KR20000047829A - 미생물에서 ｐａｎＤ 유전자를 증폭시켜 Ｄ-판토텐산을제조하는 발효 방법 - Google Patents

미생물에서 ｐａｎＤ 유전자를 증폭시켜 Ｄ-판토텐산을제조하는 발효 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 panD 유전자가 임의로 panB 및/또는 panC 유전자와 함께 증폭(과발현)되는 미생물을 발효시키고, 배지중 또는 상기 미생물 세포중에서 판토텐산을 농축시킴으로써 D-판토텐산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

미생물에서 ｐａｎＤ 유전자를 증폭시켜 Ｄ-판토텐산을 제조하는 발효 방법{Fermentation process for the preparation of D-pantothenic acid by amplifying the panD gene in microorganisms}
판토텐산은 화장품, 의약, 사람의 영양 및 동물 영양에 사용되는 상업적으로 중요한 비타민이다.
판토텐산은 화학적 합성에 의해 또는 적합한 영양액중에서 적합한 미생물을 발효시킴으로써 생물공학적으로 제조할 수 있다. 화학적 합성에서는 DL-판토락톤이 중요한 중간체이다. 포름알데히드, 이소부틸알데히드 및 시아나이드로부터 다단계 공정으로 제조한다. 추가의 공정 단계로서는 라세믹 혼합물을 용해시키고 D-판토락톤을 β-알라닌과 축합시켜 D-판토텐산을 수득한다.
미생물 발효에 의한 제조 잇점은 L-판토텐산이 없는 목적하는 입체이성체 D형의 직접적인 형성이다.
EP-A 0 493 060에 제시된 바와 같이, 여러가지 세균종, 예를들면, 에스케리키아 콜라이, 아트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens), 코리네박테리움 에리트로게네스(Corynebacterium erythrogenes) 및 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 뿐만 아니라 효모, 예를들면, 데바로마이세스 카스텔리(Debaromyces castellii)가 글루코오스, DL-판토산 및 β-알라닌을 함유하는 영양액중에서 D-판토텐산을 생산할 수 있다. EP-A 0 493 060호는 또한, 에스케리키아 콜라이의 경우, 플라스미드 pFV3 및 pFV5에 함유된 이. 콜라이로부터의 판토텐산 생합성 유전자를 글루코오스, DL-판토산 및 β-알라닌을 함유하는 영양액중에서 증폭시킴으로써 D-판토텐산의 형성이 향상됨을 나타낸다.
EP-A 0 590 857호 및 US 5,518,906호에는 에스케리키아 콜라이 균주 IFO3547로부터 유래된 돌연변이체, 예를들면, 여러가지 항대사물질 유사 살리실산, α-케토부티르산, β-하이드록시아스파르트산, O-메틸트레오닌 및 α-케토이소발레르산에 대한 내성을 포함하며, 글루코오스를 함유하는 영양액중에서 판토산을 생산하고 글루코오스와 β-알라닌을 함유하는 영양액중에서는 D-판토텐산을 생산하는 FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 및 FV5069가 기재되어 있다. EPA 0 590 857호 및 US 5,518,906호는 또한, 플라스미드 pFV31중에 함유되어 있는 판토텐산 생합성 유전자 증폭후, 상기-언급한 균주에서, D-판토산의 생산이 글루코오스를 함유하는 영양액중에서 향상되며 D-판토텐산의 생산이 글루코오스와 β-알라닌을 함유하는 영양액중에서 향상된다는 것을 제시한다.
또한, WO 97/10340호에는, 판토텐산을 형성하는 에스케리키아 콜라이 균주에서, 판토텐산 생산이 발린 생합성 효소인 아세토하이드록시카복실산 신타제 II의 활성을 증가시킴으로써 추가로 증가될 수 있는 것으로 나타나 있다.
본 발명의 목적은 판토텐산을 제조하기 위한 개선된 발효 방법에 대한 신규한 원리를 제공하는 것이다.
도 1은 orf-1 내지 orf-5를 갖는 Contig13의 맵이다.
도 2는 pUR1중에 함유된 클론된 DNA 단편의 맵과 서열화된 DNA 절편의 위치이다.
도 3은 플라스미드 pZ8-1, pND-D1 및 pND-D2의 맵이다.
도 4는 플라스미드 pND-DBC1 및 pND-DBC2의 맵이다.
도에서 사용되는 약자는 다음과 같이 정의된다:
rrnBT1T2: rrnB 유전자의 전사 터미네이터
Ptac: tac 프로모터
panB: panB 유전자의 암호화 영역
panC: panC 유전자의 암호화 영역
panD: panD 유전자의 암호화 영역
rep-C.g.: 씨. 글루타미쿰에서 DNA 복제 영역
oriV-E.c.: 이. 콜라이로의 무성적 전달 기원
kan: 카나마이신 내성 유전자
EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위
E: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위
BamHI: 제한 효소 BamHI의 절단 부위
B: 제한 효소 BamHI의 절단 부위
BglII: 제한 효소 BglII의 절단 부위
ClaI: 제한 효소 ClaI의 절단 부위
H: 제한 효소 HindIII의 절단 부위
NcoI: 제한 효소 NcoI의 절단 부위
NruI: 제한 효소 NruI의 절단 부위
NsiI: 제한 효소 NsiI의 절단 부위
P: 제한 효소 PstI의 절단 부위
PstI: 제한 효소 PstI의 절단 부위
PvuI: 제한 효소 PvuI의 절단 부위
SacI: 제한 효소 SacI의 절단 부위
SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위
ScaI: 제한 효소 ScaI의 절단 부위
SphI: 제한 효소 SphI의 절단 부위
X: 제한 효소 XbaI의 절단 부위
XhoI: 제한 효소 XhoI의 절단 부위
비타민 판토텐산은 화장품, 의약, 사람의 영양 및 동물 영양에서 사용되는 상업적으로 중요한 생성물이다. 따라서, 판토텐산을 제조하는 신규한 방법을 제공하는 것이 일반적인 관심사항이다.
