SK163399A3 - Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms - Google Patents

Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms Download PDF

Info

Publication number
SK163399A3
SK163399A3 SK1633-99A SK163399A SK163399A3 SK 163399 A3 SK163399 A3 SK 163399A3 SK 163399 A SK163399 A SK 163399A SK 163399 A3 SK163399 A3 SK 163399A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
gene
leu
microorganisms
gly
Prior art date
Application number
SK1633-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicole Dusch
Jorn Kalinowski
Alfred Puhler
Original Assignee
Degussa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa filed Critical Degussa
Publication of SK163399A3 publication Critical patent/SK163399A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Description

Kyselina pantoténová predstavuje komerčne významný vitamín, ktorý nachádza uplatnenie v kozmetike, lekárstve a vo výžive íudí aj zvierat.
Kyselina pantoténová môže byť vyrobená pomocou chemickej syntézy alebo biotechnologický pomocou fermentácie vhodného mikroorganizmu vo vhodnom živnom roztoku. Pri chemickej syntéze je dôležitým medziproduktom DL-pantolaktón. DL-pantolaktón sa vyrába viacstupňovou syntézou z formaldehydu, izobutylaldehydu a kyanidu. V ďalších krokoch syntézy sa potom delí vzniknutá racemická zmes a kondenzáciou D-pantolaktónu s β-alanínom sa získa kyselina D-pantoténová.
Výhodou fermentatívneho spôsobu výroby pri pomoci mikroorganizmov je, že vzniká požadovaný stereoizomér a to D-forma kyseliny pantoténovej, ktorá je celkom bez L-formy.
Doterajší stav techniky
Rôzne druhy baktérií, ako sú napríklad Escherichia coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes alebo tiež kvasiniek, ako sú napríklad Debaromyces castellii, môžu v živnom roztoku obsahujúcom glukózu, DL-pantoinovú kyselinu a β-alanín, produkovať kyselinu D-pantoténovou, ako je to opísané v EP-A 0 493 060.
V spise EP-A 0 493 060 sa ďalej uvádza, že pri baktériách Escherichia coli je možné zosilnením génov pre biosyntézu kyseliny pantoténovej, ktoré sa nachádzajú v plazmidoch pFV3 a pFVS, zvýšiť tvorbu tejto kyseliny v kultivačnom médie obsahujúcom glukózu, DL-pantoinovú kyselinu a β-alanín.
EP-A 0 590 857 a patent USA č.: 5,518,906 opisujú mutantné kmene baktérií odvodené od Escherichia coli IFO03547, označené ako FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 a FV5069, ktoré nesú rezistenciu k rôznym antimetabolitom, ako napríklad ku kyseline salicylové, α-ketomaslovej kyseline, β-hydroxyasparágovej kyseline, a O-metyltreonínu a a-ketoizovalérovej kyseline, a v živnom roztoku obsahujúcom glukózu a β-alanín produkujú D-pantoténovú kyselinu. V dokumente EPA0 590 857 a v patente USA 5,518,906 sa ďalej uvádza, že zosilnením génov pre biosyntézu kyseliny pantoténovej, ktoré sa nachádzajú v plazmide pFV31, je možné v hore uvedených kmeňoch E. coli zvýšiť produkciu D-pantoinovej kyseliny v kultivačnom médie obsahujúcom glukózu a produkciu D-pantoténovej kyseliny v kultivačnom médie obsahujúcom glukózu a β-alanín.
Dokument WO 97/10340 okrem to opisuje, že v kmeňoch baktérií Escherichia coli, ktoré vytvárajú kyselinu pantoténovú, je možné ďalej zvýšiť produkciu kyseliny pantoténovej zvýšením aktivity syntázy hydroxyoctovej kyseliny II - enzýmu, ktorý sa podiela na biosyntéze valínu.
Podstata vynálezu
Vynález sa snaží opísať nové základy pre zlepšené spôsoby fermentatívnej výroby kyseliny D-pantoténovej.
Vitamín pantoténová kyselina predstavuje komerčne významný produkt s využitím v kozmetike, lekárstve a vo výžive ludí aj zvierat. Z toho vyplýva všeobecný záujem o vylepšený spôsob výroby pantoténovej kyseliny.
V nasledujúcom texte sa výrazmi D-pantoténová kyselina alebo pantoténová kyselina alebo pantotenát rozumie nielen voíná kyselina, ale tiež jej soli, ako napríklad vápenatá, sodná, amónna alebo draselná sol.
Predmetom vynálezu je okrem iného spôsob fermentatívnej výroby kyseliny D-pantoténovej pri použití mikroorganizmov, a to najmä takých, ktoré už produkujú D-pantoténovú kyselinu, a v ktorých je samostatne alebo v kombinácii s génmi panB a/alebo panC zosilnený gén panD kódujúci L-aspartát-l-dekarboxylázu (E.C. 4.1.1.11), pričom zosilnením je osobitne zvýšenie expresie génu. Vynález ďalej opisuje príslušné rekombinantné DNA sekvencie, ktoré sú ďalej opísané v nárokoch. Predmetom vynálezu sú rovnako spôsoby fermentatívnej výroby kyseliny D-pantoténovej využívajúce zlepšené, kyselinu D-pantoténovú produkujúce mikroorganizmy, ktoré boli vytvorené podlá nárokov 8 až 17.
Výrazom zosilnenie sa v tomto prípade rozumie zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekolkých enzýmov, ktoré sú v mikroorganizmu kódované príslušnými DNA, napríklad tým, že sa zvýši počet kópií génu (génov) na bunku, použije sa silný promotor, alebo sa použije gén kódujúci enzým so zvýšenou aktivitou, prípadne kombinácia týchto účinkov.
Predmetom vynálezu sú ďalej mikroorganizmy, ktoré sú schopné vytvárať kyselinu pantoténovú z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo
I ’ z glycerínu a etanolu. Môže ísť huby, kvasinky alebo o Grampozitívne baktérie napríklad rodu Corynebacteriun alebo Gramnegatívne baktérie ako sú napríklad Enterobacteriaceae.
Z enterobaktérií je potrebné menovať najmä rod Escherichia a druh Escherichia coli. Z baktérií patriacich k druhu Escherichia coli je potrebné ďalej menovať takzvané kmene K-12 ako sú napríklad kmene MG1655 alebo W3110 (Neidhard et al. Escherichia coli and Salmonella·, Cellular and Molecular Biology,
ASM Press, Washington D.C.) alebo prirodzene sa vyskytujúci kmeň (wild type) Escherichia coli IF03547 (Inštitút fermentácie, Osaka, Japonsko) a od nich odvodené mutanty. Z baktérií rodu Corynebacterium je potrebné uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktoré sú odborníkom známe vďaka svojej schopnosti produkovať aminokyseliny. K tomuto druhu baktérií patria prirodzene sa vyskytujúce kmene ako napríklad Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 a od nich odvodené kmene.
Vynález ďalej opisuje skutočnosť, že k zvýšenej produkcii kyseliny D-pantoténovej dochádza po zosilnení expresie novo izolovaného génu panD, ktorý kóduje L-aspartát-l-dekarboxylázu (E.C. 4.1.1.11). Vo výhodnom rozpracovaní tento gén pochádza z baktérií Corynebacterium glutamicum.
Vynález ďalej opisuje skutočnosť, že zvýšená expresia génu panD má výhodné účinky v takých kmeňoch baktérií, v ktorých je súčasne zvýšená expresia génov panB a panC, ktoré kódujú ketopantoát hydroxymetyl-transferázu respektíve pantotenát syntetázu. Výhodné účinky týchto génov sa prejavujú keď je zvýšená expresia každého zvlášť alebo obidvoch dohromady.
Zvýšenie expresie génu je možné dosiahnuť napríklad zvýšením počtu kópií príslušného génu na bunku alebo mutáciou v oblasti promotoru a/alebo v regulačnej oblasti proti smeru transkripcie od štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom môžu účinkovať expresné kazety zabudované proti smeru transkripcie od štruktúrneho génu. Pomocou indukovateľných promotorov je možné ďalej zosilniť expresiu počas fermentatívnej produkcie D-pantotenátu. Expresiu je možné ďalej zlepšiť predĺžením životnosti m-RNA v bunke alebo inhibíciou rozkladu enzymatických proteínov. Gény alebo rekombinantné génové konštrukty podlá vynálezu sa pritom nachádzajú v plazmidovom vektore s rôznym počtom kópií na bunku alebo sú integrované v chromozómu a amplifikované. Alternatívne môže byť expresia príslušného génu ďalej zvýšená zmenou zloženia média a spôsobu kultivácie.
Návody na to môžu odborníci nájsť okrem iných v publikáciách Martin et al. (Bio/Technology 5, strana 137 až 146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, strana 35 až 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, strana 428 až 430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, strana 93 až 98 (1991)), v Európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v patente USA č.. 4,601,893, v publikáciách Schwarzer a Puhler (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, strana 1001 až 1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)) alebo v príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Manuál metód pre všeobecnú bakteriológiu) vydanej Americkou baktériologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA v roku 1981.
Okrem toho môže odborník nájsť rad návodov v článkoch Chang a Cohen (Journal of Bacteriology 134: strana 1141 až 1156 (1978)), Hartley a Gregori (Gene 13: strana 347 až 353 (1981)), Amann a Brosius (Gene 40: strana 183 až 190 (1985)), de Broer et al., (Proceedingš of the National of Sciences of the United States of America 80: strana 21 až 25 (1983), pri LaVallie et al.. (Bio/Technology 11, strana 187 až 193 (1993)), v prihláške PCT/US 97/13359, a v článkoch Llosa et al., (Plasmid 26: strana 222 až 224 (1991)), Quandt a Klipp (Gene 80: strana 161 až 169 (1989)), Hamilton (Journal of Bacteriology 171: strana 4617 až 4622 (1989)), Makrides (Microbiological Reviews 60: strana 512 až 538 (1996) a ďalej v zná mych učebniciach zameraných na výuku genetiky a molekulárnej biológie.
