JP5080787B2 - タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質改変方法などに関する。より詳しくは、新規メカニズムに基づくタンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ、該成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法に関する。

タンパク質の改変は、タンパク質の機能、性質、活性、安定性、局在性などに深く関わっている。例えば、リン酸化のようなタンパク質の修飾による改変は、生体内でのタンパク質機能制御やシグナル伝達などに関わっている。また、活性中心に金属を含有する酵素などに、金属元素を結合又は付加、若しくは脱離することによる改変は、該酵素の活性に関わっている。その他、特定のリガンドの結合若しくは脱離、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加などにより、構造や機能が改変されるタンパク質も多く存在する。

特許文献１には、アルツハイマー病等に関与するタウタンパク質のリン酸化方法が、特許文献２には、生理活性タンパク質をポリエチレングリコール、多糖等で修飾する方法が、特許文献３には、生理活性ペプチド又は生理活性タンパク質にアミノ供与体を有する物質を修飾する方法が開示されている。

また、非特許文献１では、一般的な金属部位の生合成メカニズムが、特許文献４では、結合タンパク質からリガンドを脱離する方法が開示されている。

なお、ニトリルヒドラターゼを成熟化（活性化）させる方法として、特許文献５では、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する遺伝子を用いて活性化したニトリルヒドラターゼを発現させる方法が、非特許文献２には、鉄型ニトリルヒドラターゼを成熟化させる遺伝子を用いて成熟化した鉄型ニトリルヒドラターゼを発現させる方法が開示されている。
特開２００２−３３５９８３号公報。 ＷＯ９６／０６１８１。 ＷＯ９６／１００８９。 特表平９−５０９２４９号公報。 特開平１１−２５３１６８号公報。 Chem.Rev.2004,104,509-525。 FEBS Letters 553(2003)391-396。

上記のように、タンパク質の改変は、タンパク質の機能、性質、活性、安定性、局在性などにおいて、非常に重要な役割を担っている。そのため、タンパク質の新規な改変方法の開発が期待されている。

そこで、本発明では、新規メカニズムに基づくタンパク質改変方法を提供するとともに、該方法の産業的利用を可能とすることを主目的とする。

本願発明者らは、複数のサブユニットから構成されるタンパク質の改変方法を研究した結果、一部のサブユニットを交換することにより、タンパク質を改変する新規なメカニズムを見出した。

本発明では、まず、タンパク質中の特定のサブユニット（Ａ）を、下記のいずれか一つ以上の特徴を有するタンパク質（Ｂ）に交換する段階を含むタンパク質改変方法を提供する。
（１）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、前記構造の一部が修飾されたタンパク質（Ｂ）。
（２）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離がされたタンパク質（Ｂ）。
（３）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、リガンドの結合若しくは脱離がされたタンパク質（Ｂ）。
（４）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされたタンパク質（Ｂ）。

従来、複数のサブユニットから構成されるタンパク質の改変方法は、該タンパク質を構成するサブユニット自体を直接修飾等することにより改変する方法であった。即ち、改変前の構成サブユニットは、何らかの改変が行われているものの、改変後にも該タンパク質を構成するサブユニットとして残存していた。

しかし、本発明に係るタンパク質改変方法は、タンパク質中の一部のサブユニット（Ａ）が、該タンパク質外に存在する任意のタンパク質（Ｂ）と入れ替わる方法である。即ち、改変前のサブユニット（Ａ）は、前記タンパク質中には残存しない新規な方法である。

本発明に係るタンパク質改変方法は、あらゆるタンパク質改変に用いることができる。例えば、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、アシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、リン酸化、硫酸化、ISG15化、SUMO化、ユビキチン化、シトルリン化、脱アミノ化、前記構造の一部のジスルフィド化、前記構造の一部のタンパク質切断などの修飾機構のいずれか又は複数による修飾に基づくタンパク質改変、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離に基づくタンパク質改変、リガンド結合若しくは脱離に基づくタンパク質改変、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加に基づくタンパク質改変などに用いることができる。

また、本発明に係るタンパク質改変方法は、酵素として機能するタンパク質の改変にも用いることができる。該酵素は特に限定されないが、一例としては、ニトリルヒドラターゼを挙げることができる。

本発明に係るタンパク質改変方法を用いてニトリルヒドラターゼを改変する方法の一例として、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を説明する。ニトリルヒドラターゼは、αサブユニット、及びβサブユニットから形成され、その活性中心に金属元素を有する酵素であるが、金属元素の含有量が低いと、その活性も低い。そこで、ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットを、金属元素高含有型αサブユニットに交換することで、金属元素含有量を高め、酵素活性の高いニトリルヒドラターゼへと成熟化することができる。

本発明に係る成熟化方法は、微生物由来のニトリルヒドラターゼに用いることができ、その微生物の種は限定されない。一例としては、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のニトリルヒドラターゼを挙げることができる。