D-판토텐산, 판토텐산 및 판토테네이트가 다음 본문에서 언급되는 경우, 이들은 유리산 뿐만 아니라 D-판토텐산 염, 예를들면, 칼슘, 나트륨, 암모늄 또는 칼륨염을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 특히 이미 D-판토텐산을 생산하며 L-아스파테이트-1-데카복실라제(E.C. 4.1.1.11)를 암호화하는 panD 유전자가 개별적으로 또는 panB 및/또는 panC 유전자와 함께 증폭, 특히 과발현되는 미생물을 이용하여 D-판토텐산을 제조하는 발효 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 특허청구범위에 기재된 바와 같은 상응하는 재조합 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특허청구의 범위 제8항 내지 17항에 따라서 제조된 개선된 D-판토텐산-생산 미생물을 사용하여 수행되는 D-판토텐산의 제조를 위한 발효 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "증폭"은 예를들어 강력한 프로모터를 사용하거나 활성이 높은 적절한 효소를 암호화하는 유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 함께 사용하여 유전자(들)의 카피수를 증가시킴으로써, 적합한 DNA에 의해 암호화되는 효소 1종 이상의 세포내 활성을 미생물에서 증가시키는 것을 기술하는 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 미생물은 글로코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 또는 셀룰로오스로부터 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 판토텐산을 생산할 수 있다. 상기 미생물은 진균류, 효모, 그램-양성균(예: 코리네박테리움속의 세균), 또는 그램-음성균(예: 엔테로박테리아세애족의 세균)일 수 있다. 에스케리키아 콜라이종이 포함되는 에스케리키아속은 특히 엔테로박테리아세애족에서 언급될 수 있다. 에스케리키아 콜라이종내에서, 소위 K-12 균주, 예를들면, 균주 MG1655 또는 W3110(Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology(ASM Press, Washington DC)), 또는 에스케리키아 콜라이 야생형 균주 IFO3547(Institute of Fermentation, Osaka, Japan), 및 이들로부터 유래된 돌연변이주가 언급될 수 있다. 코리네박테리움속에서는 코리네박테리움 글루타미쿰종이 특히 언급될 수 있으며, 당해 분야의 숙련가들에게는 이의 아미노산 생산 능력이 공지되어 있다. 상기 종은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965와 같은 야생형 균주 및 이들로부터 유래된 돌연변이주가 포함된다.
본 발명자들은 미생물에 의한 판토텐산의 생산이 L-아스파테이트-1-데카복실라제(E.C. 4.1.1.11)를 암호화하는 신규한 panD 유전자, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 유전자의 과발현후 증가됨을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 panD 유전자의 과발현이 케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제 및 판토테네이트 신테타제를 암호화하는 panB 및 panC 유전자가 개별적으로 또는 함께 추가로 과발현되는 균주에서 유리한 효과를 가짐을 발견하였다.
과발현은 적합한 유전자들의 카피수를 증가시키거나 구조 유전자로부터의 상부에 위치하는 프로모터와 조절 영역을 돌연변이시킴으로써 수행될 수 있다. 구조 유전자로부터의 상부에 혼입된 발현 카세트는 동일한 방법으로 작업한다. 유발성 프로모터는 추가로 발효에 의한 D-판토테네이트의 형성 과정에서 발현을 증가시킬 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키기 위한 수단은 또한 발현을 증가시킨다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성이 향상된다. 상기 유전자 또는 유전자 작제물은 가변성 카피수의 플라스미드에 위치할 수 있거나 염색체에 통합되어 증폭될 수 있다. 별법으로, 배지의 조성과 배양 기술을 변형시킴으로써 당해 유전자의 과발현을 성취할 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은 관련있는 내용을 발견할 수 있는데 특히 다음과 같은 문헌을 언급할 수 있다: Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), EP 0 472 869, US 4,601,893, Schwarzer and Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), 특허원 WO 96/14246, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) 또는 handbook "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981). 당해 분야의 숙련가들은 또한 다음 문헌을 발견할 것이다: Chang and Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), Hartley and Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), Amann and Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), PCT/US97/13359, Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), Quandt and Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), Hamilton(Journal of Bacteriology 171:4617-4622(1989)), Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) 및 유전한 및 분자생물학에 대해 숙지된 교재.
panD 유전자 또는 다른 유전자, 예를들어 panB 및 panC 유전자를 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)으로부터 분리하는데 있어서 제1 단계는 이. 콜라이에서 상기 미생물의 유전자 라이브러리를 작제하는 것이다. 유전자 라이브러리의 작제는 일반적으로 숙지되어 있는 교재 및 핸드북에 문서화되어 있다. 언급할 수 있는 교재의 예로는 다음과 같은 것들이 있다: the textbook by Winnacker entitled From Genes to Clones, Introduction to Gene Technology (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) 또는 the handbook by Sambrook et al. entitled Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 숙지된 유전자 라이브러리는 코하라 등에 의해 λ벡터에서 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110(Kohara et al; Cell 50, 495-508 (1987))의 것이다. 문헌(참조: Bathe et al.; Molecular and General Genetics 252:255-265 (1996))에는 이. 콜라이 K-12 균주 NM554(Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575)에서 코스미드 벡터 SuperCos I(Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164)을 사용하여 작제된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리가 기재되어 있다. 이. 콜라이중 씨. 글루타미쿰의 유전자 라이브러리를 또한 플라스미드 유사 pBR322(Bolivar, Life Sciences 25, 807-818 (1979)) 또는 pUC9(Viera et al., 1982, Gene, 19:259-268)를 사용하여 작제할 수 있다. 제한- 및 재조합-결함 이. 콜라이 균주가 특히 적합한 숙주로서, 이의 예로는 문헌(Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, (1990) 4645-4649)에 기재된 균주 DH5αmcr이 있다.
