JP2000228990A - 複製可能なｄｎａ、形質転換された微生物、プラスミドベクター及びｄ−パントテン酸の製造方法 - Google Patents
複製可能なｄｎａ、形質転換された微生物、プラスミドベクター及びｄ−パントテン酸の製造方法Info
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- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 発酵によるパントテン酸の改善された製造方
法の提供 【解決手段】 アスパルテート−１−デカルボキシラー
ゼをコードするヌクレオチド配列を含む、コリネバクテ
リウム属及びエシェリキア属の微生物中で複製可能な、
場合により組み換えられたＤＮＡ
法の提供 【解決手段】 アスパルテート−１−デカルボキシラー
ゼをコードするヌクレオチド配列を含む、コリネバクテ
リウム属及びエシェリキア属の微生物中で複製可能な、
場合により組み換えられたＤＮＡ
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】パントテン酸は化粧品、医薬
品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要
なビタミンである。
品、栄養食品及び動物飼料中に使用される商業的に重要
なビタミンである。
【０００２】
【従来の技術】パントテン酸は化学合成又は適当な培養
液中での適当な微生物の発酵により生物工学的に製造す
ることができる。化学合成の場合にはＤＬ−パントラク
トンが重要な中間体である。これはホルムアルデヒド、
イソブチルアルデヒド及びシアニドから多工程法で製造
される。他の方法工程においてラセミ混合物を分離し、
Ｄ−パントラクトンをβ−アラニンで縮合し、Ｄ−パン
トテン酸が得られる。
液中での適当な微生物の発酵により生物工学的に製造す
ることができる。化学合成の場合にはＤＬ−パントラク
トンが重要な中間体である。これはホルムアルデヒド、
イソブチルアルデヒド及びシアニドから多工程法で製造
される。他の方法工程においてラセミ混合物を分離し、
Ｄ−パントラクトンをβ−アラニンで縮合し、Ｄ−パン
トテン酸が得られる。
【０００３】微生物による発酵製造の利点は、Ｌ−パン
トテン酸不含のパントテン酸の所望のＤ−形の直接形成
にある。
トテン酸不含のパントテン酸の所望のＤ−形の直接形成
にある。
【０００４】バクテリア、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｒ
ｙｔｈｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ及び酵母、例えばＤｅｂａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉの多様な種類は、
欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書に示された
ように、グルコース、ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラ
ニンを含有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生する
ことができる。欧州特許出願公開第０４９３０６０号明
細書は、さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉか
らの、プラスミドｐＦＶ３及びｐＦＶ５上に含まれるパ
ントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、グルコース、
ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラニンを含有する培養液
中で、Ｄ−パントテン酸の生成が改善されることが示さ
れている。
ａ ｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆ
ａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｒ
ｙｔｈｒｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ及び酵母、例えばＤｅｂａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｓｔｅｌｌｉｉの多様な種類は、
欧州特許出願公開第０４９３０６０号明細書に示された
ように、グルコース、ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラ
ニンを含有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生する
ことができる。欧州特許出願公開第０４９３０６０号明
細書は、さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉか
らの、プラスミドｐＦＶ３及びｐＦＶ５上に含まれるパ
ントテン酸−生合成遺伝子の増幅により、グルコース、
ＤＬ−パントイン酸及びβ−アラニンを含有する培養液
中で、Ｄ−パントテン酸の生成が改善されることが示さ
れている。
【０００５】欧州特許出願公開第０５９０８５７号明細
書及び米国特許５５１８９０６号明細書は、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＩＦＯ３５４７から誘導され
た突然変異種、例えばＦＶ５７１４、ＦＶ５２５、ＦＶ
８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２１、ＦＶ６０５１及びＦ
Ｖ５０６９を記載しており、これらは多様な代謝拮抗
物、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−ヒドロキシ
アスパラギン酸、Ｏ−メチルトレオニン及びα−ケトイ
ソ吉草酸に対して耐性を有し、グルコース含有培養液中
でパントイン酸を及びグルコース及びβ−アラニンを含
有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生する。欧州特
許出願公開０５９０８５７号明細書及び米国特許５５１
８９０６号明細書中では、さらに、プラスミドｐＦＶ３
１上に含まれるパントテン酸−生合成遺伝子の増幅によ
り、上記の株中で、グルコース含有培養液中でＤ−パン
トイン酸の産生が、及びグルコース及びβ−アラニンを
含有する培養液中でＤ−パントテン酸の産生が改善され
ることが示されている。
書及び米国特許５５１８９０６号明細書は、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＩＦＯ３５４７から誘導され
た突然変異種、例えばＦＶ５７１４、ＦＶ５２５、ＦＶ
８１４、ＦＶ５２１、ＦＶ２２１、ＦＶ６０５１及びＦ
Ｖ５０６９を記載しており、これらは多様な代謝拮抗
物、例えばサリチル酸、α−ケト酪酸、β−ヒドロキシ
アスパラギン酸、Ｏ−メチルトレオニン及びα−ケトイ
ソ吉草酸に対して耐性を有し、グルコース含有培養液中
でパントイン酸を及びグルコース及びβ−アラニンを含
有する培養液中でＤ−パントテン酸を産生する。欧州特
許出願公開０５９０８５７号明細書及び米国特許５５１
８９０６号明細書中では、さらに、プラスミドｐＦＶ３
１上に含まれるパントテン酸−生合成遺伝子の増幅によ
り、上記の株中で、グルコース含有培養液中でＤ−パン
トイン酸の産生が、及びグルコース及びβ−アラニンを
含有する培養液中でＤ−パントテン酸の産生が改善され
ることが示されている。
【０００６】ＷＯ９７／１０３４０中では、さらにパン
トテン酸を形成するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
の株中で、酵素のアセトヒドロキシ酸−シンターゼＩＩ
の活性の向上により、バリン−生合成の酵素、パントテ
ン酸−産生をさらに高めることができる。
トテン酸を形成するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
の株中で、酵素のアセトヒドロキシ酸−シンターゼＩＩ
の活性の向上により、バリン−生合成の酵素、パントテ
ン酸−産生をさらに高めることができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、発酵
によるパントテン酸の改善された製造方法に対する新規
の基本を提供することであった。
によるパントテン酸の改善された製造方法に対する新規
の基本を提供することであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】ビタミンのパントテン酸
は、化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用さ
れる商業的に重要な生成物である。従って、パントテン
酸の改善された製造方法を提供するという一般的興味が
生じる。
は、化粧品、医薬品、栄養食品及び動物飼料中に使用さ
れる商業的に重要な生成物である。従って、パントテン
酸の改善された製造方法を提供するという一般的興味が
生じる。
【０００９】以後、Ｄ−パントテン酸又はパントテン酸
又はパントテネートに言及する場合、遊離酸だけでなく
Ｄ−パントテン酸の塩、例えばカルシウム塩、ナトリウ
ム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を意味するものと
する。
又はパントテネートに言及する場合、遊離酸だけでなく
Ｄ−パントテン酸の塩、例えばカルシウム塩、ナトリウ
ム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を意味するものと
する。
【００１０】本発明の対象は、特に既にＤ−パントテン
酸を産生する微生物の使用下で、微生物中でＬ−アスパ
ルテート−１−デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ． ４．
１．１．１１）をコードするｐａｎＤ−遺伝子を単独又
は遺伝子ｐａｎＢ及び／又はｐａｎＣと組み合わせて強
化する（特に過剰発現させる）Ｄ−パントテン酸の発酵
による製造方法である。本発明はさらに特許請求の範囲
に記載されているような相応する組換えＤＮＡ−配列に
関する。本発明の対象は、請求項８から１７に従って製
造され、改善された、Ｄ−パントテン酸産生微生物の使
用下で実施される、Ｄ−パントテン酸の発酵により製造
方法にも関する。
酸を産生する微生物の使用下で、微生物中でＬ−アスパ
ルテート−１−デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ． ４．
１．１．１１）をコードするｐａｎＤ−遺伝子を単独又
は遺伝子ｐａｎＢ及び／又はｐａｎＣと組み合わせて強
化する（特に過剰発現させる）Ｄ−パントテン酸の発酵
による製造方法である。本発明はさらに特許請求の範囲
に記載されているような相応する組換えＤＮＡ−配列に
関する。本発明の対象は、請求項８から１７に従って製
造され、改善された、Ｄ−パントテン酸産生微生物の使
用下で実施される、Ｄ−パントテン酸の発酵により製造
方法にも関する。
【００１１】「強化」の概念は、本願明細書において、
遺伝子のコピー数を高めるか、強いプロモータを使用す
るか又は高い活性を有する相当する酵素をコードする遺
伝子を使用することにより、及び場合によりこれらの手
法を組み合わせることにより、微生物中で相当するＤＮ
Ａによりコードされる１種以上の酵素の細胞内活性を高
めることを意味する。
遺伝子のコピー数を高めるか、強いプロモータを使用す
るか又は高い活性を有する相当する酵素をコードする遺
伝子を使用することにより、及び場合によりこれらの手
法を組み合わせることにより、微生物中で相当するＤＮ
Ａによりコードされる１種以上の酵素の細胞内活性を高
めることを意味する。
【００１２】本発明の対象である微生物は、グルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
とエタノールとからパントテン酸を製造できる。菌類又
は酵母又はグラム陽性バクテリア、例えばＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属又はグラム陰性バクテリア、例え
ば腸内細菌科が挙げられる。腸内細菌科において、特に
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの種類のＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ属が挙げられる。この種のＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉの中で、いわゆるＫ−１２株、例えば
ＭＧ１６５５又はＷ３１１０（Neidhard et al.: Esche
richia coli and Salmonella. Cellularand Molecular
Biology (ASM Press, Washington D.C.)）又はＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ野生型ＩＦＯ３５４７（Inst
itut fuer Fermentation, Osaka, Japan）及びこれらか
ら誘導された突然変異種が挙げられる。コリネバクテリ
ウム属の場合に特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの種類が挙げられ、これはこの専
門分野においてそのアミノ酸を産生する能力が公知であ
る。この種に属する野生型株、例えばＢ． Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ
ｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５
及びこれらの突然変異種が挙げられる。
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセリン
とエタノールとからパントテン酸を製造できる。菌類又
は酵母又はグラム陽性バクテリア、例えばＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属又はグラム陰性バクテリア、例え
ば腸内細菌科が挙げられる。腸内細菌科において、特に
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉの種類のＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ属が挙げられる。この種のＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉの中で、いわゆるＫ−１２株、例えば
ＭＧ１６５５又はＷ３１１０（Neidhard et al.: Esche
richia coli and Salmonella. Cellularand Molecular
Biology (ASM Press, Washington D.C.)）又はＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ野生型ＩＦＯ３５４７（Inst
itut fuer Fermentation, Osaka, Japan）及びこれらか
ら誘導された突然変異種が挙げられる。コリネバクテリ
ウム属の場合に特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの種類が挙げられ、これはこの専
門分野においてそのアミノ酸を産生する能力が公知であ
る。この種に属する野生型株、例えばＢ． Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣ
Ｃ１３０３２、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａ
ｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５
及びこれらの突然変異種が挙げられる。
【００１３】発明者は、微生物をＬ−アスパルテート−
１−デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１１）
をコードする新規のｐａｎＤ−遺伝子、特にコリネバク
テリウム グルタミクムからのｐａｎＤ−遺伝子の過剰
発現によりパントテン酸を改善して産生することを見出
した。
１−デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１１）
をコードする新規のｐａｎＤ−遺伝子、特にコリネバク
テリウム グルタミクムからのｐａｎＤ−遺伝子の過剰
発現によりパントテン酸を改善して産生することを見出
した。
【００１４】さらに、ｐａｎＤ−遺伝子の過剰発現は、
付加的にケトパントエートヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ及びパントテネートシンテターゼをコードする
遺伝子のｐａｎＢ及びｐａｎＣを個々に又は一緒に過剰
発現させて存在する株中で有利に作用することが見出さ
れた。
付加的にケトパントエートヒドロキシメチルトランスフ
ェラーゼ及びパントテネートシンテターゼをコードする
遺伝子のｐａｎＢ及びｐａｎＣを個々に又は一緒に過剰
発現させて存在する株中で有利に作用することが見出さ
れた。
【００１５】過剰発現の達成のために、例えば相応する
遺伝子のコピー数を高めるか、又は構造遺伝子の上流に
存在するプロモーター部位及びレギュレーション部位を
突然変異させることができる。同様に、構造遺伝子の上
流に組み込まれた発現カセットが作用する。誘導可能な
プロモーターにより、付加的に発酵によるＤ−パントテ
ネート形成の過程において発現を向上させることができ
る。ｍ−ＲＮＡの寿命を延長させる手段によっても同様
に発現を改善できる。さらに酵素タンパク質の分解を阻
害することによっても同様に酵素活性が強化される。遺
伝子又は遺伝子構造体は異なるコピー数を有するプラス
ミド中に存在するか又は染色体中に組み込まれ、増幅さ
れ得る。また、さらに該当する遺伝子の過剰発現は、培
地組成の変更及び培養操作の変更により達成することが
できる。
遺伝子のコピー数を高めるか、又は構造遺伝子の上流に
存在するプロモーター部位及びレギュレーション部位を
突然変異させることができる。同様に、構造遺伝子の上
流に組み込まれた発現カセットが作用する。誘導可能な
プロモーターにより、付加的に発酵によるＤ−パントテ
ネート形成の過程において発現を向上させることができ
る。ｍ−ＲＮＡの寿命を延長させる手段によっても同様
に発現を改善できる。さらに酵素タンパク質の分解を阻
害することによっても同様に酵素活性が強化される。遺
伝子又は遺伝子構造体は異なるコピー数を有するプラス
ミド中に存在するか又は染色体中に組み込まれ、増幅さ
れ得る。また、さらに該当する遺伝子の過剰発現は、培
地組成の変更及び培養操作の変更により達成することが
できる。
【００１６】これについての手引きは、当業者には特に
Martin et al. (Bio/Technology 5,137-146 (1987)), G
uerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya
andMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Ei
kmanns et al. (Gene 102,93-98 (1991)), 欧州特許第
０４７２８６９明細書, 米国特許第４６０１８９３号明
細書, Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-
87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Envirome
ntal Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et
al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (199
3)), 特許出願ＷＯ ９６／１５２４６, Jensen and Ha
mmer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195
(1998))又はハンドブック”Manual of Methods for Ge
neral Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)”
に見ることができる。
Martin et al. (Bio/Technology 5,137-146 (1987)), G
uerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya
andMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Ei
kmanns et al. (Gene 102,93-98 (1991)), 欧州特許第
０４７２８６９明細書, 米国特許第４６０１８９３号明
細書, Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-
87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Envirome
ntal Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et
al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (199
3)), 特許出願ＷＯ ９６／１５２４６, Jensen and Ha
mmer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195
(1998))又はハンドブック”Manual of Methods for Ge
neral Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)”
に見ることができる。
【００１７】さらに、、当業者には特にChang and Cohe
n (Journal of Bacteriology 134:1141-1156 (1978)),
Hartley and Gregori (Gene 13:347-353 (1981)), Aman
n and Brosius (Gene 40:183-190 (1985)), Broer et a
l. (Proceedings of the National of Sciences of the
United States of America 80:21-25 (1983)), LaVall
ie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), PCT
/US97/13359, Llosa et al. (Plasmid 26:222-224 (199
1)), Quandt and Klipp (Gene 80:161-169 (1989)), Ha
milton (Journal of Bacteriology 171:4617-4622 (198
9), Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538
(1996)) 及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見る
ことができる。
n (Journal of Bacteriology 134:1141-1156 (1978)),
Hartley and Gregori (Gene 13:347-353 (1981)), Aman
n and Brosius (Gene 40:183-190 (1985)), Broer et a
l. (Proceedings of the National of Sciences of the
United States of America 80:21-25 (1983)), LaVall
ie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), PCT
/US97/13359, Llosa et al. (Plasmid 26:222-224 (199
1)), Quandt and Klipp (Gene 80:161-169 (1989)), Ha
milton (Journal of Bacteriology 171:4617-4622 (198
9), Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538
(1996)) 及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書に見る
ことができる。
【００１８】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺
伝子又は他の遺伝子例えば遺伝子ｐａｎＢ及びｐａｎＣ
の単離のために、まずＥ．ｃｏｌｉ中の微生物の遺伝子
ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーの作成は
一般に公知の教書及びハンドブックにおいて記載されて
いる。例として、Winnackerの教書：Gene und Klone,Ei
ne Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemi
e, Weinheim, Deutschland, 1990)又はSambrook et al.
の教書：Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙げられ
る。公知の遺伝子ライブラリーは、Kohara et al. (Cel
l 50, 495-508 (1987))によるλ−ベクター中に作成さ
れたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０の遺伝子ライ
ブラリーである。Bathe et al. (Molecular and Genera
l Genetics, 252:255-265, 1996)はＣ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリを記載
しており、この遺伝子ライブラリーはコスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ(Wahl et al., 1987, Proceeding
s of the National Academy of Sciences USA, 84:2160
-2164)を用いてＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株ＮＭ５５４（Ra
leigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563
-1575）中で作成された。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍの遺伝子ライブラリーの製造は、ｐＢＲ
３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (197
9)）又はｐＵＣ９（Vieria et al., 1982, Gene, 19:25
9-268）のようなプラスミドも使用することができる。
宿主として特に制限欠失（restriktionsdefekt）及び組
換え欠失（rekombinationsdefekt）であるようなＥ．ｃ
ｏｌｉ株が適している。これについての例は、Grant et
al. (Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA, 87 (1990) 4645-4649)に記載されてた株ＤＨ５
αｍｃｒである。
伝子又は他の遺伝子例えば遺伝子ｐａｎＢ及びｐａｎＣ
の単離のために、まずＥ．ｃｏｌｉ中の微生物の遺伝子
ライブラリーを作成する。遺伝子ライブラリーの作成は
一般に公知の教書及びハンドブックにおいて記載されて
いる。例として、Winnackerの教書：Gene und Klone,Ei
ne Einfuehrung in die Gentechnologie (Verlag Chemi
e, Weinheim, Deutschland, 1990)又はSambrook et al.
の教書：Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙げられ
る。公知の遺伝子ライブラリーは、Kohara et al. (Cel
l 50, 495-508 (1987))によるλ−ベクター中に作成さ
れたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０の遺伝子ライ
ブラリーである。Bathe et al. (Molecular and Genera
l Genetics, 252:255-265, 1996)はＣ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリを記載
しており、この遺伝子ライブラリーはコスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ(Wahl et al., 1987, Proceeding
s of the National Academy of Sciences USA, 84:2160
-2164)を用いてＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株ＮＭ５５４（Ra
leigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563
-1575）中で作成された。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍの遺伝子ライブラリーの製造は、ｐＢＲ
３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (197
9)）又はｐＵＣ９（Vieria et al., 1982, Gene, 19:25
9-268）のようなプラスミドも使用することができる。
宿主として特に制限欠失（restriktionsdefekt）及び組
換え欠失（rekombinationsdefekt）であるようなＥ．ｃ
ｏｌｉ株が適している。これについての例は、Grant et
al. (Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA, 87 (1990) 4645-4649)に記載されてた株ＤＨ５
αｍｃｒである。
【００１９】この遺伝子ライブラリーは引き続き指示株
中へ形質転換（Hanahan, Journal of Molecular Biolog
y 166, 577-580, 1983）又はエレクトロポレーション
（Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letter
s, 123:343-347）によって導入することができる。この
指示株は、検出可能な表現型、例えば栄養要求性を生じ
させる重要な遺伝子中に突然変異を有することにおいて
優れている。本発明の範囲内で、ｐａｎＤ遺伝子中に突
然変異を有するＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ＤＶ９（Vallar
i and Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164:136-
142）が特に重要である。パントテン酸必要性Ｅ．ｃｏ
ｌｉ突然変異体の他の例はＳＪ２株であり、これはｐａ
ｎＢ−遺伝子中に突然変異を有し、Ｙａｌｅ大学のGene
tic StockCenter（New Haven, Cnnecticut, USA）から
購入することができる。指示株、例えばｐａｎＤ−突然
変異体ＤＶ９を、重要な遺伝子、例えばｐａｎＤ−遺伝
子を有する組換えプラスミドで形質転換し、該当する遺
伝子を発現させた後で、この指示株は相応する特性、例
えばパントテン酸−要求性に関して原栄養体となる。こ
のように単離された遺伝子もしくはＤＮＡ−フラグメン
トは、例えばSanger et al. (Proceedings of the Nati
onal of Sciences of the United States of America U
SA, 74:5463-5467, 1977)に記載されたように配列決定
により特性決定された。引き続き、例えばGenBank (Ben
son et al., 1998, Nucleic Acids Research, 26:1-7)
のデータバンク中に含まれている公知の遺伝子に対する
同一性の度合いを、公開された方法（Altschul et al.,
1990, Journal of Molecular Biology 215:403-410）
で分析することができる。
中へ形質転換（Hanahan, Journal of Molecular Biolog
y 166, 577-580, 1983）又はエレクトロポレーション
（Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letter
s, 123:343-347）によって導入することができる。この
指示株は、検出可能な表現型、例えば栄養要求性を生じ
させる重要な遺伝子中に突然変異を有することにおいて
優れている。本発明の範囲内で、ｐａｎＤ遺伝子中に突
然変異を有するＥ．ｃｏｌｉ突然変異体ＤＶ９（Vallar
i and Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164:136-
142）が特に重要である。パントテン酸必要性Ｅ．ｃｏ
ｌｉ突然変異体の他の例はＳＪ２株であり、これはｐａ
ｎＢ−遺伝子中に突然変異を有し、Ｙａｌｅ大学のGene
tic StockCenter（New Haven, Cnnecticut, USA）から
購入することができる。指示株、例えばｐａｎＤ−突然
変異体ＤＶ９を、重要な遺伝子、例えばｐａｎＤ−遺伝
子を有する組換えプラスミドで形質転換し、該当する遺
伝子を発現させた後で、この指示株は相応する特性、例
えばパントテン酸−要求性に関して原栄養体となる。こ
のように単離された遺伝子もしくはＤＮＡ−フラグメン
トは、例えばSanger et al. (Proceedings of the Nati
onal of Sciences of the United States of America U
SA, 74:5463-5467, 1977)に記載されたように配列決定
により特性決定された。引き続き、例えばGenBank (Ben
son et al., 1998, Nucleic Acids Research, 26:1-7)
のデータバンク中に含まれている公知の遺伝子に対する
同一性の度合いを、公開された方法（Altschul et al.,
1990, Journal of Molecular Biology 215:403-410）
で分析することができる。
【００２０】このようにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺
伝子ｐａｎＤをコードする新規のＤＮＡ−配列が得ら
れ、この配列は配列番号１として本発明の構成要素であ
る。さらに、本発明のＤＮＡ−配列から上記記載の方法
を用いて相応する酵素のアミノ酸配列が誘導された。配
列番号２中ではｐａｎＤ−遺伝子産物の得られたアミノ
酸配列、つまりＬ−アスパルテート−１−デカルボキシ
ラーゼが示されている。さらにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍの遺伝子ｐａｎＢ及びｐａｎＣをコードする新規のＤ
ＮＡ−配列が得られ、この配列は配列番号３として本発
明の構成要素である。配列番号４中にはｐａｎＢ−遺伝
子産物の得られたアミノ酸配列、つまりケトパントエー
トヒドロキシメチルトランスフェラーゼが示されてお
り、配列番号５中にはｐａｎＣ−遺伝子産物の得られた
アミノ酸配列、つまりパントテネートシンテターゼが示
されている。
伝子ｐａｎＤをコードする新規のＤＮＡ−配列が得ら
れ、この配列は配列番号１として本発明の構成要素であ
る。さらに、本発明のＤＮＡ−配列から上記記載の方法
を用いて相応する酵素のアミノ酸配列が誘導された。配
列番号２中ではｐａｎＤ−遺伝子産物の得られたアミノ
酸配列、つまりＬ−アスパルテート−１−デカルボキシ
ラーゼが示されている。さらにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍの遺伝子ｐａｎＢ及びｐａｎＣをコードする新規のＤ
ＮＡ−配列が得られ、この配列は配列番号３として本発
明の構成要素である。配列番号４中にはｐａｎＢ−遺伝
子産物の得られたアミノ酸配列、つまりケトパントエー
トヒドロキシメチルトランスフェラーゼが示されてお
り、配列番号５中にはｐａｎＣ−遺伝子産物の得られた
アミノ酸配列、つまりパントテネートシンテターゼが示
されている。
【００２１】配列番号１及び／又は配列番号３から遺伝
子コードの同義性（Degeneriertheit）により生じたコ
ードするＤＮＡ−配列も同様に本発明の構成要素であ
る。同様に、配列番号１及び／又は配列番号３とハイブ
リダイズするＤＮＡ−配列も本発明の構成要素である。
この専門分野において、さらにタンパク質中での同類ア
ミノ酸置換（konservative Aminosaeureaustausch）、
例えばグリシンのアラニンによる置換又はアスパラギン
酸のグルタミン酸による置換は「センス突然変異」（se
nse mutations; Sinnmutationen）として公知であり、
このセンス突然変異はタンパク質の活性の根本的な変更
を引き起こさない、つまり機能的に中立である。さら
に、タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端での変更はそ
の機能に本質的に影響を及ぼさないか、それどころか安
定化することもできることは公知である。これについて
の情報は、当業者は特にBen-Bassat et al. (Journal o
f Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan et al.
(Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al. (Prot
ein Sciences 3:240-247 (1994)), Hochuli et al. (Bi
o/Technology 6:1321-1325 (1988))及び遺伝学及び分子
生物学の公知の教書に見ることができる。相応して配列
番号２、配列番号４及び／又は配列番号５から得られた
アミノ酸配列も同様に本発明の構成要素である。
子コードの同義性（Degeneriertheit）により生じたコ
ードするＤＮＡ−配列も同様に本発明の構成要素であ
る。同様に、配列番号１及び／又は配列番号３とハイブ
リダイズするＤＮＡ−配列も本発明の構成要素である。
この専門分野において、さらにタンパク質中での同類ア
ミノ酸置換（konservative Aminosaeureaustausch）、
例えばグリシンのアラニンによる置換又はアスパラギン
酸のグルタミン酸による置換は「センス突然変異」（se
nse mutations; Sinnmutationen）として公知であり、
このセンス突然変異はタンパク質の活性の根本的な変更
を引き起こさない、つまり機能的に中立である。さら
に、タンパク質のＮ−及び／又はＣ−末端での変更はそ
の機能に本質的に影響を及ぼさないか、それどころか安
定化することもできることは公知である。これについて
の情報は、当業者は特にBen-Bassat et al. (Journal o
f Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan et al.
(Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al. (Prot
ein Sciences 3:240-247 (1994)), Hochuli et al. (Bi
o/Technology 6:1321-1325 (1988))及び遺伝学及び分子
生物学の公知の教書に見ることができる。相応して配列
番号２、配列番号４及び／又は配列番号５から得られた
アミノ酸配列も同様に本発明の構成要素である。
【００２２】このように特性決定された遺伝子は、引き
続き個々に又は場合により他のものと組み合わせて適当
な微生物中で発現させることができる。遺伝子を発現さ
せるもしくは過剰発現させる公知の方法は、さらに発現
シグナルを設置することができるプラスミドベクターを
用いて増幅することである。プラスミドベクターとし
て、相応する微生物中で増幅可能なものが挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ用に例えばベクターｐ
ＳＣ１０１（Vocke and Bastia, Proceedingsof the Na
tional Academy of Sciences USA 80 (21), 6557-6561
(1983)）又はｐＫＫ２２３−３（Brosius and Holy, Pr
oceedings of the National Academyof Sciences USA 8
1, 6929 (1984)）又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用に例えばベクターｐＥＫＥx
１（Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)）又はｐ
Ｚ８−１（欧州特許第０３７５８８９号明細書）が本発
明のために挙げられる。この種の微生物の例は、Ｃ．ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ
２及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２及びＥ．
ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５／ｐＮＤ−Ｄ２であり、これら
はプラスミドｐＮＤ−Ｄ２及びｐＮＤ−ＤＢＣ２を含有
する。プラスミドｐＮＤ−Ｄ２はプラスミドｐＺ８−１
ベースのＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャ
トルベクターであり、このシャトルベクターはＣ．ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺伝子を有する。プラス
ミドｐＮＤ−ＤＢＣ２はプラスミドｐＺ８−１ベースの
Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベク
ターであり、このシャトルベクターはＣ．ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍの遺伝子ｐａｎＤ、ｐａｎＢ及びｐａｎＣを有
する。
続き個々に又は場合により他のものと組み合わせて適当
な微生物中で発現させることができる。遺伝子を発現さ
せるもしくは過剰発現させる公知の方法は、さらに発現
シグナルを設置することができるプラスミドベクターを
用いて増幅することである。プラスミドベクターとし
て、相応する微生物中で増幅可能なものが挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ用に例えばベクターｐ
ＳＣ１０１（Vocke and Bastia, Proceedingsof the Na
tional Academy of Sciences USA 80 (21), 6557-6561
(1983)）又はｐＫＫ２２３−３（Brosius and Holy, Pr
oceedings of the National Academyof Sciences USA 8
1, 6929 (1984)）又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ用に例えばベクターｐＥＫＥx
１（Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)）又はｐ
Ｚ８−１（欧州特許第０３７５８８９号明細書）が本発
明のために挙げられる。この種の微生物の例は、Ｃ．ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ
２及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２及びＥ．
ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５／ｐＮＤ−Ｄ２であり、これら
はプラスミドｐＮＤ−Ｄ２及びｐＮＤ−ＤＢＣ２を含有
する。プラスミドｐＮＤ−Ｄ２はプラスミドｐＺ８−１
ベースのＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャ
トルベクターであり、このシャトルベクターはＣ．ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺伝子を有する。プラス
ミドｐＮＤ−ＤＢＣ２はプラスミドｐＺ８−１ベースの
Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルベク
ターであり、このシャトルベクターはＣ．ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍの遺伝子ｐａｎＤ、ｐａｎＢ及びｐａｎＣを有
する。
【００２３】染色体突然変異、代謝物質及び代謝拮抗物
質に対する耐性を引き起こすか又はパントテン酸の前駆
体の流出を阻止する染色体突然変異は、本発明の対象で
ある手段を用いて有利に組み合わせることができること
は当業者には明らかである。
質に対する耐性を引き起こすか又はパントテン酸の前駆
体の流出を阻止する染色体突然変異は、本発明の対象で
ある手段を用いて有利に組み合わせることができること
は当業者には明らかである。
【００２４】本発明により製造された微生物は、連続的
に又は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又は
フィードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は
繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repet
itives Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的
で培養することができる。公知の培養法に関する概要は
Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bi
overfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttga
rt, 1991))の教書又はStorhas (Bioreaktorenund perip
here Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wi
esbaden, 1994))の教書に記載されている。
に又は不連続的に、バッチ法（Satzkultivierung）又は
フィードバッチ法（fed batch; Zulaufverfahren）又は
繰り返しフィードバッチ法（repeated fed batch;repet
itives Zulaufverfahren）でパントテン酸−産生の目的
で培養することができる。公知の培養法に関する概要は
Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bi
overfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttga
rt, 1991))の教書又はStorhas (Bioreaktorenund perip
here Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wi
esbaden, 1994))の教書に記載されている。
【００２５】使用すべき培養基は適当な手法でそれぞれ
の微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生
物の培養基の記載は、ハンドブック"Manual of Methods
forGeneral Bacteriology", American Society for Ba
cteriology (Washington D.C., USA, 1981)になされて
いる。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例
えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂
肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。こ
の材料は単独で又は混合物として使用することができ
る。窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプト
ン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ
膨潤水、ダイズ粉及び尿素又は無機化合物、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸
アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用される。この
窒素源は個々に又は混合物として使用することができ
る。リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又は
リン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩を
使用することができる。この培養基は、さらに成長に必
要な金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有
しなければならない。最後に、必須の成長物質、例えば
アミノ酸及びビタミンを前記の物質に対して付加的に使
用することができる。この培養基にさらにパントテン酸
の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン、ケト
イソバレレート又はケトパントイン酸又はパントイン酸
及び場合によりこれらの塩を添加することができる。前
記の添加物質は培養へ１回のバッチの形で添加するか、
又は適当な手法で培養の間に供給することができる。
の微生物の要求を満たさなければならない。多様な微生
物の培養基の記載は、ハンドブック"Manual of Methods
forGeneral Bacteriology", American Society for Ba
cteriology (Washington D.C., USA, 1981)になされて
いる。炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコー
ス、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルト
ース、糖蜜、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、例
えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂
肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。こ
の材料は単独で又は混合物として使用することができ
る。窒素源として、有機窒素含有化合物、例えばペプト
ン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ
膨潤水、ダイズ粉及び尿素又は無機化合物、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸
アンモニウム及び硝酸アンモニウムが使用される。この
窒素源は個々に又は混合物として使用することができ
る。リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム又は
リン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩を
使用することができる。この培養基は、さらに成長に必
要な金属塩、例えば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有
しなければならない。最後に、必須の成長物質、例えば
アミノ酸及びビタミンを前記の物質に対して付加的に使
用することができる。この培養基にさらにパントテン酸
の前駆体、例えばアスパルテート、β−アラニン、ケト
イソバレレート又はケトパントイン酸又はパントイン酸
及び場合によりこれらの塩を添加することができる。前
記の添加物質は培養へ１回のバッチの形で添加するか、
又は適当な手法で培養の間に供給することができる。
【００２６】培地のｐＨ−コントロールのために、塩基
性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が
適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消
泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用する
ことができる。プラスミドの安定を維持するために、培
地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加す
ることができる。好気性条件を維持するために、酸素又
は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入す
る。培地の温度は通常２０℃〜５０℃、有利に２５℃〜
４５℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで
培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時
間の間に達成される。
性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
アンモニア、又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が
適当な手法で使用される。泡形成を制御するために、消
泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用する
