TWI773716B - 變異型腈水合酶、編碼該變異型腈水合酶之核酸、含有該核酸之表現載體及轉形體、該變異型腈水合酶之製造方法、及醯胺化合物之製造方法 - Google Patents
變異型腈水合酶、編碼該變異型腈水合酶之核酸、含有該核酸之表現載體及轉形體、該變異型腈水合酶之製造方法、及醯胺化合物之製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供一種變異型腈水合酶，係具α次單元與β次單元之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶，包括選自由α次單元之N末端起40號及43號及β次單元之N末端起205號、206號及215號構成之群組中之至少1個位置的胺基酸殘基成為特定胺基酸殘基之取代。
Description
本揭示係關於變異型腈水合酶、編碼該變異型腈水合酶之核酸、含有該核酸之表現載體及轉形體、該變異型腈水合酶之製造方法、及醯胺化合物之製造方法。
腈水合酶係具有將各種化合物之腈基利用水合而變換為醯胺基之腈水合活性的酵素，利用於利用酵素反應之工業化醯胺化合物之製造處理。
近年來，對於工業化醯胺化合物之製造技術要求的水準有日益升高的傾向。 有鑑於如此的情況，為了減少腈水合酶的運作成本佔醯胺化合物之製造成本，迄今已有人進行了各種研究。尤其針對腈水合酶，已有許多可提高該酵素之每單位重量的活性値的關於變異體的技術(日本特開平9-275978號公報、日本特開2 004-194588號公報、日本特開2005-160403號公報、國際公開第2004/056990號、國際公開第2010/055666號、日本特開2007-143409號公報、日本特開2008-253182號公報等)。
在此，在利用酵素反應之工業化醯胺化合物的代表性製造處理，通常係按順序實施下列步驟：於調整pH為7~9的溶液中，利用腈水合酶之觸媒作用而使從腈化合物合成醯胺化合物的反應進行的反應步驟，以及調整上述溶液之pH為3. 5~6.5，並於該pH使用活性碳吸附前述溶液中存在的腈水合酶而去除以獲得精製的醯胺化合物的精製步驟(日本特開2001-270857號公報)。
[發明欲解決之課題]
本案發明人等為了比起以往更增加利用腈水合酶之工業化醯胺化合物之製造效率而努力研究。結果發現就設計方針而言，即使是在酸性的pH區進行的前述精製步驟，仍持續進行利用腈水合酶之觸媒作用而從腈化合物合成醯胺化合物的反應係有效。
但是一般而言，野生型腈水合酶的最佳pH為7~9，野生型腈水合酶在pH3.5~ 6.5之條件下，活性會大幅下降。因此即使使用野生型腈水合酶，精製步驟的酵素反應易不到令人滿意的程度。又，如上述，已有人報告了各種腈水合酶變異體，但它們亦為在精製步驟使用的這樣的酸性條件下，活性會大幅下降。如此，迄今尚無顯示在酸性條件下的精製步驟催化從腈化合物合成醯胺化合物之反應的酵素活性的良好pH安定性的腈水合酶變異體的相關技術。尤其在pH5.0以下這樣的較強的酸性條件下，蛋白質失活的傾向較高，即使在如此的pH條件下仍保持良好酵素活性的腈水合酶變異體的相關技術，迄今尚無人報告。
本揭示提供關於催化從腈化合物合成醯胺化合物之反應的酵素活性的對於pH的安定性改善的有新的變異點的變異型腈水合酶的技術。更具體而言，提供關於即使在pH3.5~6.5的酸性區仍保持良好酵素活性的變異型腈水合酶的技術。更具體而言，提供關於即使在pH為3.5~5.0之較強酸性區仍保持良好酵素活性的變異型腈水合酶的技術。 [解決課題之方式]
本揭示包括下列態樣。 ＜1＞ 一種變異型腈水合酶，係具有α次單元與β次單元之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶，包括選自由下列胺基酸殘基取代(a)~(e)構成之群組中之至少1個胺基酸殘基取代： (a) α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基取代為Asn、 (b) α次單元之N末端起43號之胺基酸殘基取代為Val、 (c) β次單元之N末端起205號之胺基酸殘基取代為Val、 (d) β次單元之N末端起206號之胺基酸殘基取代為Gln、 (e) β次單元之N末端起215號之胺基酸殘基取代為Asn。
＜2＞ 如＜1＞之變異型腈水合酶，包括選自於由胺基酸殘基取代(a)~(e)構成之群組中之2個以上之胺基酸殘基取代。
＜3＞ 如＜1＞或＜2＞之變異型腈水合酶，包括胺基酸殘基取代(b)、及選自於由胺基酸殘基取代(a)、(c)、(d)及(e)構成之群組中之至少一者。
＜4＞ 如＜1＞~＜3＞中任一項之變異型腈水合酶，其中，α次單元之胺基酸序列中，N末端起36號之胺基酸為Trp。
＜5＞ 如＜1＞~＜3＞中任一項之變異型腈水合酶，其中，α次單元之胺基酸序列中，N末端起36號之胺基酸為Met、Ser、Gly或Ala。
＜6＞ 如＜1＞~＜5＞中任一項之變異型腈水合酶，其中，α次單元之胺基酸序列符合以下之(1)~(13)中之一者以上： (1) N末端起6號之胺基酸殘基為Thr或Ala、 (2) N末端起13號之胺基酸殘基為Leu、 (3) N末端起19號之胺基酸殘基為Val、 (4) N末端起27號之胺基酸殘基為Ile、 (5) N末端起48號之胺基酸殘基為Gln、 (6) N末端起71號之胺基酸殘基為His、 (7) N末端起92號之胺基酸殘基為Glu、 (8) N末端起94號之胺基酸殘基為Ile、 (9) N末端起126號之胺基酸殘基為Tyr、 (10) N末端起148號之胺基酸殘基為Asp、 (11) N末端起188號之胺基酸殘基為Gly、 (12) N末端起197號之胺基酸殘基為Cys、 (13) N末端起204號之胺基酸殘基為Arg。
＜7＞ 如＜1＞~＜6＞中任一項之變異型腈水合酶，其中，β次單元之胺基酸序列符合以下之(15)~(47)中之至少一者： (15) N末端起4號之胺基酸殘基為Met、 (16) N末端起8號之胺基酸殘基為Ala、 (17) N末端起10號之胺基酸殘基為Asp、 (18) N末端起24號之胺基酸殘基為Ile、 (19) N末端起33號之胺基酸殘基為Val或Met、 (20) N末端起37號之胺基酸殘基為Val或Leu、 (21) N末端起40號之胺基酸殘基為Ile、Val或Leu、 (22) N末端起41號之胺基酸殘基為Ile、 (23) N末端起46號之胺基酸殘基為Lys、 (24) N末端起48號之胺基酸殘基為Val、 (25) N末端起51號之胺基酸殘基為Val、 (26) N末端起61號之胺基酸殘基為Val、Gly、Trp、Ser、Leu或Thr、 (27) N末端起79號之胺基酸殘基為Asn、 (28) N末端起96號之胺基酸殘基為Arg、 (29) N末端起107號之胺基酸殘基為Met、 (30) N末端起108號之胺基酸殘基為Asp或Arg、 (31) N末端起110號之胺基酸殘基為Asn、 (32) N末端起112號之胺基酸殘基為Val或Ile、 (33) N末端起118號之胺基酸殘基為Val、 (34) N末端起127號之胺基酸殘基為Ser、 (35) N末端起146號之胺基酸殘基為Gly、 (36) N末端起150號之胺基酸殘基為Asn或Ser、 (37) N末端起160號之胺基酸殘基為Cys、Trp或Met、 (38) N末端起168號之胺基酸殘基為Glu、 (39) N末端起176號之胺基酸殘基為Ala、Thr、Met或Cys、 (40) N末端起186號之胺基酸殘基為Arg、 (41) N末端起200號之胺基酸殘基為Glu、 (42) N末端起212號之胺基酸殘基為Tyr、 (43) N末端起217號之胺基酸殘基為Val、His、Met、Gly、Ser、Leu或Cys、 (44) N末端起218號之胺基酸殘基為Met或Ser、 (45) N末端起226號之胺基酸殘基為Ile、 (46) N末端起230號之胺基酸殘基為Glu、 (47) N末端起231號之胺基酸殘基為Val。
＜8＞ 如＜1＞~＜7＞中任一項之變異型腈水合酶，其中，下列[1]~[49]中之任一者之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶中，包括選自於由前述(a)~(e)構成之群組中之至少1個胺基酸殘基取代： [1] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號2之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [2] 包括具序列編號16之胺基酸序列之α次單元與具序列編號33之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [3] 包括具序列編號17之胺基酸序列之α次單元與具序列編號33之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [4] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號34之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [5] 包括具序列編號19之胺基酸序列之α次單元與具序列編號34之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [6] 包括具序列編號20之胺基酸序列之α次單元與具序列編號35之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [7] 包括具序列編號20之胺基酸序列之α次單元與具序列編號36之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [8] 包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號37之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [9] 包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號38之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [10] 包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號39之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [11] 包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號40之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [12] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號41之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [13] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號42之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [14] 包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號43之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [15] 包括具序列編號22之胺基酸序列之α次單元與具序列編號44之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [16] 包括具序列編號23之胺基酸序列之α次單元與具序列編號45之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [17] 包括具序列編號24之胺基酸序列之α次單元與具序列編號46之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [18] 包括具序列編號25之胺基酸序列之α次單元與具序列編號47之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [19] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號48之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [20] 包括具序列編號23之胺基酸序列之α次單元與具序列編號49之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [21] 包括具序列編號16之胺基酸序列之α次單元與具序列編號50之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [22] 包括具序列編號26之胺基酸序列之α次單元與具序列編號51之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [23] 包括具序列編號27之胺基酸序列之α次單元與具序列編號52之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [24] 包括具序列編號28之胺基酸序列之α次單元與具序列編號53之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [25] 包括具序列編號17之胺基酸序列之α次單元與具序列編號54之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [26] 包括具序列編號29之胺基酸序列之α次單元與具序列編號55之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [27] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號56之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [28] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號57之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [29] 包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號58之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [30] 包括具序列編號29之胺基酸序列之α次單元與具序列編號59之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [31] 包括具序列編號31之胺基酸序列之α次單元與具序列編號60之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [32] 包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號61之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [33] 包括具序列編號32之胺基酸序列之α次單元與具序列編號62之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [34] 包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號63之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [35] 包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號64之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [36] 包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號65之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [37] 包括具序列編號25之胺基酸序列之α次單元與具序列編號54之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [38] 包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號66之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [39] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號67之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [40] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號68之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [41] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號69之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [42] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號70之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [43] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號71之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [44] 包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號72之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [45] 包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號73之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [46] 上述[1]~[45]之腈水合酶中之任一者的α次單元的N末端起36號之胺基酸殘基為Trp殘基的腈水合酶 [47] 具有上述[1]~[46]中之任一者的腈水合酶(A)的α次單元或由與該α次單元有90%以上之序列同一性之胺基酸序列構成的α次單元變體、及前述腈水合酶(A)之β次單元或由與該β次單元有90%以上之序列同一性之胺基酸序列構成的β次單元變體，且α次單元及β次單元中之至少一者為α次單元變體或β次單元變體的腈水合酶 [48] 上述[1]~[46]中之任一者的腈水合酶(B)中的α次單元中的加成、取代、缺失、及/或插入之胺基酸殘基(前述(a)及(b)的被取代的胺基酸殘基除外)的總數為1~10，且前述腈水合酶(B)中的β次單元中的加成、取代、缺失、及/或插入的胺基酸殘基(前述(c)~(e)的被取代的胺基酸殘基除外)的總數為1~10的腈水合酶。