이어서, 유전자 라이브러리를 형질전환(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580 (1983)) 또는 전기천공(Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347)에 의해 지시 균주로 옮긴다. 지시 균주의 특징은 검출가능한 표현형, 예를들어 영양요구성을 일으키는 당해 유전자에서 돌연변이를 갖는 것이다. panD 유전자에서 돌연변이를 포함하는, 이. 콜라이 돌연변이체 DV9(Vallari and Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164: 136-142)가 본 발명의 작업내에서 특히 관심있는 것이다. 판토텐산을 필요로 하는 이. 콜라이 돌연변이주의 다른 예는 panB 유전자에서 돌연변이를 포함하고 다음 기관(Genetic Stock Center of Yale University; New Haven, Connecticut, USA)으로부터 입수가능한 균주 SJ2이다. 지시 균주, 예를들어 panD 돌연변이체 DV9를 당해 유전자, 예를들어 panD 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환시켜 당해 유전자를 발현시킨후, 지시 균주는 적절한 특성, 예를들어 판토텐산 요구성에 대해 야생영양성으로 된다. 이 방법으로 분리된 유전자 또는 DNA 단편은, 예를들어 문헌[참조: Sanger et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74: 5463-5467 (1977)]에 기재된 바와 같이, 서열을 결정함으로써 특성화시킬 수 있다. 데이타 뱅크, 예를들면, Gene Bank(Benson et al. (sic), 1998, Nucleic Acids Research, 26: 1-7)에 포함된 공지된 유전자에 대한 동일성 정도는 공개된 방법(Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410)으로 분석할 수 있다.
panD 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰으로부터의 신규한 DNA 서열을 이 방법으로 수득한다; 서열 1로서, 이는 본 발명의 일부를 형성한다. 상기 상응하는 효소의 아미노산 서열은 또한 상기한 방법에 의해 상기 DNA 서열로부터 유도된다. 생성된 panD 유전자 생성물, 즉 L-아스파테이트-1-데카복실라제의 아미노산 서열을 서열 2에 나타낸다. panB 및 panC 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미쿰으로부터의 신규한 DNA 서열을 또한 이 방법으로 수득한다; 서열 3으로서, 이는 본 발명의 일부를 형성한다. panB 유전자 생성물, 즉 케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열 4에 나타내며, panC 유전자 생성물, 즉 판토테네이트 신테타제의 아미노산 서열은 서열 5에 나타낸다.
유전자 코드의 축퇴로 인하여 서열 1 및/또는 서열 3으로부터 발생되는 암호화 DNA 서열은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 유사하게, 서열 1 및/또는 서열 3과 하이브리드화되는 DNA 서열이 본 발명의 일부를 형성한다. 또한, 보존적 아미노산 교환, 예를들어 단백질에서 글리신의 알라닌으로의 교환 또는 아스파트산의 글루탐산으로의 교환은 단백질의 활성에 있어서 근본적인 변화를 일으키지 않는, 즉 중성인 센스 돌연변이로 당해 분야의 숙련가들에게 알려져 있다. 또한 단백질의 N 및/또는 C 말단에서의 변화는 실질적으로 이의 기능을 손상시키지 않거나 심지어 이를 안정화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 당해 분야의 숙련가들은 이런 주제에 대한 정보를 다음 문헌에서 발견할 수 있다: Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)); O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) 및 유전학 및 분자생물학에 대한 교재. 서열 2, 서열 4 및/또는 서열 5로부터 상응하게 발생되는 아미노산 서열은 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
이어서, 이 방법으로 특성화된 유전자를 적합한 미생물에서 개별적으로 또는 다른 유전자와 함께 발현시킬 수 있다. 유전자의 공지된 발현 또는 과발현 방법은 발현 시그날이 추가로 제공될 수 있는 플라스미드 벡터를 사용하여 이들을 증폭시키는 데 있다. 가능한 플라스미드 벡터는 적절한 미생물에서 복제할 수 있는 것들이다. 본 발명에 대해 가능한 벡터의 예로는 에스케리키아 콜라이의 경우 pSC101(Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80(21), 6557-6561 (1983)) 또는 pKK223-3(Brosius and Holy, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81, 6929 (1984)) 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 pEKEx1(Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) 또는 pZ8-1(EP 0 375 889)가 있다. 이러한 미생물의 예는 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC 13032/pND-D2 및 ATCC 13032/pND-DBC2 및 이.콜라이 균주 MG1655/pND-D2로서, 이들은 플라스미드 pND-D2 및 pND-DBC2를 함유한다. 플라스미드 pND-D2는 씨. 글루타미쿰으로부터의 panD 유전자를 포함하고 플라스미드 pZ8-1을 기본으로 하는 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터이다. 플라스미드 pND-DBC2는 씨. 글루타미쿰으로부터의 panD, panB 및 panC 유전자를 포함하고 플라스미드 pZ8-1을 기본으로 하는 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터이다.
대사물질 및 항대사물질에 대한 내성을 부여하거나 판토텐산 전구체가 유출되는 것을 방지하는 염색체 돌연변이를 본 발명에 의해 제공되는 방법과 조합하는 것이 유리할 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 자명하다.
본 발명에 따라서 제조된 미생물은 판토텐산 생산을 위하여 연속적으로 또는 불연속적으로 배치식 공정, 공급 배치식 공정 또는 반복되는 공급 배치식 공정에 의해 배양할 수 있다. 공지된 배양법의 요약 내용이 다음 문헌에 의해 제공된다: Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioengineering) (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 또는 Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment) (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).
사용할 배양 배지는 특정 미생물의 요구조건을 적합하게 만족시켜야 한다. 여러가지 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 다음 문헌에서 알 수 있다: handbook "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology(Washington DC, USA, 1981). 사용될 수 있는 탄소 공급원은 당 및 탄수화물, 예를들어 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스, 유지 및 지방, 예를들어 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유, 지방산, 예를들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알코올, 예를들어 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예를들어 아세트산이다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소 공급원은 유기 질소-함유 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두박분및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨염이다. 배양 배지는 또한 금속염, 예를들어 성장에 필수적인 황산마그네슘 또는 황산철을 함유하여야 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질외에 사용할 수 있다. 아스파테이트, β-알라닌, 케토이소발레레이트, 케토판토산 또는 판토산과 같은 판토텐산 전구체, 및 임의로 이의 염을 상기 배양 배지에 가하여 판토텐산 생산량을 증가시킬 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나 배양중 적절하게 공급할 수 있다.