また、ニトリルヒドラターゼの活性中心金属も限定されない。工業的に多く用いられるものとしては、例えば、コバルト元素を活性中心に持つコバルト型ニトリルヒドラターゼが挙げられる。

本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化において、交換に用いる金属元素高含有型αサブユニットは、そのαサブユニット同士の交換に支障がなければ、その形態は限定されない。例えば、他のタンパク質と複合体を形成した状態で用いることも可能である。

この場合、それぞれのαサブユニット同士が交換されるので、成熟化後、成熟化ニトリルヒドラターゼは金属元素高含有型αサブユニットを含有し、一方の前記タンパク質複合体は金属元素低含有量αサブユニット含有することとなる。

本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化に用いることが可能であり、かつ、コバルト元素高含有型αサブユニットを含むタンパク質複合体として、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、を有するタンパク質複合体を例示する。

本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を用いれば、酵素活性の高い成熟化ニトリルヒドラターゼを大量に生産することができる。成熟化ニトリルヒドラターゼは、様々なニトリル化合物からアミド化合物への変換酵素として、アミド化合物の工業的生産に用いることができる。例えば、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として用いることができる。また、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素としても用いることができる。

以下、本発明で使用する技術用語等を説明する。

「タンパク質の改変」とは、タンパク質の構造の一部の修飾、金属元素等の結合又は付加若しくは脱離、リガンドの結合若しくは脱離、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加、などに基づいて、該タンパク質の機能、活性、安定性、局在性などの性質を変化させることを意味する。

「修飾」とは、広く翻訳後修飾を意味し、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、アシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、リン酸化、硫酸化、ISG15化、SUMO化、ユビキチン化、シトルリン化、脱アミノ化、前記構造の一部のジスルフィド化、前記構造の一部のタンパク質切断などの修飾機構のいずれか又は複数によるもの、及び、これらを工業的に行うことを含む。

「成熟化ニトリルヒドラターゼ」とは、構造変換により、活性中心金属含有量が高く活性化した状態の酵素を意味する。

本発明に係るタンパク質改変方法は、従来のタンパク質改変方法とは全く異なるメカニズムに基づく方法であるため、あらゆる分野において、様々な状況に応じて、タンパク質改変方法の選択の幅を増やすことができる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

＜タンパク質改変方法について＞
本発明に係るタンパク質改変方法について、図１を用いて説明する。

図１は、本発明に係るタンパク質改変方法を模式的に示す図である。

図１中符号１は、サブユニットＡとサブユニットＣから構成されるタンパク質を示している。該タンパク質１は、便宜上、２つのサブユニットから構成されるタンパク質を例示しているが、３つ以上のサブユニットから構成されるタンパク質であってもよい。該タンパク質１の特定のサブユニットＡが、別のタンパク質Ｂと交換されることにより、改変されたタンパク質２１となる（図１中（Ｉ）参照）。

タンパク質Ｂは、下記のいずれか一つ以上の特徴を有するタンパク質である。
（１）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、前記構造の一部が修飾されたタンパク質。
（２）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離がされたタンパク質。
（３）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、リガンドの結合若しくは脱離がされたタンパク質。
（４）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされたタンパク質。図１では、タンパク質Ｂの一例として、サブユニットＡと同一の構造を有し、かつ、リン酸化により修飾されたタンパク質（「タンパク質Ａｐ」と称する。）を例示して説明する（図１中かっこ参照）。

タンパク質１は、その構成サブユニットＡを、リン酸化により修飾されたタンパク質Ａｐに交換することにより、リン酸化により改変されたタンパク質２２となる（図１中（II）参照）。

タンパク質Ｂは、リン酸化による修飾をうけたタンパク質Ａｐに限定されない。例えば、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、アシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、硫酸化、ISG15化、SUMO化、ユビキチン化、シトルリン化、脱アミノ化、前記構造の一部のジスルフィド化、前記構造の一部のタンパク質切断などの修飾機構のいずれか又は複数によるもの、及び、これらを工業的に行うことにより修飾されたタンパク質であってもよい。

また、タンパク質Ｂは、サブユニットＡと同一又は近似の構造を有するタンパク質であって、任意の金属元素を結合又は付加若しくは脱離、特定のリガンドの結合若しくは脱離、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加、などの特徴を有するタンパク質であってもよい。

更に、タンパク質Ｂは、サブユニットＡとの交換に支障がなければ、その形態は限定されない。例えば、他のタンパク質と複合体を形成した状態で用いることも可能である。

このように、本発明に係るタンパク質改変方法は、タンパク質１の構成サブユニットＡ、Ｃ自体を直接、修飾等するのではなく、タンパク質１中の特定のサブユニットＡを、タンパク質１外に存在し、修飾等された別のタンパク質Ｂに交換することにより、タンパク質１全体としての改変を行う新規メカニズムに基づく改変方法である。

