제작소)를 이용해서 2종류의 단백질의 N말단 아미노산 서열을 해독했다. 그 결과, 분자량 25K달톤의 단백질의 N말단 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 번호 23에 기재된 서열이며, 분자량 28K달톤의 단백질의 N말단 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 번호 24에 기재된 서열이었다.
기지의 니트릴 히드라타아제 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 25K달톤의 폴리펩티드쇄가 니트릴 히드라타아제 α서브유닛과, 28K달톤의 폴리펩티드쇄가 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과의 낮은 상동성을 나타내고, 상기 단백질을 코딩하는 것이 시사되었다.
(2) N말단 아미노산 서열에 대응하는 올리고 뉴클레오티드 프라이머의 합성
상기에서 해독한 2종류의 단백질의 N말단의 아미노산 서열로부터, 상기 균속의 코돈 사용에 근거해서 축퇴성 PCR용 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이하의 12종류로 합성했다. 서열 목록의 서열 번호 5에 기재된 프라이머 1(αF1), 서열 목록의 서열 번호 6에 기재된 프라이머 2(αF2), 서열 목록의 서열 번호 7에 기재된 프라이머 3(αF3), 서열 목록의 서열 번호 8에 기재된 프라이머 4(αR1), 서열 목록의 서열 번호 9에 기재된 프라이머 5(αR2), 서열 목록의 서열 번호 10에 기재된 프라이머 6(αR3), 서열 목록의 서열 번호 11에 기재된 프라이머 7(βF1), 서열 목록의 서열 번호 12에 기재된 프라이머 8(βF2), 서열 목록의 서열 번호 13에 기재된 프라이머 9(βF3), 서열 목록의 서열 번호 14에 기재된 프라이머 10(βR1), 서열 목록의 서열 번호 15에 기재된 프라이머 11(βR2), 서열 목록의 서열 번호 16에 기재된 프라이머 12(βR3)이다. 또한 y는 c 또는 t를 나타내고, r은 a 또는 g를 나타내고, m는 a 또는 c를 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, s는 c 또는 g를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, d는 a, g 또는 t를 나타내고, n는 a, c, g 또는 t를 나타내고 있다. 또 α서브유닛 및 β서브유닛을 코딩하는 유전자의 염색체상에서의 위치를 고려하여 프라이머를 작성했다.
(3) 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주로부터 염색체 DNA의 추출 및 축퇴성 PCR
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주를 실시예 6과 같은 방법에 의해 배양, 회수하고, 퀴아젠(QIAGEN)사의 제노믹-팁 시스템(Genomic－tip　System)(500/G) 키트를 이용해서 균체로부터 염색체 DNA를 추출했다. TE용액에 용해시킨 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 염색체 DNA 0.1㎍을 주형으로 해서 축퇴성 PCR을 했다. 축퇴성 PCR은 서열 목록의 서열 번호 5 내지 10에 기재된 프라이머 1 내지 6과 서열 목록의 서열 번호 11 내지 16에 기재된 프라이머 7 내지 12의 조합 36가지를 행했다. 100p㏖의 프라이머 2종류를 각각, 5U의 다까라(Takara)사의 Ex　Taq　DNA 폴리머라아제 및 완충액을 포함하는 전량 100㎕의 반응액을 이용해서 축퇴성 PCR을 하고 DNA 단편의 증폭을 시도했다. 반응 조건은 이하와 같다. 96℃, 3분의 열 변성 후, 96℃, 30초 열 변성, 42℃, 30초 어닐링, 72℃, 1분 30초 신장 반응을 35 사이클한 후, 72℃, 5분간 신장 반응을 시켜 4℃에서 보냉했다. 각각의 PCR 산물을 1중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공하고, DNA의 증폭의 확인을 한 바, 서열 목록의 서열 번호 9에 기재된 프라이머 5(αR2)와 서열 목록의 서열 번호 11에 기재된 프라이머 7(βF1)의 조합 및 서열 목록의 서열 번호 9에 기재된 프라이머 5(αR2)와 서열 목록의 서열 번호 12에 기재된 프라이머 8(βF2)의 조합으로 행한 PCR의 경우만 약 700bp의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다.
(4) 축퇴성 PCR 산물의 클로닝 및 증폭 DNA 단편의 염기 서열 해독
증폭된 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고, 퀴아퀵 젤 엑스트랙션 키트(QIAquick Gel　Extraction　Kit)(퀴아젠사)를 이용해서 추출하여 pGEM－T　벡터(프로메가(Promega)사)에 T4　DNA 리가아제(다까라사)를 이용해서 라이게이션했다. Ex　Taq에 의한 PCR의 결과, 3＇말단에 A가 1염기 부가되는 성질을 이용했다. 라이게이션 반응 후, 대장균 JM109주를 형질전환하고, LB 한천 배지(50㎍/㎖ 암피실린, 0.5중량％ 박토 효모 엑기스, 1중량％ 박토트립톤, 0.5중량％ NaCl, 2.0중량％ 박토 한천(pH7.5))로 37℃로 하룻밤 배양하여 암피실린으로 형질전환체를 선택했다. 암피실린을 포함하는 LB배지에서 배양한 형질전환체로부터 통상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 약 700bp의 인서트 서열을, 벡터 위에 있는 SP6 및 T7 프로모터의 서열을 프라이머로서 이용해서 염기 서열을 해독했다.
그 결과, 증폭 DNA 단편 내에 681bp의 오픈 리딩 프레임(이후 ORF1이라고 호칭)이 확인되었다. ORF1의 번역 정지 코돈과 다음의 오픈 리딩 프레임(이후 ORF2라고 호칭)의 번역 개시 코돈 ATG의 사이는 13bp였다. ORF1의 염기 서열로부터 추정되는 N말단측 25개의 아미노산 서열과 상기에서 정제한 28K달톤의 폴리펩티드쇄의 N말단측의 25개의 아미노산 서열은 완전히 일치하고 있고, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열의 첫 번째부터 25번째까지의 서열에 상당하고 있다. ORF1의 아미노산 서열은 기지의 니트릴 히드라타아제의 β서브유닛의 아미노산 서열과의 낮은 상동성을 나타내고, 상기 단백질을 코딩하는 것이 시사되었다.