배양물의 pH는 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 적절히 사용하여 조정한다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 거포제를 사용하여 조정할 수 있다. 플라스미드의 안정성은 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를들어 항생제를 배지에 가하여 유지할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를들어 공기를 배양물중으로 도입시켜 호기성 상태를 유지시킨다. 배양물의 온도는 통상적으로 20 내지 50 ℃, 바람직하게는 25 내지 45 ℃이다. 판토텐산의 형성이 최대에 도달할 때까지 배양을 계속한다. 이는 통상적으로 10 내지 160시간내에 성취된다.
또한, 효소 L-아스파테이트-1-데카복실라제의 활성이 높은 균주를 사용하여 L-아스파테이트로부터 β-알라닌을 제조할 수 있다. 이를 위하여 발효 공정, 효소 전환 반응 또는 상기 두가지 방법을 함께 사용할 수 있다.
형성된 판토텐산의 농도는 공지된 방법(Velisek, Chromatographic Science 60, 515-560 (1992))으로 측정할 수 있다.
다음 미생물은 부다페스트 조약하에서 다음 수탁기관에 기탁되었다: Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ), Brunswick, Germany).
DSM12438로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pND-D2,
DSM12437로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pND-DBC2.
실시예
본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세하게 설명된다.
실시예 1
씨. 글루타미쿰으로부터 panD 유전자의 클로닝 및 서열화
1. panD 유전자의 클로닝
씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 염색체 DNA를 문헌(Tauch et al.; 1995, Plasmid, 33: 168-179)에 기재된 바와 같이 분리하여 제한 효소 Sau3A(Pharmacia Biotech(Freiburg, Germany), product description Sau3A, code no. 27-0913-02)로 부분적으로 분해한다. 크기 범위가 7 내지 9kb인 DNA 단편은 Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids(Macherey and Nagel, Duren, Germany; cat. no. 740584)를 사용하여 분리하고, MBI Fermentas(Vilnius, Lithuania)로부터 수득한 벡터 pUC19(Norrander et al., 1982, Gene, 26: 101-106)의 탈포스포릴화 BamHI 절단 부위에 결합시킨다. 결합은 문헌(Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)에 기재된 바와 같이 수행하고, DNA 혼합물은 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 배양시킨다. 상기 결합 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αmcr(Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87:4645-4649)로 전기천공(Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347)에 의해 옮기고, LB 아가(Lennox, 1955, Viology, 1: 190) + 100㎍/㎖의 암피실린상에 플레이팅시킨다. 37 ℃에서 24시간 배양후, 씨. 글루타미쿰 유전자 라이브러리는 비른보임과 돌리의 알칼린 용해법(Birnboim and Doly; Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523 (1997))에 의해 플라스미드 DNA를 재-단리시켜 상기 형질전환체로부터 수득할 수 있다. 상기 유전자 라이브러리를 전기천공에 의해 panD 유전자에서 돌연변이를 포함하는 이. 콜라이 균주 DV9(Vallari and Rock, 1985, Journal of Bacteriology, 164: 136-142)의 감응성 세포로 옮긴다. 재생기(Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347) 이후, 전기천공 혼합물을 배지 E(Vogel and Bonner, 1956, Journal of Biological Chemistry, 218: 97-106)로 2회 세척한다. 배지 E의 조성은 표 1에 나타내었다. 250㎖ 원뿔형 플라스크중 배지 E 50㎖ + 100㎍/㎖의 암피실린을 이들 세포에 접종하고 공기 진탕기중 250rpm 및 39 ℃에서 배양시킨다. 2일간 배양후, 세균 현탁액을 희석시키고 100 ㎍/㎖의 암피실린이 보충된 LB 아가(Lennox, 1955, Virology, 1: 190)상에 스트리킹시킨다.
물질 리터당 양 설명
K2HPO4 10 g
NaNH4HPO4*4H2O 3.5 g
시트르산 2 g
MgSO4*7H2O 0.2 g
글루코오스 4 g 별도로 멸균화
티아민 0.2 ㎍ 멸균 조건하에서 여과
NIC-1.3으로 명명된, DV9 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분리하여 아가로스 겔 전기영동법(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 공지된 길이의 표준 DNA 단편과의 비교로 특성화시킨다. 플라스미드 pNIC-1.3은 7 kbp 삽입물을 함유한다. panD 돌연변이체 DV9의 새로운 형질전환에 의해 pNIC-1.3의 상보성을 검사한다. 수득한 형질전환체도 상기한 조건하에서 β-알라닌-유리 배지 E중에서 성장할 수 있다.
플라스미드 pNIC-1.3을 제한 효소 BamHI(Pharmacia Biotech (Freiburg, Germany), 제품 설명 BamHI, code no. 27-0868-03), EcoRI (Pharmacia Biotech(Freiburg, Germany), 제품 설명 EcoRI, code no. 27-0884-03) 및 BglII(Pharmacia Biotech (Freiburg, Germany), 제품 설명 BglII, code no. 27-0946-02)로 절단한 다음, 적절한 제한 효소(Schafer, 1994, Gene, 145: 69-73)로 분해시킨 벡터 pK18mob에 결합시켜 7kb 삽입물을 서브클로닝시킨다. 상기 수득한 결합 혼합물을 전기천공에 의해 이. 콜라이 panD 돌연변이체 DV9으로 옮기고; 상보성 형질전환체에 대해 상기한 바와 같이 선별하는데, 이 경우 아가 플레이트는 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유한다. 상보성 단일 클론의 플라스미드를 분리하여 제한 분석법으로 특성화한다. 이후 pNIC-10으로 명명되는, 대략 3kb의 DNA 삽입물을 갖는 EcoRI 서브클론을 이후의 서열 분석용으로 선택한다.
