CN114990045A - 一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法 - Google Patents

一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5‑戊二胺的方法，属于基因工程技术领域，该重组大肠杆菌含有催化L‑赖氨酸生成1,5‑戊二胺的赖氨酸脱羧酶最优突变体CadAP530L/M569V、促进底物/产物进/出细胞的赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB以及提供辅因子PLP自供应吡哆醛激酶I和II，将该重组大肠杆菌作为催化剂，得到的高产量的1,5‑戊二胺，摩尔转化率高达98.67％。本发明提供的合成1,5‑戊二胺的方法，该方法以重组大肠杆菌作为催化剂，不需要额外添加辅因子PLP，不使用缓冲液(无需调节pH)，无需使用盐酸进行中和，合成转化1,5‑戊二胺的时间短，生产成本低，为1,5‑戊二胺的工业化生产提供了一种高效且经济的方法。

Description

一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法。
背景技术
1,5-戊二胺，又名1,5-二氨基戊烷、尸胺，是具有多种生物活性的天然多胺，可通过赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸直接脱羧形成，在农业，医药和工业中应用广泛。
目前，戊二胺的生产方法主要包括微生物发酵法或全细胞生物转化法。微生物发酵法通常由具有生产赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌改造而来，存在的主要问题是发酵周期长，转化率低等；此外，发酵体系复杂，杂质多，戊二胺分离纯化困难，进而增加了生产成本。而全细胞生物转化法，与微生物发酵法区别是先通过发酵培养富集菌株，再离心获得全细胞全细胞催化剂，用于生物催化底物L-赖氨酸或L-赖氨酸盐酸盐转化生成戊二胺，优点在于体系杂质少，易于纯化。
最新的研究普遍采用过表达大肠杆菌的CadA来生产1,5-戊二胺。日本味之素公司的US7189543专利中保护了以二羧酸调节pH并通过细胞过表达大肠杆菌的野生型CadA酶转化赖氨酸产生1,5-戊二胺，产量达69g/L。上海凯赛在其专利CN102851307A中通过在蜂房哈夫尼菌中过量表达大肠杆菌野生型CadA酶来转化赖氨酸，从而实现戊二胺和下游聚合物的制备。日本味之素公司的EP3118312专利中公开了热稳定性提高的大肠杆菌CadA突变位点Val3、Ala590和Glu690。日本三井化学公司的US2015132808专利保护了多个活性增加的大肠杆菌CadA突变体，然而，这些CadA突变体的活性提高程度均低于20％，甚至大多数CadA突变体的活性提高程度不到10％，因此这些CadA突变体在实际生产上的应用价值非常有限。
赖氨酸脱羧酶作为催化赖氨酸生产1,5-戊二胺的催化剂，提升赖氨酸脱羧酶的活性可以减少催化剂的用量或缩短反应时间，进而降低生产成本，对1,5-戊二胺的工业化有重要的影响。其次，赖氨酸脱羧酶在催化赖氨酸生成1,5-戊二胺时需要额外添加辅因子PLP，PLP价格昂贵，导致生产成本升高。因此急需构建一株戊二胺高效生产菌株，实现1,5-戊二胺的工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法，本发明的重组大肠杆菌能够高效生产1,5-戊二胺，同时制备1,5-戊二胺时，不需要额外添加辅因子PLP，不使用缓冲液，无需使用盐酸进行中和，转化时间短，降低生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌依次含有赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶。
优选的，所述吡哆醛激酶为吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II。
优选的，所述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示；所述编码赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
优选的，所述赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示；所述编码赖氨酸/尸胺反向转运蛋白的基因cadB的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
优选的，所述重组大肠杆菌依次含有赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB、吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II。
优选的，所述吡哆醛激酶I氨基酸序列如SEQ ID No.25所示；所述编码吡哆醛激酶I基因pdxK的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示。
优选的，所述吡哆醛激酶II氨基酸序列如SEQ ID No.27所示；所述编码吡哆醛激酶II基因pdxY的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。
优选的，所述重组大肠杆菌的出发菌株为大肠杆菌E.coli BL21。
本发明还提供了一种含有上述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶的氨基酸序列的表达载体。
优选的，所述表达载体包括pETDuet1、pACYCDuet1、pET28a中的任意一种。
本发明还提供了一种上述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：将赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶的基因序列依次导入大肠杆菌。
优选地，将赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB、吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II的基因序列依次导入大肠杆菌。
本发明还提供了一种上述重组大肠杆菌或上述构建方法得到的重组大肠杆菌在合成1,5-戊二胺中的应用。
本发明还提供了一种合成1,5-戊二胺的方法，将上述重组大肠杆菌或上述构建方法得到的重组大肠杆菌进行发酵培养后，接种至含有L-赖氨酸盐酸盐的转化体系中，以转化L-赖氨酸盐酸盐为1,5-戊二胺。
优选的，所述的转化体系包括如下浓度的成分：L-赖氨酸盐酸盐1.5～2.5M、Mn2+45～55mM、维生素B60.2～0.3mM，pH自然。
优选的，所述转化的温度为38～42℃，所述转化的时间为2.5～3.5h。
优选的，所述发酵培养的方法包括：
将重组大肠杆菌的种子液接种在发酵培养基中发酵，发酵温度为32～40℃、转速为550～650rpm、通气量为3～5vvm，OD600为7～9时，开始匀速流加补料培养基，补料时间控制在10～13h，发酵7～9h后，添加IPTG诱导剂，并将发酵温度设为27～29℃，诱导培养20～26h后，发酵结束。
优选的，所述发酵培养基为TY培养基，所述TY培养基包括酵母提取物8g/L、胰蛋白胨12g/L、K3PO44.02 g/L、NaCl 3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、甘油10g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，用氨水调pH至7.2。
优选的，所述补料培养基包括甘油400g/L、酵母粉50g/L、胰蛋白胨25g/L。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法，该重组大肠杆菌含有催化L-赖氨酸生成1,5-戊二胺的赖氨酸脱羧酶最优突变体CadAP530L /M569V、促进底物/产物进/出细胞的赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB以及提供辅因子PLP自供应吡哆醛激酶I和II，将该重组大肠杆菌作为催化剂，得到的高产量的1,5-戊二胺，摩尔转化率高达98.67％。
(2)本发明提供的合成1,5-戊二胺的方法，该方法以重组大肠杆菌作为催化剂，不需要额外添加辅因子PLP，不使用缓冲液(无需调节pH)，无需使用盐酸进行中和，合成转化1,5-戊二胺的时间短，生产成本低，为1,5-戊二胺的工业化生产提供了一种高效且经济的方法。
附图说明
图1为野生型赖氨酸脱羧酶及其突变酶的SDS-PAGE结果图；
图2为赖氨酸标准品HPLC图谱；
图3为1,5-戊二胺标准品HPLC图谱；
图4为E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱；
图5为E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱；
图6为E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK和E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxY菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱，其中，A为E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱；B为E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxY菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱；
图7为E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱；
图8为重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY菌株合成1,5-戊二胺的HPLC图谱；
图9为重组pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY质粒示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌依次含有赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶。