＜9＞ 一種核酸，編碼如＜1＞~＜8＞中任一項之變異型腈水合酶。
＜10＞ 一種載體，含有如＜9＞之核酸。
＜11＞ 如＜10＞之載體，係表現載體。
＜12＞ 一種轉形體，含有如＜11＞之表現載體。
＜13＞ 一種變異型腈水合酶之製造方法，包括下列步驟： 在培養基中培養如＜12＞之轉形體；及 從培養的轉形體及培養基中之至少一者回收如＜1＞~＜8＞中任一項之變異型腈水合酶。
＜14＞ 一種變異型腈水合酶，係利用如＜13＞之變異型腈水合酶之製造方法獲得。
＜15＞ 一種醯胺化合物之製造方法，包括使如＜1＞~＜8＞及＜14＞中任一項之變異型腈水合酶接觸腈化合物之步驟。
＜16＞ 如＜15＞之醯胺化合物之製造方法，更包括於pH3.5~pH6.5從含有醯胺化合物之溶液去除雜質之步驟。
＜17＞ 如＜15＞或＜16＞之醯胺化合物之製造方法，更包括利用活性碳來精製醯胺化合物之步驟。 [發明之效果]
依照本揭示，提供關於催化從腈化合物合成醯胺化合物之反應的酵素活性的對於pH的安定性改善的有新的變異點的變異型腈水合酶的技術。更具體而言， 提供關於即使在pH3.5~6.5的酸性區仍保持良好酵素活性的變異型腈水合酶的技術。更具體而言，提供關於即使在pH為3.5~5.0之較強酸性區仍保持良好酵素活性的變異型腈水合酶的技術。
＜變異型腈水合酶＞ 本揭示一種變異型腈水合酶(以下也稱為變異型腈水合酶A)，係具有α次單元與β次單元之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶，包括選自由下列胺基酸殘基取代(a)~(e)構成之群組中之至少1個胺基酸殘基取代： (a) α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基取代為Asn、 (b) α次單元之N末端起43號之胺基酸殘基取代為Val、 (c) β次單元之N末端起205號之胺基酸殘基取代為Val、 (d) β次單元之N末端起206號之胺基酸殘基取代為Gln、 (e) β次單元之N末端起215號之胺基酸殘基取代為Asn。
含有上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代中的至少1個以上的變異體，迄今尚無人報告。亦即，前述變異型腈水合酶含有的(a)~(e)之胺基酸殘基取代，皆可說是迄今無人報告的變異。這些(a)~(e)之胺基酸殘基取代以下也稱為胺基酸殘基取代群A。又，包括上述變異之本揭示之變異型腈水合酶，係對於由腈化合物合成醯胺化合物之反應能顯示比起習知的腈水合酶變異體在更廣pH區有安定性的酵素活性的酵素。針對此點，於實施例詳細説明。
自以往已有人嘗試獲得野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia therm ophila)之腈水合酶之變異體，但此等嘗試主要係為了提高在酵素的最適pH條件下的酵素活性，並不是探討在和酵素之最適pH條件為相反的酸性條件下之酵素活性。本案發明人等首次注意到落在最適條件外的酸性條件下的腈水合酶的酵素活性，並找出上述新的胺基酸殘基變異係有效。
以下針對本揭示之變異型腈水合酶更詳細説明。本揭示之核苷酸序列説明雖有時即使保持該核苷酸序列的核酸股形成雙股，仍著眼在其中一股上之序列， 但如此的序列説明應可適用在雙股中的另一股解讀為其互補的序列。 本揭示中，「步驟」之用語不僅是獨立的步驟，即使無法與其他步驟明確區別，而若可達成該步驟之所期待目的，即包括在本用語。 本揭示中，使用「~」表達的數値範圍，代表「~」前後記載的數値分別作為最小値及最大値而包括的範圍。 本揭示中，組成物中之各成分之量，當組成物中之各成分該當的物質有多數存在時，若未特別指明，則代表組成物中存在的該多數物質之合計量。
本揭示中，來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶，不僅是具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號2之胺基酸序列之β次單元的野生型的嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)為來源的腈水合酶，也包括對於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶，以該技術領域中有通常知識者能認識的程度施加了野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶之改變序列的改變的改變腈水合酶的概念。來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶之概念中含有的改變腈水合酶，也包括對於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pse udonocardia thermophila)之腈水合酶，施加了由下列構成的群組選出的1種以上之改變的改變腈水合酶：(i)1個以上之胺基酸殘基取代成其他胺基酸殘基、(ii)上述(a)~(e)以外之1個以上之胺基酸殘基的缺失、(iii)胺基酸殘基的插入、(iv)對於α次單元的胺基酸序列N末端及C末端中之一者或兩者附加胺基酸殘基、(v)對於β次單元之胺基酸序列N末端及C末端中之一者或兩者附加胺基酸殘基。
前述改變腈水合酶的α次單元中，被取代的胺基酸殘基的數目，例如：1~20，或1~15，或1~10，或1~8，或1~7，或1~6，或1~5，或1~4，或1~3，或1~2，或1。被取代的胺基酸殘基的數目也可以為0。 前述改變腈水合酶的β次單元中，被取代的胺基酸殘基的數目，例如：1~20，或1~15，或1~10，或1~8，或1~7，或1~6，或1~5，或1~4，或1~3，或1~2，或1。被取代的胺基酸殘基的數目也可以為0。
前述改變腈水合酶的α次單元中，缺失的胺基酸殘基的數目，例如：1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。被缺失的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述改變腈水合酶的β次單元中，缺失的胺基酸殘基的數目，例如：1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。缺失的胺基酸殘基的數目也可為0。
前述改變腈水合酶之α次單元中，插入的胺基酸殘基的數目，例如：1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。插入的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述改變腈水合酶的β次單元中，插入的胺基酸殘基的數目，例如：為1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。插入的胺基酸殘基的數目也可為0。
前述改變腈水合酶的α次單元中，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數，例如：1~20，或1~14，或1~8，或1~4，或1~2，或1。有末端加成時等，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數也可為0。 前述改變腈水合酶的β次單元中，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數，例如：1~20，或1~14，或1~8，或1~4，或1~2，或1。有末端加成時等，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數也可為0。
前述改變腈水合酶的α次單元中，末端加成的胺基酸殘基的數目，例如：每一末端為1~60，或1~40，或1~20，或1~10，或1~5，或1~3，或1。加成的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述改變腈水合酶的β次單元中，末端加成的胺基酸殘基的數目，例如：每一末端為1~60，或1~40，或1~20，或1~10，或1~5，或1~3，或1。加成的胺基酸殘基的數目也可為0。 末端加成胺基酸殘基也可為例如分泌信號序列。末端加成胺基酸殘基可僅存在於N末端，僅在C末端，或存在於N末端及C末端兩者。
前述改變腈水合酶與野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermop hila)之腈水合酶的類似性亦可由序列同一性來表達。 前述改變腈水合酶的α次單元的胺基酸序列，與序列編號1表示之野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶之α次單元之胺基酸序列之間，例如有70%以上之序列同一性，或有80%以上之序列同一性，或有85%以上之序列同一性，或有90%以上之序列同一性，或有95%以上之序列同一性，或有96%以上之序列同一性，或有97%以上之序列同一性，或有98%以上之序列同一性，或有99%以上之序列同一性。
前述改變腈水合酶的β次單元的胺基酸序列，與序列編號2表示之野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶的β次單元的胺基酸序列之間，例如有70%以上之序列同一性，或有80%以上之序列同一性，或有85%以上之序列同一性，或有90%以上之序列同一性，或有95%以上之序列同一性，或有96%以上之序列同一性，或有97%以上之序列同一性，或有98%以上之序列同一性，或有99%以上之序列同一性。
又，序列彼此的對準(alignment)可利用ClustalW(1.83)進行，可使用初始參數(gap open penalty：10、gap extension penalty：包括0.05)進行。
改變腈水合酶的胺基酸序列與野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardi a thermophila)之腈水合酶之胺基酸序列對準時，依照改變腈水合酶之改變之樣式，有時即使在對準之上對應的胺基酸殘基彼此之間，仍會有如上述規定之次單元之N末端起算的距離不同的情形。本揭示中，如此的情形，針對改變腈水合酶，自次單元的N末端起X號之胺基酸殘基係指與野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶之該次單元之N末端起X號之胺基酸殘基在對準上對應的胺基酸殘基。例如：本揭示中，「α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基」、「α次單元之N末端起40號之Asp殘基」或「α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基即Asp殘基」，可能位在改變腈水合酶之胺基酸序列上自α次單元之N末端起40號以外之位置。例如：改變腈水合酶之α次單元之N末端起41號之胺基酸殘基(不一定必為Asp)可能因為胺基酸殘基插入，結果對應於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶之α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基即Asp殘基。如此的情形，本揭示中之説明中，「α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基」、「α次單元之N末端起40號之Asp殘基」或「α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基即Asp殘基」，係指改變腈水合酶中之α次單元之N末端起41號之胺基酸殘基。
野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶中，位在序列編號1之起頭的Met殘基為α次單元之胺基酸序列N末端起1號之胺基酸殘基，α次單元之胺基酸序列N末端起40號之胺基酸殘基為Asp殘基，α次單元之胺基酸序列N末端起43號之胺基酸殘基為Ala殘基。又，野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶中，位在序列編號2之起頭之Met殘基為β次單元之胺基酸序列N末端起1號之胺基酸殘基，β次單元之胺基酸序列N末端起205號之胺基酸殘基為Gly殘基，β次單元之胺基酸序列N末端起206號之胺基酸殘基為Pro殘基，β次單元之胺基酸序列N末端起215號之胺基酸殘基為Tyr殘基。
可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用的改變腈水合酶的序列，可以從National Center for Biotechnology Information(NCBI)提供之登錄在GenBank的腈水合酶的序列、或公知文獻記載之腈水合酶的序列中選用。又，可以從上述特開平9-275978號公報、日本特開2004-194588號公報、日本特開2005-160403號公報、國際公開第2004/056990號、國際公開第2010/055666號記載之改變腈水合酶的序列中選用。於此情形，除了該等專利文獻記載之改良，也可獲得藉由胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入獲致的pH安定性改善的新的效果。
又，可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用的改變腈水合酶，可為N末端起36號之胺基酸殘基(野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之胺基酸序列的N末端起36號的Thr殘基在對準上對應的胺基酸殘基)為Trp殘基者(以下也稱為胺基酸殘基取代(f))。除了具有胺基酸殘基取代(a)~(e)中一者以上更具有胺基酸殘基取代(f)的話，從獲得有更良好pH安定性之變異型腈水合酶之觀點較理想。換言之，胺基酸殘基取代(f)若存在，胺基酸殘基取代(a)至(e)獲致的效果有更增強的傾向。
又，例如：國際公開第2010/055666號中，記載對於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之胺基酸序列導入如下列之胺基酸殘基取代(以下也稱為胺基酸殘基取代群B)。
α次單元之胺基酸序列的胺基酸殘基取代(以α次單元之N末端為基準的位置來表示) 6號之胺基酸殘基Leu取代為Thr或Ala 13號之胺基酸殘基Ile取代為Leu 19號之胺基酸殘基Ala取代為Val 27號之胺基酸殘基Met取代為Ile 36號之胺基酸殘基Thr取代為Met、Ser、Gly或Ala 48號之胺基酸殘基Asn取代為Gln 71號之胺基酸殘基Arg取代為His 92號之胺基酸殘基Asp取代為Glu 94號之胺基酸殘基Met取代為Ile 126號之胺基酸殘基Phe取代為Tyr 148號之胺基酸殘基Gly取代為Asp 188號之胺基酸殘基Thr取代為Gly 197號之胺基酸殘基Gly取代為Cys 204號之胺基酸殘基Val取代為Arg
β次單元之胺基酸序列的胺基酸殘基取代(以β次單元之N末端為基準的位置來表示) 4號之胺基酸殘基Val取代為Met 8號之胺基酸殘基Gly取代為Ala 10號之胺基酸殘基Thr取代為Asp 24號之胺基酸殘基Val取代為Ile 33號之胺基酸殘基Ala取代為Val或Met 37號之胺基酸殘基Phe取代為Val或Leu 40號之胺基酸殘基Thr取代為Ile、Val或Leu 41號之胺基酸殘基Phe取代為Ile 46號之胺基酸殘基Met取代為Lys 48號之胺基酸殘基Leu取代為Val 51號之胺基酸殘基Phe取代為Val 61號之胺基酸殘基Ala取代為Val、Gly、Trp、Ser、Leu或Thr 79號之胺基酸殘基His取代為Asn 96號之胺基酸殘基Gln取代為Arg 107號之胺基酸殘基Pro取代為Met 108號之胺基酸殘基Glu取代為Asp或Arg 110號之胺基酸殘基Glu取代為Asn 112號之胺基酸殘基Lys取代為Val或Ile 118號之胺基酸殘基Phe取代為Val 127號之胺基酸殘基Leu取代為Ser 146號之胺基酸殘基Arg取代為Gly 150號之胺基酸殘基Ala取代為Asn或Ser 160號之胺基酸殘基Arg取代為Cys、Trp或Met 168號之胺基酸殘基Thr取代為Glu 176號之胺基酸殘基Tyr取代為Ala、Thr、Met或Cys 186號之胺基酸殘基Leu取代為Arg 200號之胺基酸殘基Ala取代為Glu 206號之胺基酸殘基Pro取代為Leu 212號之胺基酸殘基Ser取代為Tyr 217號之胺基酸殘基Asp取代為Val、His、Met、Gly、Ser、Leu或Cys 218號之胺基酸殘基Cys取代為Met或Ser 226號之胺基酸殘基Val取代為Ile 230號之胺基酸殘基Ala取代為Glu 231號之胺基酸殘基Ala取代為Val