Pred vlastnou izoláciou génu panD alebo iných génov, napríklad génov panB a pane z baktérie C. glutamicum je najskôr nutné vytvoriť DNA knižnicu tohto mikroorganizmu v baktériách E. coli. Spôsob vytvorenia takejto DNA knižnice je opísaný vo všeobecne známych učebniciach a príručkách ako je napríklad učebnica Winnacker: Gene und Klone: Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Gény a Klony: Úvod do génového inžinierstva, nakladatelstvo Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručka Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Laboratórny manuál molekulárneho klonovania, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jednou takou známou knižnicou je knižnica E. coli K-12 kmeň W3110 v Λ-vektoroch vytvorená a opísaná Koharou et al. (pozri Celí 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe et al. opisujú (Molecular and General Genetics, 252: strana 255 až 265, 1996) DNA knižnicu baktérie C. glutamicum ATCC13032, vytvorenú pomocou kozmidu SuperCos I (Wahl et al. 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v baktériách E. coli K-12 kmeň NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575. Na prípravu DNA knižnice baktérie C. glutamicum v E. coli môžu byť použité tiež plazmidy ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) alebo pUCl9 (Norrander et al. 1983, Gene 26: strana 101 až 106). Ako hostitelské sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a a rekombinačne deficienI tné. Príkladom takého kmeňa sú bunky kmeňa DH5aMCR, pozri Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) strana 4645 až 4649.
Niektorým z hore uvedených spôsobov vytvorená DNA knižnica sa potom prenesie do indikátorového kmeňa nech už pomocou transformácie (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, strana 557 až 580, 1983) alebo elektroporácie (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až 347). Vhodný indikátorový kmeň sa vyznačuje tým, že obsahuje mutáciu vo vhodnom géne a to takú, ktorá vyvoláva viditeľnú zmenu fenotypu, napríklad závislosť od prídavku metabolitu do kultivačného média (auxotrofiu). Indikátorové kmene alebo mutanty je možné získať z publikovaných zdrojov a/alebo zo zbierok kmeňov a kultúr, alebo je možné ich prípadne aj priamo vytvoriť. Pre tento vynález majú veľký význam baktérie E. coli DV9 (pozri Vallari a Rock, Journal of Bacteriology 1985, 164: strana 136 až 142), ktoré majú mutáciu v géne panD. Iným príkladom E. coli s defektom v tvorbe pantoténovej kyseliny je kmeň SJ2, ktorý má mutáciu v géne panB a je možné ho získať z génovej banky Univerzity v Yale, New Haven, Connecticut,
USA.
Po transformácii indikátorového kmeňa, napríklad panD-mutantných buniek DV9, rekombinantným plazmidom, ktorý obsahuje hľadaný gén, napríklad gén panD, a po expresii príslušného génu, dôjde k zmene fenotypu indikátorového kmeňa, napríklad tento kmeň stratí závislosť od prídavku pantoténovej kyseliny v kultivačnom médie.
Takto izolovaný gén alebo DNA fragment môže byť ďalej opísaný a charakterizovaný určením jeho sekvencie, tak ak je to opísané napríklad Sangerom et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America, 74: strana 5463 až 5467, 1977). Sekvenciu génu je možné potom porovnať so t
známymi sekvenciami vo verejných databázach napríklad v databáze GenBank (Benson et al., 1998, Nuleic Acids Research, 26:
strana 1 až 7) a publikovanými spôsobmi ju analyzovať, pozri
Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: strana 403 až 410.
Týmto spôsobom bola získaná a spracovaná aj nová DNA sekvencia z baktérie C. glutamicum, ktorá je súčasťou vynálezu a je uvedená ako Sekvencia id. č.: 1. Ďalej boli z uvedenej DNA sekvencie hore opísanými metódami odvodené aminokyselinové sekvencie príslušného enzýmu. Sekvencia id. č.: 2 udáva poradie aminokyselín v produkte génu panD, menovito L-aspartát1-dekarboxylázy.
Ďalej boli uvedeným spôsobom získané aj nové sekvencie génov kódujúcich enzýmy panB a panC z baktérie C. glutamicum, ktoré sú rovnako súčasťou vynálezu ako Sekvencia id. č.: 3. Sekvencia id. č.: 4 udáva poradie aminokyselín v produkte génu panB, menovito ketopantoát hydroxymetyl transferázy a Sekvencia id. č.: 5 udáva poradie aminokyselín v produkte génu panC teda pantotenát syntetázy.
Vynález ďalej opisuje všetky čfalšie kódujúce DNA sekvencie, ktoré zodpovedajú Sekvencii id. č.: 1 a/alebo 3 v dôsledku degenerácie genetického kódu. Vynález rovnako opisuje všetky sekvencie DNA, ktoré hybridizujú so Sekvenciou id. č.: l a/alebo 3. Odborníkom sú ďalej známe konzervatívne zámeny aminokyselín ako je napríklad zámena glycínu za alanín alebo zámena kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú. Tieto zámeny aminokyselín sa nazývajú sense mutations a s ohladom na to, že nevedú k zásadnej zmene aktivity proteínu nazývajú sa rovnako funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny v N- a/alebo C-konci proteínu nemívajú zásadný negatívny vplyv na funkciu proteínu, dokonca v niektorých prípadoch môže dôjsť aj k jej stabilizácii. Odborník môže nájsť údaje, ktoré to potvrdzujú okrem iných v práci Ben-Bassata et al. v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), O'Regana et al. v časopise Gene 77: strana 237 až 251 (1989), Sahin-Totha et al. v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 (1994), Hochuliho et al. v Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 (1988) a v známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré sú v tomto zmysle analogické Sekvenciám id. č.:· 2, id. č.: 4 a/alebo Sekvencii id. č.: 5 sú teda rovnako predmetom vynálezu.
Takto charakterizovaný gén môže byt následne samostatne alebo v kombinácii s ďalšími génmi exprimovaný vo vhodnom mikroorganizme. Jeden spôsob expresie, respektíve zvýšenej expresie (over-expression) génov spočíva v tom, že sa gén amplifikuje pomocou plazmidového vektoru, ktorý navyše obsahuje regulačné sekvencie fungujúce ako signály pre expresiu. Pri výbere vhodného plazmidu prichádzajú do úvahy také, ktoré sú schopné sa v príslušných mikroorganizmoch replikovať. Pre baktérie E. coli je možné brat do úvahy napríklad vektory pSCIOl (Vocke a Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21), strana 6557 až 6561 (1983)) alebo plazmid pKK223—3 (Brosius a Holý, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81, 6929 (1984), pre baktérie Corynebacterium glutamicum potom sú to napríklad vektory pEKExl (pozri Eikmanns et al., Gene 102: strana 93 až 98 (1991)), pZ8-l (Európsky patentový spis 0 375 889).
Príkladom mikroorganizmov pódia vynálezu sú kmene baktérie C. glutamicum ATCC13032/pND-D2 a ATCC13032/pND-DBC2 a kmeň baktérie E. coli MG1655/PND-D2, ktoré obsahujú plazmidy pND-D2 a pND-DBC2. Plazmid pND-D2 je kyvadlový vektor pre E. coli-C. glutamicum založený na plazmide pZ8-l a obsahujúci gén panD z C. glutamicum. Plazmid pND-DBC2 je kyvadlový vektor pre E.coli a C. glutamicum založený na plazmide pZ8-l a obsahujúci t J gény panD, panB a panC z C. glutamicum.
Odborníkom je zrejmé, že je výhodne možné skombinovať spôsoby pódia vynálezu s chromozornáInými mutáciami, ktoré spôsobujú rezistenciu k metabolitom a antimetabolitom, prípadne bránia vylučovaniu medziproduktov syntézy pantoténovej kyseliny.
Mikroorganizmy skonštruované podlá vynálezu môžu byť za účelom produkcie kyseliny D-pantoténovej kultivované kontinuálnym spôsobom, alebo spôsobmi diskontinuálnymi, nech už vsádzkovou kultiváciou alebo prítokovou kultiváciou. Prehlad známych spôsobov kultivácie je uvedený v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechník, nakladatelstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenia, nakladatelstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené v príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú bakteriológiu) vydaný Americkou baktériologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981. Ako zdroj uhlíka môžu byť použité cukry a uhlohydráty ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byt použité buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje dusíka môžu byť použité zlúčeniny obsahujúce organický dusík ako napríklad peptón, kvasničný
I extrakt, extrakt z masa, extrakt zo sladu, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka môžu byť použité bud jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu je možné použit hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný alebo zodpovedajúce sodné soli. Ako zdroj fosforu je možné použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný alebo zodpovedajúce sodné soli. Kultivačné médium musí dfalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nezbytné pre rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnátý. A konečne môže byt kultivačné médium okrem hore uvedených látok oboha- , tené o esenciálne rastové látky ako napríklad aminokyseliny a vitamíny. Na zvýšenie tvorby kyseliny pantoténovej je možné kultivačné médium ešte obohatiť o jej prekurzory ako sú napríklad aspartát, β-alanín, ketoizovalerát, ketopantoát, pantoát a prípadne príslušné soli. Uvedené zložky môžu byt pridané do média jednorázovo na počiatku, alebo vhodným spôsobom počas kultivácie.
Na kontrolu pH počas kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny ako napríklad hydroxíd sodný, hydroxíd draselný, amoniak alebo kyslé zlúčeniny ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi je možné kontrolovať prídavkom činidiel potlačujúcich tvorbu peny ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov je možné udržať prostredníctvom vhodného selekčného činidla napríklad antibiotika. Vhodné aeróbne podmienky je možné udržovať privádzaním kyslíka alebo kyslík obsahujúcej zmesi plynov, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na kultiváciu baktérií sa normálne pohybuje od 20’C do 50’C a výhodne od 25’C do 45’C. Čas kultivácie by mal byt taký, aby bolo dosiahnuté maximum tvorby pantoténovej kyseliny. Toto maximum je zvyčajne dosiahnuté počas 10 až 160 hodín.
I
Kmene, vykazujúce vysokú aktivitu enzýmu L-aspartát 1-dekarboxylázy, môžu byt rovnako použité na výrobu β-alanínu z L-aspartátu. Na to môžu byt použité fermentatívne spôsoby, alebo primá enzymatická premena alebo kombinácia obidvoch spôsobov.