在本发明中，所述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V来源于粘质沙雷氏菌，是粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶CadA的最优赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V，该CadAP530L /M569V的赖氨酸脱羧酶的酶活高，比酶活为292.54U/mg，是野生型CadA的1.63倍。在本发明中，所述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的氨基酸序列优选地如SEQ ID No.15所示；所述编码赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的核苷酸序列优选地如SEQ ID No.16所示。
在本发明中，该重组大肠杆菌还赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB，促进了促进底物/产物进/出细胞。在本发明中，所述赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB的氨基酸序列优选地如SEQ ID No.19所示；所述编码赖氨酸/尸胺反向转运蛋白的基因cadB的核苷酸序列优选地如SEQ ID No.20所示。
在本发明中，该重组大肠杆菌还提供辅因子PLP自供应系统，即吡哆醛激酶。所述吡哆醛激酶优选地为吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II，所述所述吡哆醛激酶I氨基酸序列优选地如SEQ ID No.25所示；所述编码吡哆醛激酶I基因pdxK的核苷酸序列优选地如SEQ IDNo.26所示；所述吡哆醛激酶II氨基酸序列优选地如SEQ ID No.27所示；所述编码吡哆醛激酶II基因pdxY的核苷酸序列优选地如SEQ ID No.28所示。本发明的重组大肠杆菌表达吡哆醛激酶I和II构建的PLP自供应系统，增强了胞内辅因子PLP水平，在合成1,5-戊二胺时，无需添加昂贵的添加辅因子PLP，即能高效合成1,5-戊二胺，降低生产成本。
在本发明中，作为一优选的实施方式，所述重组大肠杆菌依次含有赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB、吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II。
在本发明中，所述重组大肠杆菌的出发菌株优选地为大肠杆菌E.coliBL21。
本发明还提供了一种含有上述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶的氨基酸序列的表达载体。
在本发明中，所述表达载体优选地包括pETDuet1、pACYCDuet1、pET28a中的任意一种。
本发明还提供了一种上述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：将赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶的基因序列依次导入大肠杆菌。
作为本发明的一优选地实施方式，将赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB、吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II的基因序列依次导入大肠杆菌。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌E.coli BL21。所述编码赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的核苷酸序列优选地如SEQ ID No.16所示；所述编码赖氨酸/尸胺反向转运蛋白的基因cadB的核苷酸序列优选地如SEQ ID No.20所示；所述编码吡哆醛激酶I基因pdxK的核苷酸序列优选地如SEQ ID No.26所示；所述编码吡哆醛激酶II基因pdxY的核苷酸序列优选地如SEQ IDNo.28所示。
本发明还提供了一种上述重组大肠杆菌或上述构建方法得到的重组大肠杆菌在合成1,5-戊二胺中的应用。
本发明还提供了一种合成1,5-戊二胺的方法，将上述重组大肠杆菌或上述构建方法得到的重组大肠杆菌进行发酵培养后，接种至含有L-赖氨酸盐酸盐的转化体系中，以转化L-赖氨酸盐酸盐为1,5-戊二胺。
在本发明中，所述的转化体系优选地包括如下浓度的成分：L-赖氨酸盐酸盐1.5～2.5M、Mn2+45～55mM、维生素B60.2～0.3mM，pH自然。在本发明中，所述转化的温度优选为38～42℃，所述转化的时间优选为2.5～3.5h。在本发明中，所述的反应体系不需要添加缓冲液，无需调节pH，也就无需使用盐酸进行中和，转化时间短。
作为本发明的一种优选地实施方式，所述发酵培养的方法包括：将重组大肠杆菌的种子液接种在发酵培养基中发酵，发酵温度为32～40℃、转速为550～650rpm、通气量为3～5vvm，OD600为7～9时，开始匀速流加补料培养基，补料时间控制在10～13h，发酵7～9h后，添加IPTG诱导剂，并将发酵温度设为27～29℃，诱导培养20～26h后，发酵结束。在本发明中，所述发酵培养基为TY培养基，所述TY培养基优选地包括酵母提取物8g/L、胰蛋白胨12g/L、K3PO44.02g/L、NaCl 3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、甘油10g/L、(NH4)2SO42.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，用氨水调pH至7.2。在本发明中，所述补料培养基优选地包括甘油400g/L、酵母粉50g/L、胰蛋白胨25g/L。本发明对TY培养基、补料培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的方法即可。在本发明中，合成的1,5-戊二胺含量高，摩尔转化率高，不需要添加缓冲液，无需调节pH，不需要额外添加昂贵的辅因子PLP，该合成方法高效且经济，实现了1,5-戊二胺的工业化生产。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中涉及的培养基如下：
(1)LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
(2)LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。
(3)TB培养基：
A：酵母粉24g、蛋白胨12g、甘油4g
B：KH2PO42.3g、K2HPO416.4g
将A溶于900mL超纯水，高压灭菌；将B溶于100mL超纯水，高压灭菌，将900mL A和100mL B混合以制备1LTB培养基。
(4)TY培养基：酵母提取物8g/L、胰蛋白胨12g/L、K3PO44.02g/L、NaCl 3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、甘油10g/L、(NH4)2SO42.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，用氨水调pH至7.2。
(5)补料培养基：甘油400g/L、酵母粉50g/L、胰蛋白胨25g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
赖氨酸脱羧酶的酶活测定方法：
酶活反应体系：500mM、pH 6.0乙酸钠缓冲液(350μL)，100mM底物L-赖氨酸(100μL)，0.25mM辅因子PLP(50μL)和纯酶(100μL)，40℃下反应1h，100℃煮沸5min，HPLC检测戊二胺含量。
酶活定义：每分钟生成1μmol的戊二胺所需的酶量为1U。
赖氨酸和尸胺的HPLC检测方法：
(1)样品衍生化处理：将样品以10000rpm离心20min，分别取上清液和标准品(赖氨酸和戊二胺)各75μL加入到含有乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)4.5μL、蒸馏水70.5μL、100％甲醇150μL、50mM、pH 9.0的硼酸盐缓冲液450μL的反应体系中，涡旋震荡混匀后在70℃下孵育2h，以去除多余的DEEMM和副产物。将衍生后的样品以10000rpm离心5min，上清液经0.22μm膜过滤后用于HPLC检测。
(2)HPLC检测条件为：UV-VIS检测器、色谱柱(Platisil ODS 5μm，250×4.6mm)、柱温：35℃、流速1mL/min、检测波长：284nm。流动相A：100％乙腈、流动相B：25mM、pH 4.8的乙酸钠水溶液，梯度为：0～2min：20～25％A、2～20min：25～60％A、20～25min：60～20％A。
实施例1
1.1粘质沙雷氏菌来源赖氨酸脱羧酶突变位点的选择
使用在线工具HotSpotWizard 3.0(https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard)生成可行的突变热点。其中，选取了6个突变位点N120A、S165R、P530L、M569V、M678A和T691P，可能会提高赖氨酸脱羧酶的酶活水平，有利于1,5-戊二胺的生物合成。
1.2重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadA及其突变株的构建
(1)重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadA的构建
以cadA-F和cadA-R为引物，以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组为模板PCR扩增获得cadA基因片段，其大小为2139bp，纯化后的cadA基因片段与经BamHI和EcoRI双酶切的pETDuet1线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coliBL21感受态细胞。重组质粒进行双酶切验证，验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 3.2.1软件分析测序结果，测序正确的菌株命名为E.coli BL21/pETDuet1-cadA。其中，引物如下：