可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用的改變腈水合酶，可相較於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之胺基酸序列時，含有選自上述胺基酸殘基取代群B中之一者以上之胺基酸殘基取代，也可更具有胺基酸殘基取代(f)。上述胺基酸殘基取代也可2個以上組合而含有。如此的組合的例子，在國際公開第2010/055666號已有多數記載。又，改變腈水合酶當然應有腈水合酶活性。
例如：3個組合而含有時， 可列舉α次單元中之Thr36Ser及Asp92Glu及β次單元之Ala33Val之組合、 α次單元之Met94Ile及β次單元之Ala61Gly及Ala150Asn之組合、 β次單元之Val4Met、Tyr176Ala及Asp217Val之組合、 β次單元之Ala33Met、His79Asn及Tyr176Thr之組合、 β次單元之Thr40Val、Cys218Met及Val226Ile之組合等為例。
又，例如8個組合而含有時，可列舉 α次單元之Ile13Leu、Ala19Val、Arg71His及Phe126Tyr及β次單元之Phe37Le u、Gln96Arg、Glu108Asp及Ala200Glu之組合(國際公開第2010/055666號：轉形體編號59)、 α次單元之Leu6Thr、Met27Ile、Thr36Met及Phe126Tyr及β次單元之Thr10Asp、 Pro107Met、Phe118Val及Ala200Glu之組合(國際公開第2010/055666號：轉形體編號68)、 α次單元之Leu6Thr、Thr36Met及Phe126Tyr及β次單元之Thr10Asp、Phe118Va l、Ala200Glu、Pro206Leu及Ala230Glu之組合(國際公開第2010/055666號：轉形體編號92)、 α次單元之Leu6Thr、Ala19Val及Phe126Tyr及β次單元之Leu48Val、His79Asn、 Glu108Arg、Ser212Tyr及Ala230Glu之組合(國際公開第2010/055666號：轉形體編號85)、 α次單元之Thr36Met、Gly148Asp及Val204Arg及β次單元之Phe41Ile、Phe51Va l、Glu108Asp、Pro206Leu及Ala230Glu之組合(國際公開第2010/055666號：轉形體編號93) 為例。
又，可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用之改變腈水合酶之胺基酸序列，可相較於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之胺基酸序列，含有上述例示之處(胺基酸殘基取代群B及胺基酸殘基取代(f))以外之胺基酸殘基之胺基酸殘基取代。對於有如此的胺基酸殘基取代群B中之一者以上之胺基酸殘基取代及/或胺基酸殘基取代(f)且更含有胺基酸殘基取代群B及胺基酸殘基取代(f)以外之胺基酸殘基之胺基酸殘基取代之改變腈水合酶、或胺基酸殘基取代群B之胺基酸殘基之取代、胺基酸殘基取代(f)皆無且含有胺基酸殘基取代群B及胺基酸殘基取代(f)以外之胺基酸殘基之胺基酸殘基取代之改變腈水合酶， 胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入，藉由如後述立體結構上之安定化，可發揮改善改變腈水合酶擁有之pH安定性之效果。
可對於上述野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶或改變腈水合酶導入胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上，而獲得本揭示之變異型腈水合酶。
前述變異腈水合酶，也可含有胺基酸殘基取代(a)~(e)及(f)中之表I所示之2個胺基酸殘基取代之組合。
【表1】
前述變異腈水合酶，也可含有胺基酸殘基取代(a)~(e)及(f)中之表II所示之3個胺基酸殘基取代之組合。
【表2】
前述變異腈水合酶，也可含有胺基酸殘基取代(a)~(e)及(f)中之表III所示之4個胺基酸殘基取代之組合。
【表3】
前述變異腈水合酶，也可含有胺基酸殘基取代(a)~(e)及(f)中之表IV所示之5個胺基酸殘基取代之組合。
【表4】
前述變異腈水合酶，也可含有胺基酸殘基取代(a)~(e)及(f)之全部(表V所示之6個胺基酸殘基取代)之組合。
【表5】
可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用之改變腈水合酶之胺基酸序列，也可為國際公開第2010/055666號等製作之改變腈水合酶之胺基酸序列或與其類似的序列。所以本揭示之變異型腈水合酶例如可為將下列取代中之至少任一者對於以下之腈水合酶(1)~(47)中任一者導入而得者(以下也稱為變異型腈水合酶B)： α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基取代為Asn、 α次單元之N末端起43號之胺基酸殘基取代為Val、 β次單元之N末端起205號之胺基酸殘基取代為Val、 β次單元之N末端起206號之胺基酸殘基取代為Gln、 β次單元之N末端起215號之胺基酸殘基取代為Asn。
(1) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號2之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (2) 具有具序列編號16之胺基酸序列之α次單元及具序列編號33之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (3) 具有具序列編號17之胺基酸序列之α次單元及具序列編號33之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (4) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號34之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (5) 具有具序列編號19之胺基酸序列之α次單元及具序列編號34之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (6) 具有具序列編號20之胺基酸序列之α次單元及具序列編號35之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (7) 具有具序列編號20之胺基酸序列之α次單元及具序列編號36之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (8) 具有具序列編號21之胺基酸序列之α次單元及具序列編號37之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (9) 具有具序列編號21之胺基酸序列之α次單元及具序列編號38之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (10) 具有具序列編號21之胺基酸序列之α次單元及具序列編號39之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (11) 具有具序列編號21之胺基酸序列之α次單元及具序列編號40之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (12) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號41之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (13) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號42之胺基酸酸序列之β次單元的腈水合酶、 (14) 具有具序列編號21之胺基酸序列之α次單元及具序列編號43之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (15) 具有具序列編號22之胺基酸序列之α次單元及具序列編號44之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (16) 具有具序列編號23之胺基酸序列之α次單元及具序列編號45之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (17) 具有具序列編號24之胺基酸序列之α次單元及具序列編號46之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (18) 具有具序列編號25之胺基酸序列之α次單元及具序列編號47之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (19) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號48之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (20) 具有具序列編號23之胺基酸序列之α次單元及具序列編號49之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (21) 具有具序列編號16之胺基酸序列之α次單元及具序列編號50之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (22) 具有具序列編號26之胺基酸序列之α次單元及具序列編號51之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (23) 具有具序列編號27之胺基酸序列之α次單元及具序列編號52之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (24) 具有具序列編號28之胺基酸序列之α次單元及具序列編號53之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (25) 具有具序列編號17之胺基酸序列之α次單元及具序列編號54之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (26) 具有具序列編號29之胺基酸序列之α次單元及具序列編號55之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (27) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號56之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (28) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號57之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (29) 具有具序列編號30之胺基酸序列之α次單元及具序列編號58之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (30) 具有具序列編號29之胺基酸序列之α次單元及具序列編號59之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (31) 具有具序列編號31之胺基酸序列之α次單元及具序列編號60之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (32) 具有具序列編號18之胺基酸序列之α次單元及具序列編號61之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (33) 具有具序列編號32之胺基酸序列之α次單元及具序列編號62之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (34) 具有具序列編號30之胺基酸序列之α次單元及具序列編號63之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (35) 具有具序列編號30之胺基酸序列之α次單元及具序列編號64之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (36) 具有具序列編號30之胺基酸序列之α次單元及具序列編號65之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (37) 具有具序列編號25之胺基酸序列之α次單元及具序列編號54之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (38) 具有具序列編號30之胺基酸序列之α次單元及具序列編號66之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (39) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號67之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (40) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號68之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (41) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號69之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (42) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號70之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (43) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號71之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (44) 具有具序列編號21之胺基酸序列之α次單元及具序列編號72之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (45) 具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元及具序列編號73之胺基酸序列之β次單元的腈水合酶、 (46) 上述(1)~(45)之腈水合酶中之任一者的α次單元之N末端起36號之胺基酸殘基為Trp殘基的腈水合酶、 (47) 改變腈水合酶，具有上述(1)~(46)之腈水合酶中之任一特定腈水合酶的α次單元之胺基酸序列或由與該胺基酸序列有70%以上之序列同一性之胺基酸序列構成的α次單元變體、及前述特定腈水合酶的β次單元的胺基酸序列或由與該胺基酸序列有70%以上之序列同一性之胺基酸序列構成的β次單元變體，且α次單元之胺基酸序列及β次單元之胺基酸序列中之至少一者為α次單元變體或β次單元變體之胺基酸序列。
又，上述腈水合酶(2)~(45)若與具有具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號2之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶(1)比較，在以下表6~表13記載之胺基酸殘基不同，尚記載國際公開第2010/055666號中的轉形體編號。以下表中，變異處之欄之數字，代表該相應次單元之胺基酸序列N末端起算的位置。又，轉形體編號，係國際公開第2010/055666號標註的編號。
【表6】 
【表7】 
【表8】 
【表9】 
【表10】 
【表11】 
【表12】 
【表13】 
可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用之改變腈水合酶之胺基酸序列，宜為上述(2)~(45)之44種中任一腈水合酶之胺基酸序列較佳，上述(3)、(11)、(18)、(19)、(25)、(27)、(28)、(29)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)、(37)、(38)、(39)、(40)、(41)、(42)、(43)、(44)、及(45)中之任一腈水合酶之胺基酸序列更佳。
上述(47)中，α次單元變體之胺基酸序列對於特定腈水合酶之α次單元的序列同一性可為80%以上，或可為85%以上，或可為90%以上，或可為95%以上，或可為96%以上，或可為97%以上，或可為98%以上，或可為99%以上。同樣地上述(47)中，β次單元變體之胺基酸序列對於特定腈水合酶之β次單元之序列同一性，可為80%以上，或可為85%以上，或可為90%以上，或可為95%以上，或可為96%以上，或可為97%以上，或可為98%以上，或可為99%以上。又，α次單元變體，係指符合上述規定之序列同一性但與特定腈水合酶之α次單元有不同胺基酸序列之α次單元。β次單元變體，係指符合上述規定之序列同一性但具有與特定腈水合酶之β次單元不同之胺基酸序列之β次單元。
上述(2)~(45)之腈水合酶，係國際公開第2010/055666號中在實施例確認了其活性(轉形體編號5、62、68、95及111)的腈水合酶。又，上述(1)之腈水合酶係野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶。(2)~(46)之腈水合酶也可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用。又，具有與腈水合酶之胺基酸序列類似之胺基酸序列之其他改變腈水合酶也可作為胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入對象使用。因此，針對改變腈水合酶與野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之間之胺基酸序列差異所説明的事項(包括序列改變的程度、例的相關説明)，可將「野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶」直接套用在上述(1)~(46)中的任一腈水合酶。又，改變腈水合酶當然也有腈水合酶活性。