ことができる。プラスミドの安定を維持するために、培
地に適当な選択作用する物質、例えば抗生物質を添加す
ることができる。好気性条件を維持するために、酸素又
は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地中へ導入す
る。培地の温度は通常２０℃〜５０℃、有利に２５℃〜
４５℃である。パントテン酸の最大量が生成されるまで
培養は継続される。この目的は通常１０時間〜１６０時
間の間に達成される。
【００２７】酵素Ｌ−アスパルテート １−デカルボキ
シラーゼの高い活性を有する株は、Ｌ−アスパルテート
からβ−アラニンを製造するために使用できることは当
業者には明らかである。このため、発酵による方法、酵
素による変換反応又はこの両方の組合せが使用される。
シラーゼの高い活性を有する株は、Ｌ−アスパルテート
からβ−アラニンを製造するために使用できることは当
業者には明らかである。このため、発酵による方法、酵
素による変換反応又はこの両方の組合せが使用される。
【００２８】生成されたパントテン酸の濃度は、公知の
方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)）で測定することができる。
方法（Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)）で測定することができる。
【００２９】次の微生物をブタペスト条約に従ってDeut
sche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２をＤＳＭ１２４３８
としてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２をＤ
ＳＭ１２４３７として。
sche Sammlung fuer Mikrorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託した：Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２をＤＳＭ１２４３８
としてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２をＤ
ＳＭ１２４３７として。
【００３０】
【実施例】本発明を次に実施例により詳説する。
【００３１】例１ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ−遺伝子のクロー
ニング及び配列決定 １． ｐａｎＤ−遺伝子のクローニング Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２から
の染色体ＤＮＡを、Tauch et al. (1995, Plasmid, 33:
168-179)に記載されたように単離し、制限酵素Ｓａｕ３
Ａ（Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品
表示Ｓａｕ３Ａ、Code no. 27-0913-02）を用いて部分
的に分解した。７〜９ｋｂのサイズ領域のＤＮＡ−フラ
グメントを"Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic A
cids" (Machery und Nagel, Duersen, Deutschland; Ca
t. No. 740584)を用いて単離し、MBI Fermentas社（Vil
nius, Litauen）から販売されたベクターｐＵＣ１９（N
orrander et al., 1982, Gene, 26:101-106）の脱リン
酸化されたＢａｍＨＩ−切断部位へ連結した。この連結
はSambrook et al. (1989, Molecular Cloning: Alabor
atory Manual, Cold Spring Harbor)に記載されたよう
に実施し、その際、ＤＮＡ−混合物はＴ４−リガーゼ
（Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland）と一緒
に一晩中インキュベートした。この連結混合物を引き続
きＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proce
edings of the National Acadimies ofSciences USA, 8
7:4645-4649）中へエレクトロポレーション（Tauch, 19
94, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347）
し、ＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）＋
アンピシリン１００μｇ／ｍｌ上で平板培養した。３７
℃で２４時間のインキュベーションの後に、Ｃ．ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍ遺伝子ライブラリーを、"Alkalischen-L
yse-Methode" Birnboim and Doly (Nucleic Acids Rese
arch, 7:1513-1523, 1997)によるプラスミド−ＤＮＡの
再単離によって形質転換体から得た。この遺伝子バンク
を用いて、ｐａｎＤ−遺伝子中に突然変異を有するＥ．
ｃｏｌｉ株ＤＶ９（Vallari and Rock, 1985, Journal
of Bacteriology, 164:136-142）のコンピテント細胞を
エレクトロポレーションした。このエレクトロポレーシ
ョン処理物を再生期間（Tauch et al., 1994, FEMS Mic
robiological Letters, 123:343-347）に引き続き培地
Ｅ（Vogel and Bonner, 1956, Journal of Biological
Chemistry, 218:97-106）を用いて２回培養した。培地
Ｅの組成を表１に示した。この細胞を２５０ｍｌのエル
レンマイヤーフラスコ中に装入した培地Ｅ ５０ｍｌ＋
アンピシリン１００μｇ／ｍｌに接種し、エアシェーカ
ー中で２５０ｒｐｍで３９℃でインキュベーションし
た。２日間のインキュベーションの後に、バクテリア懸
濁液を希釈し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充し
たＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に
塗り付けた。
ニング及び配列決定 １． ｐａｎＤ−遺伝子のクローニング Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２から
の染色体ＤＮＡを、Tauch et al. (1995, Plasmid, 33:
168-179)に記載されたように単離し、制限酵素Ｓａｕ３
Ａ（Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品
表示Ｓａｕ３Ａ、Code no. 27-0913-02）を用いて部分
的に分解した。７〜９ｋｂのサイズ領域のＤＮＡ−フラ
グメントを"Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic A
cids" (Machery und Nagel, Duersen, Deutschland; Ca
t. No. 740584)を用いて単離し、MBI Fermentas社（Vil
nius, Litauen）から販売されたベクターｐＵＣ１９（N
orrander et al., 1982, Gene, 26:101-106）の脱リン
酸化されたＢａｍＨＩ−切断部位へ連結した。この連結
はSambrook et al. (1989, Molecular Cloning: Alabor
atory Manual, Cold Spring Harbor)に記載されたよう
に実施し、その際、ＤＮＡ−混合物はＴ４−リガーゼ
（Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland）と一緒
に一晩中インキュベートした。この連結混合物を引き続
きＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 1990, Proce
edings of the National Acadimies ofSciences USA, 8
7:4645-4649）中へエレクトロポレーション（Tauch, 19
94, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347）
し、ＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）＋
アンピシリン１００μｇ／ｍｌ上で平板培養した。３７
℃で２４時間のインキュベーションの後に、Ｃ．ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍ遺伝子ライブラリーを、"Alkalischen-L
yse-Methode" Birnboim and Doly (Nucleic Acids Rese
arch, 7:1513-1523, 1997)によるプラスミド−ＤＮＡの
再単離によって形質転換体から得た。この遺伝子バンク
を用いて、ｐａｎＤ−遺伝子中に突然変異を有するＥ．
ｃｏｌｉ株ＤＶ９（Vallari and Rock, 1985, Journal
of Bacteriology, 164:136-142）のコンピテント細胞を
エレクトロポレーションした。このエレクトロポレーシ
ョン処理物を再生期間（Tauch et al., 1994, FEMS Mic
robiological Letters, 123:343-347）に引き続き培地
Ｅ（Vogel and Bonner, 1956, Journal of Biological
Chemistry, 218:97-106）を用いて２回培養した。培地
Ｅの組成を表１に示した。この細胞を２５０ｍｌのエル
レンマイヤーフラスコ中に装入した培地Ｅ ５０ｍｌ＋
アンピシリン１００μｇ／ｍｌに接種し、エアシェーカ
ー中で２５０ｒｐｍで３９℃でインキュベーションし
た。２日間のインキュベーションの後に、バクテリア懸
濁液を希釈し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充し
たＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上に
塗り付けた。
【００３２】
【表１】
【００３３】ＤＶ９−形質転換体のプラスミド−ＤＮＡ
を単離し、これをｐＮＩＣ−１．３とし、アガロースゲ
ル電気泳動（Sambrook et al., Molecular cloning. A
laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Labor
atory Press）及び公知の長さの標準−ＤＮＡ−フラグ
メントとの比較により特性決定した。プラスミドｐＮＩ
Ｃ−１．３は７ｋｂｐの長さの挿入物を有する。ｐＮＩ
Ｃ−１．３の相補能力をｐａｎＤ突然変異体ＤＶ９の新
たな形質転換により調査した。得られた形質転換体は再
び、β−アラニン不含培地Ｅ中で上記の条件下で成長す
ることができた。
を単離し、これをｐＮＩＣ−１．３とし、アガロースゲ
ル電気泳動（Sambrook et al., Molecular cloning. A
laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Labor
atory Press）及び公知の長さの標準−ＤＮＡ−フラグ
メントとの比較により特性決定した。プラスミドｐＮＩ
Ｃ−１．３は７ｋｂｐの長さの挿入物を有する。ｐＮＩ
Ｃ−１．３の相補能力をｐａｎＤ突然変異体ＤＶ９の新
たな形質転換により調査した。得られた形質転換体は再
び、β−アラニン不含培地Ｅ中で上記の条件下で成長す
ることができた。
【００３４】７ｋｂのインサートのサブクローニング
は、プラスミドｐＮＩＣ−１．３を制限酵素ＢａｍＨＩ
（Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品表
示ＢａｍＨＩ、Code no. 27-0868-03）、ＥｃｏＲＩ（P
harmacia Biotech (Freiburg,Deutschland),製品表示Ｅ
ｃｏＲＩ、Code no. 27-0884-03）及びＢｇｌＩＩ（Pha
rmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品表示Ｂ
ｇｌＩＩ、Code no. 27-0946-02）を用いて分解し及び
引き続き相応する制限消化したベクターｐＫ１８ｍｏｂ
（Schaefer, 1994, Gene, 145:69-73）中へ連結した。
得られた連結物をＥ．ｃｏｌｉ ｐａｎＤ突然変異体Ｄ
Ｖ９中へエレクトロポレーションし；相補的形質転換体
に関して上記のように選択を行った（この場合、寒天プ
レートはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有）。相補的
な単一クローンのプラスミドを単離し、制限分析により
特性決定した。約３ｋｂのサイズのＤＮＡ−インサート
を有するＥｃｏＲＩ−サブクローン（以後ｐＮＩＣ−１
０とする）を次の配列分析のために選択した。
は、プラスミドｐＮＩＣ−１．３を制限酵素ＢａｍＨＩ
（Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品表
示ＢａｍＨＩ、Code no. 27-0868-03）、ＥｃｏＲＩ（P
harmacia Biotech (Freiburg,Deutschland),製品表示Ｅ
ｃｏＲＩ、Code no. 27-0884-03）及びＢｇｌＩＩ（Pha
rmacia Biotech (Freiburg, Deutschland),製品表示Ｂ
ｇｌＩＩ、Code no. 27-0946-02）を用いて分解し及び
引き続き相応する制限消化したベクターｐＫ１８ｍｏｂ
（Schaefer, 1994, Gene, 145:69-73）中へ連結した。
得られた連結物をＥ．ｃｏｌｉ ｐａｎＤ突然変異体Ｄ
Ｖ９中へエレクトロポレーションし；相補的形質転換体
に関して上記のように選択を行った（この場合、寒天プ
レートはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有）。相補的
な単一クローンのプラスミドを単離し、制限分析により
特性決定した。約３ｋｂのサイズのＤＮＡ−インサート
を有するＥｃｏＲＩ−サブクローン（以後ｐＮＩＣ−１
０とする）を次の配列分析のために選択した。
【００３５】２． ｐａｎＤ−遺伝子の配列決定 ｐＮＩＣ−１０の３ｋｂ断片の二本鎖の配列決定のため
に、この断片を多様な制限酵素で分解し、この断片をプ
ラスミドｐＵＣ１９又はｐＫ１８ｍｏｂ中へサブクロー
ニングした。配列決定のために使用したプラスミド−Ｄ
ＮＡは、"QIAGEN Plasmid Mini kit" (Qiagen, Inc., C
hatsworth, Ca., USA)を用いて製造元の指示により単離
し、プラスミドサイズの決定をアガロースゲル電気泳動
を用いて実施した。
に、この断片を多様な制限酵素で分解し、この断片をプ
ラスミドｐＵＣ１９又はｐＫ１８ｍｏｂ中へサブクロー
ニングした。配列決定のために使用したプラスミド−Ｄ
ＮＡは、"QIAGEN Plasmid Mini kit" (Qiagen, Inc., C
hatsworth, Ca., USA)を用いて製造元の指示により単離
し、プラスミドサイズの決定をアガロースゲル電気泳動
を用いて実施した。
【００３６】配列決定は、Zimmermann et al. (Nucleic
Acids Research, 18:1067, 1990)により改良したSange
r et al. (Proceedings of the National Academies of
Sciences USA, 74:5463-5467, 1977)のジデオキシ−鎖
中断−法により行った。Pharmacia (Product No. 27-26
90-02, Freiburg, Germany)の"Cy5-AutoRead Sequencin
g kit"を使用した。ゲル電気泳動による分離及び配列反
応の分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, S
chweden)社の"automatischen Laser-Fluoreszenz (A.L.