cadA-F：TCATCACCACAGCCAGGATCCATGAACGTTATCGCCATCATGA(下划线部分为BamHI，SEQ ID NO.1)
cadA-R：AGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTTCGCCTTCAGCACTTTC(下划线部分为EcoRI，SEQ ID NO.2)
(2)突变菌株的构建
以cadA-F/N120A-R、N120A-F/cadA-R，cadA-F/S165R-R、S165R-F/cadA-R，cadA-F/P530L-R、P530L-F/cadA-R，cadA-F/M569V-R、M569V-F/cadA-R，cadA-F/M678A-R、M678A-F/cadA-R和cadA-F/T691P-R、T691P-F/cadA-R为引物，以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组为模板PCR扩增分别获得含N120A、S165R、P530L、M569V、M678A和T691P突变点的cadA基因片段，其大小均为2139bp，纯化后的含N120A、S165R、P530L、M569V、M678A和T691P突变点的cadA基因片段分别与经BamHI和SalI双酶切的pETDuet1线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coliBL21感受态细胞。重组质粒进行双酶切验证，验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 3.2.1软件分析测序结果，测序正确的菌株分别命名为E.coliBL21/pETDuet1-cadAN120A、E.coli BL21/pETDuet1-cadAS165R、E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L、E.coli BL21/pETDuet1-cadAM569V、E.coli BL21/pETDuet1-cadAM678A和E.coliBL21/pETDuet1-cadAT691P。其中，引物如下表1所列(大写字母为突变位点)：
表1各个引物的引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’) 序列编号
N120A-F gccaagatcaaacagGCGaccgacgaatatatc SEQ ID NO.3
N120A-R gatatattcgtcggtCGCctgtttgatcttggc SEQ ID NO.4
S165R-F aaaagcccggtcggcAGActgttctacgatttc SEQ ID NO.5
S165R-R gaaatcgtagaacagTCTgccgaccgggctttt SEQ ID NO.6
P530L-F gtcgagaaaaccgggCTGtacaacctgttgttc SEQ ID NO.7
P530L-R gaacaacaggttgtaCAGcccggttttctcgac SEQ ID NO.8
M569V-F ctgcgggtgaaaaacGTActgccttcgctgtat SEQ ID NO.9
M569V-R atacagcgaaggcagTACgtttttcacccgcag SEQ ID NO.10
M678A-F ctggagttcctgcagGCActgtgcgaaatcggc SEQ ID NO.11
M678A-R gccgatttcgcacagTGCctgcaggaactccag SEQ ID NO.12
T691P-F tatccgggctttgaaCCGgacattcacggcgcc SEQ ID NO.13
T691P-R ggcgccgtgaatgtcCGGttcaaagcccggata SEQ ID NO.14
1.3野生型赖氨酸脱羧酶及突变酶的表达与酶学性质研究
将构建好的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadA及其突变株在含50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上进行划线活化，37℃培养12-24h后，挑取单菌落，转接添加50μg/mL氨苄青霉素的10mLLB液体培养基，于37℃、180r/min培养12-24h；之后以1％(v/v)接种量接种至添加50μg/mL氨苄青霉素的50mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养2h后，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于28℃、180r/min诱导表达16h；最后，将诱导完成后的菌液在4℃下离心，收集菌体；将菌体用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，重新悬浮于浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS缓冲液中，得到浓缩菌液；将浓缩菌液利用超声破碎仪破碎，得到破碎液；将破碎液在4℃下离心20min，收集上清，此上清即为粗酶液。
对细胞破碎上清液进行SDS-PAGE分析，其中，泳道1～8分别为E.coli BL21/pETDuet1-cadAN120A、E.coli BL21/pETDuet1-cadAS165R、E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L、E.coli BL21/pETDuet1-cadAM569V、E.coli BL21/pETDuet1-cadAM678A、E.coli BL21/pETDuet1-cadAT691P、E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V和E.coli BL21/pETDuet1细胞破碎上清液，结果显示，在75kDa有一条明显的蛋白带，表明野生型赖氨酸脱羧酶成功实现表达，在75kDa有一条明显的蛋白带，表明赖氨酸脱羧突变酶均成功实现表达(见图1)。
接下来，则进行赖氨酸脱羧酶的纯化以进行酶学性质研究。蛋白纯化的方法是采用镍柱亲和层析，具体过程根据公司提供的仪器操作步骤进行。经蛋白纯化仪直接纯化获得的纯酶中含有大量咪唑，会降低赖氨酸脱羧酶的酶活，因此，为去除纯酶中含有的大量咪唑，使用0.05M、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液作为透析液对纯酶进行了透析处理，经透析处理的纯酶用于后续的活性测定。
研究了不同pH(4.0～10.0，间隔1.0)、不同温度(30、35、40、45、50和60℃)下野生型赖氨酸脱羧酶及其突变体的酶学性质差异，结果显示，在pH 6.0～9.0范围内，野生型赖氨酸脱羧酶及其突变体均具有活性，且在pH 6.0时转化率最佳。野生型赖氨酸脱羧酶及其突变体的最佳反应温度均为40℃。
最后，测定野生型赖氨酸脱羧酶及其突变体酶活：在最适温度40℃和最适pH 6.0条件下反应1h后，立即于100℃下水浴5min以终止酶反应，HPLC检测生成的戊二胺含量。采用上述赖氨酸脱羧酶的酶活测定方法测定酶活。
野生型赖氨酸脱羧酶及其突变体酶活测定结果显示，野生型赖氨酸脱羧酶CadA及突变酶CadAN120A、CadAS165R、CadAP530L、CadAM569V、CadAM678A和CadAT691P的比酶活分别为179.01、165.45、172.23、232.78、254.32、180.25和176.62U/mg，可见CadAP530L、CadAM569V的比酶活得到提高，分别是野生型CadA的1.3和1.42倍。
1.4最优突变体E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V的构建、酶活测定以及全细胞转化合成戊二胺
酶活测定结果显示，突变酶CadAP530L、CadAM569V的比酶活得到提高，分别是野生型CadA的1.3和1.42倍。因此，将这两个突变位点进行组合突变，以期进一步提高赖氨酸脱羧酶的酶活水平。
以cadA-F/M569V-R和M569V-F/cadA-R为引物，以含P530L突变位点的重组质粒为模板PCR扩增分别获得含M569V和P530L双突变位点的cadA基因片段，其大小均为2139bp，纯化后的含M569V和P530L双突变位点的cadA基因片段分别与经BamHI和EcoRI双酶切的pETDuet1线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coli BL21感受态细胞。重组质粒进行双酶切验证，验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 3.2.1软件分析测序结果，测序正确的菌株分别命名为E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V。
经测序，所述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，所述编码赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。
之后按1.3所述方法对赖氨酸脱羧酶进行诱导表达及酶活测定，结果显示，CadAP530L/M569V的比酶活为292.54U/mg，是野生型CadA的1.63倍。
采用HPLC检测戊二胺：将构建好的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadA或重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板上进行划线活化，37℃培养12～24h后，挑取单菌落，转接添加50μg/mL氨苄青霉素的10mLLB液体培养基，于37℃、180r/min培养12～24h；之后以1％(v/v)接种量接种至添加50μg/mL氨苄青霉素的50mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养2h后，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于28℃、180r/min诱导表达16h；最后，将诱导完成后的菌液在4℃下离心，收集菌体。在控制菌体浓度一样的前提下(OD600＝4.0)，在500mM、pH 6.0乙酸钠缓冲液中加入0.5M底物L-赖氨酸盐酸盐、1％50mM Mn2+、0.25mM PLP，40℃下反应20min，得到转化液。然后将转化液采用上述戊二胺HPLC检测方法检测戊二胺及其含量。