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛은 226 아미노산을 코딩하고 있고, 기존의 데이터 베이스 중에서 상동성을 가지는 단백질과의 아미노산 서열의 일치도는 높은 쪽부터 차례대로 클레브시엘라속MC12609주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과 43％, 아그로박테리움속의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과 42％, 로도슈도모나스속 CGA009주 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과 40％로 매우 낮다. 또 지오바실루스속과 근접하게 연관된 속인 바실루스속 유래의 단백질과의 아미노산의 일치도도, 호열균 바실루스 BR449주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과 35.0％, 호열균 바실루스 스미시 SC－J05－1주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과 34.5％로 극히 낮았다. 한편, 호열균 바실루스 BR449주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛과 호열균 바실루스 스미시 SC－J05－1주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛은 85.6％라고 하는 높은 일치도를 가지고 있다. 또 ORF2의 염기 서열로부터 추정되는 N말단의 아미노산 서열과 상기에서 정제한 25K달톤의 폴리펩티드쇄의 N말단의 아미노산 서열은 완전히 일치했다.
이상으로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주에서는 5＇말단측 상류에서 28K달톤의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛을 코딩하는 유전자, 25K달톤의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛을 코딩하는 유전자가 이 순번으로 인접해서 존재하고 있는 것이 판명되었다.
(5) 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 부분의 유전자의 클로닝
상기에서 얻어진 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛 부분의 유전자의 주변 유전자 및 α서브유닛 부분의 유전자를 클로닝하기 위해서 축퇴성 PCR을 했다. 기지의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛의 하류에 위치하는 유전자를 참고로 해서 이하의 축퇴성 PCR용 올리고 뉴클레오티드 프라이머 2종류를 작성했다. 서열 목록의 서열 번호 17에 기재된 프라이머 13(pR1), 서열 목록의 서열 번호 18에 기재된 프라이머 14(pR2)이다.
또 앞서 염기 서열을 해독한 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛내에 PCR 증폭용의 올리고 뉴클레오티드 프라이머 이하 2종류를 작성했다. 서열 목록의 서열 번호 19에 기재된 프라이머 15(Q6AposF), 서열 목록의 서열 번호 20에 기재된 프라이머 16(Q6abF1)이다. 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 염색체 DNA 0.1㎍을 주형으로 해서 축퇴성 PCR을 했다. 축퇴성 PCR은 어닐링 온도 50℃에서, 서열 목록의 서열 번호 17, 18에 기재된 프라이머 13, 14와, 서열 목록의 서열 번호 18, 19에 기재된 프라이머 15, 16의 조합 4가지를 행했다. 그 결과, 서열 목록의 서열 번호 17에 기재된 프라이머 13(pR1)과 서열 목록의 서열 번호 18에 기재된 프라이머 15(Q6AposF)의 조합으로 행한 PCR로 약 0.8kb의 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다. 또한, 서열 목록의 서열 번호 16에 기재된 프라이머 13(pR1)과 서열 목록의 서열 번호 19에 기재된 프라이머 16(Q6abF1)의 조합으로 행한 PCR로 1.5k의 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다. 또한 그 외의 조합으로 행한 PCR의 경우는 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 없었다.
서열 목록의 서열 번호 16에 기재된 프라이머 13(pR1)과 서열 목록의 서열 번호 19에 기재된 프라이머 15(Q6AposF)의 조합으로 행한 축퇴성 PCR에 의해 증폭된 0.8kb의 DNA 단편을 아가로오스 겔로부터 잘라내어 통상법에 의해 DNA를 추출하고, pGEM－T 벡터(프로메가사)에 조립하여 대장균 JM109주를 형질전환하고, 50㎍/㎖의 암피실린에 의해 재조합체를 선택했다. 암피실린을 포함하는 LB배지에서 형질전환체를 배양하여 통상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 약 0.8kb의 인서트 부분의 염기 서열을 해독했다. 그 결과, 618bp의 오픈 리딩 프레임(이후 ORF2라고 호칭)이 확인되었다. ORF2의 염기 서열로부터 추정되는 N말단측 29개의 아미노산 서열과 상기에서 정제한 25K달톤의 폴리펩티드쇄의 N말단측의 29개의 아미노산 서열은 완전하게 일치하고 있고, 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열의 1번째에서 29번째까지의 서열에 상당한다. ORF2의 아미노산 서열은 기지의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛의 아미노산 서열과의 낮은 상동성을 나타내고, 상기 단백질을 코딩하는 것이 시사되었다.
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛은 205 아미노산을 코딩하고 있고, 기존의 데이터베이스 중에서 상동성을 가지는 단백질과의 아미노산 서열의 일치도는 높은 쪽부터 순서로, 호열균 바실루스 BR449주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛과 66.3％, 호열균 바실루스 스미시 SC－J05－1주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛과 63.9％로 낮다. 한편, 호열균 바실루스 BR449주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛과 호열균 바실루스 스미시 SC－J05－1주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛은 88.8％가 일치하여 높은 상동성을 가지고 있다.