F.) Express DNA Sequenziergeraet"を備えた"Long Ran
ger Gel Solution"-Polyacrylamidgel (FMC BioProduct
s, Rockland, Me., USA)中で行った。得られた粗−配列
データを引き続きStaden-Programpakets（Nucleic Acid
s Research, 14:217-231, 1986）Version 97-0を使用し
て処理した。ｐＮＩＣ−１０サブクローンの全体の単一
配列は関連する３０６０ｂｐの長さのＣｏｎｔｉｇに組
み立て、これをＣｏｎｔｉｎｇ１３とした。全体のＤＮ
Ａ−フラグメントのプログラム XNIP (Staden, 1986, N
ucleic Acids Research, 14:217-231)を用いたコンピュ
ータによるコード領域分析は５つのオープンリードフレ
ーム（ＯＲＦｓ）の同定が明らかになった。
Acids Research, 18:1067, 1990)により改良したSange
r et al. (Proceedings of the National Academies of
Sciences USA, 74:5463-5467, 1977)のジデオキシ−鎖
中断−法により行った。Pharmacia (Product No. 27-26
90-02, Freiburg, Germany)の"Cy5-AutoRead Sequencin
g kit"を使用した。ゲル電気泳動による分離及び配列反
応の分析を、Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, S
chweden)社の"automatischen Laser-Fluoreszenz (A.L.
F.) Express DNA Sequenziergeraet"を備えた"Long Ran
ger Gel Solution"-Polyacrylamidgel (FMC BioProduct
s, Rockland, Me., USA)中で行った。得られた粗−配列
データを引き続きStaden-Programpakets（Nucleic Acid
s Research, 14:217-231, 1986）Version 97-0を使用し
て処理した。ｐＮＩＣ−１０サブクローンの全体の単一
配列は関連する３０６０ｂｐの長さのＣｏｎｔｉｇに組
み立て、これをＣｏｎｔｉｎｇ１３とした。全体のＤＮ
Ａ−フラグメントのプログラム XNIP (Staden, 1986, N
ucleic Acids Research, 14:217-231)を用いたコンピュ
ータによるコード領域分析は５つのオープンリードフレ
ーム（ＯＲＦｓ）の同定が明らかになった。
【００３７】図１において、Ｃｏｎｔｉｎｇ１３の制限
マップ及びｏｒｆ−１〜ｏｒｆ−５として示されるＯＲ
Ｆｓの長さが示されている。相同性分析は、"National
Library of Medicine" (Bethesda, MD, USA)のＮＣＢＩ
−サービスのオンラインサービスを介して供給された"B
LAST search programs" (Gish and States, 1993, Natu
re of Genetics, 3:266-272; Altschul et al., 1990,
Journal of MolecularBiology, 215:403-410)を用いて
実施した。Ｃｏｎｔｉｎｇ１３の分析によりｏｒｆ−３
がｐａｎＤ−遺伝子であることを明らかになった。以
後、ｏｒｆ−３をｐａｎＤとした。ｐａｎＤ−遺伝子を
有するＤＮＡ−フラグメントのヌクレオチド配列を配列
番号１として記載した。上記方法で生じたｐａｎＤ−遺
伝子産物のアミノ酸配列、つまりＬ−アスパルテート−
１−デカルボキシラーゼを配列番号２として記載した。
マップ及びｏｒｆ−１〜ｏｒｆ−５として示されるＯＲ
Ｆｓの長さが示されている。相同性分析は、"National
Library of Medicine" (Bethesda, MD, USA)のＮＣＢＩ
−サービスのオンラインサービスを介して供給された"B
LAST search programs" (Gish and States, 1993, Natu
re of Genetics, 3:266-272; Altschul et al., 1990,
Journal of MolecularBiology, 215:403-410)を用いて
実施した。Ｃｏｎｔｉｎｇ１３の分析によりｏｒｆ−３
がｐａｎＤ−遺伝子であることを明らかになった。以
後、ｏｒｆ−３をｐａｎＤとした。ｐａｎＤ−遺伝子を
有するＤＮＡ−フラグメントのヌクレオチド配列を配列
番号１として記載した。上記方法で生じたｐａｎＤ−遺
伝子産物のアミノ酸配列、つまりＬ−アスパルテート−
１−デカルボキシラーゼを配列番号２として記載した。
【００３８】例２ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの遺伝子ｐａｎＢ及びｐ
ａｎＣのクローニング及び配列決定 １． 遺伝子ｐａｎＢ及びｐａｎＣのクローニング Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２から
の染色体ＤＮＡを、Schwarzer and Puehler (Bio/Techn
ology 9 (1990) 84-87)に記載されたように単離し、制
限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分的に分解した。３〜７ｋ
ｂもしくは９〜２０ｋｂのサイズ領域のＤＮＡ−フラグ
メントを抽出し、次いでベクターｐＢＲ３２２の一本鎖
のＢａｍＨＩ切断部位中へ連結させた。この連結物を用
いてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al., Pr
oceedings of the National Acadimies of Sciences un
ited States of America USA, 87 (1990),4645-4649）
を形質転換した（Hanahan, Journal of Molecular Biol
ogy 166 (1983) 557-580）。インサートを有するクロー
ンをそのテトラサイクリン感度に基づき、テトラサイク
リン１０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天プレート上に
接種した後に同定した。合わせたクローンのプラスミド
調製（Sambrook et al., Molecular cloning. A labora
tory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory
Press）により、９〜２０ｋｂのインサートサイズを有
するそれぞれ４００のプラスミド、３〜７ｋｂのインサ
ートサイズを有するそれぞれ５００のプラスミドを有す
る８グループを単離した。Ｅ．ｃｏｌｉのｐａｎＢ突然
変異体ＳＪ２（Cronan et al.1982, Journal of Bacter
iology 149: 916-922）をこの遺伝子ライブラリでエレ
クトロポレーション（Wehrmann et al. 1994, Microbio
logy 140: 3349-3356）により形質転換した。この形質
転換物を、寒天１５ｇ／ｌを有するＣＧＸＩＩ−培地
（Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993)
175: 5595-5603）上で直接平板培養した。パントテネ
ート補足なしで成長できるクローンからプラスミド−Ｄ
ＮＡを単離した（Sambrook et al., Molecular clonin
g. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour
Laboratory Press）。８つのプラスミドにおいて、再形
質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体ＳＪ２のｐａｎ
Ｂ−欠失を非相同的に相補する能力が確認された。
ａｎＣのクローニング及び配列決定 １． 遺伝子ｐａｎＢ及びｐａｎＣのクローニング Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２から
の染色体ＤＮＡを、Schwarzer and Puehler (Bio/Techn
ology 9 (1990) 84-87)に記載されたように単離し、制
限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分的に分解した。３〜７ｋ
ｂもしくは９〜２０ｋｂのサイズ領域のＤＮＡ−フラグ
メントを抽出し、次いでベクターｐＢＲ３２２の一本鎖
のＢａｍＨＩ切断部位中へ連結させた。この連結物を用
いてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αｍｃｒ（Grant et al., Pr
oceedings of the National Acadimies of Sciences un
ited States of America USA, 87 (1990),4645-4649）
を形質転換した（Hanahan, Journal of Molecular Biol
ogy 166 (1983) 557-580）。インサートを有するクロー
ンをそのテトラサイクリン感度に基づき、テトラサイク
リン１０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天プレート上に
接種した後に同定した。合わせたクローンのプラスミド
調製（Sambrook et al., Molecular cloning. A labora
tory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory
Press）により、９〜２０ｋｂのインサートサイズを有
するそれぞれ４００のプラスミド、３〜７ｋｂのインサ
ートサイズを有するそれぞれ５００のプラスミドを有す
る８グループを単離した。Ｅ．ｃｏｌｉのｐａｎＢ突然
変異体ＳＪ２（Cronan et al.1982, Journal of Bacter
iology 149: 916-922）をこの遺伝子ライブラリでエレ
クトロポレーション（Wehrmann et al. 1994, Microbio
logy 140: 3349-3356）により形質転換した。この形質
転換物を、寒天１５ｇ／ｌを有するＣＧＸＩＩ−培地
（Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993)
175: 5595-5603）上で直接平板培養した。パントテネ
ート補足なしで成長できるクローンからプラスミド−Ｄ
ＮＡを単離した（Sambrook et al., Molecular clonin
g. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour
Laboratory Press）。８つのプラスミドにおいて、再形
質転換により、Ｅ．ｃｏｌｉ突然変異体ＳＪ２のｐａｎ
Ｂ−欠失を非相同的に相補する能力が確認された。
【００３９】この８つのプラスミドを用いて制限マップ
作成を実施した。調査したプラスミドベクターの１つ
（以後ｐＵＲ１とする）は９．３ｋｂのインサートを有
していた（図２）。Ｅ．ｃｏｌｉのｐａｎＣ突然変異体
ＤＶ３９（Vallari and Rock 1985, Journal of Bacter
iology 164: 136-142）の形質転換は、ベクターｐＵＲ
１が同様にこの突然変異体のｐａｎＣ欠失を相補するこ
とができることを示した。
作成を実施した。調査したプラスミドベクターの１つ
（以後ｐＵＲ１とする）は９．３ｋｂのインサートを有
していた（図２）。Ｅ．ｃｏｌｉのｐａｎＣ突然変異体
ＤＶ３９（Vallari and Rock 1985, Journal of Bacter
iology 164: 136-142）の形質転換は、ベクターｐＵＲ
１が同様にこの突然変異体のｐａｎＣ欠失を相補するこ
とができることを示した。
【００４０】２． ｐａｎＢ−遺伝子及びｐａｎＣ−遺
伝子の配列決定 ｐＵＲ１のインサート（図２）の２．２ｋｂのサイズの
フラグメントを、 Sanger et al. (Proceedings of the
National Academies of Sciences of the United Stat
es of America USA, (1977) 74:5463-5467,)のジデオキ
シ−鎖中断−法により行った。このために、まずエキソ
ヌクレアーゼＩＩＩを用いてサブクローンを製造し、こ