其中，图2为赖氨酸标准品HPLC图谱，在该HPLC图谱中，赖氨酸的保留时间为11.725min；图3为1,5-戊二胺标准品HPLC图谱，在该HPLC图谱中，1,5-戊二胺的保留时间为24.111min。
结果显示，E.coli BL21/pETDuet1-cadA菌株合成了3.15g/L的戊二胺，E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V菌株合成了3.76g/L的戊二胺(见图4)，由此可见，该菌株可以用于进一步改造来提高戊二胺的合成能力。
1.5赖氨酸/尸胺反向转运蛋白过表达促进戊二胺的生物合成
以cadB-F和cadB-R为引物，以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增获得cadB基因片段，其大小为1335bp，纯化后的cadB基因片段与经BglII和XhoI双酶切的pETDuet1-cadAP530L /M569V线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coli BL21感受态细胞。重组质粒进行双酶切验证，验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 3.2.1软件分析测序结果，测序正确的菌株命名为E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB。其中，引物如下：
cadB-F：AGATATACATATGGCAGATCTATGAGTTCTGCCAAGAAGATCG(下划线部分为BglII，SEQ IDNo.17)
cadB-R：GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAATGTGCGTTAGACGCTGTG(下划线部分为XhoI，SEQ ID No.18)
所述赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，所述编码赖氨酸/尸胺反向转运蛋白的基因cadB的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
采用HPLC检测戊二胺：将构建好的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V及E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板上进行划线活化，37℃培养12～24h后，挑取单菌落，转接添加50μg/mL氨苄青霉素的10mL LB液体培养基，于37℃、180r/min培养12～24h；之后以1％(v/v)接种量接种至添加50μg/mL氨苄青霉素的50mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养2h后，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于28℃、180r/min诱导表达16h；最后，将诱导完成后的菌液在4℃下离心，收集菌体。在控制菌体浓度一样的前提下(OD600＝4.0)，在500mM、pH 6.0乙酸钠缓冲液中加入1M底物L-赖氨酸盐酸盐和1％50mM Mn2+，40℃下反应20min，得到转化液1。在控制菌体浓度一样的前提下(OD600＝4.0)，在500mM、pH 6.0乙酸钠缓冲液中加入1M底物L-赖氨酸盐酸盐、1％50mM Mn2+、0.25mM PLP，40℃下反应20min，得到转化液2。将收集的转化液1和转化液2采用上述戊二胺HPLC检测方法检测戊二胺及其含量。
结果显示，在额外添加和不添加PLP辅因子条件下，E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB菌株可合成15.95g/L和5.57g/L的戊二胺，而E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V菌株仅合成了3.76g/L和1.47g/L的戊二胺(见图5)。由此可见，赖氨酸/尸胺反向转运蛋白的过表达有利于底物L-赖氨酸进入细胞和产物戊二胺运出细胞，提高了戊二胺的合成效率，其次，额外添加辅因子PLP提高了戊二胺的产量，可以看出，辅因子PLP供应不足将不利于戊二胺的合成。
1.6PLP辅因子自循环系统构建
以pdxK-F/R和pdxY-F/R为引物，以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增获得pdxK和pdxY基因片段，其大小分别为852bp和864bp，纯化后的pdxK和pdxY基因片段与经EcoRI和HindIII双酶切的pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coliBL21感受态细胞。转化子验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 3.2.1软件分析测序结果，测序正确的菌株分别命名为E.coliBL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK和E.coli BL21/pETDuet1-cad AP530L/M569V-cadB-pdxY。其中，引物如下：
pdxK-F：CTGAAGGCGAAATAAGAATTCATGAGTAGTTTGTTGTTGTTTA(下划线部分为EcoRI，SEQ ID No.21)
pdxK-R：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTATGCTTCCGCCAGCGGCGGC(下划线部分为HindIII，SEQ ID No.22)
pdxY-F：CTGAAGGCGAAATAAGAATTCATGATGAAAAATATTCTCGCTA(下划线部分为EcoRI，SEQ ID No.23)
pdxY-R：GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTCAGAGCTTTGTTGCGCTGAAG(下划线部分为HindIII，SEQ ID No.24)
所述吡哆醛激酶I的氨基酸序列如SEQ ID No.25所示，所述编码吡哆醛激酶I的基因pdxK核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；所述吡哆醛激酶II的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示，所述编码吡哆醛激酶II的基因pdxY的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。
采用HPLC检测戊二胺：将构建好的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB、E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK和E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxY在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板上进行划线活化，37℃培养12～24h后，挑取单菌落，转接添加50μg/mL氨苄青霉素的10mL LB液体培养基，于37℃、180r/min培养12～24h；之后以1％(v/v)接种量接种至添加50μg/mL氨苄青霉素的50mLLB液体培养基中，于37℃、180r/min培养2h后，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于28℃、180r/min诱导表达16h；最后，将诱导完成后的菌液在4℃下离心，收集菌体。在控制菌体浓度一样的前提下(OD600＝4.0)，在500mM、pH 6.0乙酸钠缓冲液中加入1M底物L-赖氨酸盐酸盐，40℃下反应20min，得到转化液。将转化液采用上述戊二胺HPLC检测方法检测戊二胺及其含量。
结果显示，在不额外添加PLP条件下，E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK和E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxY菌株分别合成了11.88g/L和14.43g/L的戊二胺，分别是E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB(5.57g/L)的2.13和2.59倍(见图6中的A和B)。因此，可以看出，吡哆醛激酶I和II编码基因pdxK和pdxY的过表达提高了辅因子PLP自供应水平，有利于戊二胺的生物合成。
为进一步提高辅因子PLP自供应能力，以pdxY-FF和pdxY-RR为引物，以大肠杆菌基因组为模板PCR扩增分别获得添加NdeI和BglII酶切位点和同源臂的pdxY基因片段，纯化后的添加NdeI和BglII酶切位点和同源臂的pdxY基因片段与经NdeI和BglII双酶切的pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coliBL21感受态细胞。转化子验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene3.2.1软件分析测序结果，测序正确的菌株分别命名为E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L /M569V-cadB-pdxK-pdxY。其中，引物如下：
pdxY-FF：TAAGAAGGAGATATACATATGATGATGAAAAATATTCTCGCTA(下划线部分为NdeI，SEQ ID No.29)
pdxY-RR：CTTGGCAGAACTCATAGATCTTCAGAGCTTTGTTGCGCTGAAG(下划线部分为BglII，SEQ ID No.30)
将构建好的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板上进行划线活化，37℃培养12～24h后，挑取单菌落，转接添加50μg/mL氨苄青霉素的10mL LB液体培养基，于37℃、180r/min培养12～24h；之后以1％(v/v)接种量接种至添加50μg/mL氨苄青霉素的50mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养2h后，添加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续于28℃、180r/min诱导表达16h；最后，将诱导完成后的菌液在4℃下离心，收集菌体。在控制菌体浓度一样的前提下(OD600＝4.0)，在500mM、pH 6.0乙酸钠缓冲液中加入1M底物L-赖氨酸盐酸盐，40℃下反应20min，得到转化液。将转化液采用上述戊二胺HPLC检测方法检测戊二胺及其含量。