例如：針對上述變異型腈水合酶B可能含有的胺基酸殘基取代及其組合、及腈水合酶之α次單元之N末端起36號之胺基酸殘基，前述變異型腈水合酶B可含有選自於由前述表I記載之胺基酸殘基之組合a~o、前述表II記載之胺基酸殘基之組合p~ai、前述表III記載之胺基酸殘基之組合aj~ax、前述表IV記載之胺基酸殘基之組合ay~bd、及前述表V記載之胺基酸殘基之組合be構成之群組中的胺基酸殘基之組合。亦即，可對於上述(1)~(46)之腈水合酶之胺基酸序列導入如此的胺基酸殘基取代之組合。
又，例如：上述(47)的腈水合酶，可為對於上述(1)~(46)之腈水合酶中之任一者施加了選自於由下列構成之群組中之一者以上之改變的改變腈水合酶(i)1個以上之胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基、(ii)上述(a)~(e)以外之1個以上之胺基酸殘基之缺失、(iii)胺基酸殘基之插入、(iv)對於α次單元之胺基酸序列N末端及C末端中之一者或兩者附加胺基酸殘基、(v)對於β次單元之胺基酸序列N末端及C末端中之一者或兩者附加胺基酸殘基。
前述(47)之腈水合酶之α次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之α次單元作為基準時，被取代之胺基酸殘基之數目例如為1~20，或1~15，或1~10，或1~8，或1~7，或1~6，或1~5，或1~4，或1~3，或1~2，或1。被取代的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述(47)之腈水合酶之β次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之β次單元作為基準時，被取代之胺基酸殘基之數目例如為1~20，或1~15，或1~10，或1~8，或1~7，或1~6，或1~5，或1~4，或1~3，或1~2，或1。被取代之胺基酸殘基之數目也可為0。
前述(47)之腈水合酶之α次單元中，上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之α次單元作為基準時，缺失的胺基酸殘基的數例如為1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。缺失的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述(47)之腈水合酶之β次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之β次單元作為基準時，缺失的胺基酸殘基的數目例如為1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。缺失的胺基酸殘基的數目也可為0。
前述(47)之腈水合酶之α次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之α次單元作為基準時，插入的胺基酸殘基的數目例如為1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。插入的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述(47)之腈水合酶之β次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之β次單元作為基準時，插入的胺基酸殘基的數目例如為1~10，或1~7，或1~4，或1~2，或1。插入的胺基酸殘基的數目也可為0。
前述(47)之腈水合酶之α次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之α次單元作為基準時，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數，例如為1~20，或1~14，或1~8，或1~4，或1~2，或1。有末端加成時等，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數也可為0。 前述(47)的改變腈水合酶的β次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之β次單元作為基準時，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數，例如：1~20，或1~14，或1~8，或1~4，或1~2，或1。有末端加成時等，取代、缺失或插入的胺基酸殘基的總數也可為0。
前述(47)之腈水合酶之α次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之α次單元作為基準時，末端加成的胺基酸殘基的數目，例如：每一末端為1~60，或1~40，或1~20，或1~10，或1~5，或1~3，或1。加成的胺基酸殘基的數目也可為0。 前述(47)之腈水合酶之β次單元中，將上述(1)~(46)中之任一腈水合酶之β次單元作為基準時，末端加成的胺基酸殘基的數目，例如：每一末端為1~60，或1~40，或1~20，或1~10，或1~5，或1~3，或1。加成的胺基酸殘基的數目也可為0。
前述(47)的腈水合酶，當與(1)~(46)中之任一腈水合酶之胺基酸序列比較時， 也可包括選自上述胺基酸殘基取代群B中之1個以上之胺基酸殘基取代。上述胺基酸殘基取代也可將2個以上組合而含有。
上述中，(47)之α/β次單元變體，也可為相較於特定腈水合酶之α/β次單元之胺基酸序列不具胺基酸之插入、胺基酸殘基之缺失，僅有胺基酸殘基之取代或末端加成者。(47)之α/β次單元變體中，針對胺基酸殘基之位置，與前述同樣，係指特定腈水合酶之α/β次單元中之指定胺基酸殘基在對準上對應的位置。
本揭示之變異型腈水合酶，也可為 對於上述腈水合酶(1)~(46)中之任一腈水合酶特定腈水合酶、或 對於具有對於特定腈水合酶之α次單元有70%以上之序列同一性之改變α次單元及對於特定腈水合酶之β次單元有70%以上之序列同一性之改變β次單元但不是特定之腈水合酶本身的改變腈水合酶， 導入了下列胺基酸殘基取代中之至少一者的變異型腈水合酶(以下也稱為變異型腈水合酶C)： 前述特定腈水合酶之α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Asn、 前述特定腈水合酶之α次單元之N末端起43號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Val、 前述特定腈水合酶之β次單元之N末端起205號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Val、 前述特定腈水合酶之β次單元之N末端起206號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Gln、 前述特定腈水合酶之β次單元之N末端起215號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Asn。
上述説明中，前述導入前之腈水合酶為前述改變腈水合酶時，「特定腈水合酶之α次單元之N末端起A號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基」，係指將前述改變腈水合酶之α次單元之胺基酸序列對於特定腈水合酶之α次單元之胺基酸序列對準時，與特定腈水合酶之α次單元之胺基酸序列N末端起A號之胺基酸殘基對應的改變腈水合酶之α次單元之胺基酸序列上之胺基酸殘基，同樣地，「特定腈水合酶之β次單元之N末端起A號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基」，係指將前述改變腈水合酶的β次單元的胺基酸序列對於特定腈水合酶的β次單元的胺基酸序列對準時，與特定腈水合酶的β次單元的胺基酸序列N末端起A號之胺基酸殘基對應之改變腈水合酶的β次單元的胺基酸序列上之胺基酸殘基。又，前述導入前之腈水合酶為特定腈水合酶時，「特定腈水合酶之α次單元之N末端起A號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基」，係指特定腈水合酶之α次單元之N末端起A號之胺基酸殘基，「特定腈水合酶之β次單元之N末端起A號之胺基酸殘基所對應之胺基酸殘基」，係指特定腈水合酶之β次單元之N末端起A號之胺基酸殘基。
上述改變腈水合酶中，其α次單元之對於特定腈水合酶之α次單元之序列同一性，可為80%以上，或可為85%以上，或可為90%以上，或可為95%以上，或可為96%以上，或可為97%以上，或可為98%以上，或可為99%以上。同樣地，其β次單元之對於上述特定腈水合酶之β次單元之序列同一性可為80%以上，或可為85%以上，或可為90%以上，或可為95%以上，或可為96%以上，或可為97%以上，或可為98%以上，或可為99%以上。尤其上述改變腈水合酶中，其α次單元之對於特定腈水合酶之α次單元之序列同一性，宜為90%以上較佳，95%以上更佳。同樣地，上述改變腈水合酶中，其β次單元之對於特定腈水合酶之β次單元之序列同一性，宜為90%以上較佳，95%以上更佳。針對改變腈水合酶與野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶之間之胺基酸序列差異説明的事項(包括針對序列改變之程度、例之説明)，可直接將「野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶」直接套用在特定腈水合酶。上述改變腈水合酶的α/β次單元之胺基酸序列，也可為相較於特定腈水合酶之α/β次單元之胺基酸序列沒有胺基酸之插入、胺基酸殘基之缺失，僅有胺基酸殘基取代或僅有末端加成者。又，改變腈水合酶當然應有腈水合酶活性。
針對上述變異型腈水合酶C可含有的胺基酸殘基取代及其組合、及前述特定腈水合酶之α次單元之N末端起36號所對應的胺基酸殘基，前述變異型腈水合酶C也可包括選自於由前述表I記載之胺基酸殘基之組合a~o、前述表II記載之胺基酸殘基之組合p~ai、前述表III記載之胺基酸殘基之組合aj~ax、前述表IV記載之胺基酸殘基之組合ay~bd、及前述表V記載之胺基酸殘基之組合be構成之群組中的胺基酸殘基之組合。亦即，可對於特定腈水合酶或改變腈水合酶之胺基酸序列導入如此的胺基酸殘基取代之組合。
又，例如：前述改變腈水合酶，當和如(1)~(46)中之任一腈水合酶之胺基酸序列比較時，也可含有選自上述胺基酸殘基取代群B中之1個以上之胺基酸殘基取代。上述胺基酸殘基取代也可將2個以上組合並含有。
又，以上説明之改變腈水合酶，可為具有上述特定之α次單元或在其N末端或C末端或此兩者附加了加成序列的多胜肽、以及上述特定之β次單元或在其N末端或C末端或此兩者附加了加成序列的多胜肽的腈水合酶。前述改變腈水合酶之α次單元中，末端加成的胺基酸殘基的數目，例如：每一末端為1~60，或1~40，或1~20，或1~10，或1~5，或1~3，或1。加成的胺基酸殘基的數目也可為0。前述改變腈水合酶之β次單元中，末端加成的胺基酸殘基的數目，例如：每一末端為1~60，或1~40，或1~20，或1~10，或1~5，或1~3，或1。加成的胺基酸殘基的數目也可為0。 改變腈水合酶之α次單元中，含有加成、取代、缺失、及/或插入的胺基酸序列(不包括前述(a)及(b)之取代胺基酸殘基)時，被取代、缺失、及/或插入的胺基酸殘基的總數宜為1~10較佳，1~5更佳。同樣地，改變腈水合酶的β次單元中，含有被加成、取代、缺失、及/或插入之胺基酸序列(不包括前述(c)~(e)之取代胺基酸殘基)時，被取代、缺失、及/或插入之胺基酸殘基之總數宜為1~10較佳，1~5更佳。
本揭示之變異型腈水合酶，一般而言，係2個如上述規定之α次單元與2個如上述規定之β次單元締合並作用。
本揭示之變異型腈水合酶，與習知的腈水合酶變異體不同，即使在pH3.5~6.5等酸性條件下，對於從腈化合物合成醯胺化合物之反應仍顯示良好的酵素活性。 本揭示之變異型腈水合酶擁有的前述酸性條件下的酵素活性的安定性的改善，於pH5.0以下之範圍尤其顯著。所以，依照前述變異型腈水合酶，在利用了腈水合酶的工業化醯胺化合物之製造處理中，不僅是在進行從腈化合物合成醯胺化合物的反應的反應步驟，在pH3.5~6.5等酸性條件下使用活性碳並將該溶液中存在之蛋白質等雜質吸附除去而獲得精製的醯胺化合物的精製步驟，皆能使從為基質之腈化合物變化為醯胺化合物的該醯胺化合物之合成反應充分進行。所以， 依照前述變異型腈水合酶，相較於使用習知酵素的情形，能使工業化的醯胺化合物之製造處理中，目的產物的醯胺化合物之製造效率大幅提高。前述酸性條件，為了更有效率地去除不要的蛋白質，可於5.0以下之pH，例如pH3.5~pH5.0進行。
又，施行了酸處理(例如pH4.0、30℃、30小時之處理)之變異型腈水合酶之反應初速度相對於未施行酸處理之變異型腈水合酶之反應初速度的比(酸處理後之反應初速度/酸處理前之反應初速度)的値，宜相對於施行了酸處理之野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之反應初速度相對於未施行酸處理之野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之反應初速度之比(酸處理後之反應初速度/酸處理前之反應初速度)之値，呈1.1倍以上之値較佳。 又，上述變異型腈水合酶或野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia th ermophila)的腈水合酶的pH安定性，例如可依下列方法評價。 反應條件係於含有為基質之丙烯腈2.5%(v/v)之50mM Tris鹽酸水溶液(pH8. 0)中，於反應溫度20℃反應15分鐘至60分鐘。反應結束後，將生成的丙烯醯胺定量。丙烯醯胺量可利用HPLC分析。又，酸處理，例如可藉由於pH4.0附近於30℃處理30小時以進行。具體而言，可依實施例之pH安定性之評價之欄記載的作法評價。
例如：將生產腈水合酶的轉形體的培養結束液40μL懸浮在740μL的54mM Tris鹽酸水溶液(pH8.0)，於其中添加20μL的丙烯腈，於20℃邊緩慢地攪拌邊反應15分鐘至60分鐘，反應結束後使用HPLC實施反應液之分析，測定生成的醯胺化合物的量(P)(或也可以從消耗的腈化合物的量計算)。又，取前述轉形體的培養結束液1000μL，離心分離並回收菌體，對於菌體加入50mM檸檬酸緩衝液(pH4.0) 1000μL，邊攪拌邊於30℃進行30小時處理(酸處理)。處理後，將780μL進行離心分離並回收菌體，懸浮在780μL的54mMTris鹽酸水溶液(pH8.0)，於其中加入20μL的丙烯腈，於20℃邊緩慢地攪拌邊反應15分鐘至60分鐘，反應結束後使用HPLC分析反應液，並測定生成的醯胺化合物的量(Q)(或也可從消耗的腈化合物的量計算)。反應及分析於各條件進行3次以上。將由酸處理後之腈水合酶獲得之醯胺化合物的量(Q)除以由酸處理前之腈水合酶獲得之醯胺化合物的量(P)，求商(R)。針對野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶、及試驗對象之腈水合酶分別求商R，並求出試驗對象之腈水合酶之R値相對於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之R之比(試驗對象/野生型)。若此比值超過1.0，代表比起野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶，pH安定性有所改善。
本揭示之變異型腈水合酶相較於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶，依上述方式求得的R値較高，變異型腈水合酶之R値為野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之R値之1.1倍以上較佳，1.2倍以上更佳，1.3倍以上又更佳，1.4倍以上更佳。
又，前述變異型腈水合酶，如所上述，針對從腈化合物合成醯胺化合物之反應，相較於習知的變異型腈水合酶，在較廣的pH範圍顯示酵素活性，就此點而言為pH安定性優異之酵素。又，針對上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代均為使腈水合酶之酵素活性之pH安定性改善的原因，本案發明人等研究的結果為：上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代相關的胺基酸皆存在於酵素之基質囊附近。據認為藉由含有上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代中之一者以上，蛋白質之立體結構(折疊狀態)在廣pH範圍保持良好狀態。所以，據認為上述(a)至(e)之胺基酸殘基取代乃一群之胺基酸殘基取代(胺基酸殘基取代群A)。
又，前述變異型腈水合酶係以α次單元與β次單元締合成的二聚體作為基本結構單元，此二聚體更締合而形成四聚物。為α次單元之N末端起111號之胺基酸殘基的半胱胺酸殘基接受轉譯後修飾成半胱胺酸亞磺酸(Cys-SOOH)，為N末端起113號之胺基酸殘基之半胱胺酸殘基接受轉譯後修飾成半胱胺酸次磺酸(Cys-S OH)，並介隔此修飾胺基酸殘基而使α次單元之多胜肽鏈與鈷原子鍵結形成活性中心。