Koncentráciu produkovanej pantoténovej kyseliny je možné stanoviť známymi spôsobmi (pozri Velisek; Chromatographic Science 60, strana 515 až 560 (1992).
Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, SRN) podía ustanovení Budapeštianskej zmluvy:
- Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2 ako DSM12438
- Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-DBC2 ako DSM12437
Opis obrázkov
Obrázok 1: na obrázku je schematicky znázornená mapa kontigu 13 s otvorenými čítacími rámcami orfl až orf-5.
Obrázok 2: schematická mapa plazmidov pZ8-l, pND-Dl a pND-D2.
Obrázok 3: schematická mapa fragmentu DNA klonovaného do plazmidu pURl a poloha sekvenovaných úsekov. Skratky: Ss - cieíové miesto SspI, Sc - cieíové miesto Seal, Ps - cieíové miesto PstI, Pv - cieíové miesto PvuII, Sa - cieľové miesto Sali, Sp - delové miesto Sphl a Ec - cieíové miesto EcoRI.
Obrázok 4: schematická mapa plazmidov pND-DBCl a pND-DBC2
Na obrázkoch použité skratky a symboly majú nasledujúci významy:
rrnBTlT2 - terminátor transkripcie génu rrnB
Ptac - promotor tac panB - kódujúca oblasť génu panB panC - kódujúca oblasť génu panC panD - kódujúca oblasť génu panD rep-C.g. - oblasť nezbytná na replikáciu v baktériách C. glutamicum oriV-E.c. - oblasť nezbytná na replikáciu v baktériách E. coli kan - gén pre rezistenciu ku kanamycínu
EcoRI - cieľové miesto reštrikčného enzýmu EcoRI
E - cieľové miesto reštrikčného enzýmu EcoRI
BamHI - cieľové miesto reštrikčného enzýmu BamHI
B - cieľové miesto reštrikčného enzýmu BamHI
BglII - cieľové miesto reštrikčného enzýmu BglII
Clal - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Clal
H - cieľové miesto reštrikčného enzýmu HindlII mcs - klonovací polylinker (multiple cloning site)
Ncol - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Ncol
Nrul - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Nrul
Nsil - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Nsil
P - cieľové miesto reštrikčného enzýmu PstI
Pvul - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Pvul
Sací - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Sací
Sali - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Sali
Seal - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Seal
Sphl - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Sphl
X - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Xbal
Xhol - cieľové miesto reštrikčného enzýmu Xhol.
Vynález je bližšie opísaný v nasledujúcich príkladoch.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie a sekvenovanie génu panD z baktérie C. glutamicum
1. Klonovanie génu panD
Chromozomálna DNA z baktérie C. glutamicum ATCC13032 bola izolovaná spôsobom podlá Taucha et al., 1995, Plazmid,
I
33: strana 168 až 179, a čiastočne naštiepená reštrikčnou endonukleázou Sau3A (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Nemecko), katalógové číslo 27-0913-02). DNA-fragmenty s veľkosťami 7 až 9 kb boli izolované pomocou súpravy Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey a Nagel, Duren, Nemecko; kat. čís. 740584) a naligované do defosforylovaného cieľového miesta BamHI vektoru pUC19 (Narrander et al. 1982, Gene, 26: strana 101 až 106), dodaného firmou MBI Fermentas (Vilnius, Litva).
Ligácia bola vykonaná v podstate tak, ako je to opísané v príručke Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor), pričom bola zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Nemecko) inkubovaná cez noc. Touto ligačnou zmesou boli potom elektroporované (pozri Tauch, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až a347) baktérie E. coli kmeň DH5amcr (pozri Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87 (1990) strana 4645 až 4649) a potom boli vysiate na LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 100 μg/ml ampicilínu. Po 24 hodinovej inkubácii pri 37“C a opätovnej izolácii plazmidovej DNA metódou alkalickej lýzy (pozri Birnboim a Doly (Nucleic Acids Research,
7: strana 1513 až 1523, 1997) bola získaná genómová knižnica baktérie C. glutamicum.
Touto knižnicou boli elektroporované kompetentné bunky E. coli kmeň DV9 (Vallari a Rock, 1985, Journal of Bacteriology, 164: strana 136 až 142), ktoré nesú mutáciu v géne panD. Elektroporačná zmes bola najskôr ponechaná regenerovať (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: strana 343 až
347) a potom dvakrát premytá médiom E (Vogel a Bonner, 1956, Journal of Biological Chemistry, 218: strana 97 až 106). Zloženie média E udáva tabulka 1. Týmito bunkami bolo potom inokulovaných 50 ml média E s prídavkom 100 ug/ml ampicilínu v 250 ml Erlenmeyerových bankách a tieto banky boli inkubované v trepačke pri 250 otáčkach/min a teplote 39’C. Po dvojdennej inkubácii bola bakteriálna suspenzia nariedená a preočkovaná na LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190), s prídavkom 100 pg/mililiter ampicilínu.
Tabulka 1: Zloženie média E
Zlúčenina Množstvo na 1 1 Poznámka
K2HPO4 10 g
NaNH4HP04.4H2O 3,5 g
Kyselina citrónová 2 g 1
MgSO4.7H2O 0,2 g
Glukóza 4 g Sterilizovaná oddelene
Tiamín 0,2 ug Sterilné filtrovaný
Potom bola vyizolovaná plazmidová DNA z jednej kolónie transformovaných DV9 buniek. Velkosť tohto plazmidu, označeného ako pŇIC-1.3, bola stanovená porovnaním so štandardami v elektroforéze na agarózovom géli (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Plazmid pNIC-1.3 obsahuje inzert s veľkosťou 7 kbp. Schopnosť plazmidu pNIC-1.3 komplementovať mutáciu v panD géne v bunkách DV9 bola potvrdená opätovnou transformáciou. Takto získané transformanty boli opäť schopné rásť v médie E, ktoré neobsahuje β-alanín za hore uvedených podmienok.
Tento 7 kb inzert bol ďalej subklonovaný naštiepením plazmidu pNIC-1.3 reštrikčnými enzýmami BamHI (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Nemecko, kat. č. 27-0868-03), EcoRI (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Nemecko, kat. č. 27-0884-03) a BglII (Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Nemecko, kat.č. 270946-02) a potom bol zaligovaný do zodpovedajúcimi enzýmami naštiepeného vektoru pKl8mob (Schäfer, 1994, Gene, 145: strana 69 až 73). Získanou ligačnou zmesou boli elektroporované bunky E. coli DV9 (s mutáciou v géne panD) a bola vykonaná selekcia na transformanty s komplementujúcim fenotypom za hore uvedených podmienok, pričom platne s agarózou v tomto prípade obsahovali 50 μg/ml kanamycínu. Boli izolované plazmidy z jednotlivých kolónií s komplementujúcim fenotypom a tie boli charakterizované pomocou reštrikčnej analýzy. Jeden EcoRlsubklon, ďalej označovaný ako pNIC-10, ktorý obsahoval asi 3 kb velký DNA-inzert bol vybraný na ďalšiu sekvenčnú analýzu.
2. Sekvenovanie génu panD
Počas dvoj vláknového sekvenovania 3 kb fragmentu z plazmidu pNIC-10 bol tento plazmid najskôr naštiepený s rôznymi reštrikčnými enzýmami a vzniknuté fragmenty boli preklonované do plazmidov pUCl9 alebo pK18mob. Plazmidová DNA použitá na sekvenovanie bola izolovaná podlá inštrukcií výrobca kitom QIAGEN Plasmid Mini kit (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA, USA) a jej velkosť bola určená pomocou elektroforézy na agarózovom géli.
Vlastné sekvenovanie bolo vykonané pomocou Sangerovej metódy terminácie DNA reťazca dideoxynukleotidmi, pozri Sanger et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467, s modifikáciami podľa Zimmermanna (Nucleic Acids Research,
18: strana 1067, 1990). Bol na to použitý Cy5-AutoRead Sequencing kit Pharmacia (kat. čís. 27-2690-02, Freiburg, Nemecko) . Elektroforetická analýza sekvenačnej zmesi bola vykonaná v polyakrylamidovom géli Long Ranger Gel Solution od firmy FMC BioProducts (Rockland, Me., USA) na automatickom sekvenátore využívajúcom laserom excitovanú fluorescenciu (A.L.F.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná hrubá nukleotidová sekvencia bola potom analyzovaná programovým balíkom Staden (Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231, 1986, verzia 97-0). Jednotlivé sekvencie subklonov plazmidu pNIC-10 boli zostavené do súvislého 3060 bp dlhého kontigu, ktorý bol potom označený ako kontig 13. Počítačová analýza celého DNA fragmentu programom XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231) pomohla identifikovať päť otvorených čítacích rámcov (ORF). Na obrázku 1 je znázornená reštrikčná mapa kontigu 13 ako tiež poloha jednotlivých čítacích rámcov orf-1 až orf-5. Pomocou programu BLAST (pozri Gish and States, 1993, Náture of Genetics, 3: strana 266 až 272; Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215: strana 403 až 410) bola študovaná homológia týchto čítacích rámcov, tak ako to umožňuje on-line služba na servre NCBI Národnej lékárskej knižnice (National Library of Medicíne, Bethesda, MD, USA). Z analýzy Kontigu 3 vyplýva, že orf-3 zodpovedá génu panD. V ďalšom texte sa teda orf-3 označuje ako panD. Nukleotidová sekvencia DNA fragmentu nesúceho gén panD je uvedená ako Sekvencia id. č.: 1. Aminokyselinová sekvencia produktu génu panD, teda rovnako L-asparI ‘ 1 tát 1-dekarboxylázy je uvedená ako Sekvencia id. č.: 2.
Príklad 2
Klonovanie a sekvenovanie génov panB a panC z baktérie C. glutamicum
1. Klonovanie génov panB a panC
Chromozomálna DNA z baktérie C. glutamicum ATCC13032 bola izolovaná spôsobom podlá Schwarzera a Púhlera (Bio/Technology 9 (1990) strana 84 až 87) a naštiepená reštrikčnou endonukleázou Sau3A. Po elektroforetickom rozdelení boli extrahované fragmenty DNA s velkostami 3 až 7 kb respektíve 9 až 20 kb a tie boli následne naligované do jedinečného delového miesta BamHI vo vektore pBR322.