2. panD 유전자의 서열화
이본쇄 서열화의 경우, pNIC-10의 3kb 단편을 여러가지 제한 효소로 절단하고 그 단편을 플라스미드 pUC19 또는 pK18mob중으로 서브클로닝시킨다. 서열화용으로 사용되는 플라스미드 DNA를 QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen, Inc., Chatsworth, Ca., USA)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라서 분리시키고 플라스미드 크기를 아가로스 겔 전기영동법으로 측정한다. 짐머만 등(Zimmermann et al.; Nucleic Acids Research, 18:1067 (1990))에 의해 변형된 생거 등의 디데옥시 쇄 종결법(Sanger et al.; Proceedings of the National Academies (sic) of Sciences USA, 74:5463-5467 (1977))으로 서열화를 수행한다. Pharmacia로부터의 Cy5 자동판독 서열화 키트(제품 번호: 27-2690-02, Freiburg, Germany)를 사용한다. 겔 전기영동적 분리 및 서열화 반응 분석을 Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden)으로부터의 자동 레이져 형광(A.L.F.) 표시 DNA 서열분석기로 Long Ranger Gel Solution 폴리아크릴아미드 겔(FMC BioProducts, Rockland, Me., USA)중에서 수행한다. 수득한 미완의 서열 데이타를 Staden 소프트웨어 팩키지의 버젼 97-0(Nucleic Acids Research, 14:217-231 (1986))을 사용하여 프로세싱한다. pNIC-10 서브클론의 각 서열을 모두 Contig13으로 명명된, 응집성 3060bp contig중으로 조립한다. 컴퓨터-도움을 받아 전체 DNA 단편의 암호화 영역을 XNIP 소프트웨어(Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231)로 분석하여 5개의 개방 판독 프레임(ORFs)을 확인하였다.
도 1은 Contig13의 제한 맵과 orf-1 내지 orf-5로 표시한 ORFs의 위치를 나타낸다. National Library of Medicine(Bethesda, MD, USA)의 NCBI 서버의 온라인 서비스를 통하여 입수가능한 BLAST 서치 프로그램(Gish and States, 1993, Nature of Genetics, 3: 266-272; Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215:403-410)으로 상동성 분석을 수행한다. Contig13의 분석은 orf-3이 panD 유전자임을 나타낸다. orf-3을 이후 panD로 명명한다. panD 유전자를 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 서열 1로 나타낸다. 상기 공정으로부터 생성된 panD 유전자 생성물, 즉 L-아스파테이트-1-데카복실라제의 아미노산 서열을 서열 2로 나타낸다.
실시예 2
씨.글루타미쿰으로부터 panB 및 panC 유전자의 클로닝 및 서열화
1. panB 및 panC 유전자의 클로닝
씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터 염색체 DNA를 문헌(Schwarzer and Puhler; Bio/Technology 9, (1990) 84-87)에 기재된 바와 같이 분리하여 제한 엔도뉴클레아제 Sau3A으로 절단한다. 겔 전기영동 분리후, 크기 범위가 3 내지 7kb 또는 9 내지 20kb인 DNA 단편을 추출한 다음 벡터 pBR322의 단일 BamHI 절단 부위에 결합시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr(Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (상기) 87, (1990) 4645-4649)을 상기 결합 혼합물로 형질전환시킨다(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, (1983) 557-580). 삽입물-포함 콜로니는 10㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 LB 아가 플레이트상에 접종시킨후 이들의 테트라사이클린 감응성으로 확인한다. 삽입물 크기가 9 내지 20kb인 400개의 플라스미드를 각각 함유하는 8개 그룹, 및 삽입물 크기가 3 내지 7kb인 500개의 플라스미드를 각각 함유하는 9개 그룹을 푸울한 클론으로부터 플라스미드 제조 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)으로 분리시킨다. 이. 콜라이 panB 돌연변이주 SJ2(Cronan et al., 1982, Journal of Bacteriology 149: 916-922)를 상기 유전자 라이브러리로 전기천공(Wehrmann et al., 1994, Microbiology 140:3349-3356)을 이용하여 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물을 아가 15g/ℓ를 함유하는 CGXII 배지(Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175:5595-5603)상에 직접 플레이팅시킨다. 판토테네이트의 보충(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) 없이도 성장할 수 있는 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리시킨다. 상기 이. 콜라이 돌연변이주 SJ2의 panB 결함을 이종적으로 상보시킬 수 있는 능력은 재형질전환에 의해 8개의 플라스미드의 경우에서 확인할 수 있다.
이들 8개의 플라스미드를 제한 맵화에 사용한다. 이후 pUR1으로 명명되는, 연구된 플라스미드 벡터중 하나는 9.3kb 삽입물을 함유하였다(도 2). 이. 콜라이 panC 돌연변이주 DV39(Vallari and Rock 1985, Journal of Bacteriology 164:136-142)의 형질전환으로 벡터 pUR1이 또한 상기 돌연변이주의 panC 결함을 상보시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
2. panB 및 panC 유전자의 서열화
pUR1의 삽입물의 2.2kb 단편(도 2)을 생거의 디데옥시 쇄 종결법(Sanger et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA(1977) 74:5463-5467)으로 서열화한다. 이들 수행하기 위하여, 먼저 엑소뉴클레아제 III를 사용하여 서브클론을 생산하고 이들을 표준 프라이머(Boehringer Mannheim, Germany로부터의 범용 및 역 프라이머)를 사용하여 서열화한다. 서열화 혼합물의 겔 전기영동적 분석은 Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden)으로부터의 자동 레이져 형광(A.L.F.) 서열분석기로 수행한다. 수득한 뉴클레오티드 서열은 HUSAR 소프트웨어 팩키지(Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB)로 분석한다. 상기 뉴클레오티드 서열을 서열 3으로 나타낸다. 상기 분석으로 2개의 개방 판독 프레임이 확인되었다. panB 유전자로 확인된, 813bp의 개방 판독 프레임은 아미노산 271개의 폴리펩타이드를 암호화하며 서열 4로 나타낸다. panC 유전자로 확인된, 제2의 개방 판독 프레임은 837개의 염기쌍을 포함한다. 이는 아미노산 279개의 폴리펩타이드를 암호화하며, 서열 5로 나타낸다.