结果显示，在不额外添加PLP条件下，E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY菌株合成了18.52g/L的尸胺(见图7)，使尸胺产量得到了较高程度提高。
1.7全细胞催化生物合成1,5-戊二胺
重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY在含50μg/mL氨苄青霉素的固体LB平板上进行划线活化，37℃培养12-24h后，挑取单菌落，转接添加50μg/mL氨苄青霉素的10mL LB液体培养基，于37℃、180r/min培养12～24h；之后以1％(v/v)接种量接种至添加50μg/mL氨苄青霉素的200mL LB液体培养基中，于37℃、180r/min培养18h，获得种子液。之后按10％接种量转接装有2L发酵培养基(TY培养基)的5L发酵罐，发酵条件：温度设为37℃、转速设为600rpm、通气量为4vvm。OD600为7～9时，开始匀速流加补料培养基，补料时间控制在12h。发酵8h后，添加IPTG诱导剂(终浓度0.5mM)，并将发酵罐温度设为28℃，诱导培养24h后，停止发酵，4℃下离心收集菌体。
全细胞转化体系(1L)：离心收集的菌体用500mL水悬浮后(OD600为50～70)，之后投加500mL含2M(365.3g/L)工业级L-赖氨酸盐酸盐、1％(质量浓度1g/100mL)50mM Mn2+、0.25mM维生素B6的水溶液，40℃转化3h，得到转化液，采用上述戊二胺HPLC检测方法检测戊二胺及其含量。
由图8的结果表明，重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-cadAP530L/M569V-cadB-pdxK-pdxY合成了201.65g/L的1,5-戊二胺，摩尔转化率高达98.67％，反应中不使用缓冲液，无需使用盐酸进行中和，转化时间短，为1,5-戊二胺的工业化生产提供了一种高效且经济的方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种重组大肠杆菌及其构建方法与合成1,5-戊二胺的方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcatcaccac agccaggatc catgaacgtt atcgccatca tga 43
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggcgcgccg agctcgaatt cttatttcgc cttcagcact ttc 43
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccaagatca aacaggcgac cgacgaatat atc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatatattcg tcggtcgcct gtttgatctt ggc 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaagcccgg tcggcagact gttctacgat ttc 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaatcgtag aacagtctgc cgaccgggct ttt 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgagaaaa ccgggctgta caacctgttg ttc 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaacaacagg ttgtacagcc cggttttctc gac 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgcgggtga aaaacgtact gccttcgctg tat 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atacagcgaa ggcagtacgt ttttcacccg cag 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctggagttcc tgcaggcact gtgcgaaatc ggc 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccgatttcg cacagtgcct gcaggaactc cag 33
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tatccgggct ttgaaccgga cattcacggc gcc 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcgccgtga atgtccggtt caaagcccgg ata 33
<210> 15
<211> 712
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Asn Val Ile Ala Ile Met Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Gln Ala Leu Glu Ser Leu Asp Phe Arg
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Glu Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Leu Asn Glu Tyr Met Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Met Gln Val Arg Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Thr Asp
100 105 110
Ile Ala Ala Lys Ile Lys Gln Asn Thr Asp Glu Tyr Ile Asp Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ser Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Glu Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Ile Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln Arg Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Asp Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Asn
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe His Pro Ile Tyr Lys Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Ile
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile His Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Lys Val Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Glu His Ile Asp Glu Pro Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Ala Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Ser Lys Glu Gly Ala Met Gln Pro Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu Arg Gly Ile Ile Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Met Thr Asp Phe Lys Arg Ser Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Gln Glu
565 570 575
Ala Pro Asp Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Leu Leu Val Glu Gln His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Asn Pro Tyr Gln Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Glu Val Glu Glu Val Tyr Leu Glu Asp Met
625 630 635 640
Val Gly Lys Val Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Arg Val Lys Val Leu Lys Ala Lys
705 710
<210> 16
<211> 2139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgaacgtta tcgccatcat gaatcacatg ggtgtctact tcaaagaaga gcctatccgt 60
gaactgcatc aggcgctgga aagtctggat ttccgcatcg tttaccctaa cgatcgcgaa 120
gacttgctga aactgatcga gaacaatgcc cgcttgtgtg gggtgatctt cgactgggac 180
aaatacaacc tggagctgtg cgaagagatc agccaactga acgagtacat gccgctgtac 240
gcgttcgcca acacctattc cacgctggac gtcagcctga acgatctgcg catgcaggtg 300