Ligačnou zmesou boli potom transformované baktérie E. coli kmeň DH5amcr (pozri Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, (1990) strana 4645 až 4649; Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) strana 557 až 580). Kolónie nesúce inzert boli identifikované na základe ich citlivosti k tetracyklínu po preočkovaní na platne s LB-agarózou a prídavkom 10 μς/ιηΐ tetracyklínu. Po vyizolovaní plazmidov (pozri Sambrook et al., Molecular cloning; A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press) boli klony rozdelené do 8 skupín po 400 plazmidoch s inzertom s veľkosťou 9 až 20 kb a do 9 skupín po 500 plazmidoch s inzertom s veľkosťou 3 až 7kb. Baktérie E. coli panB s mutáciou SJ2 (pozri Cronan et al. 1982, Journal of Bacteriology 149: strana 916 až 922) boli elektroporáciou transformované touto knižnicou, pozri Wehrmann et al., 1994, Microbiology 140: strana 3349 až 3356. Transformačné zmesi boli vysiate priamo na médium CGXII s prídavkom 15 g/1 agaru (pozri Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: strana 5595 až 5603). Z klonov, ktoré boli schopné rásť bez prídavku pantotenátu, bola vyizolovaná plazmidová DNA (pozri Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbour Laboratory Press). Pri 8 plazmidoch bola pomocou opätovnej transformácie potvrdená schopnosť heterologne komplementovať defekt v géne panB pri baktériách E. coli s mutáciou SJ2.
Pri týchto 8 plazmidoch bola vypracovaná reštrikčná mapa. Jeden z takto študovaných plazmidov, následne pomenúvaný ako pURl, obsahoval inzert s veľkosťou 9,3 kb (pozri obrázok 2). Transformáciou baktérií E. coli s mutáciou DV39 v géne panC (pozri Vallari a Rock, 1985, Journal of Bacteriology 164: strana 136 až 142) bolo potvrdené, že vektor pURl je rovnako schopný komplementovať defekt v géne panC v tomto mutante.
2. Sekvenovanie génov panB a panC
Fragment inzertu s veľkosťou 2,2 kb (pozri obrázok 3) z plazmidu pURl bol sekvenovaný pomocou Sangerovej metódy terminácie DNA reťazca dideoxynukleotidmi, pozri Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: strana 5463 až 5467. Na to boli najskôr zhotovené pomocou exonukleázy III menšie fragmenty a tie boli sekvenované pomocou štandardných prajmerov (univerzálneho a reverzného prajmeru firmy Boehringer Mannheim, Nemecko). Elektroforetická analýza sekvenačnej zmesi bola vykonaná automatickým sekvenátorom využívajúcim laserom excitovanú fluorescenciu (A.lLf.) od firmy Amersham Pharmacia Bio-Tech (Uppsala, Švédsko). Získaná nukleotidová sekvencia bola analyzovaná programovým balíkom HUSÁR (Verzia 4.0, EMBL, Cambridge, Veľká Británia). Táto nukleotidová sekvencia je uvedená ako Sekvencia id. č.: 3. Analýzou boli identifikované dva otvorené čítacie rámce. Jeden otvorený čítací rámec s dĺžkou 813 bp, bol identifikovaný ako gén panB, kódujúci polypeptid s dĺžkou 271 aminokyselín a je uvedený ako Se20 kvencia id. č.: 4. Druhý otvorený čítací rámec obsahujúci 837 párov báz bol identifikovaný ako gén panC, kódujúci polypeptid 279 aminokyselín dlhý je uvedený ako Sekvencia id. č.: 5.
Príklad 3
Konštrukcia vektorov vhodných na expresiu génov panD, panBC a panDBC
Gény na biosyntézu pantotenátu z baktérií C. glutamicum a E. coli boli amplifikované pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a syntetických oligonukleotidových prajmerov. Tieto PCR reakcie boli uskutočnené s Taq DNA polymerázou od firmy Gibco-BRL (Eggestein, Nemecko) v termálnom cyklere PCT-100 (MJ Research Inc., Watertown, Mass., USA). Po počiatočnej 2 minútovej denaturácii pri 94’c nasledovalo 35 cyklov skladajúcich sa z 90 sekundovej denaturácie pri 94’C, 90 sekundového annealingu pri teplote odvodenej od sekvencie prajmerov a vzorce Ta=[(2AT+4GC)-5]’C (pozri Suggs, et al., 1981, strana 683 až 593, v knihe: D. D. Brown, a C. F. Fox (editori), Developmental biology using purified genes, Academic Press, New York, USA) a konečne z 90 sekundovej polymerácie pri 72’C. Po 35 cykloch bola reakcia zakončená 10 minútovou polymeráciou pri 72’C. Takto amplifikované produkty boli potom elektroforeticky otestované na agarózovom géli a priamo ligované podlá inštrukcií výrobca do vektoru pCRR2.1 (TA Cloning Kit, Invitrogene, Leek,'Holandsko, kat. č.. KNM2030-01). Ligačná zmes bola použitá na transformáciu baktérií E. coli kmeň TOP10F’. Selekcia transformantov bola vykonaná 24 hodinovou inkubáciou pri teplote 37’C na platniach s LB-agarózou s prídavkom 100 gg/ml ampicilínu a 40 pg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro 3-Indolyl-p-D-Galaktozid).
Na základe nukleotidovej sekvencie génov na biosyntézu pantotenátu panD (Sekvencia id. č.: l) a panBC (Sekvencia id. č.: 3) z baktérií C. glutamicum ATCC 13032 a E. coli K12 (W. K. Merkel a B.P. Nichols, 1993, GenBank: L17086) boli nasyntetizované PCR prajmery (MWG Bio-Tech, Eberberg, Nemecko). Tieto prajmery boli vybrané tak, aby amplifikované fragmenty obsahovali vlastné gény, ako tiež pôvodné väzbové miesta pre ribozómy, avšak nie možné promotorové oblasti. Dodatočne bolo vložené takisto vhodné reštrikčné miesto, ktoré uľahčilo klonovanie do delového vektoru. Sekvencie týchto PCR-prajmerov vrátane vložených cieľových miest (podtrhnuté sekvencie) ako tiež opis nimi amplifikovaných génov (veľkosť fragmentov v bp je uvedená v zátvorkách) udáva nasledujúca tabuľka.
Tabuľka 2: Prajmery použité na amplifikáciu génov panD, panBC
Prajmer Sekvencie s reštrikčnými miestami Produkt Plazmid
panD-Ecl 5'-GAATTCGACAGGGTAGAAAGGTAGA-3' EcoRI panDj-.c. (462bp). 1 pND-Dl
panD-Ec2 5 * -AGATCTGGGATAACAATCAAGCAACC- 3' Bol 11
panD-Cgl 5'-CATCTCACGCTATGAATTCT-3' EcoRI panDc.q. (405bp) pND-D2
panD-Cg2 5'-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3’ PstI
panBC-El 5’- GGATČCCACAACATCAATTTATCAGG-3' BamHI panBCE.c. (1700 bp) pND-BCl
panBC-E2 5'-GGATCCTTAAGTATTACGCCAGCTC-3 ’ BamHI
panBC-Cl 5'-GTCGACTCTGAGCTGGTCATCACATC-3' Sali panBCc.g. (1700bp) pND-BC2
panBC-C2 5' -GTCGACACGCAGGGTTGGTACTAGAG-3' Sali
Ako základný vektor na expresiu ako v baktériách C. glutamicum tak aj v E. coli bol použitý kyvadlový expresný vektor pZ8-l pre E. coli - C. glutamicum (Európsky patentový spis 0 375 889, pozri obrázok 2). PCR produkty naklonované v predchádzajúcom kroku do vektoru pCRR2.1 boli pomocou reštrikčných miest obsiahnutých v prajmeroch naligované do rovnakých miest expresného vektoru pZ8-l a tým vložené pod kontrolu tac-promotoru, ktorý je obsiahnutý na tomto plazmide. Jedinou výnimkou bol PCR produkt génu panDEc. (EcoRI-BglII-fragment), ktorý bol vložený do kompatibilných reštrikčných miest EcoRI-BamHI vektoru pZ8-l. Označenia príslušných novo skonštruovaných expresných plazmidov sú uvedené v tabuľke 2.
Expresný vektor pZ8-l s génom panDEEc. z baktérie E. coli bol označený ako pND-Dl a pZ8-l s génom panDc g z baktérie C. glutamicum bol označený ako pND-D2. Zodpovedajúcim spôsobom boli označené expresné plazmidy obsahujúce gény panBEc. a panBc>g. ako pND-BCl respektíve pND-BC2. Na obrázku 2 je znázornená stratégia klonovania génov panDEc< a panDc>g> do vektoru pZ8-l. Správny výsledok klonovania všetkých génov do expresných plazmidov bol overený sekvenovaním príslušných inzertov.
Ďalej boli skonštruované umelé panDBC-operóny obsahujúce gény panD ako z baktérie E. coli tak aj z C. glutamicum. Pri konštrukcii operónu s génom panD z baktérie E. coli bol najskôr enzýmom·EcoRI naštiepený vektor pCR2.1 obsahujúci gén panDE c , plazmidová DNA bola rozdelená na agarózovom géli a fragment panD bol vyizolovaný z gélu spôsobom, ktorý bol opísaný v príklade 1.1, tzn. pomocou kitu Nucleotrap Extraction Kit for Nucleic Acids (Macherey a Nagel, Duren, Nemecko). V ďalšom kroku bol tento fragment naklonovaný do plazmidu pNDBCL naštiepeného enzýmom EcoRI. Plazmidy so správnou orientáciou génu panD boli získané tak, že ligačnou zmesou boli transformované bunky E. coli kmeň DV9, ktoré sú auxotrofné v géne panD, potom bola uskutočnená selekcia (pozri príklad 1) na komplementáciu auxotrofného fenotypu. Ďalej bola vyizolovaná plazmidová DNA komplementujúcicb mutantov a správne usporiadanie génov bolo overené sekvenovaním inzertu. Výsledný plazmid bol označený pND-DBCl a je znázornený na obrázku 4.
