CN1256314A - 通过在微生物中扩增pand基因制备d-泛酸的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过微生物的发酵制备D－泛酸的方法,其中至少panD得到扩增(过量表达),选择性地与panB和panC基因结合;并且泛酸在培养基或微生物细胞中富集。

Description

通过在微生物中扩增panD基因制备D-泛酸的发酵方法
泛酸是应用于化妆品、医药、人类和动物营养的商业上重要的维生素。
泛酸可以通过化学合成来制备或通过生物技术在适当营养溶液中适当微生物的发酵来制备。化学合成中，DL-泛内酯(pantolactone)是重要的中间产物。它是在多步骤过程中从甲醛、异丁醛和氰化物制备的。在随后的步骤中，拆分此消旋混合物并用β-丙氨酸缩合D-泛内酯以得到D-泛酸。
通过微生物发酵制备的优势是直接形成所需的立体异构体D形泛酸而无L-泛酸。
正如EP-A 0 493 060中所示，不同种的细菌如大肠杆菌、产尿节杆菌、产红棒杆菌和产氨短杆菌以及酵母如Debaromyces castellii。可以在含有葡萄糖、DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中合成D-泛酸。EP-A 0493 060也表明，以大肠杆菌为例，在含有葡萄糖、DL-泛解酸和β-丙氨酸的营养溶液中D-泛酸的合成通过扩增质粒pFV3和pFV5中所含的来自大肠杆菌的泛酸生物合成基因得到增强。
EP-A 0 590 857和US 5,518,906描述了从大肠杆菌菌株IF003547衍生的突变体如FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069，它们具有对各种抗代谢物如水杨酸、α-丁泛解酸、β-羟基天冬氨酸、O-甲基苏氨酸和α-酮异戊酸的耐受性，并且在含有葡萄糖的营养溶液中合成泛解酸，在含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中合成D-泛酸。EP-A 0590 857和US 5,518,906也表明，在上述菌株中，质粒pFV31中所含的特定泛酸生物合成基因扩增后，在含有葡萄糖的营养溶液中D-泛解酸的产量以及含有葡萄糖和β-丙氨酸的营养溶液中D-泛酸的产量均有提高。
另外，WO97/10340表明，在形成泛酸的大肠杆菌菌株中，泛酸合成可以通过提高缬氨酸生物合成酶—乙酰羟基羧酸合酶II的活性而得到进一步增强。发明目的
本发明人的目的是提供制备泛酸的改良发酵方法的新原理。发明详述
维生素泛酸是应用于化妆品、医药、人类和动物营养的商业上重要的产品。所以，对提供制备泛酸的新方法有广泛兴趣。
当在下文中提到D-泛酸、泛酸和泛酸盐时，它们应理解为不仅指游离酸也指D-泛酸盐类如钙盐、钠盐、氨盐或钾盐。
本发明特别提供使用微生物制备D-泛酸的方法，具体地，微生物是已能产D-泛酸的微生物并且其中编码L-天冬氨酸-1-脱羧酶(E.C.4.1.1.11)的panD基因单独或与panB和/或panC基因一起扩增并特别地过量表达。本发明进一步涉及权利要求书中所定义的相应重组DNA序列。本发明也提供使用按权利要求8-17制备的产D-泛酸微生物进行的制备D-泛酸的发酵方法。
本文中术语“扩增”是指微生物中由适当DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性例如通过增加基因拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的适当酶的基因以及选择性地结合这些方法而得到提高。
本发明所提供的微生物可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉或纤维素或利用甘油和乙醇合成泛酸。所述微生物可以是真菌、酵母、革兰氏阳性细菌如棒杆菌属的细菌或是革兰氏阴性细菌如肠杆菌科的细菌。肠杆菌科中可特别提出的是埃希氏菌属和大肠杆菌种。大肠杆菌品种中，可以提及所谓的K-12菌株如菌株MG1655或W3110[Neidhard等：大肠杆菌和沙门氏菌。细胞和分子生物学(ASM Press，Washington DC)]或大肠杆菌野生型菌株IFO3547(发酵研究所，Osaka，Japan)及由其衍生的突变体。在棒杆菌属中，可特别提出谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其合成氨基酸的能力，此物种包括野生型菌株如谷氨酸棒状菌ATCC13032、黄色短杆菌ATCC14067、Corynebacteriummelassecola ATCC17965及其突变体。
本发明人发现在过量表达尤其来自谷氨酸棒杆菌的编码L-天冬氨酸-1-脱羧酶(E.C.4.1.1.11)的新panD基因后，微生物的泛酸合成得到增强。
本发明人还发现panD基因在其中编码酮泛解酸羟甲基转移酶和泛酸合成酶的panB和panC基因分别或一起额外表达的菌株中具有有利效应。
过量表达可以通过增加适当基因的拷贝数或突变位于结构基因上游的启动子和调控区域来实现。在结构基因上游掺入的表达盒以相同方式起作用。另外，可诱导的启动子可以通过发酵增加D-泛酸合成过程中的表达。延长mRNA寿命的方法也可提高表达。而且，酶活性也通过防止酶蛋白的降解而得到提高。基因或基因构建体可以位于可变拷贝数的质粒中或在染色体整合并扩增。选择性地，也可以通过改变培养基的成分和培养技术实现目的基因的过量表达。
本领域技术人员将尤其在Martin等(生物/技术5，137-146(1987))、Guerrero等(基因138，35-41(1994))、Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))、Eikmanns等(基因102，93-98(1991))、EP 0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(生物/技术9，84-87(1991))、Reinscheid等，(应用和环境微生物学60，126-132(1994))、LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))、专利申请WO96/15246、Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998))或美国细菌学学会(Washington DC，USA，1981)的手册“普通细菌学方法手册”中找到相关说明。
本领域技术人员也将尤其在Chang和Cohen(细菌学杂志，134，1141-1156(1978))、Hartley和Gregori(基因13，347-353，(1981))、Amann和Brosius(基因40，183-190(1985))，de Broer等(美国国家科学院院报80，21-25(1983))、LaVallie等(生物/技术11，187-193(1993))、PCT/US97/13359、Llosa等(质粒26，222-224(1991))、Quandt和Klipp(基因80，161-169(1989))、Hamiton(细菌学杂志171，4617-4622(1989))、Makrides(微生物学综述60，512-538(1996))以及众所周知的遗传学和分子生物学书本中找到相关说明。