실시예 3
panD, panBC 및 panDBC의 발현을 위한 벡터의 작제
씨. 글루타미쿰 및 이.콜라이로부터의 판토테네이트 생합성 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시킨다. PCR 실험은 Gibco-BRL(Eggestein, Germany)로부터의 Taq DNA 폴리머라제로 PCR-100 Thermocycler(MJ Research Inc., Watertown, Mass., USA)중에서 수행한다. 94 ℃에서 2분간의 단독 변성 단계에 이어서 94 ℃에서 90초간의 변성 단계, T = (2AT + 4GC) - 5 ℃의 프라이머-의존성 온도(Suggs et al., 1981, pp. 683-693, in: D.D. Brown and C.F. Fox (Eds.), Developmental biology using purified genes. Academic Press, New York, USA)에서 90초간의 어닐링 단계 및 72 ℃에서 90초간의 신장 단계를 수행한다. 최종 3단계는 사이클에서 35회 반복하고, 반응은 72 ℃에서 10분간의 최종 신장 단계로 종결된다. 이들을 아가로스 겔 전기영동법으로 검사한 후, 이 방법으로 증폭된 생성물을 벡터 pCRR2.1(Original TA Cloning Kit, Invitrogen (Leek, The Netherlands), 제품 설명 Original TA CloningRKit, cat. no. KNM2030-01)에 제조업자의 지침에 따라서 결합시킨 다음 이. 콜라이 균주 TOP10F'로 형질전환시킨다. 100㎍/㎖의 암피실린과 40㎍/㎖의 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 24시간 동안 37 ℃에서 배양시켜 형질전환체를 선택한다.
씨. 글루타미쿰 ATCC13032 및 이. 콜라이 K12(W.K. Merkel and B.P. Nichols, 1993, Gene Bank: L17086)으로부터의 panD(서열 1) 및 panBC(서열 3) 판토테네이트 생합성 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 PCR 프라이머를 합성한다(MWG Biotech, Ebersberg, Germany). 이들 프라이머는 증폭시킨 단편이 상기 유전자와 이들의 천연 리보솜 결합 부위를 함유하지만, 가능한 프로모터 영역은 함유하지 않도록 선택한다. 또한, 적합한 제한 절단 부위를 삽입하여 표적 벡터중으로 클로닝할 수 있도록 한다. PCR 프라이머의 서열, 삽입된 절단 부위(밑줄친 서열) 및 증폭된 유전자(단편 bp 크기는 괄호안에 제시되었슴)를 하기 표 2에 수록하였다.
프라이머 제한 절단 부위를 갖는 서열 생성물 플라스미드
panD-Ec1 5'-GAATTCGACAGGGTAGAAAGGTAGA-3'(EcoRI) panDE.C.(462bp) pND-D1
panD-Ec2 5'-AGATCTGGGATAACAATCAAGCAACC-3'(BglII)
panD-Cg1 5'-CATCTCACGCTATGAATTCT-3'(EcoRI) panDC.g.(405bp) pND-D2
panD-Cg2 5'-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3'(PstI)
panBC-E1 5'-GGATCCCACAACATCAATTTATCAGG-3'(BamHI) panBCE.c.(1700bp) pND-BC1
panBC-E2 5'-GGATCCTTAAGTATTACGCCAGCTC-3'(BamHI)
panBC-C1 5'-GTCGACTCTGAGCTGGTCATCACATC-3'(SalI) panBCC.g(1700bp) pND-BC2
panBC-C2 5'-GTCGACACGCAGGGTTGGTACTAGAG-3'(SalI)
도 3에 나타낸 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pZ8-1(EP 0 375 889)를 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이 둘다에서의 발현을 위한 기본 벡터로 사용한다. 벡터 pCRR2.1중으로 먼저 클로닝시킨 증폭 생성물을 프라이머-삽입된 제한 절단 부위를 사용하여 유사하게 처리된 발현 벡터 pZ8-1에 결합시키고, 상기 플라스미드중에 함유된 tac 프로모터의 조절하에 있도록 한다. 유일하게 상이한 점은 EcoRI-BglII 단편이 벡터 pZ8-1의 상용성 EcoRI-BamHI 제한 말단중으로 클로닝될 경우 증폭 생성물이 panDE.C.이라는 것이다. 이 방법으로 작제된 발현 플라스미드에 대한 각각의 명칭을 표 2에 제시하였다. 이. 콜라이로부터의 panDE.C.유전자를 갖는 발현 벡터 pZ8-1을 pND-D1으로 명명하고 씨. 글루타미쿰으로부터의 panDC.g.유전자를 갖는 발현 벡터 pZ8-1을 pND-D2로 명명한다. 따라서, panBCE.C.및 panBCC.g.를 함유하는 발현 플라스미드를 각각 pND-BC1 및 pND-BC2로 명명한다. 일례로서, 벡터 pZ8-1중으로 panDE.C.및 panDC.g.유전자의 클로닝 전략을 도 3에 나타내었다. 모든 발현 플라스미드의 정확한 클로닝은 각 삽입물을 서열화함으로써 검사한다.
또한, 합성 panDBC 오페론을 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰 panD 유전자 둘다에 대해 작제한다. 이. 콜라이 오페론의 경우, panDE.C.를 함유하는 벡터 pCR2.1을 EcoRI로 절단하고, DNA를 아가로스 겔에서 분리하며, panD 단편을 Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids(Macherey and Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 실시예 1.1에 이미 기재된 방법으로 겔로부터 정제한다. 이어서, 상기 단편을 EcoRI-절단된 플라스미드 pND-BC1에 결합시킨다. panD 유전자의 정확한 배향을 갖는 플라스미드는 상기 결합 혼합물을 panD 영양요구성 이. 콜라이 균주 DV9로 형질전환시키고 이를, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 영양요구성에 대한 상보화에 대해 선별함으로써 수득한다. 상보된 돌연변이주의 플라스미드 DNA를 분리하고 정확한 유전자 배열을 pND-DBC1으로 명명된 플라스미드의 삽입물(도 4)을 서열화하여 확인한다.