Pri konštrukcii operónu panDBC z baktérie C. glutamicum sa postupovalo obdobne. Vektor pCR2.1 obsahujúci gén panDc>g. bol najskôr naštiepený enzýmom EcoRI, pričom gén panDc.g. bol štiepený jednak v mieste, ktoré bolo vložené do prajmeru a jednak v ďalšom mieste EcoRI, ktoré pochádzalo zo sekvencie vektoru. Vzniknutý fragment génu bol po izolácii naklonovaný do vektoru pZ8-l naštiepeného rovnako enzýmom EcoRI. Plazmid so správnou orientáciou génu panD nazvaný pND-D4 bol získaný a otestovaný hore opísaným spôsobom. V ďalšom kroku bol plazmid pND-D4 štiepený reštrikčným enzýmom Sali a spojený s prečisteným fragmentom panBC, ktorý vznikol štiepením plazmidu pND—BC2 enzýmom Sali (Pharmacia Bio-Tech, Freiburg, Nemecko, kat. č.: 27-0882-01). Táto zmes bola elektroporovaná do baktérií E. coli kmeň DHSaMCR. 10 vzniknutých plazmidov bolo podrobených reštrikčnej analýze, čím bolo zistené správne usporiadanie génov panDBC. Správne usporiadanie génov jedného z týchto plazmidov, ďalej označeného ako pND-DBC2 (pozri obrázok 4), bolo overené sekvenovaním.
Expresným vektorom pZ8-l, ako tiež na tomto plazmide založenými konštruktami pND-Dl, pND-D2 a pND-DBCl, boli transformované baktérie E. coli kmeň MG1655 a vzniknuté transformanty boli selektované na LB-agaru (Lennox, 1955, Virology,
1: strana 190) s prídavkom 50 μg/ml kanamycínu. Takto získané kmene boli pomenúvané MGL655/PZ8-1, MG1655/PND-D1, MG1655/PNDD2 a MG1655/PND-DBC1.
Elektroporáciou plazmidov pZ8-l, pND-Dl, pND-D2 a pND-DBC2 do baktérií C. glutamicum kmeň ATCC13032 a následnou selekciou na LB-agare (Lennox, 1955, Virology, i: strana 190) s prídavkom 50 μg/ml kanamycínu boli získané kmene ATCC13032/pZ8-l, ATCC13032/ pND-Dl, ATCC13032/pND-D2 a ATCC13032/pND-DBC2.
Príklad 4
Produkcia pantotenátu v rôznych klonoch baktérií E. coli kmeň KÍ2
Kvantitatívne stanovenie D-pantotenátu bolo vykonané pomocou baktérií Lactobacillus plantarum (skúšobný kmeň: Lactobacillus plantarum ATCC 8014, kat. č.: No.3211-30-3; skúšobné kultivačné médium: Bacto Pantotenat Assay Médium (DIFCO Laboratories, Michigan, USA), kat. č.: 0604-15-3).
Tento indikátorový kmeň môže rásť len v prítomnosti pantotenátu v uvedenom kultivačnom médie. Rast baktérií je možné určiť z fotometrického merania a z lineárnej závislosti rastu od koncentrácie pantotenátu v médie. Na kalibráciu bola použitá vápenatá soí pantotenátu (Sigma, kat. č.: P-2250). Optická hustota bola meraná na spektrofotometre LKB Biochrom od firmy Pharmacia Bio-Tech (Freiburg, Nemecko) pri vlnovej dĺžke 580 nm (ďalej O.D.580).
V tomto teste produkcie pantotenátu boli baktérie E. coli klonov MG1655/PZ8-1, MG1655/PND-D1, MG1655/PND-D2 a MG1655/ PND-DBC1 po 16 hodinovej kultivácii v skúšobnom kultivačnom médie (médium E s prídavkom 50 μg/ml kanamycínu) pri O-D.580 = 0,1 preočkované do 50 ml rovnakého média. Po 5 hodinovej a 72 hodinovej kultivácii pri 37’C a trepaní pri 250 otáčkach za minútu boli baktérie peletované 10 minútovou centrifugáciou pri 5000 x g. Získaný bezbunkový supernatant bol sterilné pre25 filtrovaný a potom uskladnený pri teplote 4eC až vlastného stanovenia pantotenátu.
Stanovenie D-pantotenátu v supernatante kultivačného média bolo vykonané pomocou baktérií L. plantarum kmeň ATCC 8014 pódia inštrukcií firmy DIFCO (DIFCO manual, 10. vydanie, strana 1100 až 1102; Michigan, USA). Výsledky merania uvádza tabuika 3.
Tabuika 3
Kmeň Gén °*D*580 a akumulácia pantotenátu ^g/ml) po 5 hodinách po 5 hodinách
°·°·580 Pan. °*D*580 Pan.
MG1655/pZ8-l - 2,0 0,3 2,3 1,47
MG1655/pND-Dl PanDE.C. 2,3 0,9 2,5 6,95
MG1655/pND-DBCl panDBCE>c> 2,0 0,96 2,0 6,96
MG1655/pND-D2 PanDC.g. 2,3 4,07 2,3 9,66
Príklad 5
Produkcia pantotenátu v rôznych klonoch baktérií C. glutamicum . Tvorba pantotenátu baktériami C. glutamicum kmene
I
ATCC13032/pZ8-l, ATCC13032/pND-Dl, ATCC13032/pND-D2 a C. glutamicum ATCC13032/pND-DBC2 bola testovaná v médie CGXII (pozri Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology, 175: strana 5595 až 5603; tabuika 4), s prídavkom 25 μg/mililiter kanamycínu. Toto médium je ďalej opisované ako skúšobné médium pre C. glutamicum”.
Po 16 hodinovej kultivácii v skúšobnom médie pre C. glutamicum dosiahli kmene baktérií O.D.580 = 0,1 a boli preočkované do 50 ml rovnakého média. Po 48 hodinovej kultivácii pri 30’C a trepaní pri 150 otáčkach za minútu boli baktérie peletované 10 minútovou centrifugáciou pri 5000 x g. Získaný bezbunkový supernatant bol sterilné prefiltrovaný a potom bol stanovený pantotenát spôsobom opísaným v príklade 4. Výsledky produkcie pantotenátu rôznymi klonmi C. glutamicum sú zhrnuté v tabuíke 5.
Tabuľka 4: Zloženie média CGXII
Zložka Množstvo na 1 1 Poznámka
(nh4)2so4 20 g
močovina 5 g
kh2p°4 1 g
K2 hpo4 1 g
Mg2O4.7H2O 0,25 g
MOPS (kyselina 3-morfolinopropánsulfónová) 42 g
CaCl2 10 mg
FeSO4.7H2O 10 mg
MnSO4.H2O 10 mg
ZnSO4.7H20 1 mg
CuSO4 0,2 mg
NÍC12.6H2O 0,02 mg
biotín 0,2 mg
glukóza 40 g autoklávovať oddelene
Kyselina protokatechuová 0,03 g sterilné
(3,4-dihydroxybenzoová) filtrovaná
Tabuľka 5
Kmeň Gén Akumulácia pantotenátu
^g/ml)
O.D.ggQ Obsah pantotenátu
ATCC13032/pZ8-l - 21 0,19
ATCC13032/pND-Dl 20 0,32
ATCC13032/pND-D2 PanDC.g. 19 1,78
ATCC13032/pND-DBC2 panDBCCg 20 2,6
-28INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 540 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTISENSE: nie (vi) PÔVOD:
(A) ORGANIZMUS: Corynebacterium glutamicum (B) KMEŇ: ATCC13032 (C) ANTISENSE: nie (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) POLOHA: 77 až 484 (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: štart kodón =77; produkt = L-aspartát-l-dekarboxyláza; EC = 4.1.1.11; gén = panD (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 1:
AATATTCCTT TCCTTGTCAT CTCACGCTAT GATTTCTAAA ACTTGCAGGA CAACCCCCAT 60
AAGGACACCA CAGGAC ATG CTG CGC ACC ATC CTC GGA AGT AAG ATT CAC 109
Met Leu Arg Thr íle Leu Gly Ser Lys Íle Hls
S 10
CGA GCC ACT GTC ACT CAA GCT GAT CTA GAT TAT GTT GGC TCT GTA ACC 157
Arg Ala Thr Val 15 Thr Gin Ala Asp Leu 20 Asp Tyr Val Gly Ser 25 Val Thr
ATC GAC GCC GAC CTG GTT CAC GCC GCC GGA TTG ATC GAA GGC GAA AAA 205
íle Asp Ala 30 Asp Leu Val Hls Ala Ala 35 Gly Leu íle Glu 40 Gly Glu Lys
GTT GCC ATC GTA GAC ATC ACC AAC GGC GCT CGT CTG GAA ACT TAT GTC 253
Val Ala íle 45 Val Asp íle Thr Asn Gly 50 Ala Arg Leu 55 GlU Thr Tyr val
ATT GTG GGC GAC GCC GGA ACG GGC AAT ATT TGC ATC AAT GGT GCC GCT 301
íle 60 Val Gly Asp Ala Gly 65 Thr Gly Asn íle Cys 70 íle Asn Gly Ala Ala 75
GCA CAC CTT ATT AAT CCT GGC GAT CTT GTG ATC ATC ATG AGC TAC CTT 349
Ala His Leu íle Asn 80 Pro Gly Asp Leu Val 85 íle íle Met Ser Tyr Leu 90
CAG GCA ACT GAT GCG GAA GCC AAG GCG TAT GAG CCA AAG ATT GTG CAC 397
Gin Ala Thr Asp 95 Ala Glu Ala Lys Ala 100 Tyr Glu Pro Lys íle 105 Val Hls