从谷氨酸棒杆菌分离panD基因或其它基因如panB和panC基因的第一个步骤是在大肠杆菌中构建此微生物的基因文库。基因文库的构建一般在众所周知的书本和手册中均有记录。可提及的例子是Winnacker的题为“从基因到克隆，基因技术介绍”(Verlag Chemie，Weinheim，Germany，1990)的书本或Sambrook等题为“分子克隆，实验手册”(冷泉港实验室出版社，1989)的手册。众所周知的基因文库是由Kohara等在λ载体中构建的大肠杆菌K-12菌株W3110的基因文库(细胞50，495-508(1987))。Bathe等(分子和普通遗传学252，255-265(1996))描述了使用粘粒载体SuperCos I(Watl等，美国国家科学院院报84，2160-2164(1987))在大肠杆菌K-12菌株NM554(Raleigh等，核酸研究16，1563-1575(1988))中构建的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。大肠杆菌中谷氨酸棒杆菌的基因文库也可以使用诸如PBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或PUC9(Vieira等，基因19，259-268(1982))的质粒得到构建。限制和重组缺陷性大肠杆菌是尤为适合的宿主，菌株DH5αmcr是由Grant等描述的例子(美国国家科学院院报87，4645-4649(1990))。
然后将基因文库通过转化(Hanahan，分子生物学杂志166，557-580(1983))或电穿孔(Tauch等，FEMS Microbiological Letter123，343-347(1994))转入指示菌株。指示菌株的鉴定性特征是其在目的基因中有突变导致可检测的表型，例如营养缺陷型。带有panD基因中突变的大肠杆菌突变体DV9(Vallari和Rock，细菌学杂志164，136-142(1985))，在本发明的框架中尤其有利。需要泛酸的大肠杆菌的另一例子是带有panB基因中突变的菌株SJ2，可从耶鲁大学的基因贮存中心(New Haven，Connecticut，USA)得到。用携带目的基因如panD基因的重组质粒转化指示菌株如panD突变体DV9并表达目的基因，在适当特征如需要泛酸方面，指示菌株变成原养型。用此方法分离的基因或DNA片段可以通过如Sanger等所述的序列测定(美国国家科学院院报，74，5463-5467(1977))得到鉴定。然后，与数据库如基因库中所含已知基因的相同性(Benson等，(sic)，1998，核酸研究，26：1-7)可以通过公开的方法(Altschul等，1990，分子生物学杂志215：403-410)分析。
来自谷氨酸棒杆菌编码panD基因的新DNA序列以此方法获得，为SEQID No1，它构成本发明的一部分。相应酶的氨基酸序列通过上述方法从所述DNA序列推导出来。panD基因产物即L-天冬氨酸-1-脱羧酶的氨基酸序列在SEQ ID No.2中表示。来自谷氨酸棒杆菌编码panB和panC基因的新DNA序列以此方法获得，为SEQ ID No3，它构成本发明的一部分。相应酶的氨基酸序列通过上述方法从所述DNA序列推导出来。所得的panB基因产物即酮泛解酸羟甲基转移酶的氨基酸序列在SEQ ID No.4中表示，并且所得的panC基因产物即泛酸合成酶的氨基酸序列在SEQ ID No.5中表示。
由于遗传密码的简并性而从SEQ ID No.1或SEQ ID No.3得到的编码DNA序列也构成本发明的一部分。相似地，与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3杂交的DNA序列构成本发明的一部分。而且，本领域技术人员已知保守氨基酸互换如蛋白质中甘氨酸换成丙氨酸或天冬氨酸换成谷氨酸为有义突变，这种突变不引起蛋白活性的基本改变，即它们是中性的。也已知蛋白N和/或C末端的改变基本上不破坏其功能，甚至可以稳定蛋白。本领域技术人员将尤其在Ben-Bassat等(细菌学杂志169，751-757(1987))、O’Regan等(基因77，237-251(1989))、Sahin-Toth等(蛋白质科学3，240-247(1994))、Hochuli等(生物/技术6，1321-1325(1988))以及众所周知的遗传学和分子生物学书本中发现这方面的信息。从SEQ IDNo.2、SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.5相应得来的氨基酸序列也构成本发明的一部分。
然后用此方法鉴定的基因可以单独或与其它基因结合在适当微生物中表达。表达或过量表达基因的已知方法在于借助另外提供表达信号的质粒载体扩增基因。可能的质粒载体是那些能在适当微生物中复制的质粒载体。用于本发明的可能载体的例子对于大肠杆菌是pSC101(Vocke和Bastia美国国家科学院院报80(21)，6557-6561(1983))或pKK223-3(Brosius和Holy，美国国家科学院院报81，6929(1984))，或者对于谷氨酸棒杆菌是pEK Ex1[Eikmanns等，基因102：93-98(1990)]或pZ8-1(EP 0 375 889)。这样的微生物的例子是包含质粒pND-D1和pND-D2的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC/13032/pND-D2和ATCC/3032/pND-DBC2和大肠杆菌菌株MG1655/PND-D2。质粒pND-D2是以质粒pZ8-1为基础携带来自谷氨酸棒杆菌的panD基因的大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体。质粒pND-DBC2是以质粒pZ8-1为基础携带来自谷氨酸棒杆菌的panD、panB和panC基因的大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体。
对于本领域技术人员很明显，赋予对代谢物和抗代谢物耐受性或防止泛酸前体流失的染色体突变可以与本发明所提供的方法有利地结合。
按照本发明制备的微生物可以通过分批方法、补料分批方法和重复补料分批方法连续或不连续培养用于泛酸生产。Chmiel的书(生物加工技术1.生物工程介绍，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的书(生物反应器和外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中提供了已知培养方法的总结。