실시예 12:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛 부분의 발현 벡터에의 조립과 대장균에서의 발현
(1) 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛 부분의 발현 벡터에의 조립
상기에서 해독한 염기 서열을 기초로, 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛 부분을 PCR에서 증폭하기 위한 올리고 뉴클레오티드 프라이머 이하 2종류를 작성했다. 서열 목록의 서열 번호 21에 기재된 프라이머 17(Q6ab－F1－T), 서열 목록의 서열 번호 22에 기재된 프라이머 18(Q6ABall－R1－BglII－T)이다. 서열 목록의 서열 번호 21에 기재된 프라이머 17은 제한 효소 부위 NdeI 안에, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛의 번역 개시 코돈을 설계했다. 서열 목록의 서열 번호 22에 기재된 프라이머 18에서는 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛의 번역 종지 코돈의 바로 아래에 제한 효소 BglII 구역을 도입했다. 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 서열 목록의 서열 번호 21, 22에 기재된 프라이머 17, 18을 각각 100p㏖ 이용해서 PCR을 했다. Ex　Taq　DNA 폴리머라아제를 이용해서 전량 100㎕로 96℃, 3분의 열 변성 후, 96℃ 30초 열 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 30초 신장 반응의 조건으로 PCR을 30 사이클한 후, 72℃에서 5분간 신장 반응시킨 후, 4℃로 냉각했다. PCR 후의 용액을 1.5중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공한 바, 약 1.3kb의 DNA 단편 증폭이 확인되었다. 이 증폭 DNA 산물을 아가로오스 겔로부터 통상법으로 추출하여 프로메가사의 pGEM－T 이지 벡터에 라이게이션하여 대장균 JM109주를 형질전환했다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 인서트 부분의 염기 서열을 해독하고, PCR에 의한 증폭에 에러가 없는 것을 확인했다.
다음에, 이 플라스미드를 NdeI, EcoRI 제한 효소로 소화시켜 1.5중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 약 1.3Kb의 인서트 DNA를 아가로오스 겔로부터 잘라내고, 통상법에 의해 추출했다. 발현 벡터에는 노바젠(Novagene)사의 pET－26b(＋)　벡터 및 pET－28a(＋)　벡터를 이용했다. 이 2종류의 벡터 DNA를 NdeI, EcoRI 제한 효소로 소화시켜 1중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 약 5.3Kb의 DNA 단편을 통상법에 의해 추출했다. 이들 인서트와 벡터를 통상법에 따라 라이게이션 반응시켜 대장균 JM109주를 형질전환하고, 카나마이신 내성으로 선택한 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 인서트가 도입된 플라스미드를 선출했다. 이상으로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛 부분이 인서트로서 도입된 발현 플라스미드를 취득했다. 이들 완성한 플라스미드를 pET－26b(＋)－βα 및 pET－28a(＋)－βα라고 이하 호칭한다.
(2) 대장균에서 발현시킨 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 활성
발현 플라스미드 pET－26b(＋)－βα 및 pET－28a(＋)－βα를 이용해서 노바젠사의 대장균 BL21(DE3) LysE주를 형질전환하고, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛 및 α서브유닛의 단백질을 T7 프로모터에 의해 폴리시스트론으로서 공발현시켰다.
각각의 발현 플라스미드를 이용하여 노바젠사제의 대장균 BL21(DE3) LysE주의 반응능(competent) 세포로의 형질전환을 하고, 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지(0.5중량％ 박토 효모 엑기스, 1중량％ 박토트립톤, 0.5중량％　NaCl, 2.0중량％　한천;pH7.5) 위에 형질전환 처리 후의 균액을 뿌리고, 30℃로 하룻밤 배양하여 카나마이신에 의한 선택을 했다. 이 형질전환체를 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB배지 2㎖에 식균하고, 30℃로 하룻밤 200rpm으로 진탕 배양을 했다. 전 배양액을 20㎍/㎖의 염화 코발트 6수화물(CoCl2·6H2O) 및 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB배지 10㎖에 2중량％ 식균하고, 30℃로 약 3시간, 200rpm으로 OD600=0.5가 될 때까지 진탕 배양을 하여 0.1mM의 IPTG를 첨가하고, T7 프로모터로부터의 발현을 유도한 후, 4시간 200rpm으로 진탕 배양을 하여 균체를 회수했다.
이 균체를 이용하여 27℃에 있어서 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 니트릴 히드라타아제 수화 활성을 측정했다.
지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제를 발현시킨 대장균의 균체를, 20mM의 Tris－HCl 및 15mM의 NaCl을 포함하는 TBS 완충액(pH7.5)에 재용해하고, OD=0.2가 되도록 희석하여 최종 농도 0.2중량％ 아크릴로니트릴 용액의 반응액을 작성했다. 27℃로 교반하면서 반응시키고, 30분 후에 100μL의 1규정 염산을 가함으로써 반응을 정지시켰다. 효소 활성의 단위(유닛)는 1분간에 1μ㏖의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 활성을 1유닛(이하, U라고 적는다)으로 정하고, 습균체 중량 당의 수화 활성(U/㎎)을 표 8에 나타냈다.
발현 플라스미드 활성(U/㎎)
pET－26b(＋) 벡터 0
pET－26b(＋)－βα 0.200
pET－28a(＋) 벡터 0
pET－28a(＋)－βα 0.212
이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛을 대장균으로 발현시켰을 경우에, 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환하는 니트릴 히드라타아제 활성을 가지는 것이 판명되었다.
실시예 13:콜로니 혼성화에 의한 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제 주변 유전자의 취득
(1) 형광 표식 DIG 프로브의 작성
서열 목록의 서열 번호 25에 기재된 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 부분의 DNA를 주형으로 이용하여 로슈사제의 DIG－DNA 라벨링 키트에 의해 형광 표식 프로브를 작성했다. 작성 방법은 로슈사의 DIG 매뉴얼에 따른다.