GTG GAC GCC GAC AAC CGC ATC GTT GCG CTC GGC AAC GAT CTT GCG GAA 445
Val Asp Ala 110 Asp Asn Arg íle Val Ala 115 Leu Gly Asn Asp 120 Leu Ala Glu
GCA Ala CTA CCT Leu Pro 125 GGA Gly TCC Ser GGG Gly CTT TTG ACG Leu Leu Thr 130 TCG Ser AGA Arg AGC Sex 135 ATT íle TAGCGTTTTA 494
GCTCGCCAAT ATTGCTGCCG GCCTCGTTGA AAATGGTCAT GGTGGC 540
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 136 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 2:
Met 1 Leu Arg Thr íle 5 Leu Gly Ser Lys íle 10 His Arg Ala Thr Val 15 Thr
Gin Ala Asp Leu 20 Asp Tyr Val Gly Ser 25 Val Thr íle Asp Ala 30 Asp Leu
Val His Ala 35 Ala Gly Leu íle Glu 40 Gly Glu Lys Val Ala 45 íle Val Asp
íle Thr 50 Asn Gly Ala Arg Leu 55 Glu Thr Tyr Val íle 60 Val Gly Asp Ala
Gly 65 Thr Gly Asn íle Cys 70 íle Asn Gly Ala Ala 75 Ala His Leu íle Asn 80
Pro Gly Asp Leu Val 85 íle íle Met Ser Tyr 90 Leu Gin Ala Thr Asp 95 Ala
Glu Ala Lys Ala 100 Tyr Glu Pro Lys íle 105 Val His Val Asp Ala 110 Asp Asn
Arg íle Val 115 Ala Leu Gly Asn Asp 120 Leu Ala Glu Ala Leu 125 Pro Gly Ser
Gly Leu 130 Leu Thr Ser Arg Ser 135 íle
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 2164 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ANTISENSE: nie (vi) PÔVOD:
(A) ORGANIZMUS: Corynebacterium glutamicum (B) KMEŇ: ATCC13032 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) POLOHA: 351 až 1163 (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: štart kodón = 351; produkt = ketopantoát hydroxy-metyltransferáza; EC = 4.1.2.12; gén = panB (A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) POLOHA:1166 až 2002 (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: štart kodón = 1166; produkt = pantotenátsyntáza; gén = panC (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 3:
GCTTCGGGGT ACCAATTCCT TTAAGAACCA TCAGATCAAT CTGTTGTACA TTCTCGGCCA 60
GATTCAGCTT TTCGGTAAGG ACGAAACACT TTCACTTGAA TCGGCAGCAA AGTTTCTTAA 120
AGTTTCTAAG GCAACTGCAA CGAGGTATTT TAGAACTCTC CGAGAAATGG AATTAGTTCA 180
CGAGGTCAGC AAACGCCCTT TGCGGTTTGC GCTCACGGAT AAAGGTCGTG AGATAGTAGG 240
TCTTGAGGTA AAAATTTGAC TCCATAACGA GAACTTAATC GAGCAACACC CCTGAACAGT 300
GAATCAAATC GGAATTTATT TATTCTGAGC TGGTCATCAC ATCTATACTC ATG CCC Met Pro
356
ATG TCA GGC ATT GAT GCA AAG AAA ATC CGC ACC CGT CAT TTC CGC GAA
Met Ser Gly íle Asp Ala Lys 145 Lys íle Arg Thr Arg 150 His Phe Arg Glu
140
GCT AAA GTA AAC GGC CAG AAA GTT TCG GTT CTC ACC AGC TAT GAT GCG
Ala Lys Val Asn Gly Gin Lys Val Ser Val Leu Thr Ser Tyr Asp Ala
155 160 165 170
CTT TCG GCG CGC ATT TTT GAT GAG GCT GGC GTC GAT ATG CTC CTT GTT
Leu Ser Ala Arg íle Phe Asp Glu Ala Gly Val Asp Met Leu Leu Val
175 180 185
GGT GAT TCC GCT GCC AAC GTT GTG CTG GGT CGC GAT ACC ACC TTG TCG
Gly Asp Ser Ala Ala Asn Val Val Leu Gly Arg Asp Thr Thr Leu Ser
190 195 200
ATC ACC TTG GAT GAG ATG ATT GTG CTG GCC AAG GCG GTG ACG ATC GCT
íle Thr Leu Asp Glu Met íle Val Leu Ala Lys Ala Val Thr íle Ala
205 210 215
ACG AAG CGT GCG CTT GTG GTG GTT GAT CTG CCG TTT GGT ACC TAT GAG
Thr Lys Arg Ala Leu Val Val Val Asp Leu Pro Phe Gly Thr Tyr Glu
220 225 230
GTG AGC CCA AAT CAG GCG GTG GAG TCC GCG ATC CGG GTC ATG CGT GAA
Val Ser Pro Asn Gin Ala Val Glu Ser Ala íle Arg Val Met Arg Glu
235 240 245 250
ACG GGT GCG GCT GCG GTG AAG ATC GAG GGT GGC GTG GAG ATC GCG CAG
Thr Gly Ala Ala Ala Val Lys íle Glu Gly Gly Val Glu íle Ala Gin
255 260 265
ACG ATT CGA CGC ATT GTT GAT GCT GGA ATT CCG GTT GTC GGC CAC ATC
Thr íle Arg Arg íle Val Asp Ala Gly íle Pro Val Val Gly His íle
270 275 280
GGG TAC ACC CCG CAG TCC GAG CAT TCC TTG GGC GGC CAC GTG GTT CAG
Gly Tyr Thr Pro Gin Ser Glu His Ser Leu Gly Gly His Val Val Gin
285 290 295
GGT CGT GGC GCG AGT TCT GGA AAG CTC ATC GCC GAT GCC CGC GCG TTG
Gly Are Gly Ala Ser Ser Gly Lys Leu íle Ala Asp Ala Arg Ala Leu
300 305 310
GAG CAG GCG GGT GCG TTT GCG GTT GTG TTG GAG ATG GTT CCA GCA GAG
Glu Gin Ala Gly Ala Phe Ala Val Val Leu Glu Met Val Pro Ala Glu
315 320 325 l 330
GCA GCG CGC GAG GTT ACC GAG GAT CTT TCC ATC ACC ACT ATC GGA ATC
Ala Ala Arg Glu Val Thr Glu Asp Leu Ser íle Thr Thr íle Gly íle
335 340 345
GGT GCC GGC AAT GGC ACA GAT GGG CAG GTT TTG GTG TGG CAG GAT GCC
Gly Ala Gly Asn Gly Thr Asp Gly Gin Val Leu Val Trp Gin Asp Ala
350 355 360
TTC GGC CTC AAC CGC GGC AAG AAG CCA CGC TTC GTC CGC GAG TAC GCC
Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys Lys Pro Arg Phe Val Arg Glu Tyr Ala
365 370 375
ACC TTG GGC GAT TCC TTG CAC GAC GCC GCG CAG GCC TAC ATC GCC GAT
Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr íle Ala Asp
380 385 390
404
452
500
548
596
644
692
740
788
836
884
932
980
1028
1076
1124
ATC íle 395 CAC His GCG GGT ACC TTC CCA GGC GAA GCG GAG TCC TTT TA ATG CAG 1171
Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe Met Gin 1
400 405
GTA GCA ACC ACA AAG CAG GCG CTT ATC GAC GCC CTC CTC CAC CAC AAA 1219
Val Ala Thr 5 Thr Lys Gin Ala Leu íle Asp Ala Leu 10 Leu 15 His His Lys
TCC GTC GGG CTC GTC CCC ACC ATG GGT GCG CTA CAC AGC GGA CAC GCC 1267
Ser Val 20 Gly Leu Val Pro Thr 25 Met Gly Ala Leu His 30 Ser Gly His Ala
TCG TTG GTT AAA GCA GCA CGC GCT GAA AAC GAC ACT GTT GTA GCC AGT 1315
Ser 35 Leu Val Lys Ala Ala Arg 40 Ala Glu Asn Asp Thr 45 val Val Ala Ser 50
ATT TTT GTC AAT CCC CTG CAG TTT GAA GCA CTC GGT GAT TGC GAT GAT 1363
íle Phe Val Asn Pro 55 Leu Gin Phe Glu Ala Leu Gly Asp 60 Cys Asp Asp 65
TAC CGC AAC TAT CCC CGC CAA CTC GAC GCC GAT TTA GCA CTG CTT GAA 1411
Tyr Arg Asn Tyr 70 Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp Leu 75 Ala Leu Leu Glu 80
GAG GCA GGT GTG GAT ATT GTG TTC GCA CCC GAT GTG GAG GAA ATG TAC 1459
Glu Ala Gly 85 Val Asp íle Val Phe Ala Pro Asp Val 90 Glu 95 Glu Met Tyr
CCC GGT GGC TTG CCA CTA GTG TGG GCG CGC ACC GGT TCC ATC GGA ACA 1507
Pro Gly 100 Gly Leu Pro Leu Val 105 Trp Ala Arg Thr Gly 110 Ser íle Gly Thr
AAA TTG GAG GGT GCC AGC AGG CCT GGC CAT TTC GAT GGT GTG GCT ACC 1555
Lys 115 Leu Glu Gly Ala Ser Arg 120 Pro Gly His Phe Asp 125 Gly Val Ala Thr 130
GTG GTG GCG AAG CTG TTC AAT TTG GTG CGC CCT GAT CGT GCA TAT TTT 1603
Val Val Ala Lys Leu 135 Phe Asn Leu Val Arg Pro Asp 140 Arg Ala Tyr Phe 145
GGA CAA AAA GAT GCT CAG CAG GTT GCG GTG ATT CGG CGA TTG GTT GCC 1651
Gly Gin Lys Asp 150 Ala Gin Gin Val Ala Val íle Arg 155 Arg Leu Val Ala 160
GAT CTA GAC ATT CCC GTG GAG ATT CGT CCC GTT CCG ATT ATT CGT GGC 1699
Asp Leu Asp 165 íle Pro Val Glu íle Arg Pro Val Pro 170 íle 175 íle Arg Gly
GCC GAT GGC TTA GCC GAA TCC AGC CGC AAT CAA CGT CTT TCT GCG GAT 1747
Ala Asp 1B0 Gly Leu Ala Glu Ser 185 Ser Arg Asn Gin Arg 190 Leu Ser Ala Asp t 1
CAG CGA GCG CAA GCT CTG GTG CTG CCG CAG GTG TTG AGT GGG TTG CAG 1795
Gin 195 Arg Ala Gin Ala Leu Val 200 Leu Pro Gin Val Leu 205 Ser Gly Leu Gin 210
CGT CGA AAA GCA GCT GGT GAA GCG CTA GAT ATC CAA GGT GCG CGC GAC 1843