欲使用的培养基必须适当地符合特定微生物的要求。不同微生物的培养基的描述可见于美国细菌学会的手册“普通细菌学方法手册”(Washington DC，USA，1981)。可以使用的碳源是糖类和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵花子油、花生油和椰子脂肪，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸，酒精如甘油和乙醇以及有机酸如乙酸。这些物质可以单独或作为混合物使用。可以使用的氮源是有机含氮化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉类抽提物、麦芽抽提物、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或作为混合物使用。可以使用的磷源是磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。培养基还必须含有金属盐如对于生长必需的硫酸镁或硫酸铁。最后，除了以上所述的物质，可以使用必要的促生长物质如氨基酸和维生素。也可以将泛酸前体如天冬氨酸、β-丙氨酸、酮异戊酸、酮泛解酸或泛解酸和/或选择性地它们的盐类加入培养基以进一步增加泛酸产量。上述添加物可以一次全部加入培养物，也可在培养期间适当地加入。
培养基的PH值可以通过适当使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾或氨或者酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。泡沫形成可以使用消泡剂多聚脂肪酸甘油酯来控制。质粒的稳定性可以通过加入适当选择性作用物质如抗生素来维持。需氧条件通过向培养基输入氧气或含氧气体混合物如空气来保持。培养基的温度正常在20℃-50℃，优选25℃-45℃。持续培养直至泛酸合成达到最大值。此目标一般在10到160小时达到。
具有高度L-天冬氨酸-1-脱羧酶活性的菌株也可用于从L-天冬氨酸制备β-丙氨酸。发酵方法、酶转化反应或二者的结合都可用于此目的。
合成的泛酸浓度可用已知方法确定(Velisek，色谱科学60，515-560(1992))。
下列微生物依照布达佩斯条约条款保藏于德意志微生物和细胞保藏中心(DSMZ)，Brunswick，Germany：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-D2为DSM12438
谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-DBC2为DSM12437实施例
本发明借助以下实施例得到更详细的说明。实施例1来自谷氨酸棒杆菌的panD基因的克隆和测序1.panD基因的克隆
按Tauch等所述的(质粒33，168-179(1995))从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离染色体DNA，并用限制性酶Sau3A(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述Sau3A，编号27-0913-02)部分切割。用Nucleotrap抽提试剂盒(Macherey和Nagel，Düren，Germany；目录号740584)分离大小范围7-9kb的DNA片段，并将其连接入从MBI Fermentas(Vilnius，Lithuania)得到的载体pUC19(Norrander等，基因26，101-106(1982))的磷酸化BamHI酶切位点。按Sambrook等所述的(1989，分子克隆：实验手册，冷泉港)进行连接，DNA混合物与T4连接酶(PharmaciaBiotech，Freiburg，Germany)一起温育过夜。然后，通过电穿孔(Tauch，FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))将此连接混合物转入大肠杆菌DH5αmcr(Grant，美国国家科学院院报87，4645-4649(1990))中，并将其涂在LB琼脂(Lennox，病毒学1，190(1995))+100μg/ml青霉素上。37℃培养24小时后，通过用Birnboim和Doly的碱裂解方法再分离质粒DNA(核酸研究7，1513-1523(1997))，可以从转化子获得谷氨酸棒杆菌基因文库。通过电穿孔将此基因文库转入带有panD基因突变的大肠杆菌菌株DV9(Vallari和Rock，细菌学杂志164，136-142(1985))中。再生期后(Tauch等，FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))，用培养基E(Vogel和Bonner，生物化学杂志218，97-106(1956))将此电穿孔混合物洗两次。介质E的组成见表1。用这些细胞接种250ml锥形瓶中的50ml培养基E+100μg/ml青霉素并于39℃在250rpm的通气摇床中培养。培养两天后，将细菌悬浮物稀释并在补加100μg/ml青霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1，190(1995))上划线接种。
表1
    物质     每升含量     备注
    K2HPO4     10g
    NaNH4HPO4*4H2O     3.5g
    柠檬酸     2g
    MgSO4*7H2O     0.2g
    葡萄糖     4g     分开灭菌
    维生素B1     0.2μg     无菌条件下过滤
分离称为pNIC-1.3的DV9转化子的质粒DNA并通过琼脂糖凝胶电泳(Sambrook等，分子克隆：实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社)并与已知长度的标准DNA片段比较进行鉴定。质粒pNIC-1.3含有7kbp插入片段。pNIC-1.3的互补能力通过panD突变体DV9的重新转化来检测。继而所得的转化子能在上述条件下于无β-丙氨酸的培养基E中生长。
通过用限制性BamH I(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述BamH I，编号27-0868-03)、EcoR I(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述EcoR I，编号27-0884-03)和Bgl II(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述Bgl II，编号27-0946-02)切割质粒pNIC1.3，接着与用适当限制性酶(Schǎfer，基因145，69-73(1994))消化的载体pK18mob连接对7Kb插入片段进行亚克隆。通过电穿孔将得到的连接混合物转入大肠杆菌panD突变体DV9；按上述进行互补转化子的筛选，此例中的琼脂平板含50μg/ml卡那霉素。分离互补单克隆的质粒并通过限制性分析进行鉴定选择此后称为pNIC-10的含有约3kb DNA插入序列的EcoR I亚克隆进行下列序列分析。2.panD基因的序列测定