作為能將野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶在轉形體內大量表現之質體及利用該質體轉形成的細胞株，可以使用MT-10 822(寄存編號FERM BP-5785，平成8年2月7日寄存於日本茨城縣筑波市東1-1-1獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄存中心)。又，改變腈水合酶可使用通常的基因操作技術獲得。蛋白質的立體結構，一般而言，當胺基酸序列相同性高時，不拘於含該蛋白質之菌株之種屬，有類似之結構的機率高，故由於胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上之導入獲得之效果，包括改變腈水合酶在內，一般會對於上述規定之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶發揮。並且，獲得之變異型腈水合酶，例如利用在pH4.0之酵素活性相較於在pH8.0之酵素活性所評價之pH安定性，也可比起胺基酸殘基取代(a)~(e)中之一者以上導入前更高。
又，前述變異型腈水合酶包括上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代中之至少一者。前述變異型腈水合酶可僅含有(a)~(e)之胺基酸殘基取代中的1個，也可含有2個以上。例如為2個的組合時，可列舉(a)與(b)之組合、(a)與(c)之組合、(a)與(d)之組合、(a)與(e)之組合、(b)與(c)之組合、(b)與(d)之組合、(b)與(e)之組合、(c)與(d)之組合、(c)與(e)之組合、(d)與(e)之組合、及(d)與(f)之組合。
為3個之組合時，例如：(a)、(b)及(c)之組合、(a)、(b)及(d)之組合、(a)、(b)及(e)之組合、(a)、(c)及(d)之組合、(a)、(c)及(e)之組合、(a)、(d)及(e)之組合、(b)、(c)及(d)之組合、(b)、(c)及(e)之組合、(b)、(d)及(e)之組合、及(c)、(d)及(e)之組合。 為4個之組合時，例如：(a)、(b)、(c)及(d)之組合、(a)、(b)、(c)及(e)之組合、(a)、(b)、(d)及(e)之組合、(a)、(c)、(d)及(e)之組合、及(b)、(c)、(d)及(e)之組合。 當然(a)~(e)也可5個組合並取代。
於一實施形態中，前述變異型腈水合酶包括上述(b)之胺基酸殘基取代、及除此以外的選自於由上述(a)及(c)~(e)之胺基酸殘基取代構成之群組中之1個以上之胺基酸殘基取代。與上述(b)之胺基酸殘基取代一起含有的選自於由上述(a)及(c)~(e)之胺基酸殘基取代構成之群組中的1個以上之胺基酸殘基取代，也可為2個胺基酸殘基取代，也可為3個胺基酸殘基取代，也可為4個胺基酸殘基取代(亦即(a)及(c)~(e)全部)。又，此實施形態中，前述變異型腈水合酶也可以更有前述(f)之胺基酸殘基取代。
並且，如上所述，成為導入(a)~(e)之胺基酸殘基取代中之至少一者之對象的改變腈水合酶，可為野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶或可為含有對於上述(1)~(5)之特定序列含有胺基酸之取代等改變者。 所以，變異型腈水合酶可相較於野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia th ermophila)的腈水合酶或上述(1)~(5)之特定序列，含有上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代，且更含有上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代以外之位置之胺基酸殘基取代。如此，即使是含有其他胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶，亦可獲得位在立體結構上特定位置之胺基酸殘基取代群A所獲致之效果。
於一實施形態，本揭示之變異型腈水合酶不僅pH安定性改善，在從腈化合物生成醯胺化合物之反應之初速度亦有改善。即，藉由將(a)~(e)之胺基酸殘基取代中之至少一者導入到野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶或改變腈水合酶，可獲得比起導入前之反應初速度有更高反應初速度之腈水合酶。反應初速度可藉由例如以下方式求取：將生產變異型腈水合酶之轉形體之培養結束液40 μL懸浮在740μL的54mMTris鹽酸水溶液(pH8.0)，於其中添加20μL的丙烯腈並邊於20℃緩慢攪拌邊反應15分鐘到60分鐘，反應結束後使用HPLC分析反應液以求取。又，本揭示之變異型腈水合酶，宜於pH8.0顯示比起野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶更高的反應初速度較佳，顯示高1.1倍以上之反應初速度更佳， 顯示高1.2倍以上的反應初速度又更佳，顯示高1.3倍以上的反應初速度更佳，顯示高1.4倍以上的反應初速度又更佳。
前述變異型腈水合酶可依下列方法製造。 例如：準備含有編碼前述變異型腈水合酶的DNA的表現載體，利用此表現載體對於任意寄主細胞轉形而取得轉形體或細胞株，然後，培養前述轉形體、細胞株可生產變異型腈水合酶。
在此，編碼野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶的基因，係由序列編號3所示之核苷酸序列、與序列編號4所示之核苷酸序列構成。又，序列編號3所示之核苷酸序列對應於由序列編號1構成的胺基酸序列，序列編號4所示之核苷酸序列對應於由序列編號2構成的胺基酸序列。 又，編碼前述變異型腈水合酶之DNA，至少序列編號3表示之核苷酸序列或序列編號4表示之核苷酸序列中之上述(a)~(e)之胺基酸殘基取代位置所對應的密碼子(計5處)中的一者以上具有如下列之核苷酸取代，在其他位置也具有改變腈水合酶所對應的核苷酸取代。
具體而言，例如製作野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermoph ila)的腈水合酶的α次單元之N末端起40號之胺基酸殘基即Asp殘基取代為Asn的變異體時，可使用序列編號3表示之核苷酸序列5’末端起118~120號之核苷酸GA C取代為AAC或AAT的DNA。
製作野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之α次單元之N末端起43號之胺基酸殘基Ala殘基取代為Val之變異體時，可使用序列編號3表示之核苷酸序列5’末端起127~129號的核苷酸GCC取代為GTT、GT C、GTA或GTG的DNA。
製作野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶的β次單元之N末端起205號之胺基酸殘基Gly殘基取代為Val的變異體時，可使用將序列編號4表示之核苷酸序列5’末端起613~615號的核苷酸GGG取代為GTT、G TC、GTA或GTG的DNA。
製作野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶的β次單元之N末端起206號之胺基酸殘基Pro殘基取代為Gln的變異體時，可使用序列編號4表示之核苷酸序列5’末端起616~618號的核苷酸CCG取代為CAA或C AG的DNA。
製作野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之α次單元之N末端起215號之胺基酸殘基Tyr殘基取代為Asn的變異體時，可使用序列編號4表示之核苷酸序列5’末端起643~645號的核苷酸TAC取代為AAC或A AT的DNA。
又，關於胺基酸殘基取代(f)，當製作野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudono cardia thermophila)的腈水合酶之α次單元之N末端起36號之胺基酸殘基Thr殘基取代為Trp的變異體時，可使用序列編號3表示之核苷酸序列5’末端起106~108號的核苷酸ACG取代為TGG的DNA。
前述表現載體含有編碼變異型腈水合酶之α次單元之基因及編碼變異型腈水合酶的β次單元之基因，又，視需要含有對於各基因表現為必要的控制區及自主複製所必要的區域等能利用轉形體、細胞株生產變異型腈水合酶的要素。導入有表現載體的寄主細胞可為任意細胞，例如大腸菌。
就表現所必要的控制區而言，可以列舉啟動子序列(包括控制轉錄之操作子序列)、核糖體結合序列(SD序列)、轉錄終結序列等。具體的啟動子序列，例如來自大腸菌的色胺酸操縱子的trp啟動子、乳糖操縱子的lac啟動子、來自lambda噬菌體的PL啟動子及PR啟動子等。又，也可使用如tac啟動子、trc啟動子般經人為設計、改變的序列。
核糖體結合序列宜為序列編號74中含有的具TAAGGAGGT的序列，此等控制區在表現載體上的序列順序，啟動子序列與核糖體結合序列宜位在比起編碼變異型腈水合酶的基因更靠5’末端側上游，轉錄終結序列宜位在比起編碼變異型腈水合酶之基因更靠3’末端側下游。又，可利用如此的控制區，將變異型腈水合酶之α次單元基因及β次單元基因以各自獨立的順反子(cistron)的形式表現，也可利用共通的控制區以多順反子的形式表現。
符合以上要件之載體，例如含有可在大腸菌中自主複製之區域的pBR322、p UC18、pBluescript、pKK223-3、pSC101。
針對藉由在如此的載體同時插入編碼前述變異型腈水合酶之基因以及對於該變異型腈水合酶之活性之表現為必要的區域而建構本揭示之表現載體之方法、將該表現載體轉形為所望寄主細胞之方法、進而在該轉形體內生產腈水合酶之方法等，可以採用例如「Molecular Cloning 3rd Edition」(J. Sambrook等人；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)等記載之分子生物學、生物工程、及基因工程之領域公知之一般方法、寄主細胞。
將上述表現載體對於所望之寄主細胞轉形而獲得之轉形體，可藉由以培養基培養，而依據前述表現載體所含之腈水合酶基因生產變異型腈水合酶。寄主細胞為大腸菌時，培養前述轉形體之培養基，一般使用LB培養基、M9培養基等，更佳為在如此的培養基中含有Fe離子及Co離子0.1μg/mL以上的成分的培養基。將前述轉形體接種在培養基後，於適當的培養溫度(一般而言，20℃~50℃)使其生長即可。
於使編碼前述變異型腈水合酶之基因表現而生產有所望酵素活性之變異型腈水合酶時，也可將編碼涉及腈水合酶活化之蛋白質的基因一起表現。
涉及此腈水合酶之活化之蛋白質，係指有該蛋白質表現之有無會直接影響腈水合酶之活化的性質的蛋白質，日本特開平11-253168號公報記載之涉及來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶活化的蛋白質(腈水合酶活化蛋白質)為其代表例。前述腈水合酶活化蛋白質之序列示於序列編號75。
＜核酸＞ 本揭示之核酸具有編碼前述變異型腈水合酶之胺基酸序列之核苷酸序列。 就合成編碼前述變異型腈水合酶之胺基酸序列之核苷酸序列之方法而言，可列舉對於編碼對應之野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophil a)的腈水合酶的核苷酸序列導入變異點的方法、將含有變異點的全部核苷酸序列予以化學合成的方法等。將編碼野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia th ermophila)的腈水合酶的核苷酸序列作為模板而使基因產生變異的方法，例如：部位專一性變異法(Kramer, W. and frita, H. J., Methods in Enzymology, vol. 154, P. 350(1987))、重組PCR法(PCR Technology, Stockton Press(1989)、將特定部分之D NA進行化學合成之方法、將基因以羥基胺處理之方法、將保有基因之菌株進行紫外線照射之方法、以亞硝基胍、亞硝酸等化學藥劑處理之方法、使用市售之突變異導入套組之方法等。本揭示之核酸可為DNA也可為RNA。
＜載體＞ 本揭示之載體只要是含有編碼前述變異型腈水合酶之胺基酸序列之核苷酸序列表示之核酸的載體即可，無特別限定，例如對於公知之載體導入前述變異型腈水合酶者。又，前述載體可為噬菌體載體也可為質體載體。
＜表現載體＞ 本揭示之表現載體，只要是含有編碼前述變異型腈水合酶之胺基酸序列之核苷酸序列表示之核酸的表現載體即無特殊限制，但考量轉形效率、轉譯效率增進等的觀點，為以下所示構成之質體載體、噬菌體載體更佳。
(表現載體之基本構成) 表現載體含有編碼前述變異型腈水合酶之核苷酸序列，只要可將前述寄主細胞轉形即無特殊限制。視需要，該核苷酸序列以外，也可含有構成其他區域之核苷酸序列(以下也簡單稱為「其他區域」)。其他區域，例如：前述轉形體為了生產前述變異型腈水合酶所必要的控制區、自主複製所必要的區域等。 又，考量容易選擇前述轉形體的觀點，也可更含有編碼可能成為選擇標記的選擇基因的核苷酸序列。 就為了生產前述變異型腈水合酶為必要的控制區而言，可列舉啟動子序列(包括控制轉錄之操作子序列。)、核糖體結合序列(SD序列)、轉錄終結序列等。
(以酵母作為寄主細胞時之表現載體) 以酵母作為寄主細胞時，表現載體除了編碼前述變異型腈水合酶之核苷酸序列以外，宜更含有啟動子序列較佳。啟動子序列只要能在以酵母作為寄主細胞之轉形體中表現前述變異型腈水合酶者皆可使用。
例如可使用醇去氫酶(ADH1)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK1)啟動子、胜肽鏈伸長因子(TEF)啟動子、甘油3-磷酸去氫酶(GPD)啟動子、半乳糖激酶(GAL1)啟動子、金屬硫蛋白(metallothionein)(CUP1)啟動子、抑制性酸性磷酸酶(PHO5)啟動子、甘油醛-3-磷酸去氫酶(GAPDH)啟動子等啟動子序列。 又，上述啟動子序列的來源不限於成為寄主細胞的酵母。 也可使用如巨細胞病毒(CMV)啟動子等外來的啟動子。它們可依使用的酵素的來源、種類而適當選擇。
又，前述表現載體也可以含有分泌信號。藉此，當轉形體生產前述變異型腈水合酶時，前述變異型腈水合酶可分泌到細胞外。 分泌信號只要是可從成為寄主細胞之酵母分泌前述變異型腈水合酶即可，並無特殊限制。考量分泌效率之觀點，宜使用α因子信號序列、轉化酶(invertase)信號序列、酸性磷酸酶信號序列、葡萄糖澱粉酶信號序列等較佳。
含有如以上之啟動子序列、分泌信號之表現載體具體而言可以列舉pRS423、 pRS424、YEplac195等。
(絲狀菌作為寄主細胞時之表現載體) 絲狀菌作為寄主細胞時，表現載體除了含有編碼前述變異型腈水合酶之核苷酸序列以外，尚含有啟動子序列較佳。啟動子序列只要是能使前述變異型腈水合酶在以絲狀菌作為寄主細胞之轉形體中表現者皆可使用。
對於絲狀菌適當的表現載體，記載於van den Hondel, C. A. M. J. J. et al. (1991)In：Bennett, J. W. and Lasure, L. L. (eds. )More gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428。 又，也可使用如pUC18、pBR322、pUC100、pSL1180(Pharmacia inc.公司製)、pFB6及麴菌屬(Aspergillus)pRAX、木黴屬(Trichoderma)pTEX等一般的中使用的其他表現載體。
(原核生物作為寄主細胞時之表現載體) 大腸菌、枯草菌、放線菌等原核生物作為寄主細胞時，表現載體除了含有編碼前述變異型腈水合酶之核苷酸序列以外，尚含有啟動子序列較佳。又，除了啟動子序列以外，也可含有核糖體結合序列、轉錄終結序列等。
啟動子序列，例如來自大腸菌的色胺酸操縱子的trp啟動子、乳糖操縱子之lac啟動子、來自Lambda噬菌體的PL啟動子及PR啟動子、來自枯草菌的葡萄糖酸合成酵素啟動子(gnt)、鹼性蛋白酶啟動子(apr)、中性蛋白酶啟動子(npr)、α-澱粉酶啟動子(amy)等。 又，也可使用如tac啟動子般獨特地改變或設計的啟動子序列。
核糖體結合序列可列舉來自大腸菌或來自枯草菌的序列，但若是在大腸菌、 枯草菌等所望寄主細胞內作用的序列則無特殊限制。 前述核糖體結合序列，例如利用DNA合成作出的對於16S核糖體RNA之3’末端區域為互補的序列中的連續4個核苷酸以上的一致性序列之序列等。 轉錄終結序列不一定必要，可利用ρ因子非依存性者，例如脂蛋白終結子、trp操縱子終結子等。 此等控制區在表現載體上的序列順序無特殊限制，若考慮轉錄效率，希望自5’末端側上游按順序排列啟動子序列、核糖體結合序列、編碼目的蛋白質之基因、轉錄終結序列。
就在此所指的表現載體的具體例而言，可利用包括能於大腸菌中自主複製之區域的pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3、pSC101、包括能於枯草菌中自主複製之區域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1、φ105等作為表現載體。 又，作為能於2種以上之寄主內自主複製的表現載體，例如可利用pHV14、TRp7、YEp7及pBS7等作為表現載體。
[轉形體之製作方法] 本揭示之轉形體可依公知方法製作。例如：建構含有編碼本揭示之變異型腈水合酶之核苷酸序列與視需要之前述其他區域之前述表現載體，並將該表現載體對於所望寄主細胞轉形的方法等。具體而言，可利用Sambrook, J., et. al.,”Mol ecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)等記載之在分子生物學、生物工程及基因工程的領域公知之一般方法。
本揭示之轉形體，不僅可於前述寄主細胞納入前述表現載體，也可視需要合併導入將在前述寄主細胞之使用頻度低的密碼子改為使用頻度高的密碼子的方式的靜默變異等以製作。 藉此，有可能增加已納入到表現載體的前述變異型腈水合酶為來源的蛋白質的生產量。
關於靜默變異的導入，若為配合在寄主細胞的密碼子使用頻度而調整位在表現載體上的該腈水合酶基因及使該腈水合酶基因分泌到細胞外用的信號序列密碼子的方法即可，靜默變異導入的方法、變異點、變更的核苷酸的種類等無特殊限制。