Arg Arg Lys Ala Ala 215 Gly Glu Ala Leu Asp íle Gin 220 Gly Ala Arg Asp 225
ACC TTG GCC AGC GCC GAC GGC GTG CGC TTG GAT CAC CTG GAA ATT GTC 1891
Thr Leu Ala Ser 230 Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp His 235 Leu Glu Xle Val 240
GAT CCA GCC ACC CTC GAA CCA TTA GAA ATC GAC GGC CTG CTC ACC CAA 1939
Asp Pro Ala 245 Thr Leu Glu Pro Leu Glu íle Asp Gly 250 Leu 255 Leu Thr Gin
-32CCA GCG TTG GTG GTC GGC GCG ATT TTC GTG GGG CCG GTG CGG TTG ATC Pro Ala Leu Val Val Gly Ala íle Phe-Val Gly Pro Val Arg Leu íle
260 265 270
GAC AAT ATC GAG CTC TAGTACCAAC CCTGCGTTGC AGCACGCAGC TTCGCATAAC
Asp Asn íle Glu Leu
275
GCGTGCTCAG CTCAGTGTTT TTAGGTGCGC GGTGCGGATC GGAACCGGGA GTTGGCCACT
GCGGTGGCGT GGCCTCACCC GACAGCGCCC ATGCCGCCTG ACGAGCTGCA CCCAACGCCA
CA
1987
2042
2102
2162
2164
INFORMÁCIE 0 SEKVENCIÍ ID. C. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 271 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 4:
Met 1 Pro Met Ser Gly 5 íle Asp Ala Lys Lys 10 íle Arg Thr Arg His 15 Phe
Arg Glu Ala Lya 20 Val Asn Gly Gin Lys 25 Val Ser Val Leu Thr 30 Ser Tyr
Asp Ala Leu Ser 35 Ala Arg íle Phe 40 Asp Glu Ala Gly Val 45 Asp Met Leu
Leu Val 50 Gly Asp Ser Ala Ala 55 Asn Val Val Leu Gly 60 Arg Asp Thr Thr
Leu 65 Ser íle Thr Leu Asp 70 Glu Met Xle Val Leu 75 Ala Lys Ala Val Thr 80
íle Ala Thr Lys Arg 85 Ala Leu Val Val Val 90 Asp Leu Pro Phe Gly 95 Thr
Tyr Glu Val Ser 100 Pro Asn Gin Ala Val 105 Glu Ser Ala íle Arg 110 Val Met
Arg Glu Thr Gly 115 Ala Ala Ala Val 120 Lys íle Glu Gly Gly 125 Val Glu íle
Ala Gin 130 Thr íle Arg Arg íle 135 Val Asp Ala Gly íle 140 Pro Val Val Gly
His 145 íle Gly Tyr Thr Pro 150 Gin 1 Ser Glu His Ser 155 Leu Gly Gly His Val 160
Val Gin Gly Arg Gly 165 Ala Ser Ser Gly Lys 170 Leu íle Ala Asp Ala Π5 Arg
Ala Leu Glu Gin 180 Ala Gly Ala Phe Ala 185 Val Val Leu Glu Met 190 Val Pro
Ala Glu Ala Ala 195 Arg Glu Val Thr 200 Glu Asp Leu Ser Xle 205 Thr Thr íle
Gly íle 210 Gly Ala Gly Asn Gly 215 Thr Asp Gly Gin Val 220 Leu Val Trp Gin
-33Aap Ala Phe Gly Leu Asn Arg Gly Lys .lys Pro Arg Phe Val Arg Glu
225 230 235 240
Tyr Ala Thr Leu Gly Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Gin Ala Tyr íle
245 250 255
Ala Asp íle Hls Ala Gly Thr Phe Pro Gly Glu Ala Glu Ser Phe 260 265 270
INFORMÁCIE 0 SEKVENCII ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 279 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE ID. Č. 5:
Met Gin Val 1 Ala Thr 5 Thr Lys Gin Ala Leu íle Asp Ala 10 Leu Leu His 15
Hls Lys Ser Val Gly 20 Leu Val Pro Thr Met Gly Ala Leu 25 His Ser Gly 30
His Ala Ser Leu Val 35 Lys Ala Ala Arg Ala Glu Asn Asp 40 Thr val Val 45
Ala Ser íle 50 Phe Val Asn Pro Leu Gin Phe Glu Ala Leu 55 60 Gly Asp Cys
Asp Asp Tyr Arg Asn 65 Tyr 70 Pro Arg Gin Leu Asp Ala Asp 75 Leu Ala Leu 80
Leu Glu Glu Ala Gly 85 Val Asp íle Val Phe Ala Pro Asp 90 Val Glu Glu 95
Met Tyr Pro Gly Gly 100 Leu Pro Leu Val Trp Ala Arg Thr 105 Gly Ser íle 110
Gly Thr Lys 115 Leu Glu Gly Ala Ser Arg Pro Gly His Phe 120 125 Asp Gly Val
Ala Thr Val 130 Val Ala Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro 135 140 Asp Arg Ala
Tyr Phe Gly 145 Gin Lys Asp 150 Ala Gin Gin Val Ala Val íle 155 ( Arg Arg Leu 160
Val Ala Asp Leu Asp 165 íle Pro Val Glu íle Arg Pro Val 170 Pro íle íle 175
Arg Gly Ala Asp Gly 180 Leu Ala Glu Ser Ser Arg Asn Gin 185 Arg Leu Ser 190
Ala Asp Gin 195 Arg Ala Gin Ala Leu Val Leu Pro Gin Val 200 205 Leu Ser Gly
Leu Gin Arg 210 Arg Lys Ala Ala Gly Glu Ala Leu Asp íle 215 220 Gin Gly Ala
Arg Asp Thr 225 Leu Ala Ser 230 Ala Asp Gly Val Arg Leu Asp 235 His Leu Glu 240
íle Val Asp Pro Ala Thr 245 Leu Glu Pro Leu Glu íle Asp Gly Leu Leu
.250 255
Thr Gin Pro Ala Leu Val Val Gly Ala íle Phe Val Gly Pro Val Arg
260 265 270
Leu íle Asp Asn Xle Glu Leu
275

Claims (24)

1. V mikroorganizmoch rodu Corynebacterium a Escherichia replikovateľná, pripadne rekombinantné DNA, ktorá obsahuje sekvenciu kódujúcu aspartát-l-dekarboxylázu.
2. Replikovateľná DNA podľa nároku 1, ktorá kóduje panD pôvodom z baktérií Corynebacterium a ktorej usporiadanie je znázornené na obrázku 1.
3. Replikovateľná DNA podľa nároku 2, ktorá:
i) má sekvenciu nukleotidov podľa Sekvencie id. č.: 1, ktorá kóduje panD ii) obsahuje aspoň jednu takú sekvenciu, ktorá sekvencii uvedenej v bode (i) zodpovedá vďaka degenerácii genetického kódu iii) obsahuje aspoň jednu takú sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám uvedeným v bode (i) alebo (ii) a prípadne iv) sekvencia s funkčne neutrálnou sense-mutáciou vzhľadom na sekvenciu podľa bodu (i).
4. Mikroorganizmy, osobitne potom z rodov Corynebacterium
I , alebo Escherichia, ktoré sú transformované vložením replikovateľnej DNA podľa hocijaké z nárokov 1 až 3.
5. Plazmidový vektor pND-D2, ktorý je znázornený na obrázku 2, a ktorý bol v baktériách Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2 uložený pod číslom DSM 12438.
6. Plazmidový vektor pND-DBC2, ktorý je znázornený na obrázku 4, a ktorý bol v baktériách Corynebacteriun glutanicun ATCC13032/pND-DBC2 uložený pod číslom DSM 12437.
7. Spôsob výroby kyseliny D-pantoténovej'Vyznačujúci sa tým, že sa v mikroorganizmoch zosilní (zvýši sa ich expresia) gén panD a prípadne ďalšie nukleotidové sekvencie, kódujúce aspartát-1-dekarboxylázu a tieto mikroorganizmy sa použijú na fermentáciu.
8. Spôsob výroby podlá nároku 7, vyznačuj úci sa t ý m, že sa zosilnenie dosiahne zvýšením počtu kópií génu, prípadne nukleotidových sekvencií v mikroorganizmu transformáciou plazmidom, ktorý tento gén respektíve nukleotidovú sekvenciu nesie, alebo sa zosilnia chromozomálne gény.
9. Spôsob podlá nároku 7,vyznačujúci sa tým, že sa zosilnenie dosiahne mutáciou promotorovej alebo regulačnej oblasti nachádzajúcej sa proti prúdu transkripcie od štruktúrneho génu.
10. Spôsob podlá nároku 7,vyznačujúci sa tým, že sa zosilnenie dosiahne vložením expresnej kazety proti prúdu transkripcie od štruktúrneho génu.
11. Spôsob podlá nároku 7,vyznačujúci sa tým, že sa zosilnenie dosiahne predĺžením životnosti príslušnej mRNA a/älebo spomalením odbúravania zodpovedajúceho enzymatického proteínu.
12. Spôsob podlá hocijakého z nárokov 8 až 11, v y značujúci sa tým, že sa zvýši expresia génu panD v mi k-roorganizmoch, ktoré obsahujú ďalšie mutácie pre rezistenciu k metabolitom prípadne antimetabolitom.
13. Spôsob podlá hocijakého z nárokov 8 až 12, v y značujúci sa tým, že sa zosilnenie dosiahne zmenou kultivačného média a/alebo priebehu fermentácie.
14. Spôsob podlá hocijakého z nárokov 8 až 13, vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy, v ktorých sú aspoň čiastočne inhibované metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu pantotenátu (pantoténovej kyseliny).