为进行双链测序，用各种限制性酶切割pNIC-10的3kb片段，并将片段亚克隆入质粒pUC19或pK18mob。按制造商的说明用QIAGEN质粒Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，Ca.，USA)分离用于测序的质粒DNA，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳确定质粒的大小。
测序按Sanger等的双脱氧链终止法(美国国家科学院院报74，5463-5467(1977))进行，并经Zimmermann等改良(核酸研究18，1067(1990))。使用来自Pharmacia的Cy5自动测序试剂盒(产品号27-2690-02，Freiburg，Germany)。凝胶电泳分离和测序反应的分析用来自Amersham Pharmacia Biotech(Uppsla，Sweden)的自动激光荧光(A.L.F)显示DNA测序仪，在长范围凝胶溶液聚丙烯凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，Me.，USA)上进行。然后对获得的原始序列资料用97-0版Staden软件包进行处理(核酸研究14，217-231(1986))。所有pNIC-10亚克隆的各个序列都被整理到称为重叠群13的衍接的3060bp重叠群中。用XNIP软件(Staden，核酸研究14，217-231(1986))对整个DNA片段进行计算机辅助的编码区分析，鉴定到5个开放读码框(ORF)。
图1表示重叠群13的限制性图谱和表示为orf1-orf5的ORF的位置。用可通过国家医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的NCBI服务器的网上服务得到BLAST搜索程序[Gish和States，Nature of基因tics 3，266-272(1993))；Altschul等，分子生物学杂志215，403-410(1990)]进行同源性分析。重叠群13分析表明orf-3是panD基因。orf-3以后称为panD基因。含有panD基因的DNA片段的核苷酸序列表示为SEQ ID No.1。从上述步骤得到的panD基因产物即L-天冬氨酸-1-脱羧酶的氨基酸顺序表示为SEQ ID No.2。实施例2来自谷氨酸棒杆菌的panB和panC基因的克隆和测序1.panB和panC基因的克隆
按Schwarzer和Pühler所述的(生物/技术9，84-87(1995))从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离染色体DNA，并用限制性酶Sau3A切割。凝胶电泳(sic)分离后，分离大小范围3-7kb或9-20kb的DNA片段并将其与载体BR332的单一BamH I酶切位点连接。用连接混合物转化(Hanahan，分子生物学杂志166，(1983)557-580)大肠杆菌DH5αmcr(Grant，美国国家科学院院报(sic)87，4645-4649(1990))。在含有100μg/ml青霉素的LB琼脂平板上接种后，通过它们的四环素敏感性鉴定带有插入片段的克隆。通过质粒制备方法(Sambrook等，分子克隆，实验室手册(1989)，冷泉港实验室出版社)从汇集的克隆分离8组各含有带有9-20kb插入大小的400个质粒和9组各含有带有3-7kb插入大小的500个质粒。通过电穿孔(Wehrmann等，1994，分子生物学140：3349-3356)用此基因库转化大肠杆菌panB突变体SJ2。转化混合物直接涂在含有15g/l琼脂的CGXII培养基(Keilhawer等，细菌学杂志(1993)175：5595-5603)上。从能在无泛酸添加剂的情况下生长的菌落分离质粒DNA(Sambrook等，分子克隆，实验室手册(1989)，冷泉港实验室出版社)。以8个质粒为例，可以通过再转化证实异源互补大肠杆菌突变体SJ2的panB缺陷的能力。
使用8个质粒进行限制性作图。一个研究的质粒载体(此后称为POR1)含有9.3kb插入(图2)。大肠杆菌panC突变体DV39(Vallari和Rock，1985，细菌学杂志164：136-142)的转化表明载体pUR1也能互补此突变体的panC缺陷。2.panB和panC基因的序列测定
pUR1的2.2kb插入片段(图2)按Sanger等的双脱氧链终止法(美国国家科学院院报74，5463-5467(1977))进行测序。为进行测序，首先用内切核酸酶III制备亚克隆并借助标准引物(来自德国BoehringerMannheim公司的通用和反向引物)对它们进行测序。测序混合物的凝胶电泳分析用来自Amersham Pharmacia Biotech(Uppsla，Sweden)的自动激光荧光(A.L.F)测序仪进行。得到的核苷酸序列用HUSAR软件包(Release 4.0，EMBL，Cambridge，GB)进行。分析鉴定了两个开放阅读框架。核苷酸序列表示为SEQ ID No.3。鉴定为panB基因的一个813bp开放阅读框架编码271个氨基酸并表示为SEQ ID No.4。鉴定为panC基因的第二个开放阅读框包含837个碱基对。它编码279个氨基酸并表示为SEQ ID No.5。实施例3构建表达panD、panBC和panDBC的载体
使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡聚核苷酸扩增来自谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的泛酸生物合成基因。用来自Gibco-BRL(Eggestein，Germany)的Taq DNA聚合酶在PCT-100热循环仪(MJ ResearchInc.，Watertown，Mass.，USA)中进行PCR实验。于94℃2分钟的一次变性步骤后，接着是于94℃ 90秒的变性步骤、于引物依赖温度T＝(2AT+4GC)-5℃(Suggs等，1981，683-693页，于：D.D.Brown和C.F.Fox(编)，使用纯化基因的发育生物学。Acedemic Press，New York，USA)90秒的退火步骤，于72℃90秒的延伸反应。最后三个步骤循环重复35次，反应以72℃10分钟的延伸反应结束。通过琼脂糖凝胶电泳对它们进行检测后，按厂商说明将以此方法扩增的产物与载体pCR2.1[原始TA克隆试剂盒，Invitrogen(Leek，The Netherlsnds)，产品描述原始TA克隆试剂盒，目录号KNM2030-01]连接，然后转化入大肠杆菌菌种TOP10F’。通过在含有100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂板上培养进行转化子的筛选。