れを標準プライマー（Universal and reverse primer,
Boehringer Mannheim社, Deutschland）を用いて配列決
定した。配列決定物のゲル電気泳動分析を、Amersham P
harmacia Biotech (Uppsala, Schweden)の自動的レーザ
−蛍光−シークエンサー装置（A.L.F.）を用いて行っ
た。得られたヌクレオチド配列を、プログラムパケット
ＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL, Cambrige, GB）を用
いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号３とし
て記載した。この分析により２つのオープンリードフレ
ームの同定が示された。８１３ｂｐの長さの第１のオー
プンリードフレームはｐａｎＢ−遺伝子として同定さ
れ、これは２７１個のアミノ酸のポリペプチドをコード
し、配列番号４として記載されている。第２のオープン
リードフレームはｐａｎＣとして同定され、８７３個の
塩基対を有する。これは２７９個のアミノ酸のポリペプ
チドをコードし、配列番号５として記載されている。
伝子の配列決定 ｐＵＲ１のインサート（図２）の２．２ｋｂのサイズの
フラグメントを、 Sanger et al. (Proceedings of the
National Academies of Sciences of the United Stat
es of America USA, (1977) 74:5463-5467,)のジデオキ
シ−鎖中断−法により行った。このために、まずエキソ
ヌクレアーゼＩＩＩを用いてサブクローンを製造し、こ
れを標準プライマー（Universal and reverse primer,
Boehringer Mannheim社, Deutschland）を用いて配列決
定した。配列決定物のゲル電気泳動分析を、Amersham P
harmacia Biotech (Uppsala, Schweden)の自動的レーザ
−蛍光−シークエンサー装置（A.L.F.）を用いて行っ
た。得られたヌクレオチド配列を、プログラムパケット
ＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL, Cambrige, GB）を用
いて分析した。このヌクレオチド配列を配列番号３とし
て記載した。この分析により２つのオープンリードフレ
ームの同定が示された。８１３ｂｐの長さの第１のオー
プンリードフレームはｐａｎＢ−遺伝子として同定さ
れ、これは２７１個のアミノ酸のポリペプチドをコード
し、配列番号４として記載されている。第２のオープン
リードフレームはｐａｎＣとして同定され、８７３個の
塩基対を有する。これは２７９個のアミノ酸のポリペプ
チドをコードし、配列番号５として記載されている。
【００４１】例３ ｐａｎＤ、ｐａｎＢＣ及びｐａｎＤＢＣの発現のための
ベクターの構成 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉからのパン
トテネート生合成−遺伝子をポリメラーゼ連結反応（Ｐ
ＣＲ）並びに合成オリゴヌクレオチドの適用下に増幅し
た。 ＰＣＲ−実験はGibco-BRL (Eggestein, Deutschla
nd）社のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて"PCT-100
Thermocycler" (MJ Research Inc.,Watertown, Mass.,
USA)中で実施した。９４℃で２分間の１回の変性工程
に続き９４℃で９０秒の変性工程、Ｔ＝（２ＡＴ＋４Ｇ
Ｃ）−５℃のプライマー依存温度（Suggs, et al., 198
1, p. 638-693, In: D.D. Brown, and C.F. Fox (Ed
s.), Developmental biology using purified genes. A
cademic Press, New York,USA）で９０秒のアニーリン
グ工程並びに７２℃で９０秒間の延長工程を続けた。後
の３工程を３５回のサイクルで繰り返し、この反応は７
２℃で１０分の最後の延長工程で完了した。こうして増
幅した産物を、アガロースゲル中で電気泳動により試験
した後、製造元の指示に応じて、ベクターｐＣＲ(R)
２．１（Original TA Cloning Kit, Invitrogene (Lee
k, Niederlande),製品表示Original TACloning (R) Ki
t, Cat. no. KNM2030-01）中に連結し、引き続きＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＴＯＰ１０Ｆ′中へ形質転換した。形質転換体
に関する選択は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びＸ
−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−
寒天プレート上で２４時間３７℃でインキュベーション
することによって行った。
ベクターの構成 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉからのパン
トテネート生合成−遺伝子をポリメラーゼ連結反応（Ｐ
ＣＲ）並びに合成オリゴヌクレオチドの適用下に増幅し
た。 ＰＣＲ−実験はGibco-BRL (Eggestein, Deutschla
nd）社のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて"PCT-100
Thermocycler" (MJ Research Inc.,Watertown, Mass.,
USA)中で実施した。９４℃で２分間の１回の変性工程
に続き９４℃で９０秒の変性工程、Ｔ＝（２ＡＴ＋４Ｇ
Ｃ）−５℃のプライマー依存温度（Suggs, et al., 198
1, p. 638-693, In: D.D. Brown, and C.F. Fox (Ed
s.), Developmental biology using purified genes. A
cademic Press, New York,USA）で９０秒のアニーリン
グ工程並びに７２℃で９０秒間の延長工程を続けた。後
の３工程を３５回のサイクルで繰り返し、この反応は７
２℃で１０分の最後の延長工程で完了した。こうして増
幅した産物を、アガロースゲル中で電気泳動により試験
した後、製造元の指示に応じて、ベクターｐＣＲ(R)
２．１（Original TA Cloning Kit, Invitrogene (Lee
k, Niederlande),製品表示Original TACloning (R) Ki
t, Cat. no. KNM2030-01）中に連結し、引き続きＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＴＯＰ１０Ｆ′中へ形質転換した。形質転換体
に関する選択は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びＸ
−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシド）４０μｇ／ｍｌを有するＬＢ−
寒天プレート上で２４時間３７℃でインキュベーション
することによって行った。
【００４２】このパントテネート生合成−遺伝子のＣ．
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２及びＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２（W.K. Merkel and B.P. Nichols, 199
3,GenBank: L17086）のｐａｎＤ（配列番号１）及びｐ
ａｎＢＣ（配列番号３）のヌクレオチド配列から出発
し、ＰＣＲ−プライマーを合成した（MWG Biotech, Ebe
rsberg, Deutschland）。このプライマーは、増幅され
たフラグメントが前記遺伝子並びにそのネガティブなリ
ボソーム−結合部位を有するが、可能なプロモータ−部
位は有していないように選択された。さらに、目的ベク
ター中へのクローニングを可能にするように適当な制限
切断部位を挿入した。ＰＣＲ−プライマーの配列、挿入
された切断部位（下線の配列）並びに増幅された遺伝子
（フラグメントのサイズを括弧中にｂｐで記載）を次の
表２に記載した。
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２及びＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２（W.K. Merkel and B.P. Nichols, 199
3,GenBank: L17086）のｐａｎＤ（配列番号１）及びｐ
ａｎＢＣ（配列番号３）のヌクレオチド配列から出発
し、ＰＣＲ−プライマーを合成した（MWG Biotech, Ebe
rsberg, Deutschland）。このプライマーは、増幅され
たフラグメントが前記遺伝子並びにそのネガティブなリ
ボソーム−結合部位を有するが、可能なプロモータ−部
位は有していないように選択された。さらに、目的ベク
ター中へのクローニングを可能にするように適当な制限
切断部位を挿入した。ＰＣＲ−プライマーの配列、挿入
された切断部位（下線の配列）並びに増幅された遺伝子
（フラグメントのサイズを括弧中にｂｐで記載）を次の
表２に記載した。
【００４３】
【表２】
【００４４】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ並びにＥ．ｃｏ
ｌｉ中での発現のための基本ベクターとして、図３に示
したＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトル
−発現ベクターｐＺ８−１（欧州特許第０３７５８８９
号明細書）を使用した。予めベクターｐＣＲ(R)２．１
中にクローニングされた増幅物を、プライマーが挿入さ
れた制限切断部位を用いて同様に処理された発現ベクタ
ーｐＺ８−１中へ連結し、それによりこのプラスミド上
に含まれるｔａｃ−プロモータの制御下におかれる。唯
一の例外は、 ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−フラグメント
をベクターｐＺ８−１の適合するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ−制限末端中へクローニングした増幅物のｐａｎＤ
E.c.である。こうして構成された発現プラスミドについ
てのそれぞれプラスミドの表示を表２に記載した。Ｅ．
ｃｏｌｉの遺伝子ｐａｎＤE.c.を有する発現ベクターｐ
Ｚ８−１をｐＤＮ−Ｄ１とし、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍの遺伝子ｐａｎＤC.g.を有するｐＺ８−１をｐＮＤ−
Ｄ２とした。相応してｐａｎＢＣE.c.及びｐａｎＢＣC.
g.を有する発現プラスミドをｐＮＤ−ＢＣ１もしくはｐ
ＮＤ−ＢＣ２とした。例えば図３中にベクターｐＺ８−
１中のｐａｎＤE.c.及びｐａｎＤC.g.のためのクローニ
ングストラテジーを図示した。全ての発現プラスミドの
正確なクローニングはそれぞれのインサートの配列決定
により調査された。
ｌｉ中での発現のための基本ベクターとして、図３に示
したＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトル
−発現ベクターｐＺ８−１（欧州特許第０３７５８８９
号明細書）を使用した。予めベクターｐＣＲ(R)２．１
中にクローニングされた増幅物を、プライマーが挿入さ
れた制限切断部位を用いて同様に処理された発現ベクタ
ーｐＺ８−１中へ連結し、それによりこのプラスミド上
に含まれるｔａｃ−プロモータの制御下におかれる。唯
一の例外は、 ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−フラグメント
をベクターｐＺ８−１の適合するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ
Ｉ−制限末端中へクローニングした増幅物のｐａｎＤ
E.c.である。こうして構成された発現プラスミドについ
てのそれぞれプラスミドの表示を表２に記載した。Ｅ．
ｃｏｌｉの遺伝子ｐａｎＤE.c.を有する発現ベクターｐ
Ｚ８−１をｐＤＮ−Ｄ１とし、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍの遺伝子ｐａｎＤC.g.を有するｐＺ８−１をｐＮＤ−
Ｄ２とした。相応してｐａｎＢＣE.c.及びｐａｎＢＣC.