씨. 글루타미쿰 panDBC 오페론의 작제에 대해서도 유사한 방법을 적용시킨다. panDC.g.를 함유하는 벡터 pCR2.1을 EcoRI로 절단하는데, 한편으로는 panDC.g.유전자를 프라이머-내부 절단 부위를 통하여 벡터로부터 절단하고, 다른 한편으로는 벡터의 EcoRI 절단 부위를 통하여 절단한다. 정제후, 이 유전자 단편을 EcoRI-절단된 벡터 pZ8-1중으로 클로닝하고 pND-D4로 명명된, 정확한 panD 배향을 갖는 플라스미드를 수득하여 상기한 바와 같이 검사한다. 이후 플라스미드 pND-D4를 제한 효소 SalI로 절단하고 플라스미드 pND-BC2의 SalI 분해(Pharmacia Biotech (Freiburg, Germany), 제품 설명 SalI, code no. 27-0882-01)에 의해 수득한 정제된 panBC 단편에 결합시킨다. 상기 전기천공 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αmcr로 전기천공에 의해 옮기고 panDBC 유전자 배열을 갖는 플라스미드 10개를 제한 분석으로 측정한다. pND-DBC2(도 4)로 명명된, 이들 플라스미드중 하나의 정확한 유전자 배열을 서열 분석으로 증명한다.
발현 벡터 pZ8-1 및 상기 플라스미드를 기본으로 하는 작제물 pND-D1, pND-D2 및 pND-DBC1을 이. 콜라이 균주 MG1655로 형질전환시키고, 형질전환체를 50㎍/㎖의 카나마이신이 첨가된 LB 아가(Lennox, 1955, Virology, 1: 190)상에서 선별한다. 수득한 균주를 MG1655/pZ8-1, MG1655/pND-D1, MG1655/pND-D2 및 MG1655/pND-DBC1으로 명명한다.
플라스미드 pZ8-1, pND-D1, pND-D2 및 pND-DBC2를 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC13032를 전기천공시킨 다음, 25㎍/㎖의 카나마이신이 첨가된 LB 아가(Lennox, 1955, Virology, 1: 190)상에서 선별함으로써 균주 ATCC13032/pZ8-1, ATCC13032/pND-D1, ATCC13032/pND-D2 및 ATCC13032/pND-DBC2를 수득한다.
실시예 4
여러가지 이. 콜라이 K12 균주에 의한 판토테네이트의 형성
락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 판토테네이트 검정법을 사용하여 D-판토테네이트를 정량적으로 측정한다(시험 균주: Lactobacillus plantarum ATCC8014, cat. no. 3211-30-3; 배양물 배지: bacto pantothenate assay medium (DIFCO Laboratories, Michigan, USA), cat. no. 0604-15-3).
상기 지시 균주는 표시된 배양 배지중에서 판토테네이트의 존재하에서만 성장할 수 있으며, 배지의 판토테네이트 농도에 대해 광도계로 측정가능한, 선형 성장 의존성을 나타낸다. 판토테네이트의 헤미칼슘염(Sigma, 제품 표시 P 2250)을 사용하여 교정한다. Pharmacia Biotech(Freiburg, Germany)로부터의 LKB Biochrom 광도계상에서 측정 파장 580㎚(OD580)에서 광학 밀도를 측정한다.
이. 콜라이 균주 MG1655/pZ8-1, MG1655/pND-D1, MG1655/pND-D2 및 MG1655/pND-DBC1으로부터 판토테네이트를 생산하기 위하여, 시험 배지(50㎍/㎖의 카나마이신이 첨가된 배지 E) 50㎖를 OD580이 0.1인 동일한 배지의 16-시간 배양물로 접종시킨다. 이들 배양물을 37℃ 및 250 rpm에서 5 및 72시간 동안 배양시킨 후, 5000 x g에서 10분간 원심분리시켜 세포를 펠릿화한다. 수득한 세포-유리 상등액을 멸균-여과하고, 판토테네이트를 정량할 때까지 4 ℃에서 보관한다.
배양물 상등액중 D-판토테네이트는 DIFCO MANUAL(10th edition, pp. 1100-1102; Michigan, USA)에 지시된 바와 같이 엘. 플란타룸 ATCC8014를 사용하여 정량한다. 이들 측정 결과를 표 3에 나타낸다.
균주 유전자 OD580및 판토테네이트 축적량(㎍/㎖)
5시간 72시간
OD580 Pan. OD580 Pan.
MG1655/pZ8-1 - 2.0 0.30 2.3 1.47
MG1655/pND-D1 panDE.c. 2.3 0.90 2.5 6.95
MG1655/pND-DBC1 panDBCE.c. 2.0 0.96 2.0 6.96
MG1655/pND-D2 panDC.g. 2.2 4.07 2.3 9.66
실시예 5
씨. 글루타미쿰의 여러가지 균주에 의한 펜토테네이트의 형성
씨. 글루타미쿰 균주 ATCC13032/pZ8-1, ATCC13032/pND-D1, ATCC13032/pND-D2 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032/pND-DBC2에 의한 판토테네이트 형성을 25㎍/㎖의 카나마이신이 보충된 배지 CGXII(Keilhauer et al., 1993, Journal of Bacteriology, 175: 5595-5603; 표 4)에서 시험한다. 상기 배지를 이후 씨. 글루타미쿰 시험 배지로 언급한다. 씨. 글루타미쿰 시험 배지 50㎖ 분획을 OD580이 0.1인 동일한 배지의 16-시간 배양물로 접종시킨다. 30℃ 및 150 rpm에서 48시간 동안 배양시킨 후, 5000 x g에서 10분간 원심분리시켜 세포를 제거한다. 수득한 상등액을 멸균-여과하고 판토테네이트 농도를 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정한다. 씨. 글루타미쿰의 여러가지 균주에 의한 판토테네이트 생산 결과를 표 5에 나타낸다.