本発明に係るタンパク質改変方法は、酵素として機能するタンパク質の改変などにも用いることができる。本発明に係るタンパク質改変方法を用いれば、例えば、酵素活性の強弱の調節、酵素基質特異性の変更、至適温度・至適ｐＨの変更、アポ酵素からホロ酵素への変換、局在部位の変更などの酵素タンパク質の改変が可能である。

本発明に係る酵素タンパク質の改変について、ニトリルヒドラターゼを例示して説明する。

＜ニトリルヒドラターゼ成熟化方法＞
図２は、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を模式的に示す図である。

図２（I）は、４量体及び２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼを示す。未成熟ニトリルヒドラターゼとは、構造変換が不完全で、活性中心金属含有量が低く、酵素活性の低いニトリルヒドラターゼを意味する。図２中符号α１は、ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットを示す。図２中符号βは、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットを示す。

図２中符号α２は、金属元素高含有型αサブユニットを示す。図２に示すように、４量体及び２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１を、金属元素高含有型αサブユニットα２に交換する。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化する（図２（II）参照）。

本発明に係る成熟化方法は、微生物由来のニトリルヒドラターゼの成熟化に用いることができ、その微生物の種は限定されない。例えば、Achromobacter属、Acinetobacter属、Aeromonas属、Agrobacterium属、Bacillus属、Citrobacter属、Corynebacterium属、Enterobacter属、Erwinia属、Klebsiella属、Micrococcus属、Nocardia属、Pseudomonas属、Pseudonocardia属、Rhodococcus属 Streptomyces属、Thermophila属、Rhizobium属、Xanthobacter属などに属する微生物由来のニトリルヒドラターゼに用いることができる。好適な一例としては、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のニトリルヒドラターゼが挙げられる。

本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法では、その活性中心である金属元素含有量を増加させるが、該金属元素も、特に限定されない。例えば、コバルト、鉄等が挙げられる。

交換に用いる金属元素高含有型αサブユニットα２は、αサブユニット同士の交換に支障がなければ、その形態は限定されない。例えば、他のタンパク質と複合体を形成した状態で用いることも可能である。金属元素高含有型αサブユニットα２を含むタンパク質複合体を用いて、ニトリルヒドラターゼを成熟化する方法について、図３を用いて説明する。

図３は、金属元素高含有型αサブユニットα２を含むタンパク質複合体を用いたニトリルヒドラターゼ成熟化方法を模式的に示す図である。

前記タンパク質複合体の一例を図３中（Ｘ）で示す。該タンパク質複合体は、金属元素高含有型αサブユニットα２とタンパク質ｅとからなるタンパク質複合体である（以下「タンパク質複合体αｅ_２」と称する）。

図３に示すように、４量体及び２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１が、タンパク質複合体αｅ_２を構成する金属元素高含有型αサブユニットα２と交換する。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化する（図３（II）参照）。

このとき、タンパク質複合体αｅ_２を構成するαサブユニットは、金属元素低含有型αサブユニットα１に交換されている（図３（Ｙ）参照）。

前記タンパク質複合体αｅ_２は、金属元素高含有型αサブユニットα２を少なくとも含むタンパク質複合体であれば特に限定されない。一例としては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（金属元素高含有型αサブユニットα２。以下「ＮｈｌＡタンパク質」とする。）と、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、「ＮｈｌＥタンパク質」とする。）とから形成されたタンパク質複合体を挙げることができる。

なお、前記ＮｈｌＡタンパク質は、未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１と交換可能であれば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものの実に狭く限定されない。即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＮｈｌＡタンパク質に包含される。

また、前記ＮｈｌＥタンパク質も、前記交換を妨げない性質であれば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものの実に狭く限定されない。即ち、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＮｈｌＥタンパク質に包含される。更に、ＮｈｌＥタンパク質が、前記交換において、シャペロンとして機能するタンパク質であると、より好適である。「シャペロン」とは、ニトリルヒドラターゼの立体構造の形成やＮｈｌＡタンパク質の運搬を助けるタンパク質を意味する。

ＮｈｌＥタンパク質をコードする遺伝子（以下、「ｎｈｌＥ遺伝子」とする。）は、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子（即ち、この酵素のαサブユニット及びβサブユニットをコードする遺伝子。以下、それぞれ、「ｎｈｌＡ遺伝子」、及び「ｎｈｌＢ遺伝子」とする。）の近傍に位置する。

これらの遺伝子を有するものとして、例えば、Achromobacter属、Acinetobacter属、Aeromonas属、Agrobacterium属、Bacillus属、Citrobacter属、Corynebacterium属、Enterobacter属、Erwinia属、Klebsiella属、Micrococcus属、Nocardia属、Pseudomonas属、Pseudonocardia属、Rhodococcus属 Streptomyces属、Thermophila属、Rhizobium属、Xanthobacter属などの微生物を挙げることができる。代表例として、Rhodococcus rhodochrous J1菌における塩基配列を配列表（配列番号３）に示す。