(2) 염색체 사우던 혼성화
실시예 11에서 제조한 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 염색체 DNA를 여러 가지 제한 효소를 이용해서 소화시켜 1중량％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공했다. 아가로오스 겔 내의 DNA를, 나일론 막 하이본드(Hybond)－N＋(아마샴사)에 전사한 후, 앞서 제조한 형광 표식 DIG 프로브를 이용해서 염색체 사우던 혼성화를 했다. DNA가 전사, 고정된 막을 1매당 10㎖의 혼성화 완충액(1중량％ 탈지 우유, 0.1중량％ N－라우로일자르코신, 0.02중량％ SDS, 50중량％ 포름아미드를 함유하는 5×SSC)에 담그고, 42℃로 2시간 예비혼성화했다. 상기와 같이 작성한 형광 표식 프로브 100ng을 95℃로 10분간의 비등 및 급냉 처리에 의해 열 변성을 시켜 프레하이브리제이션 완충액에 첨가하고, 42℃로 하룻밤 혼성화를 했다. 혼성화 후의 막을 150㎖의 0.1중량％ SDS를 포함하는 2×SSC로 실온에서 2회 세정했다. 다음에 65℃로 가열한 150㎖의 0.1중량％ SDS를 포함하는 1×SSC중에서 5분간의 세정을 2회 했다. 계속해서 100㎖의 말레산 완충액(0.1M 말레산, 0.15M　NaCl, NaOH를 이용해서 pH7.5로 제조가 끝난 상태)로 5분간 세정 후, 50㎖의 블로킹 용액(0.3중량％ 트윈(Tween) 20, 0.15M NaCl 및 1중량％ 탈지 우유를 포함하는 0.1M 말레산 완충액;pH7.5) 안에서 실온에서 30분간 블로킹 처리를 했다. 항디곡시게닌 AP를 75mU/㎖가 되도록 20㎖의 블로킹 용액으로 희석하여 실온에서 30분간의 항체 반응을 시킨 후, 100㎖의 세정 완충액(0.3중량％ 트윈 20, 0.15M NaCl을 포함하는 0.1M 말레산 완충액;pH7.5) 안에서 막을 5회 세정하여 결합하지 않은 항체를 씻어냈다. 20㎖의 검출 완충액(0.1M　Tris－HCl, 0.1M　NaCl, pH9.5) 안에서 5분간 평형화 처리를 한 후, 10㎖의 검출 완충액에 100mg/㎖의 NBT(니트로소블루 테트라졸리움 클로라이드) 용액을 34㎕, 50mg/㎖의 BCIP 용액을 35㎕를 희석한 발색 기질 용액 NBT/BCIP(5－브로모－4－클로로－3－인돌릴포스페이트)을 작성하고, 막이 완전하게 잠기도록 붓고 차광하여 1분 내지 16시간 인큐베이션했다. 인큐베이션 중에는 디스크를 움직이거나 흔들지 않고, 발색을 확인했다. 그 결과, 제한 효소 HindIII에 의해 소화되는 약 2.3kb 유전자 단편 안에, 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 부분의 하류 유전자가 포함되어 있는 것이 밝혀졌다.
(3) 콜로니 혼성화에 의한 목적 클론의 취득
① 콜로니 혼성화용의 플라스미드 라이브러리의 작성
다음에, 동 형광 표식 DIG 프로브를 이용해서 콜로니 혼성화를 했다. 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 염색체 DNA 10㎍을 1중량％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 아가로오스 겔로부터 약 2.0kb 내지 2.6kb의 DNA 단편을 포함하는 부분을 잘라내고, 상기와 같은 방법으로 DNA 단편을 추출 및 정제했다. 얻어진 DNA 단편을 DNA 라이게이션 키트(다까라사제)를 이용해서 pUC118 플라스미드 벡터(다까라사제)의 멀티 클로닝 구역 내에 있는 HindIII 제한 효소 부위에 도입했다. 라이게이션에 이용한 pUC118 플라스미드 벡터 DNA는 제한 효소 HindIII로 소화시킨 후에 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전에 의한 정제를 하고, 계속해서 알칼리포스파타아제(다까라사제)를 이용한 5＇말단의 탈인산화 처리 후에 재차 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전을 하여 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 아가로오스 겔로부터 추출에 의한 재정제를 실시한 것을 사용했다.
약 2.0kb 내지 2.6kb로 단편화된 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 염색체 DNA를 pUC118 플라스미드 벡터와 HindIII 제한 효소 부위에서 라이게이션 한 용액을 이용하여 대장균 JM109주를 형질전환하고, 50㎍/㎖의 암피실린, 1mM의 IPTG(이소프로필－β－D－티오갈락토피라노사이드) 및 2중량％ X－Gal(5－브로모－4－클로로－3－인돌릴－β－D－갈락토피라노시드)을 함유하는 LB 한천 배지(0.5중량％ 박토 효모 엑기스, 1중량％ 박토트립톤, 0.5중량％ NaCl, 2.0중량％ 한천;pH7.5) 위에 뿌리고, 37℃로 하룻밤 배양했다. 그 결과, 1매당 50개 내지 500개의 흰색 콜로니가 출현되어 있는 페트리 디쉬를 다수개 취득할 수 있었다.
이들 염색체 DNA의 플라스미드 라이브러리에 대해서 앞서 제조한 형광 표식 DIG 프로브를 이용해서 콜로니 혼성화를 하여 목적하는 니트릴 히드라타아제 α서브유닛의 하류 유전자를 포함하는 클론을 스크리닝했다.
② 콜로니 혼성화에 의한 목적 클론의 취득
우선, 출현한 흰색 콜로니 약 1000클론을, 멸균을 끝낸 이쑤시개를 이용해서 새로운 LB 한천 배지에 다시 스트리킹했다. 이 때, 막을 혼성화시키는 LB 한천 배지와 보존용의 LB 한천 배지에 마찬가지로 스트리킹하고, 30℃로 하룻밤 배양했다.