15. Spôsob podlá hocijakého z nárokov 8 až 14, v y značujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy, v ktorých je okrem génu panD dodatočne zosilnená expresia jedného alebo viacerých zostávajúcich génov metabolickej dráhy syntézy kyseliny pantoténovej.
16. Spôsob podlá nároku 15,vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy, v ktorých je okrem génu panD zosilnený (zvýšená jeho expresia) jeden alebo viac génov, ktoré kódujú enzým ketopantoát-hydroxymetyl transferázu (EC 4.1.2.12) a pantotenát syntázu (EC 6.3.2.1.), výhodne pôvodom z baktérii Corynobacterium.
17. Spôsob podlá nárokov 15 a 16,vyznačujúci sa t ý m, že sa použijú mikroorganizmy transformované rôznymi kompatibilnými plazmidovými vektormi, ktoré obsahujú uvedené gény.
, I » , » •
18. Spôsob podlá nárokov 15 a 16,vyznačuj úci sa t ý m, že sa použije kmeň transformovaný plazmidovým vektorom a tento plazmidový vektor nesie jeden alebo viac uvedených génov vrátane génu panD, v ktorom sú gény usporiadané za sebou pod kontrolou spoločného promotoru alebo sú od seba oddelené a sú kontrolované rôznymi promótormi.
19. Spôsob podlá nároku 17,vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy transformované plazmidovým vektorom pND-D2.
20. Spôsob podlá nároku 17,vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy transformované plazmidovým vektorom pND-DBC2.
21. Spôsob výroby pantoténovej kyseliny, vyznačujúci sa t ý m, že sa uskutočnia nasledujúce kroky:
a) nechajú sa fermentovať mikroorganizmy podlá jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, v ktorých je zosilnený (zvýšená jeho expresia) aspoň gén panD, prípadne v kombinácii s génom panB a/alebo génom panC
b) zvýši sa koncentrácia kyseliny pantoténovej v médie alebo v bunkách mikroorganizmu a
c) izoluje sa kyselina pantoténová.
22. Spôsob podlá nároku 21,vyznačujúci sa tým, že gény so zvýšenou expresiou pochádzajú z baktérií rodu Corynebacterium.
23. Spôsob podlá nároku 21 alebo 22, vyznačuj úci satým, že sa v kroku a) pridá prekurzor kyseliny pantoténovej vybraný zo skupiny obsahujúcej aspartát, β-alanín, ketoizovalerát, ketopantoát a pantoát.
24. Spôsob podlá jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa použijú mikroorganizmy z rodu Escherichia alebo Corynebacterium.
SK1633-99A 1998-12-01 1999-11-30 Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms SK163399A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19855313A DE19855313A1 (de) 1998-12-01 1998-12-01 Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK163399A3 true SK163399A3 (en) 2000-07-11

Family

ID=7889569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1633-99A SK163399A3 (en) 1998-12-01 1999-11-30 Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms

Country Status (14)

Country Link
US (1) US6184007B1 (sk)
EP (1) EP1006192B1 (sk)
JP (1) JP2000228990A (sk)
KR (1) KR20000047829A (sk)
CN (1) CN1256314A (sk)
AT (1) ATE442443T1 (sk)
BR (1) BR9905776A (sk)
DE (2) DE19855313A1 (sk)
HU (1) HUP9904447A2 (sk)
ID (1) ID24149A (sk)
IL (1) IL133214A0 (sk)
SK (1) SK163399A3 (sk)
YU (1) YU61799A (sk)
ZA (1) ZA997406B (sk)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19855312A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19855314A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentiven Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US8232081B2 (en) 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
IL148786A0 (en) * 1999-09-21 2002-09-12 Basf Ag Methods and microorganisms for production of panto-compounds
DE10030702A1 (de) * 2000-06-23 2002-01-03 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
WO2002018589A2 (en) * 2000-09-02 2002-03-07 Degussa Ag Nucleotide sequence coding for the sigc gene of corynebacterium glutamicum
DE10136986A1 (de) * 2000-09-03 2002-03-21 Degussa Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen
DE10046623A1 (de) * 2000-09-20 2002-03-28 Degussa Neue für das dps-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
CZ20031886A3 (cs) * 2001-01-19 2003-10-15 Basf Aktiengesellschaft Způsob přípravy pantothenátu ve vyšším výtěžku a mikroorganizmy používané při tomto způsobu
DE10108225A1 (de) * 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
SK10422003A3 (sk) 2001-02-21 2004-02-03 Basf Aktiengesellschaft Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív
MXPA03007455A (es) * 2001-02-21 2004-07-30 Basf Ag Metodo y produccion de acido d-pantotenico y las sales de este como adyuvante en productos alimenticios para animales.
DE10108223A1 (de) * 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
EP1247868A3 (de) * 2001-04-03 2002-10-30 Degussa AG Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
DE10116519A1 (de) * 2001-04-03 2002-10-17 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze
WO2003004673A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
DE10132178A1 (de) * 2001-07-03 2003-01-23 Degussa Verfahren zur fermantativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
WO2003004672A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
AU2002316940A1 (en) * 2001-07-07 2003-01-29 Degussa Ag Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
DE10147960A1 (de) * 2001-09-28 2003-04-10 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Panthothensäure und/oder deren Salzen
CA2491145A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Basf Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
WO2005089471A2 (en) * 2004-03-17 2005-09-29 University Of Florida Research Foundation, Inc Increased stress tolerance and enhanced yield in plants
DE102005048818A1 (de) 2005-10-10 2007-04-12 Degussa Ag Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure
JP4977691B2 (ja) 2006-04-13 2012-07-18 中外製薬株式会社 タウリントランスポーター遺伝子
JP5635260B2 (ja) 2007-03-15 2014-12-03 中外製薬株式会社 ポリペプチドの製造方法
DE102007015583A1 (de) 2007-03-29 2008-10-02 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Ein Enzym zur Herstellung von Methylmalonyl-Coenzym A oder Ethylmalonyl-Coenzym A sowie dessen Verwendung
JP5337033B2 (ja) * 2007-08-07 2013-11-06 中外製薬株式会社 異種タンパク質の製造方法
BRPI0818039A2 (pt) * 2007-10-15 2014-10-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para produzir uma célula capaz de produção de alto rendimento de heteroproteínas.
DK2213746T3 (en) * 2007-10-24 2015-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd CELL FOR USE IN THE PREPARATION OF exogenous protein, AND MANUFACTURING METHOD THAT USE CELL
EP2423309B1 (en) 2009-04-22 2018-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A method for producing a cell capable of high-yield production of heteroproteins
CN107354142A (zh) * 2017-09-14 2017-11-17 精晶药业股份有限公司 一种L‑天门冬氨酸‑α‑脱羧酶酶液处理方法
CN109593748B (zh) * 2017-10-01 2022-03-04 宁波酶赛生物工程有限公司 工程化脱羧酶多肽及其在制备β-丙氨酸中的应用
CN113122486B (zh) * 2019-12-31 2023-06-13 江南大学 一种丙二酸的全生物合成的方法
KR102389327B1 (ko) * 2020-07-01 2022-04-20 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
KR102589135B1 (ko) * 2021-05-10 2023-10-12 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
CN113789307B (zh) * 2021-09-10 2023-08-18 浙江工业大学 一种泛酸合成酶突变体、编码基因、载体及应用
KR20240105656A (ko) * 2022-12-28 2024-07-08 씨제이제일제당 (주) 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0493060A3 (en) * 1990-12-25 1993-04-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof
JP3710497B2 (ja) * 1992-09-25 2005-10-26 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法
US5932457A (en) 1995-09-13 1999-08-03 Takeda Chemical Industries, Ltd Process for producing D-pantoic acid and D-pantothenic acid or salts thereof
DE19846499A1 (de) * 1998-10-09 2000-04-20 Degussa Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen
DE19855314A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentiven Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR100878334B1 (ko) * 1999-06-25 2009-01-14 백광산업 주식회사 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자
EP1083225A1 (de) * 1999-09-09 2001-03-14 Degussa-Hüls Aktiengesellschaft Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien

Also Published As

Publication number Publication date
DE59915077D1 (de) 2009-10-22
EP1006192A3 (de) 2003-09-17
JP2000228990A (ja) 2000-08-22
US6184007B1 (en) 2001-02-06
KR20000047829A (ko) 2000-07-25
BR9905776A (pt) 2001-04-24
EP1006192B1 (de) 2009-09-09
IL133214A0 (en) 2001-03-19
ZA997406B (en) 2000-06-08
HU9904447D0 (en) 2000-01-28
YU61799A (sh) 2003-02-28
HUP9904447A2 (hu) 2000-11-28
DE19855313A1 (de) 2000-06-08
ID24149A (id) 2000-07-13
CN1256314A (zh) 2000-06-14
ATE442443T1 (de) 2009-09-15
EP1006192A2 (de) 2000-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK163399A3 (en) Method for the fermentative production of d-pantothenic acid by amplification of the pand gene of microorganisms
US6177264B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using Coryneform bacteria
US7632663B1 (en) Method for microbially producing L-valine
KR20000028952A (ko) 케토판토에이트 리덕타제를 암호화하는 뉴클레오타이드서열의 증폭에 의한 판토텐산의 제조방법
US6184006B1 (en) Method for the fermentative production of D-pantothenic acid using strains of the family enterobacteriaceae
EP1320586B1 (en) Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
US6911329B2 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
MXPA00008822A (es) Proceso para la preparacion fermentativa del acido d-pantotenico usando bacterias corineformes.
US20020042104A1 (en) Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
CZ428199A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající zvýšené exprese genu panD v mikroorganismech
CZ427799A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-pantothenové kyseliny využívající kmenů bakterií z čeledi Enterobacteriacae
DE10030702A1 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
CZ428299A3 (cs) Fermentativní způsob výroby D-panthotenové kyseliny využívající koryneformních bakterií
MXPA99010768A (en) Procedure for the preparation by fermentation of d-pantothenic acid using corinefor bacteria
WO2002024936A1 (en) Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
MXPA99010876A (en) Fermentation process for the preparation of d-pantothenic acid using strains of the family enterobacteriaceae