前記タンパク質複合体は、ｎｈｌＡ遺伝子をコードする配列（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目の配列、図中「ｎｈｌＡ」参照。）とｎｈｌＥ遺伝子をコードする配列（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目の配列、図中「ｎｈｌＥ」参照。）を少なくとも含むプラスミドを用いて、取得することができる。該プラスミドの構成例を図４に模式的に示す。

例えば、このプラスミドで、所定の培養細胞などを形質転換し、細胞内で大量発現させた後、精製することにより、本発明に係るタンパク質複合体を簡易かつ大量に取得できる。なお、本発明に係るタンパク質複合体の調製手段としては、公知の方法が広く適用可能であり、同調製手段は、前記手段のみに狭く限定されない。

図４に示すプラスミドは、公知の方法により、作製できる。例えば、ｎｈｌＡ遺伝子及びｎｈｌＥ遺伝子と同じ配列を有するＤＮＡを調製し、それらのＤＮＡ（予め連結したものを含む）とプラスミドＤＮＡとを制限酵素（例えば、図中「Ｘｂａ Ｉ」及び「Ｓａｃ Ｉ」参照。）で処理した後、連結酵素で処理することにより、即ち、プラスミドＤＮＡにそれらのＤＮＡを組み込むことにより、前記プラスミドを作製できる。

＜成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法について＞
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を、ニトリルヒドラターゼ生産方法の一工程で使用すれば、成熟化したニトリルヒドラターゼを生産することができる。成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法を、図５、及び図６を用いて説明する。

図５は、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法の一実施形態を模式的に示す図である。図５中ＳＴＥＰ１は、in vivo（宿主内）、ＳＴＥＰ２は、in vitroでの様子を示す。

まず、ｎｈｌＥ遺伝子とｎｈｌＡ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT‐nhlAEを宿主に導入し、タンパク質複合体４（αｅ_２）を精製する。発明者らの研究の結果、該タンパク質複合体を構成するＮｈｌＡタンパク質（ニトリルヒドラターゼのαサブユニット）は、金属元素高含有型であることが分かっている（実施例６参照）。

また、ｎｈｌＡ遺伝子とｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT‐nhlBAを宿主に導入し、４量体３１（α_２β_２）、及び２量体３２（αβ）のニトリルヒドラターゼを精製する。発明者らの研究の結果、これらのニトリルヒドラターゼは、金属元素含有量が低く、酵素活性も低いことが分かっている(実施例２参照)。また、これらのニトリルヒドラターゼを構成するαサブユニットは、金属元素低含有型であることも分かっている（実施例４参照）。

次に、前記タンパク質複合体４（αｅ_２）を用いて、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化を行う。具体的には、精製したタンパク質複合体４（αｅ_２）と、未成熟ニトリルヒドラターゼ（４量体３１（α_２β_２）、２量体３２（αβ））とを、in vitroにおいて混合等する。このとき、図５に示すように、４量体３１（α_２β_２）及び２量体３２（αβ）の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１が、タンパク質複合体αｅ_２を構成する金属元素高含有型αサブユニットα２と交換される。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化し、成熟化ニトリルヒドラターゼ５を生産することができる。

従来、成熟化ニトリルヒドラターゼを生産するには、ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子と共に、ニトリルヒドラターゼの成熟化に関わる遺伝子を同一の宿主内に導入し、成熟化ニトリルヒドラターゼとして発現させる必要があった。

しかし、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を用いれば、一旦、未成熟なまま発現したニトリルヒドラターゼであっても、発現後に成熟化させることが可能となった。従って、未成熟ニトリルヒドラターゼから、別に発現させたタンパク質複合体４（αｅ_２）を用いたニトリルヒドラターゼ成熟化を行うことによって、成熟化ニトリルヒドラターゼを工業的に生産することができる。

本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法は、未成熟ニトリルヒドラターゼとタンパク質複合体４（αｅ_２）を混合する方法を用いることに限定されず、前記混合以外にも、添加、滴下など、未成熟ニトリルヒドラターゼとタンパク質複合体４（αｅ_２）が接触等する方法全てを包含する。

図６は、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法の図５とは異なる一実施形態を模式的に示す図である。ｎｈｌＥ遺伝子、ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAEを宿主に導入した様子を示す。本実施形態は、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法を、同一の宿主内で行う実施形態である。

ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子からは、４量体α_２β_２と２量体αβのニトリルヒドラターゼが発現する（図６中符号３１、３２で示す）。前記と同様、このときの４量体３１（α_２β_２）、及び２量体３２（αβ）のニトリルヒドラターゼは、活性中心金属の含有量、及び酵素活性が低い。また、これらのニトリルヒドラターゼを構成するαサブユニットは、金属元素低含有型である。