从来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032和大肠杆菌K12(W.K.Merkel和B.P.Nichols，1993，基因库：L17086)的泛酸生物合成基因panD(SEQ IDNo.1)和panBC(SEQ ID No.3)合成PCR引物。选择这些引物以使扩增的片段含有这些基因及其固有的核糖体结合位点，但不含有可能的启动子区。另外，插入适当限制性酶切位点以便克隆入目的载体。下面表2中列出了PCR引物、插入的切割位点(序列下划线)和扩增的基因(以bp表示的片段长度在括号中给出)的序列。
表2
    引物        带有限制性酶切位点的序列     产物    质粒
panD-Ec1 5′- GAATTCGACAGGGTAGAAAGGTAGA-3′EcoRI   panDE.c.(462bp)   pND-D1
panD-Ec2 5′- AGATCTGGGATAACAATCAAGCAACC-3′BglII
panD-Cg1 5′-CATCTCACGCTAT GAATTCT-3′EcoRI   panDC.g.(405bp)   pND-D2
panD-Cg2 5′-ACGAGGC CTGCAGCAATA-3′PstI
panBC-E1 5′- GGATCCCACAACATCAATTTATCAGG-3′BamHI   panBCE.c.(1700bp)   pND-BC1
panBC-E2 5′- GGATCCTTAAGTATTACGCCAGCTC-3′BamHI
panBC-C1 5′- GTCGACTCTGAGCTGGTCATCACATC-3′SalI   panBCC.g.(1700bp)   pND-BC2
panBC-C2 5′- GTCGACACGCAGGGTTGGTACTAGAG-3′SalI
图3中所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pZ8-1(EP 0 375889)用作在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中表达的基本载体。以前克隆入载体pCR2.1的扩增产物通过引物插入的限制性酶切位点与相似处理的表达载体pZ8-1连接，并由此在该质粒中的tac启动子的控制之下。唯一例外是扩增产物panDE.C.，在此例中将EcoR I-Bgl II片段克隆入载体pZ8-1的相容EcoR I-BamH I限制性末端。按这种方法构建的表达质粒的相应名称在表2中表示。带有来自大肠的panDE.C.基因的表达载体pZ8-1称为PND-D1，而带有来自谷氨酸棒杆菌的panDC.g.基因的表达载体称为pND-D2。含有panDE.C.和panDC.g.的表达质粒相应地分别称为pND-BC1和pND-BC2。以举例方式，panDE.C.和panDC.g.的克隆策略在图3中表示。所有表达载体的正确克隆通过相应插入片段的测序来检测。
而且，用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌panD基因构建合成的panDBC操纵子。对于大肠杆菌操纵子，含有panDE.C.的载体pCR2.1用EcoRI酶切，在琼脂糖凝胶中分离DNA并利用用于核酸的Nucleotrap抽提试剂盒(Macherey和Nagel，Düren，Germany)采用已在实施例1.1中描述的方法从凝胶纯化panD片段。然后将片段与EcoRI酶切的质粒pND-BC1连接。通过将连接混合物转化入panD营养缺陷型大肠杆菌菌株DV9并如实施例1中所述的选择对营养缺陷型的互补作用，得到带有正确方向的panD基因的质粒。分离互补突变体的质粒DNA并通过对称为pND-DBC1的质粒(图4)的插入片段测序来证实正确的基因排列。
相同方法适用于谷氨酸棒杆菌panDBC操纵子的构建。含有panDC.g.的载体pCR2.1用EcoRI酶切。一端通过引物内的酶切位点而另一端通过载体的酶切位点将panDC.g.基因从载体上切下。纯化后，将此基因片段克隆入EcoRI酶切的载体pZ8-1，得到带有正确方向panD称为pND-D4的质粒并如上所述检测。然后用限制性酶SalI酶切质粒pND-D4并将其与纯化的通过SalI酶切得到的panBC片段(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany，产品描述SalI，编号27-0882-01)连接。将电穿孔混合物通过电穿孔转入大肠杆菌菌株DX5αmcr，并通过限制性分析确定10个带有panDBC基因排列的质粒。称为pND-DBC2(图4)的这些质粒之一的正确基因排列通过序列分析证实。
将表达载体pZ8-1和基于此质粒的构建体pND-D1、pND-2和pND-DBC1转化入大肠杆菌MG1655，并在LB琼脂糖(Lennox，病毒学1，190(1955))+50μg/ml卡那霉素上选择转化子。获得的菌株称为MG1655/pZ8-1、MG1655/pND-D1如MG1655/pND-DBC1。
通过将pZ8-1、pND-D1、pND-D2和pND-DBC2电穿孔入谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032接着在LB琼脂(lennox，1955，病毒学，1：190)+25μg/ml卡那霉素上选择，得到菌株ATCC13032/pZ8-1、ATCC13032/pND-D1、ATCC13032/pND-D2和ATCC13032/pND-DBC2。实施例4用各种大肠杆菌K12菌株合成泛酸
通过植物乳杆菌泛酸分析对D-泛酸进行定量(测试菌株：植物乳杆菌ATCC8014，目录号3211-30-3；培养基：Bacto泛酸分析培养基(DIFCOLaboratories，Michgan，USA，目录号0604-15-3)。这种指示性菌株只能在含有泛酸的指示培养基中生长，并表现可用分光计测量的细菌生长与培养基泛酸浓度之间的线性依赖关系。用泛酸的高钙盐(hemicalcium)(Sigma，产品号P 2250)进行校准。于580nm测量波长在LKB Biochrom光度计(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)上测定光密度(OD580)。
为从大肠杆菌菌株MG1655/pZ8-1、MG1655/pND-D1、MG1655/pND-D2和MG1655/pND-DBC1制备泛酸，用相同培养基中OD580为0.1的16小时培养物接种50ml测试培养基(培养基E加50μg/ml卡那霉素)。于37℃和250rpm培养这些培养物5和72小时后，通过于5000×g离心10分钟沉淀细胞，将获得的无细胞上清过滤除菌并于4℃保存直到对泛酸进行定量。
按DIFCO手册(第10版，1100-1102页；Michigan，USA)中说明的方法，用植物乳杆菌ATCC8014对培养物上清中的D-泛酸进行定量。这些测量结果在表3中表示。
表3
    菌株  基因    OD580和泛酸积累(μg/ml)
      5小时       72小时
OD580   Pan.   OD580    Pan.