＜變異型腈水合酶之製造方法＞ 本揭示之變異型腈水合酶之製造方法，包括：在培養基中培養前述轉形體，及從培養的轉形體及培養基中之至少一者回收前述變異型腈水合酶。 (轉形體之培養方法) 以前述表現載體轉形而獲得之轉形體之培養條件，與轉形前之寄主細胞之培養條件同樣，可以使用公知之條件。 就培養基而言，只要是適量含有碳源、氮源、無機物及其他營養素的培養基即可，合成培養基或天然培養基皆可使用。培養基使用的成分可使用公知品。例如可將肉精、酵母精、麥芽精、蛋白腖、NZ胺及馬鈴薯等有機營養源、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、澱粉及有機酸等碳源、硫酸銨、尿素及氯化銨等氮源、磷酸鹽、鎂、鉀及鐵等無機營養源、維生素類適當組合使用。 又，在培養經由前述含選擇標記之表現載體轉形的轉形體時，例如：前述選擇標記為藥劑耐性時，使用含有與其對應之藥劑之培養基，當前述選擇標記為營養要求性時，使用不含與其對應之營養素之培養基。培養基之pH從pH4~pH8之範圍內選擇即可。 培養可於含有前述培養基之液體培養基中，使用將前述轉形體振盪培養、通氣攪拌培養、連續培養、流加培養等通常的培養方法進行。 培養條件可依前述轉形體、培養基、培養方法的種類適當選擇，只要是轉形體可生長並生產本揭示之變異型腈水合酶的條件即可，無特殊限制。 培養溫度係於20℃~45℃，較佳為24℃~37℃進行好氣性培養。 培養期間於1日~7日之範圍培養至具目的變異型腈水合酶活性之蛋白質之含量成最大即可。
(變異型腈水合酶回收步驟) 變異型腈水合酶回收步驟，係從培養的轉形體及培養後之培養基中之至少任一者回收前述變異型腈水合酶之步驟。
培養經轉形的轉形體後回收本揭示之前述變異型腈水合酶之方法，可使用此領域慣用的方法。 本揭示之前述變異型腈水合酶分泌到經轉形的轉形體外時，可藉由將由該轉形體的培養物進行離心分離、過濾等，而輕易地獲得粗酵素液。又，本揭示之前述變異型腈水合酶累積在經轉形的轉形體內時，利用離心分離等手段回收培養的該轉形體，將回收的該轉形體懸浮於緩衝液，依照溶菌酶處理、冷凍熔解、超音波破碎等公知之方法破壞該轉形體的細胞膜，回收粗酵素液即可。
可將前述粗酵素液利用超過濾法等予以濃縮，並加入防腐劑等而以濃縮酵素的形式利用。又，也可濃縮後利用噴霧乾燥法等，獲得前述變異型腈水合酶的粉末酵素。 針對具有經回收的腈水合酶活性的粗酵素液，當需要分離精製時，例如可將利用硫酸銨等所為之鹽析、利用醇等所為之有機溶劑沉澱法、利用透析及超過濾等所為之膜分離法、或離子交換體層析、逆相高速層析、親和層析、凝膠過濾層析等公知之層析分離法予以適當組合並進行。
本揭示之醯胺化合物之製造方法，包括使前述變異型腈水合酶接觸腈化合物的步驟。前述變異型腈水合酶催化由腈化合物合成醯胺化合物的反應。醯胺化合物之製造方法於以下更具體説明。
首先，培養生產前述變異型腈水合酶的轉形體、細胞株，使獲得之培養液、細胞或細胞處理物於介質中接觸腈化合物。藉此，前述變異型腈水合酶接觸腈化合物，前述變異型腈水合酶將腈化合物變換為對應的醯胺化合物。在此所指的細胞處理物，係指來自該轉形體的萃取物、磨碎物、將該等萃取物、磨碎物的腈水合酶活性級分予以分離獲得之粗酵素製備物、進一步精製獲得之酵素精製物等後分離物、該轉形體、該轉形體之萃取物、磨碎物或後分離物使用適當手段固定化而得的固定化物。 上述接觸溫度較佳為前述變異型腈水合酶不失活的溫度範圍內，更佳為0℃~60℃，更佳為15℃~35℃。例如：可將前述生產變異型腈水合酶的轉形體、培養了細胞株的培養液直接加到含有腈化合物的水溶液中，或也可將培養液離心處理並分離菌體，將菌體添加到含有腈化合物的水溶液內。反應時之水溶液之pH宜為7~9較佳，7.5~8.5更佳。腈化合物可以於水溶液中以例如0.25體積%~20.0體積%，更佳為2.0體積%~5.0體積%的濃度存在。針對轉形體的培養的詳情如變異型腈水合酶之製造方法之項目所述。
上述腈化合物之具體例只要是前述變異型腈水合酶能作為基質作用的化合物即不特別限定，較佳為乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、異丁腈、巴豆腈、α-羥基異丁腈等這類碳數2~4的腈化合物為其代表例。腈化合物中之腈因為水合而變換為醯胺基，例如：丙烯腈可變換為丙烯醯胺。
然後，藉由不使前述變異型腈水合酶失活，而在介質中添加活性碳，以不使使用前述變異型腈水合酶作為觸媒的從腈化合物合成醯胺化合物之反應結束的方式，精製生成的醯胺化合物。
又，藉由與前述變異型腈水合酶接觸而從腈化合物製造醯胺化合物的反應， 係配合腈水合酶之最適pH，例如在pH7~9這樣的中性~鹼性之條件進行。pH可例如在緩衝液中視需要使用氨、氫氧化鈉這類的鹼性物質以調節。另一方面，醯胺化合物之精製，例如宜在pH3.5~6.5這類的酸性條件下進行較佳。原因在於將醯胺化合物含有液中含有的雜質，尤其蛋白質有效率地除去。變更為酸性pH，可使用乙酸、丙酸、辛酸、戊酸、鹽酸、丙烯酸、甲基丙烯酸等酸進行。依此方式，前述醯胺化合物之製造方法宜包括於pH3.5~6.5之條件從含有生成的醯胺化合物的溶液去除雜質的精製步驟較佳。於此步驟，為了去除雜質，宜使用活性碳較佳。亦即，於一實施形態，本揭示之醯胺化合物之製造方法更包括利用活性碳精製醯胺化合物的步驟。所以，前述變異型腈水合酶較佳為於pH3.5~6.5之條件中，具有比起導入前述(a)~(e)之胺基酸殘基取代中之至少一者前更增進的酵素活性。前述pH條件，為了更有效地去除不要的蛋白質，亦可於5.0以下之pH進行。
如上所述，本揭示之變異型腈水合酶，由於pH安定性改善，能夠在從腈化合物製造醯胺化合物的整個處理中，達成高變換效率。以上已針對實施形態記載，但係例示，也可採用上述以外之各式各樣的構成。 [實施例]
依以下之實施例更詳細說明實施形態，但本發明不定限於以下實施例。又，於以下之實施例，「變異處」係指和具有具序列編號1表示之胺基酸序列之α次單元、具序列編號2表示之胺基酸序列之β次單元的野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之胺基酸序列上之差異之位置。
[比較例1] 野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之取得(1) 於30mL之試管製備10mL的LB液體培養基，利用121℃之20分鐘之高壓釜方式將該液體培養基滅菌。對此液體培養基添加安皮西林使終濃度成為100μg/mL後，將上述細胞株MT-10822接菌一鉑耳，於37℃以300rpm培養約20小時。之後將獲得之培養液1mL分取到適當的離心管後，以離心分離(15000rpm×5分)將該菌體分離。 然後以鹼性SDS萃取法分離，從獲得之菌體製備質體pPT-DB1。將製備的質體轉形到大腸菌HB101的勝任細胞(東洋紡公司製)，獲得轉形體(1)。轉形體(1)生產野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶腈水合酶(1)。
[比較例2] 變異型腈水合酶之取得(2) 為了取得表現表14所示之野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之α次單元之N末端起92號之胺基酸殘基Asp取代Glu的變異型腈水合酶的轉形體(2)，實施使用寶酒造公司製之「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」(以下稱為變異導入套組)之部位專一性變異導入。將野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶表現質體pPT-DB1作為模板，實施PCR反應。 PCR反應No.1，係在各含50pmol之序列編號5之引子及M13引子M4(於序列編號12記載序列)之全量50μL之系(組成依變異導入套組記載之條件)，重複實施2 5回合的熱改性(98℃)15秒、黏合(55℃)30秒、伸長反應(72℃)120秒之條件以進行。 PCR反應No.2，係於各含有50pmol之MUT4引子(序列編號14記載序列)及M1 3引子RV(序列編號13記載序列)之全量50μL之系(組成依變異導入套組記載之條件)，實施與PCR反應No.1同樣的操作以進行。
利用使用各5μL之PCR反應No.1及No.2之反應結束液的瓊脂糖電泳(瓊脂糖濃度1.0重量%)實施DNA放大產物之分析，結果可確認到放大DNA產物存在。 使用Microcon100(寶酒造公司製)各從PCR反應結束液去除過量的引子及d NTP後，加入TE，各製備50μL之溶液。製備各含0.5μL之該TE溶液之全量47.5μL之黏合溶液(組成依變異導入套組記載之條件)，實施10分鐘熱改性處理(98℃)後， 費時60分鐘以一定速度冷卻至37℃，然後於37℃保持15分鐘以進行黏合處理。 於黏合處理液加入0.5μL的TaKaRa LA Taq，於72℃進行3分鐘加熱處理，完成異質雙股。 於其中各加入50pmol的M13引子M4(序列編號12記載序列)及M13引子RV (序列編號13記載序列)，使全量成為50μL後，以熱改性(98℃)15秒、黏合(55℃)30秒、伸長反應(72℃)120秒之條件重複進行25回合，以實施PCR反應No.3。
利用使用了PCR反應No.3之反應結束液5μL之瓊脂糖電泳(使用Sigma公司製第VII型低熔點瓊脂糖；瓊脂糖濃度0.8重量%)分析DNA放大產物之分析，結果可確認約2kb之放大DNA產物存在。 然後，從瓊脂糖凝膠僅切出約2Kb的DNA斷片，將該瓊脂糖片(約0.1g)微細地粉碎，懸浮於1mL的TE溶液後，於55℃保溫1小時，使瓊脂糖完全熔解。 對此熔解液實施苯酚/氯仿萃取與乙醇沈澱，精製該DNA斷片，最終溶解於10μL的TE。 將經精製的約2kb的放大DNA斷片以限制酶EcoRI及HindIII切斷後，對於此限制酶處理液實施苯酚/氯仿萃取與乙醇沈澱，將該DNA斷片精製，最後溶於10 μL的TE。 同樣地，利用EcoRI及HindIII將腈水合酶表現質體pPT-DB1切斷，實施瓊脂糖凝膠電泳(使用Sigma公司製第VII型低熔點瓊脂糖；瓊脂糖濃度0.7%)，從瓊脂糖凝膠僅切出約2.7Kb的DNA斷片。 將切出的瓊脂糖片(約0.1g)微細地粉碎，懸浮於1mL之TE溶液後，於55℃保溫1小時，使瓊脂糖完全熔解。 對此熔解液實施苯酚/氯仿萃取與乙醇沈澱，將該DNA斷片精製，最後溶於10μL的TE。 將依此方式獲得之約2kb與約2.7Kb之DNA斷片使用DNA連接套組(寶酒造公司製)連結後，對於大腸菌HB101之勝任細胞(東洋紡公司製)轉形，獲得轉形體(2)。又，從上述菌體利用鹼性SDS萃取法製備質體，以DNA定序儀決定腈水合酶基因部分之核苷酸序列，確認在實施例1記載之質體pPT-DB1，有α次單元之N末端起92號之胺基酸殘基Asp變為Glu的變異。轉形體(2)生產具表14記載之變異之腈水合酶(2)。
＜pH安定性之比較＞ 使用如此獲得之轉形體(2)、及成為其基礎之含有pPT-DB1之轉形體(1)製造醯胺化合物時之pH安定性，依以下之方法比較。藉此，可評價腈水合酶(2)相較於腈水合酶(1)之相對的pH安定性。 於試管製備含有40μg/mL之硫酸鐵(III)･七水合物及10μg/mL之氯化鈷･二水合物的5mL之LB液體培養基，於121℃利用高壓釜滅菌20分鐘。 於此培養基添加安皮西林使終濃度成為100μg/mL後，植菌各轉形體一鉑耳， 於37℃以200rpm各培養約20小時。 取該培養結束液40μl，懸浮在740μL之54mMTris鹽酸水溶液(pH8.0)，於其中添加20μL之丙烯腈，邊於20℃緩慢地攪拌邊反應15分鐘至60分鐘。反應結束後使用HPLC分析反應液，求從腈化合物生成醯胺化合物之酵素活性。反應及分析對於各轉形體實施3次以上，校正分注操作等的數據變異。 同樣地，取前述培養結束液1000μl，離心分離，於回收的菌體中加入50mM檸檬酸緩衝液(pH4.0)1000μl，邊攪拌邊於30℃處理30hr(酸處理)。處理後將780μl離心分離並回收菌體，懸浮於780μL之54mMTris鹽酸水溶液(pH8.0)，於其中添加20μL之丙烯腈，邊於20℃緩慢地攪拌邊反應15分鐘至60分鐘。反應結束後使用HPLC分析反應液，求出從腈化合物生成醯胺化合物之酵素活性。反應及分析對於各轉形體實施3次以上，校正於分注操作等的數據的變異。
＜分析條件＞ 分析設備：日本分光HPLC 管柱：YMC Pack ODS-A(150×6.00mm) 分析溫度：40℃ 移動相：3%乙腈、10mM磷酸 取經50mM檸檬酸緩衝液(pH4.0)處理之菌體之活性與無處理之菌體之酵素活性之比，定義為pH安定性。轉形體(2)之pH安定性相較於野生型(1)，為0.82倍。
上述結果，顯示即使在據認為是腈水合酶之最適條件下會使反應初速度上昇之變異(參照國際公開第2010/055666號)，pH安定性仍不一定改善。
[實施例1] 變異型腈水合酶之取得(3) 為了取得表現具有如表14所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(3)，將序列編號5之引子替換為使用序列編號7之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體並獲得轉形體(3)。轉形體(3)生產具表14記載之變異之腈水合酶(3)。 腈水合酶(3)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表14。
[實施例2] 變異型腈水合酶之取得(4) 為了取得表現具有如表14所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(4)，將序列編號5之引子替換為使用序列編號8之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，並獲得轉形體(4)。轉形體(4)生產具表14記載之變異之腈水合酶(4)。 腈水合酶(4)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表14。
[實施例3] 變異型腈水合酶之取得(5) 為了取得表現具有如表14所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(5)，將序列編號5之引子替換為使用序列編號9之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，並獲得轉形體(5)。轉形體(5)生產具表14記載之變異之腈水合酶(5)。 腈水合酶(5)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表14。
[實施例4] 變異型腈水合酶之取得(6) 為了取得表現具有如表14所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(6)，將序列編號5之引子替換為使用序列編號10之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，並獲得轉形體(6)。轉形體(6)生產具表14記載之變異之腈水合酶(6)。 腈水合酶(6)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表14。
[實施例5] 變異型腈水合酶之取得(7) 為了取得表現具有如表14所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(7)，將序列編號5之引子替換為使用序列編號11之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，並獲得轉形體(7)。轉形體(7)生產具表14記載之變異之腈水合酶(7)。 腈水合酶(7)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表14。
【表14】 
由表14所示的結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之各胺基酸殘基取代單獨地會改善腈水合酶之pH安定性。另一方面，不屬於胺基酸殘基取代群A之α次單元之N末端92號之Asp殘基取代為Glu時，相較於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶帶來pH安定性的改善。