一方、ｎｈｌＥ遺伝子、及びｎｈｌＡ遺伝子からは、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化に用いることが可能なタンパク質複合体αｅ_２が発現する（図６中符号４で示す）。前記と同様、該タンパク質複合体を構成するＮｈｌＡタンパク質（ニトリルヒドラターゼのαサブユニット）は、金属元素高含有型であることが分かっている（実施例６参照）。

次に、前記タンパク質複合体４（αｅ_２）を用いて、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化が行われる。図５に示すように、４量体３１（α_２β_２）及び２量体３２（αβ）の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１が、タンパク質複合体４（αｅ_２）を構成する金属元素高含有型αサブユニットα２と交換される。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化し、成熟化ニトリルヒドラターゼ５を生産することができる。

このように、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法をニトリルヒドラターゼ生産の一工程に使用すれば、成熟化ニトリルヒドラターゼを大量に産することができる。

本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法は、図５、及び図６で示した方法に限定されず、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を使用する工程を少なくとも含む方法を全て包含する。

＜成熟化ニトリルヒドラターゼの工業的利用について＞
前記生産方法で得られた成熟化ニトリルヒドラターゼは、反応性が高いため、あらゆるアミド化合物の工業的生産に用いることができる。

例えば、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼは、アクリルアミドの工業的生産において、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として、用いることができる。本発明に係るアクリルアミド生産方法は、成熟化ニトリルヒドラターゼを前記変換酵素として用いる工程を含む方法を全て包含する。

また、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼは、ニコチンアミドの工業的生産において、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素として、用いることができる。本発明に係るニコチンアミド生産方法は、成熟化ニトリルヒドラターゼを前記変換酵素として用いる工程を含む方法を全て包含する。

実施例１では、以下実施例２から実施例５において使用するプラスミドを構築した。

なお、以下の実施例では、本発明に係るタンパク質改変方法の新規メカニズムを解明するために、タンパク質の一例として、ニトリルヒドラターゼを用いている。しかし、本発明に係るタンパク質改変方法は、該ニトリルヒドラターゼの改変に限定されず、該ニトリルヒドラターゼのように、複数のサブユニットから構成されるタンパク質全てに適用できる。

Rhodococcus rhodochrous J1菌（特開平０５−２１９９７２号参照）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpLJK60（J.Biol.Chem.,271,15796-15802 1996）を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を本願発明者が先に発明したプラスミドpREIT19（特願2004-380940）に連結した。図７（ｍ）にプラスミドpLJK60に存在する遺伝子部位を模式的に示す。

そして、以下（I）から（III）のプラスミドを構築した。これらのプラスミドの遺伝子部位を、図７（I）から（III）に、模式的に示す。
（I）ｎｈｌＡ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目、図７中「ｎｈｌＡ」参照、以下同じ）、ｎｈｌＢ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目、図７中「ｎｈｌＢ」参照、以下同じ）、及びｎｈｌＥ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目、図７中「ｎｈｌＥ」参照、以下同じ）の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAE。
（II）ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA。
（III）ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlAE。

実施例２では、実施例１で構築した（Ｉ）〜（III）のプラスミドを宿主に導入し、発現したタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性を調べた。

まず、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、（Ｉ）〜（III）のプラスミドを導入し、それぞれタンパク質を発現させ、精製した。発現・精製したそれぞれのタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図８に、SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis）の結果を図９に示す。

プラスミドpREIT-nhlBAE（Ｉ）からは、４量体（α_２β_２）のタンパク質（図８（１）、図９lane１参照）が、プラスミドpREIT-nhlBA（II）からは、４量体（α_２β_２）及び２量体（αβ）のタンパク質（図８（２）（３）、図９lane２、３参照）が、プラスミドpREIT-nhlAE（III）からは、３量体（αｅ_２）のタンパク質（図８（４）、図９lane４）が、それぞれ発現し、精製できた。

発現・精製したそれぞれのタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性を調べた。なお、ニトリルヒドラターゼ活性測定は、以下のように行った（以下同様）。

水で希釈した精製酵素溶液、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）、20mM 3-シアノピリジンを含む0.5mL中で、20℃にて20分間反応後、アセトニトリルを0.5mL加えることにより反応を停止させた。酵素反応により生成したニコチンアミドをHPLCにより分析した。HPLCの解析条件は表１の通りである。１分間に１mmolの安息香酸を生成する酵素量を１unitとした。

発現・精製したそれぞれのタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性を表２に示す。プラスミドpREIT-nhlBAE（Ｉ）から発現した４量体（α_２β_２）のタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性は、320U/mgと高い数値を示した。プラスミドpREIT-nhlBA（II）から発現した４量体（α_２β_２）及び２量体（αβ）のタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性は、それぞれ83U/mg、4U/mgと低い数値を示した。プラスミドpREIT-nhlAE（III）から発現した３量体（αｅ_２）のタンパク質は、ニトリルヒドラターゼ活性を示さなかった。