g.を有する発現プラスミドをｐＮＤ−ＢＣ１もしくはｐ
ＮＤ−ＢＣ２とした。例えば図３中にベクターｐＺ８−
１中のｐａｎＤE.c.及びｐａｎＤC.g.のためのクローニ
ングストラテジーを図示した。全ての発現プラスミドの
正確なクローニングはそれぞれのインサートの配列決定
により調査された。
【００４５】さらに、Ｅ．ｃｏｌｉもしくはＣ．ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ遺伝子を用いて人工的にｐａ
ｎＤＢＣ−オペロンが構築した。Ｅ．ｃｏｌｉオペロン
について、ｐａｎＤE.c.含有ベクターｐＣＲ２．１をＥ
ｃｏＲＩで分解し、このＤＮＡをアガロースゲル中で分
離し、ｐａｎＤ−フラグメントを、例えば既に例１．１
に記載したように、"Nucleotrap Extraction Kit for N
ucleic Acids" (Macherey and Nagel, Dueren, Deutsch
land)を用いてゲルから精製した。引き続きこのフラグ
メントをＥｃｏＲＩ分解したプラスミドｐＮＤ−ＢＣ１
中へ連結した。ｐａｎＤ−遺伝子の正確な位置を有する
プラスミドは、この連結混合物をｐａｎＤ栄養要求性
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＶ９中へ形質転換し、これを例えば例
１に記載されたように栄養要求性の相補性に基づいて選
択することにより得られた。相補された突然変異のプラ
スミド−ＤＮＡが単離され、正確な遺伝子配置がｐＮＤ
−ＤＢＣ１としたプラスミドのインサートの配列決定に
より確認された（図４）。
ｔａｍｉｃｕｍのｐａｎＤ遺伝子を用いて人工的にｐａ
ｎＤＢＣ−オペロンが構築した。Ｅ．ｃｏｌｉオペロン
について、ｐａｎＤE.c.含有ベクターｐＣＲ２．１をＥ
ｃｏＲＩで分解し、このＤＮＡをアガロースゲル中で分
離し、ｐａｎＤ−フラグメントを、例えば既に例１．１
に記載したように、"Nucleotrap Extraction Kit for N
ucleic Acids" (Macherey and Nagel, Dueren, Deutsch
land)を用いてゲルから精製した。引き続きこのフラグ
メントをＥｃｏＲＩ分解したプラスミドｐＮＤ−ＢＣ１
中へ連結した。ｐａｎＤ−遺伝子の正確な位置を有する
プラスミドは、この連結混合物をｐａｎＤ栄養要求性
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＶ９中へ形質転換し、これを例えば例
１に記載されたように栄養要求性の相補性に基づいて選
択することにより得られた。相補された突然変異のプラ
スミド−ＤＮＡが単離され、正確な遺伝子配置がｐＮＤ
−ＤＢＣ１としたプラスミドのインサートの配列決定に
より確認された（図４）。
【００４６】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｐａｎＤＢＣ
−オペロンの構成のために、同様に実施した。ｐａｎＤ
C.g.含有ベクターｐＣＲ２．１をＥｃｏＲＩで分解し、
それによりｐａｎＤC.g.−遺伝子を一方でプライマー介
在を介して及び他方ではベクターのＥｃｏＲＩ−切断部
位を介してベクターから分解して取り出した。この遺伝
子−フラグメントを精製後にＥｃｏＲＩ分解ベクターｐ
Ｚ８−１中へクローニングし、正確なｐａｎＤ−配置を
有するプラスミドを（ｐＮＤ−Ｄ４とする）を上記した
ように得られ、調査された。引き続き、プラスミドｐＮ
Ｄ−Ｄ４を制限酵素ＳａｌＩで分解し、プラスミドｐＮ
Ｄ−ＢＣ２のＳａｌＩ−消化（Pharmacia Biotech (Fre
iburg, Deutschland),製品表示ＳａｌＩ, Code no. 27-
0882-01）により得られた、精製されたｐａｎＢＣ−断
片と連結した。このエレクトロポレーション混合物を、
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αＭＣＲ中へエレクトロポレーシ
ョンし、遺伝子配置ｐａｎＤＢＣを有する１０のプラス
ミドが制限分析により探し出された。このプラスミドの
一つの正確な遺伝子配置をｐＮｄ−ＤＢＣ２（図４）と
し、配列分析により確認した。
−オペロンの構成のために、同様に実施した。ｐａｎＤ
C.g.含有ベクターｐＣＲ２．１をＥｃｏＲＩで分解し、
それによりｐａｎＤC.g.−遺伝子を一方でプライマー介
在を介して及び他方ではベクターのＥｃｏＲＩ−切断部
位を介してベクターから分解して取り出した。この遺伝
子−フラグメントを精製後にＥｃｏＲＩ分解ベクターｐ
Ｚ８−１中へクローニングし、正確なｐａｎＤ−配置を
有するプラスミドを（ｐＮＤ−Ｄ４とする）を上記した
ように得られ、調査された。引き続き、プラスミドｐＮ
Ｄ−Ｄ４を制限酵素ＳａｌＩで分解し、プラスミドｐＮ
Ｄ−ＢＣ２のＳａｌＩ−消化（Pharmacia Biotech (Fre
iburg, Deutschland),製品表示ＳａｌＩ, Code no. 27-
0882-01）により得られた、精製されたｐａｎＢＣ−断
片と連結した。このエレクトロポレーション混合物を、
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αＭＣＲ中へエレクトロポレーシ
ョンし、遺伝子配置ｐａｎＤＢＣを有する１０のプラス
ミドが制限分析により探し出された。このプラスミドの
一つの正確な遺伝子配置をｐＮｄ−ＤＢＣ２（図４）と
し、配列分析により確認した。
【００４７】発現ベクターｐＺ８−１並びにこのプラス
ミドに基づく構成物ｐＮＤ−Ｄ１、ｐＮＤ−Ｄ２及びｐ
ＮＤ−ＤＢＣ１は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５中へ形
質転換され、この形質転換体をＬＢ−寒天（Lennox, 19
55, Virology, 1:190）＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ
上で選択した。得られた株をＭＧ１６５５／ｐＺ８−
１、ＭＧ１６５５／ｐＮＤ−Ｄ１、ＭＧ１６５５／ｐＮ
Ｄ−Ｄ２及びＭＧ１６５５／ｐＮＤ−ＤＢＣ１とした。
ミドに基づく構成物ｐＮＤ−Ｄ１、ｐＮＤ−Ｄ２及びｐ
ＮＤ−ＤＢＣ１は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５中へ形
質転換され、この形質転換体をＬＢ−寒天（Lennox, 19
55, Virology, 1:190）＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ
上で選択した。得られた株をＭＧ１６５５／ｐＺ８−
１、ＭＧ１６５５／ｐＮＤ−Ｄ１、ＭＧ１６５５／ｐＮ
Ｄ−Ｄ２及びＭＧ１６５５／ｐＮＤ−ＤＢＣ１とした。
【００４８】プラスミドｐＺ８−１、ｐＮＤ−Ｄ１、ｐ
ＮＤ−Ｄ２及びｐＮＤ−ＤＢＣ２をＣ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２中へエレクトロポレーショ
ンし、引き続きＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology,
1:190）＋カナマイシン２５μｇ／ｍｌ上で選択するこ
とにより、株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＺ８−１、ＡＴＣ
Ｃ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ
ＮＤ−Ｄ２及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２
が得られた。
ＮＤ−Ｄ２及びｐＮＤ−ＤＢＣ２をＣ．ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２中へエレクトロポレーショ
ンし、引き続きＬＢ−寒天（Lennox, 1955, Virology,
1:190）＋カナマイシン２５μｇ／ｍｌ上で選択するこ
とにより、株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＺ８−１、ＡＴＣ
Ｃ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐ
ＮＤ−Ｄ２及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２
が得られた。
【００４９】例４ 多様なＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株によるパントテネートの
形成 Ｄ−パントテネートの定量的測定は、Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍパントテネート−アッ
セイ（試験株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ ＡＴＣＣ ８０１４，Cat. No. 3211-30-3；
培養基：Bacto Pantotenate Assay Medium (DIFCO Labo
ratories, Michigan, USA), Cat. No.0604-15-3）を用
いて行った。この指示株はパントテネートの存在の場合
にだけ前記の培養基中で成長し、この成長は、測光によ
り測定可能に、培養基のパントテネート濃度に直線的に
依存することが示された。校正のためにパントテネート
のヘミカルシウム塩を使用した（Sigma,製品表示 Ｐ
２２５０）。光学密度はLKB Biochrom Photometer, Pha
rmacia Biotech社(Freiburg, Deutschland)で、５８０
ｎｍの測定波長（ｏ．Ｄ．580）で決定した。
形成 Ｄ−パントテネートの定量的測定は、Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍパントテネート−アッ
セイ（試験株：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ ＡＴＣＣ ８０１４，Cat. No. 3211-30-3；
培養基：Bacto Pantotenate Assay Medium (DIFCO Labo
ratories, Michigan, USA), Cat. No.0604-15-3）を用
いて行った。この指示株はパントテネートの存在の場合
にだけ前記の培養基中で成長し、この成長は、測光によ
り測定可能に、培養基のパントテネート濃度に直線的に
依存することが示された。校正のためにパントテネート
のヘミカルシウム塩を使用した（Sigma,製品表示 Ｐ
２２５０）。光学密度はLKB Biochrom Photometer, Pha
rmacia Biotech社(Freiburg, Deutschland)で、５８０
ｎｍの測定波長（ｏ．Ｄ．580）で決定した。
【００５０】Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５／ｐＺ８−
１、ＭＧ１６５５／ｐＮＤ−Ｄ１、ＭＧ１６５５／ｐＮ
Ｄ−Ｄ２及びＭＧ１６５５／ｐＮＤ−ＤＢＣ１のパント
テネート産生のために、試験培地（培地Ｅ及びカナマイ
シン５０μｇ／ｍｌ）５０ｍｌを同じ培地の１６時間後
の培養から出発して、ｏ．Ｄ．580が０．１になる程度
に増幅した。この培養を３７℃で２５０ｒｐｍで７２時
間インキュベーションした後、この細胞を５０００×ｇ
で１０分間遠心分離することでペレット化した。得られ
た細胞不含の上澄液を滅菌濾過し、パントテネート−定
量化のために４℃で貯蔵した。
１、ＭＧ１６５５／ｐＮＤ−Ｄ１、ＭＧ１６５５／ｐＮ
Ｄ−Ｄ２及びＭＧ１６５５／ｐＮＤ−ＤＢＣ１のパント
テネート産生のために、試験培地（培地Ｅ及びカナマイ
シン５０μｇ／ｍｌ）５０ｍｌを同じ培地の１６時間後
の培養から出発して、ｏ．Ｄ．580が０．１になる程度
に増幅した。この培養を３７℃で２５０ｒｐｍで７２時
間インキュベーションした後、この細胞を５０００×ｇ
で１０分間遠心分離することでペレット化した。得られ
た細胞不含の上澄液を滅菌濾過し、パントテネート−定
量化のために４℃で貯蔵した。
【００５１】培養上澄液中のＤ−パントテネートの定量
化は、Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣＣ ８０１４を
用いてDIFCO (DIFCO Manual, 10th Edition, p. 1100-1
102; Michigan, USA)社のハンドブックの記載により行
った。この測定結果を表３に記載した。
化は、Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣＣ ８０１４を
用いてDIFCO (DIFCO Manual, 10th Edition, p. 1100-1
102; Michigan, USA)社のハンドブックの記載により行
った。この測定結果を表３に記載した。
【００５２】
【表３】
【００５３】例５ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多様な株によるパントテネ
ートの形成 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＺ
８−１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ１、ＡＴＣＣ
１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２及びＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２によるパント
テネートの形成は、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを補足
した培地ＣＧＸＩＩ（Keilhauer et al., 1993, Journa
l of Bacteriology, 175:5595-5603;表４）中で試験し
た。この培地を以後Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ−試験培
地とする。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ−試験培地それぞ
れ５０ｍｌを、ｏ．Ｄ．580を有する同じ培地の１６時
間後の培地から接種した。４８時間３０℃で１５０ｒｐ
ｍでインキュベーションした後、この細胞を５０００×
ｇで１０分間の遠心分離で除去し、上澄液を滅菌濾過
し、パントテネート−濃度を例４に記載したと同様に測
定した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多様な株によるパ
ントテネート−産生の結果を表５にまとめた。
ートの形成 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＺ
８−１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ１、ＡＴＣＣ
１３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２及びＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍＡＴＣＣ１３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２によるパント
テネートの形成は、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを補足
した培地ＣＧＸＩＩ（Keilhauer et al., 1993, Journa
l of Bacteriology, 175:5595-5603;表４）中で試験し
た。この培地を以後Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ−試験培
地とする。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ−試験培地それぞ
れ５０ｍｌを、ｏ．Ｄ．580を有する同じ培地の１６時
間後の培地から接種した。４８時間３０℃で１５０ｒｐ
ｍでインキュベーションした後、この細胞を５０００×
ｇで１０分間の遠心分離で除去し、上澄液を滅菌濾過
し、パントテネート−濃度を例４に記載したと同様に測
定した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多様な株によるパ
ントテネート−産生の結果を表５にまとめた。
【００５４】
【表４】
【００５５】
【表５】
【００５６】配列表 （１） 書誌的事項 （ｉ） 出願人 （Ａ）名称：Degussa Aktiengesellschaft （Ｂ）番地：Weissfrauenstr. 9 （Ｃ）都市：Frankfurt am Main （Ｄ）州：Hessen （Ｅ）国：Deutschland （Ｆ）郵便番号：D-60311 （ｉｉ） 発明の名称：複製可能なＤＮＡ、形質転換さ