다음에, 콜로니가 돋아난 페트리 디쉬 위에 아마샴사제의 나일론 막 하이본드－N＋를 조심스레 두고, 1분 후 끝부터 핀셋을 이용해서 천천히 제거했다. 벗긴 막을, 균체가 부착되어 있는 면을 위로 해서 변성 용액(1.5M의 NaCl을 포함하는 0.5M의 NaOH 수용액)에 7분간 담근 후, 중화 용액(1.5M의 NaCl과 1mM의 EDTA·2Na를 포함하는 0.5M 트리스 염산 수용액;pH7.2)에 3분간 담그고, 새로운 중화 용액에 다시 3분간 담궜다. 다음에, 2×SSC 용액(1×SSC 1리터 중에 NaCl 8.76g, 시트르산 나트륨 4.41g을 포함한다)으로 1회 세정을 한 후, 마른 여과지 위에서 막을 풍건했다. 또한 120mJ/cm2의 UV조사를 함으로써 막 위에 DNA를 고정시켰다.
③ DIG 항체에 의한 검출 및 목적 클론의 단리
상기에서 처리한, DNA가 고정된 막을 1매당 10㎖의 혼성화 완충액(1중량％ 탈지 우유, 0.1중량％ N－라우로일자르코신, 0.02중량％ SDS, 50중량％ 포름아미드를 함유하는 5×SSC)에 담그고, 42℃로 2시간 예비혼성화를 했다. 상기와 같이 작성한 형광 표식 프로브 100ng을 95℃로 10분간의 비등 및 급냉 처리에 의해 열 변성을 시켜 예비혼성화 완충액에 첨가하고, 42℃로 하룻밤 혼성화를 했다. 혼성화 후의 막을 150㎖의 0.1중량％ SDS를 포함하는 2×SSC로 실온에서 2회 세정했다. 다음에 65℃로 가열한 150㎖의 0.1중량％ SDS를 포함하는 1×SSC중에서 5분간의 세정을 2회 했다. 계속해서 100㎖의 말레산 완충액(0.1M 말레산, 0.15M　NaCl, NaOH를 이용해서 pH7.5로 조정을 끝냄)로 5분간 세정 후, 50㎖의 블로킹 용액(0.3중량％ 트윈 20, 0.15M　NaCl 및 1중량％ 탈지 우유를 포함하는 0.1M 말레산 완충액;pH7.5) 안에서 실온에서 30분간 블로킹 처리를 했다. 항디곡시게닌 AP를 75mU/㎖가 되도록 20㎖의 블로킹 용액으로 희석하여 실온에서 30분간의 항체 반응을 시킨 후, 100㎖의 세정 완충액(0.3중량％ 트윈 20, 0.15M　NaCl을 포함하는 0.1M 말레산 완충액;pH7.5) 안에서 막을 5회 세정하여 결합하지 않은 항체를 씻어냈다. 20㎖의 검출 완충액(0.1M　Tris－HCl, 0.1M　NaCl, pH9.5) 안에서 5분간 평형화 처리를 한 후, 10㎖의 검출 완충액에 100mg/㎖의 NBT 용액을 34㎕, 50mg/㎖의 BCIP 용액을 35㎕를 희석한 발색 기질 용액 NBT/BCIP를 작성하고, 막이 완전하게 잠기도록 붓고 차광하여 1분 내지 16시간 인큐베이션했다. 인큐베이션 중에는 디스크를 움직이거나 흔들지 않고, 발색을 확인했다. 그 결과, 상기 막 위의 1000클론 중, 양성 신호를 4개소 발견하고, 그 위치와 겹치는 양성 클론을 원래의 페트리 디쉬 위에서 확인했다.
(4) 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 부분의 하류 유전자를 포함하는 포지티브 클론의 해석
확인된 포지티브 클론을 페트리 디쉬로부터 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에 식균하고, 37℃·250rpm으로 하룻밤 진탕 배양을 하여 균체를 원심에 의해 회수하고, 통상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출했다. 플라스미드 DNA를 제한 효소 HindIII로 소화시킨 후에, 1.5중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 삽입 단편의 크기의 확인을 한 바, 약 2.3kb의 크기였다. 또 삽입 단편이 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 부분을 포함하는 것을 수 패턴의 PCR 및 제한 효소에 의한 소화 패턴에 의해 확인했다.
이상으로부터 취득된 본 플라스미드를 pUC118－Q6Hin 2.3이라고 명명하고, 삽입 단편의 전 염기 서열을 결정했다. 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 및 하류 유전자군의 제한 효소 지도 및 유전자 구성을 도 1에 기재했다.
그 결과, 삽입 단편 중에 339bp의 염기 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임(이하, ORF3이라고 호칭한다)이 니트릴 히드라타아제 α서브유닛(ORF2)의 5＇말단측 하류에 같은 방향으로 존재하는 것이 확인되었다. ORF2의 번역 종지 코돈과 ORF3의 번역 개시 코돈의 사이는 12bp이며, ORF3의 번역 종지 코돈과 더욱 하류에 위치하는 ORF의 번역 개시 코돈의 사이는 145bp였다. ORF3은 112 아미노산을 코딩하고 있고, 기존의 데이터베이스 중의 이하의 단백질과 대단히 낮은 상동성을 가지고 있었다. 기존의 데이터베이스 중에서 상동성이 높은 서열과의 아미노산의 일치하는 비율은 바실루스속 BR449주의 P12K와 31％, 로도코커스·로도크로우스 J1주의 NhhG와 31％, 로도코커스·로도크로우스 J1주의 NhlE와 21％, 슈도노카르디아·서모필라 JCM3095주의 P16과 23％였다.
실시예 14:지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛 및 하류 유전자 ORF3의 발현 플라스미드의 구축
pET－26b(＋)－βα 및 pET－28a(＋)－βα플라스미드를 제한 효소 HindIII로 소화시켜 탈인산화 반응시키고, 페놀 클로로포름으로 추출함으로써 탈인산화 처리를 했다. 이 소화 산물을 1중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 약 6.1Kb의 DNA 단편을 통상법에 의해 추출했다. 이 DNA 단편에는 pET 벡터 및 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛 및 α서브유닛의 60번째의 아미노산에 위치하는 HindIII 제한 효소 부위까지가 포함되어 있다.