cgcttcttcg aatatgcgct cggcgcggca accgacatcg ccgccaagat caaacagaat 360
accgacgaat atatcgacac catcctgccg ccgctgacca aggcgctgtt caaatacgtg 420
cgcgaaggca agtacacctt ctgtacgccg ggccacatgg gcggcaccgc gttccagaaa 480
agcccggtcg gcagcctgtt ctacgatttc ttcggcccga ataccatgaa gtcggatatc 540
tcgatttcgg tgtccgagct gggatcgctg ctggatcact ccggcccgca caaagaggcg 600
gaagagtata tttctcgcgt gttcaacgcc gaacgcagct acatggtcac caacggcacc 660
tcaaccgcca acaagatcgt cggcatgtat tcggcgccgg cgggcagcac ggtgctgatt 720
gaccgtaact gccacaagtc gctgactcac ctgatgatga tgagtgacat tacgccgatc 780
tacttccgcc cgacccgcaa cgcttacggc atcctcggcg gcattccgca gagcgagttc 840
cagcgcgcca ccatcgccaa acgcgtgaag gacaccccga acgccacctg gccggtgcac 900
gcggtgatca ccaactccac ctatgacggc ttgctgtaca acaccgactt tatcaagaac 960
accctggacg tgaaatctat ccacttcgac tccgcctggg tgccttacac caatttccac 1020
ccgatctata aaggcaagtg cggcatgagc ggcggccgcg tggagggcaa ggtgatctat 1080
gaaacccagt ccacccacaa actgttggcg gctttctcgc aggcgtcgat gatccacgtg 1140
aagggcgaca tcaacgaaga gaccttcaac gaagcctaca tgatgcacac taccacctcg 1200
ccgcactacg gcatcgtggc ctctaccgaa accgccgcgg cgatgatgaa aggcaacgcc 1260
ggcaagcgcc tgatccacgg ctctatcgaa cgcgcgatca agttccgtaa agagatcaaa 1320
cgcctgaaag tcgaatccga cggctggttc ttcgacgtct ggcagccgga gcatatcgat 1380
gagccggaat gctggccgct gcgttccgac agcgcctggc acggtttcaa gaacatcgac 1440
aatgaacaca tgtacctcga cccgatcaag gtcaccatcc tgacgccggg gatgagcaag 1500
gaaggcgcga tgcagccgtt cggcatcccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgatgaa 1560
cgcggcatca tcgtcgagaa aaccgggctg tacaacctgt tgttcctgtt cagcatcggc 1620
atcgacaaaa ccaaggcgct cagcctgctg cgcgcgatga ccgacttcaa acgctcgttc 1680
gatctgaacc tgcgggtgaa aaacgtactg ccttcgctgt atcaggaagc gcctgatttc 1740
tatgaaaaca tgcgcattca ggatctggcg cagaacattc accttctggt ggagcaacac 1800
aacctgccgg atctgatgta ccgcgcgttc gaagtgctgc caaccatggt gatgaacccg 1860
taccaggcgt tccagaaaga gctgcacggc gaagtggaag aggtctatct ggaagacatg 1920
gtcggcaagg tcaacgccaa tatgatcctg ccatacccac cgggcgtgcc gttggtgatg 1980
ccgggcgaaa tgctgaccga ggagagccgg ccggtgctgg agttcctgca gatgctgtgc 2040
gaaatcggcg cgcattatcc gggctttgaa accgacattc acggcgccta tcgtcaggcg 2100
gacggacgtt atcgggtgaa agtgctgaag gcgaaataa 2139
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agatatacat atggcagatc tatgagttct gccaagaaga tcg 43
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtttcttta ccagactcga gttaatgtgc gttagacgct gtg 43
<210> 19
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Met Ser Ser Ala Lys Lys Ile Gly Leu Phe Ala Cys Thr Gly Val Val
1 5 10 15
Ala Gly Asn Met Met Gly Ser Gly Ile Ala Leu Leu Pro Ala Asn Leu
20 25 30
Ala Ser Ile Gly Gly Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ile Ile Ser Ile Ile
35 40 45
Gly Ala Met Ser Leu Ala Tyr Val Tyr Ala Arg Leu Ala Thr Lys Asn
50 55 60
Pro Gln Gln Gly Gly Pro Ile Ala Tyr Ala Gly Glu Ile Ser Pro Ala
65 70 75 80
Phe Gly Phe Gln Thr Gly Val Leu Tyr Tyr His Ala Asn Trp Ile Gly
85 90 95
Asn Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ala Val Ser Tyr Leu Ser Thr Phe Phe
100 105 110
Pro Val Leu Asn Asp Pro Val Pro Ala Gly Ile Ala Cys Ile Ala Ile
115 120 125
Val Trp Val Phe Thr Phe Val Asn Met Leu Gly Gly Thr Trp Val Ser
130 135 140
Arg Leu Thr Thr Ile Gly Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Val Val Met
145 150 155 160
Thr Ala Ile Val Gly Trp His Trp Phe Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Ala
165 170 175
Asn Trp Asn Thr Ala Asp Thr Thr Asp Gly His Ala Ile Ile Lys Ser
180 185 190
Ile Leu Leu Cys Leu Trp Ala Phe Val Gly Val Glu Ser Ala Ala Val
195 200 205
Ser Thr Gly Met Val Lys Asn Pro Lys Arg Thr Val Pro Leu Ala Thr
210 215 220
Met Leu Gly Thr Gly Leu Ala Gly Ile Val Tyr Ile Ala Ala Thr Gln
225 230 235 240
Val Leu Ser Gly Met Tyr Pro Ser Ser Val Met Ala Ala Ser Gly Ala
245 250 255
Pro Phe Ala Ile Ser Ala Ser Thr Ile Leu Gly Asn Trp Ala Ala Pro
260 265 270
Leu Val Ser Ala Phe Thr Ala Phe Ala Cys Leu Thr Ser Leu Gly Ser
275 280 285
Trp Met Met Leu Val Gly Gln Ala Gly Val Arg Ala Ala Asn Asp Gly
290 295 300
Asn Phe Pro Lys Val Tyr Gly Glu Val Asp Ser Asn Gly Ile Pro Lys
305 310 315 320
Lys Gly Leu Leu Leu Ala Ala Val Lys Met Thr Ala Leu Met Ile Leu
325 330 335
Ile Thr Leu Met Asn Ser Ala Gly Gly Lys Ala Ser Asp Leu Phe Gly
340 345 350
Glu Leu Thr Gly Ile Ala Val Leu Leu Thr Met Leu Pro Tyr Phe Tyr
355 360 365
Ser Cys Val Asp Leu Ile Arg Phe Glu Gly Val Asn Ile Arg Asn Phe
370 375 380
Val Ser Leu Ile Cys Ser Val Leu Gly Cys Val Phe Cys Phe Ile Ala
385 390 395 400
Leu Met Gly Ala Ser Ser Phe Glu Leu Ala Gly Thr Phe Ile Val Ser
405 410 415
Leu Ile Ile Leu Met Phe Tyr Ala Arg Lys Met His Glu Arg Gln Ser
420 425 430