[實施例6] 變異型腈水合酶之取得(8) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(8)，將實施例1的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號6之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(8)。轉形體(8)生產具表15記載之變異之腈水合酶(8)。 腈水合酶(8)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例7] 變異型腈水合酶之取得(9) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(9)，將實施例2的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號6之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(9)。轉形體(9)生產具表15記載之變異之腈水合酶(9)。 腈水合酶(9)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例8] 變異型腈水合酶之取得(10) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(10)，將實施例3的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號6之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(10)。轉形體(10)生產具表15記載之變異之腈水合酶(10)。 腈水合酶(10)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例9] 變異型腈水合酶之取得(11) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(11)，將實施例4的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號6之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(11)。轉形體(11)生產具表15記載之變異之腈水合酶(11)。 腈水合酶(11)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例10] 變異型腈水合酶之取得(12) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(12)，將實施例5的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號6之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(12)。轉形體(12)生產具表15記載之變異之腈水合酶(12)。 腈水合酶(12)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例11] 變異型腈水合酶之取得(13) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(13)，將實施例1的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號8之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(13)。轉形體(13)生產具表15記載之變異之腈水合酶(13)。 腈水合酶(13)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例12] 變異型腈水合酶之取得(14) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(14)，將實施例1的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號9之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(14)。轉形體(14)生產具表15記載之變異之腈水合酶(14)。 腈水合酶(14)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例13] 變異型腈水合酶之取得(15) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(15)，將實施例2的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號9之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(15)。轉形體(15)生產具表15記載之變異之腈水合酶(15)。 腈水合酶(15)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例14] 變異型腈水合酶之取得(16) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(16)，將實施例2的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號10之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(16)。轉形體(16)生產具表15記載之變異之腈水合酶(16)。 腈水合酶(16)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例15] 變異型腈水合酶之取得(17) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(17)，將實施例2的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號11之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(17)。轉形體(17)生產具表15記載之變異之腈水合酶(17)。 腈水合酶(17)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例16] 變異型腈水合酶之取得(18) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(18)，將比較例1的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號15之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(18)。轉形體(18)生產具表15記載之變異之腈水合酶(18)。 腈水合酶(18)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例17] 變異型腈水合酶之取得(19) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(19)，將實施例3的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號11之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(19)。轉形體(19)生產具表15記載之變異之腈水合酶(19)。 腈水合酶(19)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
[實施例18] 變異型腈水合酶之取得(20) 為了取得表現具有如表15所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(20)，將實施例4的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號11之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(20)。轉形體(20)生產具表15記載之變異之腈水合酶(20)。 腈水合酶(20)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表15。
【表15】 
由表15所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之各胺基酸殘基取代，即使互相組合仍能改善腈水合酶之pH安定性。又，屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代互相組合時，或與胺基酸殘基取代(f)組合時，其pH安定性有更為改善的傾向。
[實施例19] 變異型腈水合酶之取得(21) 為了取得表現具有如表16所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(21)，將實施例7的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號9之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(21)。轉形體(21)生產具表16記載之變異之腈水合酶(21)。 腈水合酶(21)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表16。
[實施例20] 變異型腈水合酶之取得(22) 為了取得表現具有如表16所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(22)，將實施例11的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號9之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(22)。轉形體(22)生產具表16記載之變異之腈水合酶(22)。 腈水合酶(22)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表16。
[實施例21] 變異型腈水合酶之取得(23) 為了取得表現具有如表16所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(23)，將實施例7的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號11之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(23)。轉形體(23)生產具表16記載之變異之腈水合酶(23)。 腈水合酶(23)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表16。
【表16】 
由表16所示之結果，可知：屬於胺基酸殘基取代群A之各胺基酸殘基取代即使2個以上組合，又即使進一步與胺基酸殘基取代(f)組合，腈水合酶之pH安定性亦會改善。又，安定化之程度有因為組合而更改善的傾向。
[實施例22] 變異型腈水合酶之取得(24) 為了取得表現具有如表17所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶之轉形體(24)，將實施例7的質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號15之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得轉形體(24)。轉形體(24)生產具表17記載之變異之腈水合酶(24)。 腈水合酶(24)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表17。
【表17】 
由表17所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之各胺基酸殘基取代，即使組合3個以上，腈水合酶之pH安定性仍會改善。又，其改善程度有更高的傾向。
[實施例23] 變異型腈水合酶之反應初速度 藉由測定「pH安定性之比較」記載之酸處理前之醯胺化合物生成之測定之反應初速度來調查野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶及具表18所示之胺基酸殘基取代之腈水合酶之反應初速度，結果示於表18。反應初速度之値，以相對於野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之反應初速度之値的相對値表達。
【表18】 
由表18所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代亦帶來腈水合酶的反應初速度的改善。
[比較例3] 腈水合酶變異體之取得(25) 使用含有於表19所示之胺基酸取代位置變異的腈水合酶變異體之質體(參照日本專利第5551081號轉形體編號92)，依與比較例2記載之轉形同樣的方法獲得轉形體(25)。轉形體(25)生產具表19記載之變異之腈水合酶(25)。 腈水合酶(25)之pH安定性以上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表19。
[實施例24] 腈水合酶變異體之取得(26) 為了取得表現具表19所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶的轉形體(2 6)，使用比較例3之質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號8之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，獲得轉形體(26)。轉形體(26)生產具表19記載之變異之腈水合酶(26)。 腈水合酶(26)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載的方法評價。獲得之結果示於表19。
【表19】 
由表19所示的結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代不僅使野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之pH安定性改善，也帶來由來自野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶而來之具改變胺基酸序列之腈水合酶的pH安定性的改善。
[實施例25] 腈水合酶變異體之反應初速度 藉由測定「pH安定性之比較」記載之酸處理前之醯胺化合物生成之測定之反應初速度來調查於如表20所示之胺基酸取代位置變異之腈水合酶變異體之反應初速度，結果示於表20。反應初速度之値，以相對於腈水合酶(25)之反應初速度之値的相對値表達。
【表20】 
由表20所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代，不僅使野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之反應初速度改善，也帶來由野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶而來的具改變胺基酸序列之腈水合酶之反應初速度之改善。
[比較例4] 腈水合酶變異體之取得(27) 使用含有使於表21所示之胺基酸取代位置變異之腈水合酶變異體之質體(參照日本專利第5551081號轉形體編號114)，依和比較例2記載之轉形同樣的方法獲得轉形體(27)。轉形體(27)生產具表21記載之變異之腈水合酶(27)。 腈水合酶(27)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表21。
[實施例26] 腈水合酶變異體之取得(28) 為了取得表現具表21所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶的轉形體(2 8)，使用比較例4之質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號8之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，獲得轉形體(28)。轉形體(28)生產具表21記載之變異之腈水合酶(28)。 腈水合酶(28)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載的方法評價。獲得之結果示於表21。
【表21】 
由表21所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代，不僅使野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之pH安定性改善，也帶來由野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶而來的具改變胺基酸序列之腈水合酶之pH安定性之改善。
[實施例27] 腈水合酶變異體之反應初速度 藉由測定「pH安定性之比較」記載之酸處理前之醯胺化合物生成之測定之反應初速度來調查於如表21所示之胺基酸取代位置變異之腈水合酶變異體之反應初速度，結果示於表22。反應初速度之値，以相對於腈水合酶(27)之反應初速度之値的相對値表達。
【表22】 
由表22所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代，不僅使野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之反應初速度提高，也帶來由野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶而來的具改變胺基酸序列之腈水合酶之反應初速度之提高。
[比較例5] 腈水合酶變異體之取得(29) 使用含有使於表23所示之胺基酸取代位置變異的腈水合酶變異體之質體(參照日本專利5551081號轉形體編號33)，依與比較例2記載之轉形同樣的方法獲得轉形體(29)。轉形體(29)生產具表23記載之變異之腈水合酶(29)。 腈水合酶(29)之pH安定性以上述「pH安定性之比較」記載之方法評價。獲得之結果示於表23。
[實施例28] 腈水合酶變異體之取得(30) 為了取得表現具表23所示之胺基酸殘基取代之變異型腈水合酶的轉形體(3 0)，使用比較例5之質體作為模板，並將序列編號5之引子替換為使用序列編號8之引子，除此以外與比較例2同樣進行，獲得質體，獲得轉形體(30)。轉形體(30)生產具表23記載之變異之腈水合酶(30)。 腈水合酶(30)之pH安定性依上述「pH安定性之比較」記載的方法評價。獲得之結果示於表23。
【表23】 
由表23所示的結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代不僅使野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之pH安定性改善，也帶來由來自野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶而來之具改變胺基酸序列之腈水合酶的pH安定性的改善。
[實施例29] 腈水合酶變異體之反應初速度 藉由測定「pH安定性之比較」記載之酸處理前之醯胺化合物生成之測定之反應初速度來調查於如表23所示之胺基酸取代位置變異之腈水合酶變異體之反應初速度，結果示於表24。反應初速度之値，以相對於腈水合酶(29)之反應初速度之値的相對値表達。
【表24】 
由表24所示之結果可知：屬於胺基酸殘基取代群A之胺基酸殘基取代，不僅使野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶之反應初速度提高，也帶來由野生型之來自嗜熱假諾卡氏菌之腈水合酶而來的具改變胺基酸序列之腈水合酶之反應初速度之提高。
2016年12月28日提申的日本專利出願2016-256050號的揭示，其全體以參照納入本說明書。 本說明書記載的全部文獻、專利申請案、及技術規格，各個文獻、專利出願、及技術規格以參照納入與具體且各別記載的情形同程度地納入本說明書中作為參照。
<110> 三井化學股份有限公司(Mitsui Chemicals,Inc.)