MG1655/pZ8-1  -    2.0   0.30    2.3    1.47
MG1655/pND-D1  panDE.c.    2.3   0.90    2.5    6.95
MG1655/pND-DBC1  panDBCE.c.    2.0   0.96    2.0    6.96
MG1655/pND-D2  panDC.g.    2.2   4.07    2.3    9.66
实施例5用谷氨酸棒杆菌的各种菌株合成泛酸
对谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032/pZ8-1、ATCC13032/pND-D1、ATCC13032/pND-D2和谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-DBC2在加有25μg/ml卡那霉素的培养基CGXII(keilhaney等，1993，细菌学杂志，175：5595-5603；表4)中的泛酸合成进行测试，此培养基此后称为谷氨酸棒杆菌测试培养基。用相同培养基中的16小时培养物接种50ml谷氨酸棒杆菌测试培养基。于30℃和150rpm培养48小时后，通过于5000×g离心10分钟除去细胞，将上清过滤除去并如实施例中所述测定泛酸浓度。用各种谷氨酸棒杆菌菌株的泛酸合成结果整理在表5中。
表4
    底物     每升含量     备注
    (NH4)2SO4     20g
    Urea     5g
    KH2PO4     1g
    K2HPO4     1g
    MgSO4 *7H2O     0.25g
    MOPS     42g
    CaCl2     10mg
    FeSO4 *7H2O     10mg
    MnSO4 *H2O     10mg
    ZnSO4 *7H2O     1mg
    CuSO4     0.2mg
    NiCl2 *6H2O     0.02mg
    生物素     0.5mg
    葡萄糖     40g 分开高压灭菌
    3，4-二羟苯甲酸     0.03mg 无菌条件下过滤
表5
    菌株     基因   泛酸(μg/ml)
   OD580     Pan.
ATCC13032/pZ8-1  -     21     0.19
ATCC13032/pND-D1  panDE.c.     20     0.32
ATCC13032/pND-D2  panDC.g.     19     1.78
ATCC13032/pND-DBC2  panDBCC.g.     20     2.60
附图附加下列附图：图1：含有orf-1到orf-5的重叠群13的图谱图2：PUR1所含的克隆的DNA片段的图谱以及测序的DNA片段的位置图3：质粒pZ8-1、pND-D1和pND-D2的图谱图4：质粒pND-DBC1和pND-DBC2的图谱附图中所用的缩写如下定义：rrnB T1T2：rrnB基因的转录终止子Ptac：     tac启动子panB：     panB基因的编码区panC：     panC基因的编码区panD：     panD基因的编码区rep-C.g.： 在谷氨酸棒杆菌中复制的DNA区域oriV-E.c.：用于向大肠杆菌无性转移的起始点kan：      卡那霉抗性基因EcoRI：    限制性酶EcoRI的酶切位点E：        限制性酶EcoRI的酶切位点BamHI：    限制性酶BamHI的酶切位点B：        限制性酶BamHI的酶切位点BglII：    限制性酶BglII的酶切位点ClaI：     限制性酶ClaI的酶切位点H：        限制性酶HindIII的酶切位点NcoI：     限制性酶NcoI的酶切位点NruI：     限制性酶NruI的酶切位点NsiI：     限制性酶NsiI的酶切位点P：        限制性酶PstI的酶切位点PstI：     限制性酶PstI的酶切位点PvuI：     限制性酶PvuI的酶切位点SacI：     限制性酶SacI的酶切位点SalI：     限制性酶SalI的酶切位点ScaI：     限制性酶ScaI的酶切位点SphI：     限制性酶SphI的酶切位点X：        限制性酶XhoI的酶切位点XhoI：     限制性酶XhoI的酶切位点
                 序列表(1)基本信息(i)申请人：
(A)名称：Degussa Aktiengesellschaft
  (B)街道：Weissfrauenstr.9
  (C)城市：Frankfurt am Main
  (D)地区：Hessen
  (E)国家：德国
  (F)邮政编号：D-60311(ii)发明名称：用肠杆菌科菌株制备D-泛酸的发酵方法(iii)序列数：5(iv)计算机可读形式：
 (A)介质类型：软盘
 (B)计算机：IBM PC兼容机
 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
 (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPA)(2)关于SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征
 (A)长度：540个碱基对
 (B)类型：核苷酸
 (C)链型：双链
 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：基因组DNA(iii)假设：否(iii)反义：否(vi)来源：
 (A)生物：谷氨酸棒杆菌
 (B)菌株：ATCC13032(ix)特征：
 (A)名称/关键：CDS
 (B)位置：77..484
 (C)其它信息：/密码_起始＝77
              /EC_号＝4.1.1.11
              /产品＝“L-天冬氨酸-1-脱羧酶”
              /基因＝“panD”(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AATATTCCTT TCCTTGTCAT CTCACGCTAT GATTTCTAAA ACTTGCAGGA CAACCCCCAT   60AAGGACACCA CAGGAC ATG CTG CGC ACC ATC CTC GGA AGT AAG ATT CAC      109
              Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His
                1               5                  10CGA GCC ACT GTC ACT CAA GCT GAT CTA GAT TAT GTT GGC TCT GTA ACC    157Arg Ala Thr Val Thr Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr
         15                  20                  25ATC GAC GCC GAC CTG GTT CAC GCC GCC GGA TTG ATC GAA GGC GAA AAA    205Ile Asp Ala Asp Leu Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys
     30                  35                  40GTT GCC ATC GTA GAC ATC ACC AAC GGC GCT CGT CTG GAA ACT TAT GTC    253Val Ala Ile Val Asp Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val
 45                  50                  55ATT GTG GGC GAC GCC GGA ACG GGC AAT ATT TGC ATC AAT GGT GCC GCT    301Ile Val Gly Asp Ala Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala60                  65                  70                  75GCA CAC CTT ATT AAT CCT GGC GAT CTT GTG ATC ATC ATG AGC TAC CTT    349Ala His Leu Ile Asn Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu
             80                  85                  90CAG GCA ACT GAT GCG GAA GCC AAG GCG TAT GAG CCA AAG ATT GTG CAC    397Gln Ala Thr Asp Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His
         95                 100                  105GTG GAC GCC GAC AAC CGC ATC GTT GCG CTC GGC AAC GAT CTT GCG GAA    445Val Asp Ala Asp Asn Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu
    110                 115                 120GCA CTA CCT GGA TCC GGG CTT TTG ACG TCG AGA AGC ATT TAGCGTTTTA     494Ala Leu Pro Gly Ser Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile
125                 130                 135GCTCGCCAAT ATTGCTGCCG GCCTCGTTGA AAATGGTCAT GGTGGC                 540(2)关于SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征
 (A)长度：136个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Leu Arg Thr Ile Leu Gly Ser Lys Ile His Arg Ala Thr Val Thr1               5                 10                  15Gln Ala Asp Leu Asp Tyr Val Gly Ser Val Thr Ile Asp Ala Asp Leu
         20                  25                  30Val His Ala Ala Gly Leu Ile Glu Gly Glu Lys Val Ala Ile Val Asp
     35                  40                  45Ile Thr Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Val Ile Val Gly Asp Ala
 50                  55                  60Gly Thr Gly Asn Ile Cys Ile Asn Gly Ala Ala Ala His Leu Ile Asn65                  70                  75                  80Pro Gly Asp Leu Val Ile Ile Met Ser Tyr Leu Gln Ala Thr Asp Ala
             85                  90                  95Glu Ala Lys Ala Tyr Glu Pro Lys Ile Val His Val Asp Ala Asp Asn
        100                 105                 110Arg Ile Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Ala Glu Ala Leu Pro Gly Ser
    115                 120                 125Gly Leu Leu Thr Ser Arg Ser Ile
130                 135(2)关于SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征
 (A)长度：2164个碱基对
 (B)类型：核苷酸
 (C)链型：双链
 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：基因组DNA(iii)假设：否(iii)反义：否  (vi)来源：
  (B)生物：谷氨酸棒杆菌
  (B)菌株：ATCC13032(ix)特征：
  (A)名称/关键：CDS
  (B)位置：351..1163
  (C)其它信息：/密码_起始＝351
               /EC_号＝4.1.2.12
               /产品＝“酮泛解酸羟甲基转移酶”
               /基因＝“panB”(ix)特征：
 (A)名称/关键：CDS
 (B)位置：1166..2002
 (C)其它信息：/密码_起始＝1166
              /EC_号＝6.3.2.1
              /产品＝“泛酸合成酶”
              /基因＝“panC”(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA    60GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA   120AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA   180CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG   240TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT   300GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC      356