His Ser Met Asp Asn His Thr Ala Ser Asn Ala His
435 440
<210> 20
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgagttctg ccaagaagat cgggctattt gcctgtaccg gtgttgttgc cggtaatatg 60
atggggagcg gtattgcatt attacctgcg aacctagcaa gtatcggtgg tattgctatc 120
tggggttgga ttatctctat tattggtgca atgtcgctgg cgtatgtata tgcccgactg 180
gcaacaaaaa acccgcaaca aggtggccca attgcttatg ccggagaaat ttcccctgca 240
tttggttttc agacaggtgt tctttattac catgctaact ggattggtaa cctggcgatt 300
ggtattaccg ctgtatctta tctttccacc ttcttcccag tattaaatga tcctgttccg 360
gcgggtatcg cctgtattgc tatcgtctgg gtatttacct ttgtaaatat gctcggcggt 420
acttgggtaa gccgtttaac cactattggt ctggtgctgg ttcttattcc tgtggtgatg 480
actgctattg ttggctggca ttggtttgat gcggcaactt atgcagctaa ctggaatact 540
gcggatacca ctgatggtca tgcgatcatt aaaagtattc tgctctgcct gtgggccttc 600
gtgggtgttg aatccgcagc tgtaagtact ggtatggtta aaaacccgaa acgtaccgtt 660
ccgctggcaa ccatgctggg tactggttta gcaggtattg tttacatcgc tgcgactcag 720
gtgctttccg gtatgtatcc gtcttctgta atggcggctt ccggtgctcc gtttgcaatc 780
agtgcttcaa ctatcctcgg taactgggct gcgccgctgg tttctgcatt caccgccttt 840
gcgtgcctga cttctctggg ctcctggatg atgttggtag gccaggcagg tgtacgtgcc 900
gctaacgacg gtaacttccc gaaagtttat ggtgaagtcg acagcaacgg tattccgaaa 960
aaaggtctgc tgctggctgc agtgaaaatg actgccctga tgatccttat cactctgatg 1020
aactctgccg gtggtaaagc atctgacctg ttcggtgaac tgaccggtat cgcagtactg 1080
ctgactatgc tgccgtattt ctactcttgc gttgacctga ttcgttttga aggcgttaac 1140
atccgcaact ttgtcagcct gatctgctct gtactgggtt gcgtgttctg cttcatcgcg 1200
ctgatgggcg caagctcctt cgagctggca ggtaccttca tcgtcagcct gattatcctg 1260
atgttctacg ctcgcaaaat gcacgagcgc cagagccact caatggataa ccacaccgcg 1320
tctaacgcac attaa 1335
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctgaaggcga aataagaatt catgagtagt ttgttgttgt tta 43
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcattatgcg gccgcaagct tttatgcttc cgccagcggc ggc 43
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgaaggcga aataagaatt catgatgaaa aatattctcg cta 43
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcattatgcg gccgcaagct ttcagagctt tgttgcgctg aag 43
<210> 25
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Met Ser Ser Leu Leu Leu Phe Asn Asp Lys Ser Arg Ala Leu Gln Ala
1 5 10 15
Asp Ile Val Ala Val Gln Ser Gln Val Val Tyr Gly Ser Val Gly Asn
20 25 30
Ser Ile Ala Val Pro Ala Ile Lys Gln Asn Gly Leu Asn Val Phe Ala
35 40 45
Val Pro Thr Val Leu Leu Ser Asn Thr Pro His Tyr Asp Thr Phe Tyr
50 55 60
Gly Gly Ala Ile Pro Asp Glu Trp Phe Ser Gly Tyr Leu Arg Ala Leu
65 70 75 80
Gln Glu Arg Asp Ala Leu Arg Gln Leu Arg Ala Val Thr Thr Gly Tyr
85 90 95
Met Gly Thr Ala Ser Gln Ile Lys Ile Leu Ala Glu Trp Leu Thr Ala
100 105 110
Leu Arg Lys Asp His Pro Asp Leu Leu Ile Met Val Asp Pro Val Ile
115 120 125
Gly Asp Ile Asp Ser Gly Ile Tyr Val Lys Pro Asp Leu Pro Glu Ala
130 135 140
Tyr Arg Gln Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Gln Gly Ile Thr Pro Asn Ile
145 150 155 160
Phe Glu Leu Glu Ile Leu Thr Gly Lys Asn Cys Arg Asp Leu Asp Ser
165 170 175
Ala Ile Ala Ala Ala Lys Ser Leu Leu Ser Asp Thr Leu Lys Trp Val
180 185 190
Val Val Thr Ser Ala Ser Gly Asn Glu Glu Asn Gln Glu Met Gln Val
195 200 205
Val Val Val Thr Ala Asp Ser Val Asn Val Ile Ser His Ser Arg Val
210 215 220
Lys Thr Asp Leu Lys Gly Thr Gly Asp Leu Phe Cys Ala Gln Leu Ile
225 230 235 240
Ser Gly Leu Leu Lys Gly Lys Ala Leu Thr Asp Ala Val His Arg Ala
245 250 255
Gly Leu Arg Val Leu Glu Val Met Arg Tyr Thr Gln Gln His Glu Ser
260 265 270
Asp Glu Leu Ile Leu Pro Pro Leu Ala Glu Ala
275 280
<210> 26
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgagtagtt tgttgttgtt taacgataag agtagggcac tgcaggcgga tatcgtcgcc 60
gtgcagtcgc aggtggttta cggcagcgtg ggcaacagca ttgccgtgcc tgctatcaaa 120
cagaacggcc tgaatgtctt tgccgtgccg acggtattgc tgagcaatac gccgcattat 180
gacactttct acggtggtgc gattccggac gaatggttta gcggctattt gcgtgcgctt 240
caggagcgtg atgcgctgcg ccaacttcgt gctgtaacca cgggctatat gggaacggca 300
tcgcaaatca aaatccttgc cgagtggctg actgcgctac gcaaagacca tcctgaccta 360
ttgatcatgg tcgatccggt gattggcgat attgatagcg gaatttatgt caaacctgac 420
cttcccgaag cgtatcgaca atatttactg ccgctggcgc agggaattac ccccaatatc 480
tttgagttgg aaatcctgac cggtaaaaat tgccgcgatc tcgacagtgc cattgctgcc 540
gcaaaaagtc tgctttcaga cacattaaaa tgggtggtgg ttaccagcgc ctccggtaat 600
gaagaaaatc aggagatgca ggttgtggtg gtcactgccg acagcgtgaa tgtcatttcc 660
cattcacggg taaaaaccga cctgaaaggg actggcgacc tgttttgtgc tcagctcatc 720
agtggcttgc tgaaagggaa ggcgttaacc gatgcagtgc accgagcggg gttgcgcgta 780
ctggaagtga tgcgctacac ccagcagcat gagagcgatg aattgatttt gccgccgctg 840
gcggaagcat aa 852
<210> 27
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Met Met Lys Asn Ile Leu Ala Ile Gln Ser His Val Val Tyr Gly His