れた微生物、プラスミドベクター及びＤ−パントテン酸
の製造方法 （ｉｉｉ） 配列の数：５ （ｉｖ） コンピュータ記録方式： （Ａ）記録媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換 （Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release #1.0, Versi
on #1.30 (EPA) （２） 配列番号１に関する情報： （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：５４０塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ （ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし （ｉｖ） アンチセンス：なし （ｖｉ） 起源 （Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum （Ｂ）株名：ATCC13032 （ｉｘ） 配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：７７．．４８４ （Ｄ）他の情報：/codon_start=77 /EC_number=4.1.1.11 /product="Ｌ−アスパルテート−１−デカルボキシラー
ゼ" /gene="ｐａｎＤ" （ｘｉ） 配列番号１：
れた微生物、プラスミドベクター及びＤ−パントテン酸
の製造方法 （ｉｉｉ） 配列の数：５ （ｉｖ） コンピュータ記録方式： （Ａ）記録媒体：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換 （Ｃ）オペレーションシステム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release #1.0, Versi
on #1.30 (EPA) （２） 配列番号１に関する情報： （ｉ） 配列の特徴 （Ａ）長さ：５４０塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ （ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし （ｉｖ） アンチセンス：なし （ｖｉ） 起源 （Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum （Ｂ）株名：ATCC13032 （ｉｘ） 配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：７７．．４８４ （Ｄ）他の情報：/codon_start=77 /EC_number=4.1.1.11 /product="Ｌ−アスパルテート−１−デカルボキシラー
ゼ" /gene="ｐａｎＤ" （ｘｉ） 配列番号１：
【００５７】
【外１】
【００５８】（２） 配列番号２に関する情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ）長さ：１３６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：タンパク質 （ｘｉ） 配列番号２：
【００５９】
【外２】
【００６０】（２） 配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１６４塩基対 （Ｂ）配列の型：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ （ｉｉｉ） ハイポセティカル：なし （ｉｖ） アンチセンス：なし （ｖｉ） 起源 （Ａ）生物名：Corynebacterium glutamicum （Ｂ）株名：ATCC13032 （ｉｘ） 配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：３５１．．１１６３ （Ｄ）他の情報：/codon_start=351 /EC_number=4.1.2.12 /product="ケトパントエートヒドロキシメチルトランス
フェラーゼ" /gene="ｐａｎＢ" （ｉｘ） 配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１１６６．．２００２ （Ｄ）他の情報：/codon_start=1166 /EC_number=6.3.2.1 /product="パントテネートシンテターゼ" /gene="ｐａｎＣ" （ｘｉ） 配列番号３：
フェラーゼ" /gene="ｐａｎＢ" （ｉｘ） 配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１１６６．．２００２ （Ｄ）他の情報：/codon_start=1166 /EC_number=6.3.2.1 /product="パントテネートシンテターゼ" /gene="ｐａｎＣ" （ｘｉ） 配列番号３：
【００６１】
【外３】
【００６２】
【外４】
【００６３】
【外５】
【００６４】
【外６】
【００６５】（２） 配列番号４に関する情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ）長さ：２７１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：タンパク質 （ｘｉ） 配列番号４：
【００６６】
【外７】
【００６７】
【外８】
【００６８】（２） 配列番号５に関する情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ）長さ：２７９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ） 配列の種類：タンパク質 （ｘｉ） 配列番号５：
【００６９】
【外９】
【００７０】
【外１０】
【図１】ｏｒｆ−１〜ｏｒｆ−５を有するＣｏｎｔｉｇ
１３のマップを示す図。
１３のマップを示す図。
【図２】ｐＵＲ１中に含まれるクローニングされたＤＮ
Ａ−フラグメントのマップ及び配列決定されたＤＮＡ−
断片の位置表示を示す図。
Ａ−フラグメントのマップ及び配列決定されたＤＮＡ−
断片の位置表示を示す図。
【図３】プラスミドｐＺ８−１、ｐＮＤ−Ｄ１及びｐＮ
Ｃ−Ｄ２のマップを示す図。
Ｃ−Ｄ２のマップを示す図。
【図４】プラスミドｐＮＤ−ＤＢＣ１及びｐＮＤ−ＤＢ
Ｃ２のマップを示す図。
Ｃ２のマップを示す図。
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ ｒｒｎＢ−遺伝子のトランスクリプ
ション−ターミネータ Ｐｔａｃ ｔａｃプロモータ ｐａｎＢ ｐａｎＢ遺伝子のコード領域 ｐａｎＣ ｐａｎＣ遺伝子のコード領域 ｐａｎＤ ｐａｎＤ遺伝子のコード領域 ｒｅｐ−Ｃ．ｇ． Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の複製
のためのＤＮＡ−領域 ｏｒｉＶ−Ｅ．ｃ． Ｅ．ｃｏｌｉ中の栄養成長のトラ
ンスファー用の起源 ｋａｎ カナマイシン耐性 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 Ｅ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 Ｂ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 ＢｇｌＩＩ 制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位 ＣｌａＩ 制限酵素ＣｌａＩの切断部位 Ｈ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＮｃｏＩ 制限酵素ＮｃｏＩの切断部位 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの切断部位 ＮｓｉＩ 制限酵素ＮｓｉＩの切断部位 Ｐ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＰｖｕＩ 制限酵素ＰｖｕＩの切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｃａＩ 制限酵素ＳｃａＩの切断部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 Ｘ 制限酵素ＸｂａＩの切断部位 ＸｈｏＩ 制限酵素ＸｈｏＩの切断部位
ション−ターミネータ Ｐｔａｃ ｔａｃプロモータ ｐａｎＢ ｐａｎＢ遺伝子のコード領域 ｐａｎＣ ｐａｎＣ遺伝子のコード領域 ｐａｎＤ ｐａｎＤ遺伝子のコード領域 ｒｅｐ−Ｃ．ｇ． Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の複製
のためのＤＮＡ−領域 ｏｒｉＶ−Ｅ．ｃ． Ｅ．ｃｏｌｉ中の栄養成長のトラ
ンスファー用の起源 ｋａｎ カナマイシン耐性 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 Ｅ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 Ｂ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 ＢｇｌＩＩ 制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位 ＣｌａＩ 制限酵素ＣｌａＩの切断部位 Ｈ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＮｃｏＩ 制限酵素ＮｃｏＩの切断部位 ＮｒｕＩ 制限酵素ＮｒｕＩの切断部位 ＮｓｉＩ 制限酵素ＮｓｉＩの切断部位 Ｐ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩの切断部位 ＰｖｕＩ 制限酵素ＰｖｕＩの切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｃａＩ 制限酵素ＳｃａＩの切断部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 Ｘ 制限酵素ＸｂａＩの切断部位 ＸｈｏＩ 制限酵素ＸｈｏＩの切断部位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:185） (72)発明者 イェルン カリノヴスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２
Claims (24)
- 【請求項１】 アスパルテート−１−デカルボキシラー
ゼをコードするヌクレオチド配列を含む、コリネバクテ
リウム属及びエシェリキア属の微生物中で複製可能な、
場合により組み換えられたＤＮＡ。 - 【請求項２】 図１中に前記ヌクレオチドの配列位置が
示されており、前記ヌクレオチド配列がコリネバクテリ
ウム由来のｐａｎＤをコードする、請求項１記載の複製
可能なＤＮＡ。 - 【請求項３】 （ｉ） 配列番号１で示された、ｐａｎ
Ｄをコードするヌクレオチド配列、又は（ｉｉ） 遺伝
子コードの同義性の範囲内で配列（ｉ）に相当する配
列、又は（ｉｉｉ） 配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対する
相補的配列とハイブリダイズする配列、及び場合により
（ｉｉｉｉ） （ｉ）において機能的に中立なセンス突
然変異を有する、請求項２記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１から３までのいずれか１項記載
の複製可能なＤＮＡを導入することにより形質転換され
た微生物。 - 【請求項５】 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣ １３０３２／ｐＮＤ−Ｄ２として、ＤＳＭ１２４
３８の名称で寄託された、図２に記載された制限マップ
を特徴とするプラスミドベクターｐＮＤ−Ｄ２。 - 【請求項６】 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣ １３０３２／ｐＮＤ−ＤＢＣ２として、ＤＳＭ１
２４３７の名称で寄託された、図４に記載された制限マ
ップを特徴とするプラスミドベクターｐＮＤ−ＤＢＣ
２。 - 【請求項７】 ｐａｎＤ−遺伝子を微生物中で強化し
（過剰発現させ）、この微生物を発酵のために使用す
る、Ｄ−パントテン酸の製造方法。 - 【請求項８】 強化の達成のために、遺伝子もしくはヌ
クレオチド配列のコピー数を、この遺伝子もしくはヌク
レオチド配列を有するプラスミドベクターを用いた微生
物の形質転換又は染色体増幅により高める、請求項７記
載の方法。 - 【請求項９】 過剰発現の達成のために、構造遺伝子の
上流に存在するプロモータ部位及びレギュレーション部
位を突然変異させる、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 過剰発現の達成のために、構造遺伝子
の上流に発現カセットを組み込む、請求項７記載の方
法。 - 【請求項１１】 微生物中でのｐａｎＤ−遺伝子の発現
を、相応するｍ−ＲＮＡの寿命を延長する及び／又は該
当する酵素タンパク質の分解を阻害することにより改善
する、請求項７記載の方法。 - 【請求項１２】 ｐａｎＤ−遺伝子を、代謝物質−もし
くは代謝拮抗物質−耐性突然変異を有する微生物中で過
剰発現させる、請求項８から１１までのいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項１３】 過剰発現を達成するために、微生物を
変更した培養基中で発酵させる及び／又は発酵操作を変
更する、請求項８から１２までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１４】 パントテネート−（パントテン酸）−
形成を低下させる物質代謝経路が少なくとも部分的に遮
断されている微生物を使用する、請求項８から１３まで
のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 微生物を使用し、その微生物中でｐａ
ｎＤ−遺伝子に対して付加的に、パントテン酸形成の物
質代謝経路の他の遺伝子を個々に又は一緒に強化する
（過剰発現させる）、請求項８から１４までのいずれか
１項記載の方法。 - 【請求項１６】 微生物を使用し、その微生物中で、ｐ
ａｎＤ−遺伝子に対して付加的に、酵素のケトパントエ
ート−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ
４．１．２．１２）、及びパントテネート−シンテター
ゼ（ＥＣ ６．３．２．１）をコードする１以上の遺伝
子を強化する（過剰発現させる）、請求項１５記載の方
法。 - 【請求項１７】 前記の遺伝子を個々に含有する多様な
適合性のプラスミドベクターを用いて形質転換した微生
物を使用する、請求項１５又は１６記載の方法。 - 【請求項１８】 プラスミドベクターを用いて形質転換
した株を使用し、前記プラスミドベクターはｐａｎＤ−
遺伝子を含めた前記の遺伝子の１種以上を有し、前記ベ
クター中で前記遺伝子は連続して配置されておりかつ共
通のプロモータの制御下にあるか、又は相互に別々に配
置されており、異なるプロモータの制御下にある、請求
項１５又は１６記載の方法。 - 【請求項１９】 プラスミドベクターｐＮＤ−Ｄ２で形
質転換した微生物を使用する、請求項１７記載の方法。 - 【請求項２０】 プラスミドベクターｐＮＤ−ＤＢＣ２
で形質転換した微生物を使用する、請求項１７記載の方
法。 - 【請求項２１】 次の工程： ａ） 少なくともｐａｎＤ−遺伝子を強化する（過剰発
現させる）、請求項１から２０までのいずれか１項記載
の微生物の発酵、 ｂ） パントテン酸を培地中で又は微生物の細胞中で富
化させ、及び ｃ） パントテン酸を単離する、 を実施することを特徴とするパントテン酸の製造方法。 - 【請求項２２】 過剰発現した遺伝子がコリネバクテリ
ウム属の微生物から由来する、請求項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 工程ａ）において、アスパルテート、
β−アラニン、ケトイソバレレート、ケトパントエート
又はパントエートのグループから選択されるパントテン
酸の前駆体を添加する、請求項２１又は２２記載の方
法。 - 【請求項２４】 エシェリキア属又はコリネバクテリウ
ム属の微生物を使用する、請求項７から２３までのいず
れか１項記載の方法。
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