물질 양/L 설명
(NH4)2SO4 20g
우레아 5g
KH2PO4 1g
K2HPO4 1g
MgSO4*7H2O 0.25g
MOPS 42g
CaCl2 10mg
FeSO4*7H2O 10mg
MnSO4*H2O 10mg
ZnSO4*7H2O 1mg
CuSO4 0.2mg
NiCl2*6H2O 0.02mg
비오틴 0.5mg
글루코오스 40g 별도의 오토클레이브
프로토카테큐 산 0.03mg 멸균 조건하의 여과
균주 유전자 판토테네이트(㎍/ml)
OD580 Pan.
ATCC13032/pZ8-1 - 21 0.19
ATCC13032/pND-D1 panDE.c. 20 0.32
ATCC13032/pND-D2 panDC.g. 19 1.78
ATCC13032/pND-DBC2 panDBCC.g. 20 2.60
화장품, 의약, 사람의 영양 및 동물 영양에 사용되는 상업적으로 중요한 비타민인 판토텐산의 개선된 발효 방법이 제공된다.

Claims (24)

  1. 코리네박테리움속 및 에스케리키아속의 미생물에서 복제할 수 있으며 아스파테이트-1-데카복실라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 임의의 재조합 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 코리네박테리움으로부터 기원하는 panD를 암호화하고 이의 위치가 도 1에 나타낸 바와 같은, 복제할 수 있는 DNA.
  3. 제2항에 있어서,
    (i) panD를 암호화하는, 서열 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는
    (ii) 유전자 코드의 축퇴 영역내에 있는 서열(i)에 상응하는 서열, 또는
    (iii) 서열(i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 서열, 및 임의로
    (iv) (i)에 중성 센스 돌연변이를 포함하는, 복제할 수 있는 DNA.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따르는 복제할 수 있는 DNA를 도입시킴으로써 형질전환된 미생물, 특히 코리네박테리움 또는 에스케리키아속의 미생물.
  5. 수탁번호 DSM12438하에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pND-D2로서 기탁되어 있는, 도 2에 나타낸 제한 맵을 특징으로 하는, 플라스미드 벡터 pND-D2.
  6. 수탁번호 DSM12437하에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pND-DBC2로서 기탁되어 있는, 도 4에 나타낸 제한 맵을 특징으로 하는, 플라스미드 벡터 pND-DBC2.
  7. panD 유전자와 임의의 아스파테이트-1-데카복실라제를 암호화하는 다른 뉴클레오티드 서열을 미생물에서 증폭(과발현)시키고 이들 미생물을 발효에 사용함을 특징으로 하는, D-판토텐산의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, panD 유전자 또는 아스파테이트-1-데카복실라제를 암호화하는 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터로 미생물을 형질전환시켜 유전자 또는 뉴클레오티드의 카피수를 증가시키거나, 염색체의 증폭에 의해 증폭을 수행함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 구조 유전자로부터의 상부에 위치하는 프로모터 및 조절 영역을 돌연변이시켜 과발현을 수행함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 구조 유전자로부터의 상부에 발현 카세트를 도입시킴으로써 과발현을 수행함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상응하는 mRNA의 수명을 연장시키고/시키거나 상응하는 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 미생물중에서 panD 유전자의 발현을 향상시킴을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, panD 유전자를 다른 대사물질 또는 항대사물질 내성 돌연변이를 포함하는 미생물중에서 과발현시킴을 특징으로 하는 방법.
  13. 제8항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 미생물을 변형된 배양 배지중에서 발효시키고/시키거나 발효 기술을 변형시킴으로써 과발현을 수행함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서, 판토테네이트(판토텐산)의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 스위칭-오프되어 있는 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제8항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, panD 유전자 이외에, 판토텐산 형성의 대사 경로의 다른 유전자를 개별적으로 또는 함께 증폭(과발현)시키는 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, panD 유전자 이외에, 특히 코리네박테리움으로부터 기원하는 효소 케토판토에이트 하이드록시메틸트랜스퍼라제(E.C. 4.1.2.12) 및 판토테네이트 신테타제(E.C.6.3.2.1)를 암호화하는 유전자 1개 이상을 증폭(과발현)시키는 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 유전자를 포함하는 다양한 화합성 플라스미드 벡터로 개별적으로 형질전환시킨 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 플라스미드 벡터로 형질전환시킨 균주를 사용하고, 상기 플라스미드 벡터가 panD 유전자를 포함하여 상기 유전자 1개 이상을 포함하며, 상기 유전자가 연속적으로 배열되어 있으며 통상의 프로모터의 조절하에 있거나 서로 별도로 상이한 프로모터의 조절하에 있음을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 플라스미드 벡터 pND-D2로 형질전환시킨 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 플라스미드 벡터 pND-DBC2로 형질전환시킨 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  21. a) 적어도 panD 유전자가 임의의 panB 및/또는 panC 유전자와 함께 증폭(과발현)되는, 선행 항중 어느 한 항에 따르는 미생물을 발효시키는 단계,
    b) 배지 또는 미생물의 세포중에서 판토텐산을 농축시키는 단계, 및
    c) 판토텐산을 분리시키는 단계를 수행함을 특징으로 하는, 판토텐산의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 과발현된 유전자가 코리네박테리움속의 미생물로부터 기원함을 특징으로 하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 아스파테이트, β-알라닌, 케토이소발레레이트, 케토판토에이트 및 판토에이트를 포함하는 그룹으로부터 선택된 판토텐산 전구체를 단계 a)에 첨가함을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서, 에스케리키아 또는 코리네박테리움속의 미생물을 사용함을 특징으로 하는 방법.
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