다음에, pUC118－Q6Hin 2.3 플라스미드를 제한 효소 HindIII에 의해 소화시켜 1중량％ 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 약 2.3kb의 인서트 DNA를 추출했다. 이 인서트를, 앞서 추출한 단편과 라이게이션을 하여 대장균 JM109주를 형질전환하고, 카나마이신 내성으로 선택한 형질전환체로부터 인서트 DNA를 포함하는 플라스미드를 선출했다. 인서트의 방향을 PCR에 의해 확인함으로써 pET－26b(＋) 및 pET－28a(＋) 벡터에 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛 및 하류 유전자 ORF3과 또한 하류역이 포함된 플라스미드를 취득했다. 이렇게 해서 완성한 플라스미드를 pET－26b(＋)－βα12 및 pET－28a(＋)－βα12라고 이하 호칭한다.
다음에, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛, β서브유닛 및 하류 유전자 ORF3의 번역 종지 코돈까지를 도입하고, 3 종류의 단백질이 공발현되도록 하는 발현 플라스미드를 구축했다. 앞서 구축한 플라스미드 pET－26b(＋)－βα12를 제한 효소 NdeI 및 BglII로 소화시켜 1.5중량％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, α서브유닛, β서브유닛 및 하류 유전자 ORF3의 번역 종지 코돈까지를 포함하는 1.7kb 유전자 단편을 통상법에 의해 추출했다. 동시에, 발현 벡터 pET－26b(＋) 및 pET－28a(＋)를, NdeI 및 BamHI로 소화시켜 1중량％ 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 5.3kb의 벡터 부분의 유전자 단편을 통상법에 의해 추출했다. 이들 벡터를 앞서 추출한 α서브유닛, β서브유닛 및 하류 유전자 ORF3의 번역 종지 코돈까지를 포함하는 1.7kb 유전자 단편을 인서트로 해서 통상법에 따라 라이게이션 반응을 시켰다. 이 반응시, BglII 제한 효소로 소화시킨 말단과 BamHI 제한 효소로 소화시킨 말단이 접착된다. 라이게이션 반응 후의 용액을 이용해서 대장균 JM109주를 형질전환하고, 카나마이신 내성으로 선택한 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 인서트가 도입된 플라스미드를 선출했다. 이상으로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛, β서브유닛 부분 및 하류 유전자 ORF3이 인서트로서 도입되어 3 종류의 단백질이 공발현되도록 하는 발현 플라스미드를 취득했다. 이들 목적하는 플라스미드를 pET－26b(＋)－βα1 및 pET－28a(＋)－βα1이라고 이하 호칭한다.
실시예 15:대장균에서 하류 유전자를 공발현시킨 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 활성
발현 플라스미드 pET－26b(＋)－βα 및 pET－28a(＋)－βα를 이용해서 노바젠사의 대장균 BL21(DE3) LysE주를 형질전환하고, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛 및 α서브유닛의 단백질을 T7 프로모터에 의해 공발현시켰다. 마찬가지로 pET－26b(＋)－βα1 및 pET－28a(＋)－βα1을 이용해서 노바젠사의 대장균 BL21(DE3) LysE주를 형질전환하고, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 β서브유닛, α서브유닛 및 하류 유전자 ORF3의 단백질을 T7 프로모터에 의해 공발현시켰다. 컨트롤로서 발현 벡터 pET－26b(＋) 및 pET－28a(＋)를 이용해서 노바젠사의 대장균 BL21(DE3) LysE주를 형질전환한 형질전환체를 이용했다.
각각의 발현 플라스미드를 이용하여 노바젠사제의 대장균 BL21(DE3) LysE주의 반응능 세포로의 형질전환을 하고, 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지(0.5중량％ 박토 효모 엑기스, 1중량％ 박토트립톤, 0.5중량％　NaCl, 2.0중량％　한천;pH7.5) 위에 형질전환 처리 후의 균액을 뿌리고, 30℃로 하룻밤 배양하여 카나마이신 내성에 의한 선택을 했다. 이 형질전환체를 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB배지 2㎖에 식균하고, 30℃로 하룻밤 200rpm으로 진탕 배양을 했다. 전 배양액을 20㎍/㎖의 염화 코발트 6수화물(CoCl2·6H2O) 및 30㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB배지 10㎖에 2중량％ 식균하고, 30℃로 약 3시간, 200rpm으로 OD600=0.5가 될 때까지 진탕 배양을 하고, 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 T7 프로모터로부터의 발현을 유도시키고, 다시 약 4시간 200rpm으로 진탕 배양을 하여 균체를 회수했다.
이와 같이 해서 얻어진 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주 유래의 니트릴 히드라타아제를 발현시킨 대장균의 균체를, 20mM의 Tris－HCl 및 15mM의 NaCl을 포함하는 TBS 완충액(pH7.5)에 재현탁하고, OD=0.2가 되도록 희석하여 최종 농도 0.2중량％ 아크릴로니트릴 용액의 반응액을 작성했다. 27℃로 교반하면서 반응시키고, 10분 후, 30분 후에 100μL의 1규정 염산을 가함으로써 반응을 정지시켰다. 효소 활성의 단위(유닛)는 1분간에 1μ㏖의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 활성을 1유닛(이하, U라고 적는다)으로 정하고, 습균체 중량 당의 수화 활성(U/㎎)을 표 9에 나타냈다.
발현 플라스미드 활성 (U/㎎)
pET－26b(＋) 벡터 0
pET－26b(＋)－βα 0.20
pET－26b(＋)－βα1 2.74
pET－28a(＋) 벡터 0
pET－28a(＋)－βα 0.21
pET－28a(＋)－βα1 4.22
이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제 α서브유닛 및 β서브유닛만을 발현시켰을 경우와 하류 유전자 ORF3를 공발현시켰을 경우를 비교하면, 하류 유전자 ORF3의 존재에 의해 니트릴 히드라타아제 활성이 현저하게 증가한 것을 알 수 있다. ORF3이 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제의 효소 활성을 현저하게 상승시키는 기능을 가지는 것이 밝혀졌다.