                                                   Met ProATG TCA GGC ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA     404Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe Arg Glu
140                 145                 150GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG     452Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala155                 160                 165                 170CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT     500Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val
            175                  180                185GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG    548Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser
        190                 195                 200ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT    596Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr Ile Ala
    205                 210                 215ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG    644Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu
220                 225                 230GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA    692Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met Arg Glu235                 240                 245                 250ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG    740Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile Ala Gln
            255                260                 265ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC    788Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly His Ile
        270                 275                 280GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG    836Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gln
    285                 290                 295GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG    884Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg Ala Leu
300                 305                 310GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG    932Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu315                 320                 325                 330GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC    980Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile Gly Ile
            335                 340                 345GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC    1028Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln Asp Ala
        350                 355                 360TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC    1076Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala
    365                 370                 375ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT    1124Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile Ala Asp
380                 385                 390ATC CAC GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG     1171Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe    Met Gln395                 400         405                      1GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA    1219Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His His Lys
      5                  10                  15TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC    1267Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly His Ala
 20                  25                  30TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT    1315Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val Ala Ser35                  40                  45                  50ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT    1363Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys Asp Asp
             55                  60                  65TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA    1411Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu Leu Glu
         70                  75                  80GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC    1459Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu Met Tyr
     85                  90                  95CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA    1507Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile Gly Thr
100                 105                 110AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC    1555Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val Ala Thr115                 120                 125                 130GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT    1603Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala Tyr Phe
            135                 140                 145GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC    1651Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu Val Ala
        150                 155                 160GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC    1699Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile Arg Gly
    165                 170                 175GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT    1747Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser Ala Asp
180                 185                 190CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG    1795Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly Leu Gln195                 200                 205                 210CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC    1843Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala Arg Asp
            215                 220                 225ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC    1891Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu Ile Val
        230                 235                 240GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA    1939Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu Thr Gln
    245                 250                 255CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC      1987Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg Leu Ile
260                 265                 270GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC      2042Asp Asn Ile Glu Leu275GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT    2102GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA    2162CA                                                                   2164(2)关于SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征