実施例２では、プラスミドpREIT-nhlBAE（Ｉ）からは、成熟化した４量体（α_２β_２）のニトリルヒドラターゼ（以下「ホロ酵素α_２β_２」と称する。）が発現し、pREIT-nhlBA（II）からは、未成熟の４量体（α_２β_２）及び２量体（αβ）のニトリルヒドラターゼ（以下それぞれ「アポ酵素α_２β_２」「アポ酵素αβ」と称する。）が発現することが分かった。

実施例３では、in vitroにおいて、アポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβから、ホロ酵素α_２β_２への改変を試みた。

実施例２で発現させたアポ酵素α_２β_２（比活性83U/mg）、及びアポ酵素αβ（比活性4U/mg）を、それぞれ、２倍量の（実施例２で発現させた）タンパク質複合体αｅ_２と混合し、ゲル濾過カラムを用いて混合溶液を分画・精製した。

まず、アポ酵素α_２β_２とタンパク質複合体αｅ_２との混合溶液を分画・精製した。その結果、４量体（α_２β_２）酵素の大きさはそのままであったが、この酵素の比活性は、328.4U/mgまで上昇した。生成した酵素を「Ｒ−アポ酵素α_２β_２」と称する。

混合時（０時間）のアポ酵素α_２β_２とタンパク質複合体αｅ_２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ａに、混合後１２時間後のＲ−アポ酵素α_２β_２とタンパク質複合体αｅ_２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ｂに示す。新たに生成したＲ−アポ酵素α_２β_２の比活性は、328.4U/mgであった。比活性を表３に示す。Ｒ−アポ酵素α_２β_２の比活性は、プラスミドpREIT-BAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から発現・精製したホロ酵素α_２β_２の比活性と同じレベルであった。

次に、アポ酵素αβとタンパク質複合体αｅ_２との混合溶液を分画した。その結果、新たに４量体（α_２β_２）酵素が生成した。生成した酵素を「Ｒ−アポ酵素αβ（α_２β_２）」と称する。

混合時（０時間）のアポ酵素αβとタンパク質複合体αｅ_２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ｃに、混合後１２時間後のＲ−アポ酵素αβ（α_２β_２）とタンパク質複合体αｅ_２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ｄに示す。新たに生成したＲ−アポ酵素αβ（α_２β_２）の比活性は、326.2U/mgであった。比活性を表３に示す。これも、プラスミドpREIT-BAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から発現・精製したホロ酵素α_２β_２の比活性と同じレベルであった。

実施例３では、in vitroにおいて、酵素活性の低い未成熟な状態で発現したアポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβを、タンパク質複合体αｅ_２を用いることにより、酵素活性の高い成熟化したホロ酵素α_２β_２へと改変させることができた。

実施例４では、以下に示す、実施例２で発現させたタンパク質、及び実施例３で改変させたタンパク質について、コバルトイオン含有量の測定を行った。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して発現したホロ酵素α_２β_２。
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して発現したアポ酵素α_２β_２。
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して発現したアポ酵素αβ。
（ｄ）pREIT-nhlAE（III）を導入して発現したタンパク質αｅ_２。
（ｅ）（ｂ）のアポ酵素α_２β_２を改変させたＲ−アポ酵素α_２β_２。
（ｆ）（ｃ）のアポ酵素αβを改変させたＲ−アポ酵素αβ（α_２β_２）。

（ａ）から（ｆ）のそれぞれの酵素について、コバルトイオン含有量の測定結果を表４に示す。

（ａ）pREIT-BAE（I）を導入して発現したホロ酵素α_２β_２はαβサブユニットあたり1.06モル（2.12モル/α_２β_２）のコバルトイオンを含有しているのに対し、（ｂ）pREIT-BA（II）を導入して発現したアポ酵素α_２β_２、及び（ｃ）pREIT-BA（II）を導入して発現したアポ酵素α_２β_２は、それぞれαβサブユニットあたり0.036モル（0.072モル/α_２β_２）、0.030モルのコバルトイオンしか含有していなかった。また、（ｂ）のアポ酵素α_２β_２と混合するタンパク質複合体αｅ_２、及び（ｃ）のアポ酵素αβと混合する（ｄ）タンパク質複合体αｅ_２のコバルトイオン含有量は、どちらもαｅ_２サブユニットあたり0.92モルであった。

しかし、（ｂ）のアポ酵素α_２β_２、及び（ｃ）のアポ酵素αβをそれぞれタンパク質複合体αｅ_２と混合した後に改変した（ｅ）Ｒ−アポ酵素α_２β_２、及び（ｆ）Ｒ−アポ酵素αβ（α_２β_２）のコバルトイオン含有量は、それぞれ、αβサブユニットあたり1.16モル（2.32モル/α_２β_２）、1.18モル（2.36モル/α_２β_２）と増加した。