실시예 16:대장균에서 발현시킨 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제의 열 안정성
활성의 열 안정성을 조사하기 위해서 발현 벡터 pET26b(＋)－βα를 가지고, 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제를 발현시킨 대장균액(20mM의 Tris－HCl 및 15mM의 NaCl을 포함하는 TBS 완충액(pH7.5))을 30분간 30, 65, 70℃에서 보온 처리를 했다. 보온 처리 후, 얼음 위에서 냉각시키고, 27℃로 보온하여 온도를 일정하게 한 후, 반응 온도 27℃에서 니트릴 히드라타아제 활성을 측정했다. 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제를 발현시킨 대장균의 균을 OD=0.2의 탁도로 현탁하고, 최종 농도 0.5중량％ 아크릴로니트릴 용액의 반응액을 작성하여 27℃로 교반하면서 반응을 개시하고, 30분 후에 10액량％의 1규정 염산을 가함으로써 반응을 정지시켰다. 30℃에서의 보온 처리를 했을 경우의 활성을 기준(100％)으로 한 환산치로서 표 10에 나타낸다.
처리 온도(℃) 잔존 활성(％)
30 100.0
65 102.5
70 83.9
이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시데시우스 Q－6주의 니트릴 히드라타아제를 발현시킨 대장균에 있어서의 니트릴 히드라타아제의 효소 활성은 70℃라고 하는 고온 하에서도 약 80％의 활성을 유지할 수 있고, 대장균으로 발현시켰을 경우에 있어서도 높은 내열성을 가지고 있어 공업적으로도 대단히 유용한 효소라고 말할 수 있다.
본 발명의 조성물은 열이나 고농도의 니트릴, 아미드 화합물에 대해서 높은 안정성을 나타내고, 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 효율적으로 변환시키는 효과를 가진다. 본 발명의 조성물은 고온, 및 고니트릴 화합물 농도나 고아미드 화합물 농도하의 반응에 있어서도 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 변환시키는 분야에서 아주 적합하게 이용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (49)

  1. (a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고,
    (b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타내고,
    (c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같고
    서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 695-1312위로부터 코딩되는 서브유닛 α: 분자량 25000±2000
    서열번호 2 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 1-681위로부터 코딩되는 서브유닛 β: 분자량 28000±2000
    (d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존하고,
    (e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않으며,
    (f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가지는
    이화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질을 코딩하는 DNA.
  2. 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 α서브유닛 유전자를 갖는 염기 서열과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 β서브유닛 유전자를 갖는 염기 서열의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  3. 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위의 서열을 갖는 DNA와, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위의 서열을 갖는 DNA의 조합을 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 목록의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA가 추가로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1325－1663위의 서열을 갖는 DNA가 추가로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA.
  6. 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 니트릴 히드라타아제의 α서브유닛 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  7. 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 니트릴 히드라타아제의 β서브유닛 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  8. 서열 목록의 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열을 코딩하는 니트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 것을 특징으로 하는 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 DNA.
  9. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스(Geobacillus)속 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  10. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) 종 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  11. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)　Q－6주(FERM　BP－08658) 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  12. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항 기재의 DNA를 조립한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  13. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물, 또는 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) Q－6주(FERM　BP－08658)인 미생물.
  14. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  15. 지오바실루스속에 속하며,
    (a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고,
    (b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타내고,
    (c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같고,
    서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 695-1312위로부터 코딩되는 서브유닛 α: 분자량 25000±2000
    서열번호 2 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 1-681위로부터 코딩되는 서브유닛 β: 분자량 28000±2000
    (d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존하고
    (e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않으며,
    (f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가지는
    이화학적 성질을 갖는 단백질을 생산할 수 있는 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  16. 제14항 기재의 제조 방법에 의해 배양된 미생물로부터 취득된, 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 균체 처리물.
  17. (a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고,
    (b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타내고,
    (c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같고,
    서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 695-1312위로부터 코딩되는 서브유닛 α: 분자량 25000±2000
    서열번호 2 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 1-681위로부터 코딩되는 서브유닛 β: 분자량 28000±2000
    (d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존하고,
    (e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않으며,
    (f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가지는
    이화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  18. 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열을 갖는 β서브유닛을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  19. 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 695－1312위의 서열을 갖는 DNA가 코딩하는 α서브유닛과, 서열 목록의 서열 번호 3의 염기 서열의 1－681위의 서열을 갖는 DNA가 코딩하는 β서브유닛을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  20. 적어도 서열 목록의 서열 번호 1 기재의 아미노산 서열인 α서브유닛을 갖는 폴리펩티드와, 서열 목록의 서열 번호 2 기재의 아미노산 서열인 β서브유닛을 갖는 폴리펩티드 중 어느 한쪽, 또는 양쪽을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  21. (a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고,
    (b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타내고,
    (c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같고,
    서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 695-1312위로부터 코딩되는 서브유닛 α: 분자량 25000±2000
    서열번호 2 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 1-681위로부터 코딩되는 서브유닛 β: 분자량 28000±2000
    (d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존하고,
    (e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않으며,
    (f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가지는
    이화학적 성질을 갖는 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물을 니트릴 화합물에 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물, 또는 지오바실루스속에 속하며,
    (a) 니트릴 히드라타아제 활성을 가지고,
    (b) 기질 특이성:아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n－발레로니트릴, n－부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 해서 활성을 나타내고,
    (c) 분자량:적어도 하기 2종류의 서브유닛으로 구성되는 단백질로서, 각 서브유닛의 환원형 SDS－폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같고,
    서열번호 1 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 695-1312위로부터 코딩되는 서브유닛 α: 분자량 25000±2000
    서열번호 2 기재의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 3 기재의 염기 서열 1-681위로부터 코딩되는 서브유닛 β: 분자량 28000±2000
    (d) 열 안정성:수액 중의 효소를 70℃의 온도로 30분 가열 후에, 가열 전의 35％ 이상의 활성이 잔존하고,
    (e) 6중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 해도 그 이하의 기질 농도 시에 비해 활성이 감소하지 않으며,
    (f) 35중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 가지는
    이화학적 성질을 갖는 단백질을 생산할 수 있는 미생물 중 어느 하나를 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물에 니트릴 화합물을 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
  23. 제4항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스(Geobacillus)속 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  24. 제5항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스(Geobacillus)속 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  25. 제4항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) 종 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  26. 제5항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) 종 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  27. 제4항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)　Q－6주(FERM　BP－08658) 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  28. 제5항에 있어서, 상기 DNA가 지오바실루스·서모글루코시데시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)　Q－6주(FERM　BP－08658) 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
  29. 제4항 기재의 DNA를 조립한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  30. 제5항 기재의 DNA를 조립한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  31. 제9항 기재의 DNA를 조립한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  32. 제10항 기재의 DNA를 조립한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  33. 제11항 기재의 DNA를 조립한 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  34. 제4항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물.