 (A)长度：271个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Pro Met Ser Gly Ile Asp Ala Lys Lys Ile Arg Thr Arg His Phe1               5                  10                  15Arg Glu Ala Lys Val Asn Gly Gln Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr
         20                  25                  30Asp Ala Leu Ser Ala Arg Ile Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu
     35                  40                  45Leu Val Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr
 50                  55                  60Leu Ser Ile Thr Leu Asp Glu Met Ile Val Leu Ala Lys Ala Val Thr65                  70                  75                  80Ile Ala Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr
             85                  90                  95Tyr Glu Val Ser Pro Asn Gln Ala Val Glu Ser Ala Ile Arg Val Met
        100                 105                 110Arg Glu Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys Ile Glu Gly Gly Val Glu Ile
    115                 120                 125Ala Gln Thr Ile Arg Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Pro Val Val Gly
130                 135                 140His Ile Gly Tyr Thr Pro Gln Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val145                 150                 155                 160Val Gln Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu Ile Ala Asp Ala Arg
            165                 170                 175Ala Leu Glu Gln Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro
        180                 185                 190Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser Ile Thr Thr Ile
    195                 200                 205Gly Ile Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gln Val Leu Val Trp Gln
210                 215                 220Asp Ala Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu225                 230                 235                 240Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gln Ala Tyr Ile
            245                 250                 255Ala Asp Ile His Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe
        260                 265                 270(2)关于SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征
 (A)长度：279个氨基酸
 (B)类型：氨基酸
 (D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Gln Val Ala Thr Thr Lys Gln Ala Leu Ile Asp Ala Leu Leu His1               5                  10                  15His Lys Ser Val Gly Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu His Ser Gly
         20                  25                  30His Ala Ser Leu Val Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp Thr Val Val
     35                  40                  45Ala Ser Ile Phe Val Asn Pro Leu Gln Phe Glu Ala Leu Gly Asp Cys
 50                  55                  60Asp Asp Tyr Arg Asn Tyr Pro Arg Gln Leu Asp Ala Asp Leu Ala Leu65                  70                  75                  80Leu Glu Glu Ala Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Pro Asp Val Glu Glu
             85                  90                  95Met Tyr Pro Gly Gly Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr Gly Ser Ile
        100                 105                 110Gly Thr Lys Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe Asp Gly Val
    115                 120                 125Ala Thr Val Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp Arg Ala
130                 135                 140Tyr Phe Gly Gln Lys Asp Ala Gln Gln Val Ala Val Ile Arg Arg Leu145                 150                 155                 160Val Ala Asp Leu Asp Ile Pro Val Glu Ile Arg Pro Val Pro Ile Ile
            165                 170                 175Arg Gly Ala Asp Gly Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gln Arg Leu Ser
        180                 185                 190Ala Asp Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val Leu Pro Gln Val Leu Ser Gly
    195                 200                 205Leu Gln Arg Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp Ile Gln Gly Ala
210                 215                 220Arg Asp Thr Leu Ala Ser Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His Leu Glu225                 230                 235                 240Ile Val Asp Pro Ala Thr Leu Glu Pro Leu Glu Ile Asp Gly Leu Leu
            245                 250                 255Thr Gln Pro Ala Leu Val Val Gly Ala Ile Phe Val Gly Pro Val Arg
        260                 265                 270Leu Ile Asp Asn Ile Glu Leu
    275

Claims (24)

1.一种重组DNA，能在棒杆菌和埃希氏菌属微生物中复制并含有编码天冬氨酸-1-脱羧酶的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的可复制DNA，其核苷酸序列编码来自棒杆菌的panD并且其位置在图1中表示。
3.根据权利要求2所述的可复制DNA，包括：
(i)SEQ ID No.1中所示的编码panD的核苷酸序列，或者
(ii)在遗传密码简并性区域内对应于序列(i)的序列，或者
(iii)与互补于序列(i)或(ii)的序列杂交的序列，以及选择性地
(iv)(i)中的中性意义突变。
4.通过导入根据权利要求1-3中的任意一项所述的可复制DNA转化的微生物，尤其棒杆菌或埃希氏菌属微生物。
5.质粒载体pND-D2，以图2中所示的限制性图谱为特征并作为谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-D2以保藏号DSM12438保藏。
6.质粒载体pND-DBC2，以图4中所示的限制性图谱为特征并作为谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pND-DBC2以保藏号DSM12437保藏。
7.制备D-泛酸的方法，其中panD基因和选择性地其它编码天冬氨酸-L-脱羧酶的核苷酸序列在微生物中扩增(过量表达)，并且将这些微生物用于发酵。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于通过用带有这些基因或核苷酸序列的质粒载体转化微生物来增加基因或核苷酸序列的拷贝数从而实现扩增或通过染色体扩增来实现扩增。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于通过突变位于结构基因上游的启动子和调控区域来实现过量表达。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于通过在结构基因上游掺入表达盒来实现过量表达。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于通过延长相应mRNA的寿命和/或防止相应酶蛋白的降解来增强panD基因在微生物中的表达。
12.根据权利要求8-11所述的方法，其特征在于panD基因在带有其它代谢物或抗代谢物抗性基因突变的微生物中过量表达。
13.根据权利要求8-12所述的方法，其特征在于通过在改良的适当培养基中发酵微生物或改变发酵技术来实现过量表达。
14.根据权利要求8-13所述的方法，其特征在于使用其中减弱泛酸盐(泛酸)形成的代谢途径至少部分被关闭的微生物。
15.根据权利要求8-14所述的方法，其特征在于使用微生物，其中除了panD基因，泛酸合成代谢途径的其它基因也单独或全部地得到扩增(过量表达)。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于使用微生物，其中除了panD基因，编码酮泛解酸羟甲基转移酶(E.C.4.1.2.12)和泛酸合成酶(E.C.6.3.2.1)的一种或多种基因、尤其是源于棒杆菌的那些基因得到扩增(过量表达)。
17.根据权利要求15和16所述的方法，其特征在于使用以单独含有上述基因的各种相容性质粒载体转化的微生物。
18.根据权利要求15和16所述的方法，其特征在于使用以质粒载体转化的菌株，而且质粒载体含有一种或多种上述基因包括panD基因，其中基因连续排列并在共同启动子的控制之下或彼此分开在不同启动子的控制之下。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于使用以质粒载体pND-D2转化的微生物。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于使用以质粒载体pND-DBC2转化的微生物。
21.制备泛酸的方法，其特征在于进行下列步骤：
a)根据一个或多个前述权利要求所述的微生物的发酵，其中至少panD基因得到扩增(过量表达)，选择性地与panB和/或panC基因结合。
b)泛酸在培养基或微生物细胞中的富集，和
c)泛酸的分离
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于过量表达的基因来自棒杆菌属微生物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于在步骤a)中加入从包括天冬氨酸、β-丙氨酸、酮泛解酸、酮异戊酸和泛解酸的群体中选出的泛酸前体。
24.根据一个或多个前述权利要求所述的方法，其特征在于使用埃希氏菌或棒杆菌属微生物。
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