一方で、混合後の（ｄ）タンパク質複合体αｅ_２のコバルトイオン含有量は、それぞれ、αｅ_２サブユニットあたり0.40モル、0.42モルと減少していた。

実施例４の結果より、タンパク質複合体αｅ_２は、コバルトイオン含量が少なく比活性の低いアポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβに対し、自身のコバルトイオンを受け渡すことにより、酵素活性を上昇させることが分かった。

実施例５では、実施例４で用いた（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）のそれぞれの酵素について、内部構造の違いを調べるためにＣＤスペクトルを測定した。

ＣＤスペクトルパターンを図１１に示す。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して精製したホロ酵素α_２β_２：黒
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製したアポ酵素α_２β_２：赤
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製したアポ酵素αβ：青
（ｅ）（ｂ）のアポ酵素α_２β_２を改変させたＲ−アポ酵素α_２β_２：緑
（ｆ）（ｃ）のアポ酵素αβを改変させたＲ−アポ酵素αβ（α_２β_２）：紫

図１１に示す通り、（ａ）ホロ酵素α_２β_２（黒）と比較して、（ｂ）アポ酵素α_２β_２（赤）、及び（ｃ）アポ酵素αβ（青）は、異なるＣＤスペクトルパターンを示した。

しかし、タンパク質複合体αｅ_２と混合後に改変した（ｅ）Ｒ−アポ酵素α_２β_２（緑）、及び（ｆ）Ｒ−アポ酵素αβ（α_２β_２）（紫）は、（ａ）ホロ酵素α_２β_２（黒）と同じＣＤスペクトルパターンを示すようになった。

実施例５の結果より、（ｂ）アポ酵素α_２β_２（赤）、及び（ｃ）アポ酵素αβ（青）は、（ａ）ホロ酵素α_２β_２と内部構造が異なるが、タンパク質複合体αｅ_２と混合することにより、（ａ）ホロ酵素α_２β_２と同じ構造へと改変することが明らかとなった。

実施例６では、タンパク質複合体αｅ_２に含有されるコバルトイオンが、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）、又はＮｈｌＥタンパク質のどちらに含有されているかを調べた。

まず、液体クロマトグラフィーにおける保持容量（図１２）、及びSDS-PAGE（図１３）上のバンドを指標に、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）とＮｈｌＥタンパク質の分離を行った。得られたＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）、及びＮｈｌＥタンパク質のそれぞれのコバルトイオン含有量を測定した。測定結果を表５に示す。

表５に示すように、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）は、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）あたり0.79±0.08モルのコバルトイオンを含有していたが、ＮｈｌＥタンパク質は、コバルトイオンを全く含有していなかった。

なお、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）、及びＮｈｌＥタンパク質を、それぞれ単独でアポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβを混合したところ、Ｒ−アポ酵素α_２β_２、及びＲ−アポ酵素αβ（α_２β_２）へと改変されなかった。

実施例６では、コバルトイオンは、タンパク質複合体αｅ_２を構成するＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）が含有していることが分かった。

実施例７では、タンパク質複合体αｅ_２からアポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβへのコバルトイオン受け渡しメカニズムを調べた。

まず、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３番目のアラニンをグリシンに置換したＯＲＦと、ｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA-α-A3Gを構築した。

そして、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、アポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβに対応する変異体酵素を発現・精製した。精製した酵素を「アポ酵素(α−A3G)_２β_２」、「アポ酵素(α−A3G)β」と称する。アポ酵素(α−A3G)_２β_２、及びアポ酵素(α−A3G)βの比活性を調べたところ、アポ酵素(α−A3G)_２β_２の比活性は78.2±3.2U/mg、アポ酵素(α−A3G)βの比活性は3.2±1.6U/mgであった。これは、アポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβと同レベルの数値である。

次に、アポ酵素(α−A3G)_２β_２、及びアポ酵素(α−A3G)βそれぞれと、（αサブユニットの３番目がアラニンである）タンパク質複合体αｅ_２とを混合した。それぞれ生成した酵素を精製し、その比活性を調べたところ、それぞれ330.5±15.5U/mg、318.6±10.6U/mgと上昇していた。比活性を表６に示す。これは、ホロ酵素α_２β_２と同レベルの数値である。

更に、生成したそれぞれの酵素を精製し、そのN末端アミノ酸配列を調べた。それぞれの酵素のN末端アミノ酸配列を表７に示す。表７に示す通り、３番目のグリシンは、アラニンへ変化していた。

実施例７の結果から、タンパク質複合体αｅ_２は、自身のＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）とアポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβを構成するαサブユニットとを交換することで、アポ酵素α_２β_２、及びアポ酵素αβを、Ｒ−アポ酵素α_２β_２、及びＲ−アポ酵素αβ（α_２β_２）へと改変することが分かった。