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ser Ala Ala Glu Phe Pro Met Arg Arg Leu Gly Ala Asn
20 25 30
Val Trp Pro Leu Asn Thr Val Gln Phe Ser Asn His Thr Gln Tyr Gly
35 40 45
Lys Trp Thr Gly Cys Val Met Pro Pro Ser His Leu Thr Glu Ile Val
50 55 60
Gln Gly Ile Ala Ala Ile Asp Lys Leu His Thr Cys Asp Ala Val Leu
65 70 75 80
Ser Gly Tyr Leu Gly Ser Ala Glu Gln Gly Glu His Ile Leu Gly Ile
85 90 95
Val Arg Gln Val Lys Ala Ala Asn Pro Gln Ala Lys Tyr Phe Cys Asp
100 105 110
Pro Val Met Gly His Pro Glu Lys Gly Cys Ile Val Ala Pro Gly Val
115 120 125
Ala Glu Phe His Val Arg His Gly Leu Pro Ala Ser Asp Ile Ile Ala
130 135 140
Pro Asn Leu Val Glu Leu Glu Ile Leu Cys Glu His Ala Val Asn Asn
145 150 155 160
Val Glu Glu Ala Val Leu Ala Ala Arg Glu Leu Ile Ala Gln Gly Pro
165 170 175
Gln Ile Val Leu Val Lys His Leu Ala Arg Ala Gly Tyr Ser Arg Asp
180 185 190
Arg Phe Glu Met Leu Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Trp His Ile Ser
195 200 205
Arg Pro Leu Val Asp Phe Gly Met Arg Gln Pro Val Gly Val Gly Asp
210 215 220
Val Thr Ser Gly Leu Leu Leu Val Lys Leu Leu Gln Gly Ala Thr Leu
225 230 235 240
Gln Glu Ala Leu Glu His Val Thr Ala Ala Val Tyr Glu Ile Met Val
245 250 255
Thr Thr Lys Ala Met Gln Glu Tyr Glu Leu Gln Val Val Ala Ala Gln
260 265 270
Asp Arg Ile Ala Lys Pro Glu His Tyr Phe Ser Ala Thr Lys Leu
275 280 285
<210> 28
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgatgaaaa atattctcgc tatccagtct cacgttgttt atggtcatgc gggtaacagt 60
gcggcagagt ttccgatgcg ccgcctgggc gcgaacgtct ggccgctgaa caccgttcaa 120
ttttctaatc acacccaata cggcaaatgg actggctgcg tgatgccgcc cagccattta 180
accgaaattg tgcaaggcat tgccgccatt gataaattac acacctgtga tgccgtatta 240
agtggctatc tgggatcggc ggagcagggt gaacatatcc tcggtatcgt ccgtcaggtg 300
aaagccgcga atccgcaggc gaaatatttt tgcgatccgg taatgggtca tccggaaaaa 360
ggctgtatcg ttgcaccggg tgtcgcagag tttcatgtgc ggcacggttt gcctgccagc 420
gatatcattg cgccaaatct ggttgagctg gaaatactct gtgagcatgc ggtaaataac 480
gtcgaagaag cggttctggc agcgcgcgaa ctcattgcgc aagggccaca aattgtgttg 540
gttaaacacc tggcgcgagc tggctacagc cgtgaccgtt ttgaaatgct gctggtcacc 600
gccgatgaag cctggcatat cagccgtccg ctggtggatt ttggtatgcg ccagccggta 660
ggtgttggtg atgtgacgag cggtttactg ctggtgaaac tgcttcaggg ggcaacgctg 720
caggaggcgc tggaacatgt gaccgctgca gtctacgaaa tcatggtgac caccaaagca 780
atgcaggaat atgagctgca agtggtggct gctcaggatc gtattgccaa accagaacat 840
tacttcagcg caacaaagct ctga 864
<210> 29
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taagaaggag atatacatat gatgatgaaa aatattctcg cta 43
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cttggcagaa ctcatagatc ttcagagctt tgttgcgctg aag 43

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌依次含有赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述吡哆醛激酶为吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II；
优选的，所述重组大肠杆菌依次含有赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB、吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II；
优选的，所述吡哆醛激酶II氨基酸序列如SEQ ID No.27所示；所述编码吡哆醛激酶II基因pdxY的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
优选的，所述吡哆醛激酶I氨基酸序列如SEQ ID No.25所示；所述编码吡哆醛激酶I基因pdxK的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示；所述编码赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L /M569V的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB的氨基酸序列如SEQ ID No.19所示；所述编码赖氨酸/尸胺反向转运蛋白的基因cadB的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的出发菌株为大肠杆菌E.coliBL21。
5.含有权利要求1所述赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶的氨基酸序列的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括pETDuet1、pACYCDuet1、pET28a中的任意一种。
6.一种权利要求1～4任意一项所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，将赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB和吡哆醛激酶的基因序列依次导入大肠杆菌；
优选的，将赖氨酸脱羧酶突变体CadAP530L/M569V、赖氨酸/尸胺反向转运蛋白CadB、吡哆醛激酶I和吡哆醛激酶II的基因序列依次导入大肠杆菌。
7.权利要求1～4任意一项所述重组大肠杆菌或权利要求6所述构建方法得到的重组大肠杆菌在合成1,5-戊二胺中的应用。
8.一种合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，将权利要求1～4任意一项所述重组大肠杆菌或权利要求6所述构建方法得到的重组大肠杆菌进行发酵培养后，接种至含有L-赖氨酸盐酸盐的转化体系中，以转化L-赖氨酸盐酸盐为1,5-戊二胺；
优选的，所述的转化体系包括如下浓度的成分：L-赖氨酸盐酸盐1.5～2.5M、Mn2+45～55mM、维生素B60.2～0.3mM，pH自然。
优选的，所述转化的温度为38～42℃，所述转化的时间为2.5～3.5h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的方法包括：
将重组大肠杆菌的种子液接种在发酵培养基中发酵，发酵温度为32～40℃、转速为550～650rpm、通气量为3～5vvm，OD600为7～9时，开始匀速流加补料培养基，补料时间控制在10～13h，发酵7～9h后，添加IPTG诱导剂，并将发酵温度设为27～29℃，诱导培养20～26h后，发酵结束。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为TY培养基，所述TY培养基包括酵母提取物8g/L、胰蛋白胨12g/L、K3PO44.02g/L、NaCl3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、甘油10g/L、(NH4)2SO42.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L，用氨水调pH至7.2；所述补料培养基包括甘油400g/L、酵母粉50g/L、胰蛋白胨25g/L。
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