<120> 變異型腈水合酶、編碼該變異型腈水合酶之核酸、含有該核酸之表現載體及轉形體、該變異型腈水合酶之製造方法、及醯胺化合物之製造方法
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<223> 引子
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<223> 改變的腈水合酶α次單元
<400> 29
<210> 30
<211> 205
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶α次單元
<400> 30
<210> 31
<211> 205
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶α次單元
<400> 31
<210> 32
<211> 205
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶α次單元
<400> 32
<210> 33
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 33
<210> 34
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 34
<210> 35
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 35
<210> 36
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 36
<210> 37
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 37
<210> 38
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 38
<210> 39
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 39
<210> 40
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 40
<210> 41
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 41
<210> 42
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 42
<210> 43
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 43
<210> 44
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 44
<210> 45
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 45
<210> 46
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 46
<210> 47
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 47
<210> 48
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 48
<210> 49
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 49
<210> 50
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 50
<210> 51
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 51
<210> 52
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 52
<210> 53
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 53
<210> 54
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 54
<210> 55
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 55
<210> 56
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 56
<210> 57
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 57
<210> 58
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 58
<210> 59
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 59
<210> 60
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 60
<210> 61
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 61
<210> 62
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 62
<210> 63
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 63
<210> 64
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 64
<210> 65
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 65
<210> 66
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 66
<210> 67
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 67
<210> 68
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 68
<210> 69
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 69
<210> 70
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 70
<210> 71
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 71
<210> 72
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 72
<210> 73
<211> 233
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 改變的腈水合酶β次單元
<400> 73
<210> 74
<211> 33
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 作為PCR引子之寡核苷酸
<400> 74
<210> 75
<211> 144
<212> PRT
<213> 嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)
<400> 75
Claims (17)
- 一種變異型腈水合酶，係具有與序列編號1表示之胺基酸序列有90%以上之序列同一性之α次單元及與序列編號2表示之胺基酸序列有90%以上之序列同一性之β次單元之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudon ocardia thermophila)之腈水合酶，包括選自由下列胺基酸殘基取代(a)~(e)構成之群組中之至少1個胺基酸殘基取代：(a)α次單元中，序列編號1之N末端起40號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Asn、(b)α次單元中，序列編號1之N末端起43號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Val、(c)β次單元中，序列編號2之N末端起205號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Val、(d)β次單元中，序列編號2之N末端起206號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Gln、(e)β次單元中，序列編號2之N末端起215號之胺基酸殘基所對應的胺基酸殘基取代為Asn；施行了pH4.0、30℃、30小時之酸處理之變異型腈水合酶之反應初速度相對於未施行酸處理之變異型腈水合酶之反應初速度的比即酸處理後之反應初速度/酸處理前之反應初速度的值，相對於施行了酸處理之野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之反應初速度相對於未施行酸處理之野生型的來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶之反應初速度之比即酸處理後之反應初速度/酸處理前之反應初速度之值，為1.1倍以上。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，包括選自於由胺基酸殘基取代(a)~(e)構成之群組中之2個以上之胺基酸殘基取代。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，包括胺基酸殘基取代(b)、及選自於由胺基酸殘基取代(a)、(c)、(d)及(e)構成之群組中之至少一者。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，其中，α次單元之胺基酸序列中，序列編號1之N末端起36號之胺基酸所對應的胺基酸為Trp。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，其中，α次單元之胺基酸序列中，序列編號1之N末端起36號之胺基酸所對應的胺基酸為Met、Ser、Gly或Ala。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，其中，序列編號1之α次單元之胺基酸序列符合以下之(1)~(13)中之一者以上：(1)N末端起6號之胺基酸殘基為Thr或Ala、(2)N末端起13號之胺基酸殘基為Leu、(3)N末端起19號之胺基酸殘基為Val、(4)N末端起27號之胺基酸殘基為Ile、(5)N末端起48號之胺基酸殘基為Gln、(6)N末端起71號之胺基酸殘基為His、(7)N末端起92號之胺基酸殘基為Glu、(8)N末端起94號之胺基酸殘基為Ile、(9)N末端起126號之胺基酸殘基為Tyr、(10)N末端起148號之胺基酸殘基為Asp、 (11)N末端起188號之胺基酸殘基為Gly、(12)N末端起197號之胺基酸殘基為Cys、(13)N末端起204號之胺基酸殘基為Arg。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，其中，序列編號2之β次單元之胺基酸序列符合以下之(15)~(47)中之至少一者：(15)N末端起4號之胺基酸殘基為Met、(16)N末端起8號之胺基酸殘基為Ala、(17)N末端起10號之胺基酸殘基為Asp、(18)N末端起24號之胺基酸殘基為Ile、(19)N末端起33號之胺基酸殘基為Val或Met、(20)N末端起37號之胺基酸殘基為Val或Leu、(21)N末端起40號之胺基酸殘基為Ile、Val或Leu、(22)N末端起41號之胺基酸殘基為Ile、(23)N末端起46號之胺基酸殘基為Lys、(24)N末端起48號之胺基酸殘基為Val、(25)N末端起51號之胺基酸殘基為Val、(26)N末端起61號之胺基酸殘基為Val、Gly、Trp、Ser、Leu或Thr、(27)N末端起79號之胺基酸殘基為Asn、(28)N末端起96號之胺基酸殘基為Arg、(29)N末端起107號之胺基酸殘基為Met、(30)N末端起108號之胺基酸殘基為Asp或Arg、(31)N末端起110號之胺基酸殘基為Asn、(32)N末端起112號之胺基酸殘基為Val或Ile、 (33)N末端起118號之胺基酸殘基為Val、(34)N末端起127號之胺基酸殘基為Ser、(35)N末端起146號之胺基酸殘基為Gly、(36)N末端起150號之胺基酸殘基為Asn或Ser、(37)N末端起160號之胺基酸殘基為Cys、Trp或Met、(38)N末端起168號之胺基酸殘基為Glu、(39)N末端起176號之胺基酸殘基為Ala、Thr、Met或Cys、(40)N末端起186號之胺基酸殘基為Arg、(41)N末端起200號之胺基酸殘基為Glu、(42)N末端起212號之胺基酸殘基為Tyr、(43)N末端起217號之胺基酸殘基為Val、His、Met、Gly、Ser、Leu或Cys、(44)N末端起218號之胺基酸殘基為Met或Ser、(45)N末端起226號之胺基酸殘基為Ile、(46)N末端起230號之胺基酸殘基為Glu、(47)N末端起231號之胺基酸殘基為Val。
- 如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶，其中，下列[1]~[48]中之任一者之來自嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)之腈水合酶中，包括選自於由前述(a)~(e)構成之群組中之至少1個胺基酸殘基取代：[1]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號2之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[2]包括具序列編號16之胺基酸序列之α次單元與具序列編號33之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [3]包括具序列編號17之胺基酸序列之α次單元與具序列編號33之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[4]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號34之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[5]包括具序列編號19之胺基酸序列之α次單元與具序列編號34之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[6]包括具序列編號20之胺基酸序列之α次單元與具序列編號35之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[7]包括具序列編號20之胺基酸序列之α次單元與具序列編號36之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[8]包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號37之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[9]包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號38之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[10]包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號39之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[11]包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號40之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[12]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號41之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[13]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號42之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[14]包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號43之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [15]包括具序列編號22之胺基酸序列之α次單元與具序列編號44之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[16]包括具序列編號23之胺基酸序列之α次單元與具序列編號45之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[17]包括具序列編號24之胺基酸序列之α次單元與具序列編號46之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[18]包括具序列編號25之胺基酸序列之α次單元與具序列編號47之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[19]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號48之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[20]包括具序列編號23之胺基酸序列之α次單元與具序列編號49之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[21]包括具序列編號16之胺基酸序列之α次單元與具序列編號50之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[22]包括具序列編號26之胺基酸序列之α次單元與具序列編號51之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[23]包括具序列編號27之胺基酸序列之α次單元與具序列編號52之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[24]包括具序列編號28之胺基酸序列之α次單元與具序列編號53之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[25]包括具序列編號17之胺基酸序列之α次單元與具序列編號54之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[26]包括具序列編號29之胺基酸序列之α次單元與具序列編號55之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [27]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號56之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[28]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號57之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[29]包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號58之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[30]包括具序列編號29之胺基酸序列之α次單元與具序列編號59之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[31]包括具序列編號31之胺基酸序列之α次單元與具序列編號60之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[32]包括具序列編號18之胺基酸序列之α次單元與具序列編號61之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[33]包括具序列編號32之胺基酸序列之α次單元與具序列編號62之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[34]包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號63之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[35]包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號64之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[36]包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號65之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[37]包括具序列編號25之胺基酸序列之α次單元與具序列編號54之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[38]包括具序列編號30之胺基酸序列之α次單元與具序列編號66之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、 [39]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號67之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[40]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號68之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[41]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號69之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[42]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號70之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[43]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號71之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[44]包括具序列編號21之胺基酸序列之α次單元與具序列編號72之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[45]包括具序列編號1之胺基酸序列之α次單元與具序列編號73之胺基酸序列之β次單元之腈水合酶、[46]上述[1]~[45]之腈水合酶中之任一者的α次單元的N末端起36號之胺基酸殘基為Trp殘基的腈水合酶、[47]具有上述[1]~[46]中之任一者的腈水合酶(A)的α次單元或由與該α次單元有90%以上之序列同一性之胺基酸序列構成的α次單元變體、及前述腈水合酶(A)之β次單元或由與該β次單元有90%以上之序列同一性之胺基酸序列構成的β次單元變體，且α次單元及β次單元中之至少一者為α次單元變體或β次單元變體的腈水合酶、[48]上述[1]~[46]中之任一者的腈水合酶(B)中的α次單元中的加成、取代、缺失、及/或插入之胺基酸殘基，且係排除前述(a)及(b)的被取代的胺基酸殘基之胺基酸殘基的總數為1~10，且前述腈水合酶(B)中的β次單元中的加成、取代、缺失、及 /或插入的胺基酸殘基，且係排除前述(c)~(e)的被取代的胺基酸殘基之胺基酸殘基的總數為1~10的腈水合酶。
- 一種核酸，編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項之變異型腈水合酶。
- 一種載體，含有如申請專利範圍第9項之核酸。
- 如申請專利範圍第10項之載體，係表現載體。
- 一種轉形體，含有如申請專利範圍第11項之表現載體。
- 一種變異型腈水合酶之製造方法，包括下列步驟：在培養基中培養如申請專利範圍第12項之轉形體；及從培養的轉形體及培養基中之至少一者回收變異型腈水合酶。
- 一種變異型腈水合酶，係利用如申請專利範圍第13項之變異型腈水合酶之製造方法獲得。
- 一種醯胺化合物之製造方法，包括使如申請專利範圍第1項之變異型腈水合酶接觸腈化合物之步驟。
- 如申請專利範圍第15項之醯胺化合物之製造方法，更包括於pH3.5~pH6.5從含有醯胺化合物之溶液去除雜質之步驟。
- 如申請專利範圍第15或16項之醯胺化合物之製造方法，更包括利用活性碳來精製醯胺化合物之步驟。
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