また、以上の結果より、ＮｈｌＥタンパク質は、アポ酵素α_２β_２、αβをホロ酵素α_２β_２へと改変する際のシャペロンとして機能することが示唆された。

実施例８では、ＢＬＡＳＴ法を用いて、ＮｈｌＥタンパク質と以下のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性を調べた。

（１）ＮｈｈＧタンパク質： Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型高分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスター中に存在し、ＮｈｌＥに相同性を示すタンパク質
（２）Ｐ１４Ｋタンパク質：Bacillus pallidus RAPc8菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質
（３）Ａ．ｔｕｍタンパク質：Agrobacterium tumefaciens菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（４）Ｊ１ｎｈｌＢタンパク質：Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（５）Ｐ．ｐｕｔタンパク質：Psudomonas putida菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット

結果を表８、及び図１４に示す。表８に示すように、ＮｈｌＥタンパク質とそれぞれのタンパク質の相同性は、ＮｈｈＧタンパク質３８％、Ｐ１４Ｋタンパク質３５％、Ａ．ｔｕｍタンパク質３３％、Ｊ１ｎｈｌＢタンパク質３０％、Ｐ．ｐｕｔタンパク質３２％であった。

また、図１４に示すように、ＮｈｌＥタンパク質とそれぞれのタンパク質は、全体にわたり相同性を示していることが分かった。

実施例８より、これらのタンパク質も、ＮｈｌＥタンパク質と同様の機能を有することが示唆された。即ち、これらのタンパク質も本発明に係るタンパク質改変に深く関わることが示唆された。

本発明に係るタンパク質改変方法は、タンパク質同士を交換することにより行う方法であるため、従来、in vivoにおいてのみ可能であったタンパク質改変方法であっても、場合によってはin vivo、及びin vitroにかかわらず行えることが期待できる。そのため、あらゆる分野において、様々な状況に応じて、タンパク質改変方法の選択の幅を増やすことができる。

また、タンパク質を改変させる際に触媒等が必要な場合であっても、本発明に係るタンパク質改変方法は全く新規なメカニズムに基づく改変方法であるため、場合によっては触媒が必要なくなったり、別の触媒に変更できたりするなど、手間やコスト面での軽減を図ることも期待できる。

本発明に係るタンパク質改変方法を模式的に示す図である。 本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を模式的に示す図である。 本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法の図２とは異なる一実施形態を模式的に示す図である。 本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法に用いるタンパク質複合体の取得に用いるプラスミドを模式的に示す図である。 本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法の一実施形態を模式的に示す図である。 本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法の図５とは異なる一実施形態を模式的に示す図である。 実施例１で作成したプラスミドの遺伝子部位を模式的に示した図である。 実施例２でのゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を示す図面代用グラフである。 実施例２でのSDS-PAGEの結果を示す図面代用写真である。 実施例３でのゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を示す図面代用グラフである。 実施例５で測定したＣＤスペクトルパターンを示す図面代用グラフである。 実施例６で用いたゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を示す図面代用グラフである。 実施例６で用いたSDS-PAGEの結果を示す図面代用写真である。 実施例８におけるＢＬＡＳＴ法の結果を示す図である。

符号の説明

１ サブユニットＡとサブユニットＣから構成されるタンパク質
２１、２２ 改変されたタンパク質
Ａ、Ｂ、Ｃ タンパク質
α ニトリルヒドラターゼのαサブユニット
β ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
α１ 金属元素低含有型αサブユニット
α２ 金属元素高含有型αサブユニット
ｅ ＮｈｌＥタンパク質
３１ ４量体の未成熟ニトリルヒドラターゼ
３２ ２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼ
４ タンパク質複合体αｅ_２
５ 成熟化ニトリルヒドラターゼ

Claims (4)

1. インビトロにおいて、
   下記のαサブユニットおよび配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目の配列でコードされるβサブユニットから構成されるコバルト型ニトリルヒドラターゼのコバルト元素低含有型αサブユニットを、
   下記のαサブユニットと、下記のタンパク質Ｅと、を有するタンパク質複合体中のコバルト元素高含有型の前記αサブユニットに、交換することを特徴とするコバルト型ニトリルヒドラターゼの成熟化方法。
   αサブユニット：配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、前記コバルト元素低含有型αサブユニットと交換可能なタンパク質。
   タンパク質Ｅ：配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、前記αサブユニットと複合体を形成可能なタンパク質。
2. 前記コバルト型ニトリルヒドラターゼは、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼであることを特徴とする請求項１記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ成熟化方法。
3. 請求項１または２に記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を使用する工程を含む成熟化コバルト型ニトリルヒドラターゼ生産方法。
4. 請求項１または２に記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を使用する工程を含む成熟化コバルト型ニトリルヒドラターゼの生産工程、および、
   該生産工程によって生産された成熟化コバルト型ニトリルヒドラターゼを、ニトリル化合物からアミド化合物への変換酵素として用いる工程を含むアミド化合物生産方法。