  35. 제5항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물.
  36. 제9항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물.
  37. 제10항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물.
  38. 제11항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물.
  39. 제4항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  40. 제5항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  41. 제9항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  42. 제10항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  43. 제11항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
  44. 제15항 기재의 제조 방법에 의해 배양된 미생물로부터 취득된, 상기 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 균체 처리물.
  45. 제4항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물에 니트릴 화합물을 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
  46. 제5항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물에 니트릴 화합물을 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
  47. 제9항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물에 니트릴 화합물을 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
  48. 제10항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물에 니트릴 화합물을 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
  49. 제11항 기재의 DNA에 의해 형질전환된 미생물을 배지에서 배양해서 얻은 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 균체 처리물에 니트릴 화합물을 작용시켜 상기 니트릴 화합물로부터 유도되는 아미드 화합물을 취득하는 것을 특징으로 하는 아미드 화합물의 제조 방법.
KR1020057023755A 2003-06-10 2004-06-10 신규 니트릴 히드라타아제 KR100806991B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2003-00164773 2003-06-10
JP2003164773 2003-06-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060016115A KR20060016115A (ko) 2006-02-21
KR100806991B1 true KR100806991B1 (ko) 2008-02-25

Family

ID=33508825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057023755A KR100806991B1 (ko) 2003-06-10 2004-06-10 신규 니트릴 히드라타아제

Country Status (6)

Country Link
JP (1) JP4108095B2 (ko)
KR (1) KR100806991B1 (ko)
CN (1) CN1806047A (ko)
AU (1) AU2004245849B2 (ko)
TW (1) TW200504211A (ko)
WO (1) WO2004108942A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200634151A (en) * 2004-12-09 2006-10-01 Asahi Chemical Ind Transformant expressing nitrile hydratase
JP2007181404A (ja) * 2005-12-29 2007-07-19 Institute Of Physical & Chemical Research イソニトリル加水分解酵素、およびアミンの製造方法
JP5120852B2 (ja) * 2006-07-06 2013-01-16 国立大学法人 筑波大学 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法
JP5080787B2 (ja) * 2006-11-15 2012-11-21 達彦 小林 タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法
KR101995103B1 (ko) 2014-06-06 2019-07-03 미쯔비시 케미컬 주식회사 개량형 니트릴 히드라타제
CN107075494B (zh) * 2014-09-30 2021-11-23 巴斯夫欧洲公司 制备具有较少丙烯酸的酰胺化合物的手段和方法
CN111334495B (zh) * 2020-03-12 2022-04-29 宜昌东阳光生化制药有限公司 制备右旋酰胺酮洛芬的方法
CN113444714B (zh) * 2021-07-29 2022-06-21 浙江大学杭州国际科创中心 一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6153415A (en) * 1998-04-29 2000-11-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for producing amide compounds using a nitrile hydratase from a thermophilic bacillus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
미국특허공보 제6153415호 (2000.11.28)

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004245849B2 (en) 2008-10-09
TWI321151B (ko) 2010-03-01
KR20060016115A (ko) 2006-02-21
JP4108095B2 (ja) 2008-06-25
CN1806047A (zh) 2006-07-19
TW200504211A (en) 2005-02-01
AU2004245849A1 (en) 2004-12-16
JPWO2004108942A1 (ja) 2006-07-20
WO2004108942A1 (ja) 2004-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2000228990A (ja) 複製可能なｄｎａ、形質転換された微生物、プラスミドベクター及びｄ−パントテン酸の製造方法
US6287828B1 (en) Method for producing amide compounds using a nitrile hydratase from a thermophilic bacillus
JPWO2006062189A1 (ja) ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体
JP6044675B2 (ja) Ｄ−サクシニラーゼ、およびこれを用いたｄ−アミノ酸の製造方法
US7553652B2 (en) Process for the preparation of (S)- or (R)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid
KR100806991B1 (ko) 신규 니트릴 히드라타아제
Takashima et al. Nitrile hydratase from a thermophilic Bacillus smithii
US6596528B2 (en) Heat-stable D-aminoacylase
US7977073B2 (en) Polynucleotide encoding a thermostable amide hydrolase and methods for producing an L-α-amino acid
JP5096911B2 (ja) ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法
JP4627039B2 (ja) アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子
JP2006055131A (ja) 新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその遺伝子
AU1568900A (en) Method for isolating and selecting genes coding for enzymes, and suitable culture medium
JP2005328787A (ja) ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規な微生物、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子及びアミド化合物の製造方法
KR20030006724A (ko) 신규한 ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자,그의 제조방법, 이를 이용한 ｄ-아미노산의 제조방법
EP1526180A1 (en) Bifunctional gene for mannosylglycerate synthesis
JP2003125784A (ja) 新規チロシン脱炭酸酵素

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130118

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140117

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150119

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160119

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170119

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee