CN113881719A - 一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种全细胞催化合成1,5‑戊二胺的方法，所述方法包括：将底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5‑戊二胺；所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂。所述方法通过一步催化反应即可得到目标产物，促进剂的引入能够显著改善细胞膜的通透性，增强物质的传递速率，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤简单，原料成本低，无需多次离心、冲洗、冷冻等耗时耗能的工序，节约了生产成本，能够快速、高效地获得高收率的1,5‑戊二胺。

Description

一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法
技术领域
本发明属于生物制备技术领域，具体涉及一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法。
背景技术
1,5-戊二胺简称为戊二胺，是一种具有多种化学反应活性和生物活性的天然多胺。戊二胺可以作为原料制备一系列具有市场前景的高附加值产品，是聚酰胺、聚氨酯和聚脲等聚合物的核心单体之一；其中，高性能聚酰胺尼龙5X材料(例如尼龙52、5T、54、56、510、516或518等)在机械强度、透气性、吸湿性和阻燃性能方面都具有优异的表现，可应用于纤维和工程塑料等多种重要领域，因此备受关注。上述聚酰胺、聚氨酯、聚脲等聚合物的生产受制于其核心单体戊二胺的合成。化学法合成戊二胺通常面临设备腐蚀问题严重、目标产物选择性低、催化剂稳定性差等问题，多年来仍无法突破连续稳定生产的要求。通过生物催化的方法合成戊二胺，不仅具有良好的反应选择性，而且可以利用可再生资源，减少化石能源消耗，提高循环经济水平，实现经济与生态循环相协调。
在生物催化的方法中，目前普遍采用构建基因工程菌株，利用全细胞催化转化L-赖氨酸为戊二胺。由于赖氨酸脱羧酶受高浓度底物的抑制和产物戊二胺的毒害作用，而细胞能为酶提供一种天然的胞内环境，确保酶的稳定性和适应性，提高催化效率并能原位再生辅酶；因此，与传统的化学方法相比，全细胞催化法具有绿色和高特异性的优点。CN102844440A公开了一种1,5-戊二胺的制造方法，该方法通过在1,5-戊二胺的发酵中使用棒状杆菌，使副产物L-赖氨酸的生成得以抑制；所述棒状杆菌的染色体中具有LDC基因，并且在培养中持续保持有50mU/mg蛋白以上的赖氨酸脱羧酶活性。CN105368766A公开了一种生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法，所述菌株在赖氨酸脱羧酶启动子ldcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子的同时表达信号肽，其催化合成戊二胺的酶的活力得到提高，并可通过环境温度进行调节，使最终表达的酶介于细胞内膜与细胞壁之间、而不释放于发酵体系中，达到戊二胺高效转化的目的。
但是，人们在研究中发现，全细胞催化法还存在一系列不容忽视的共性问题，例如全细胞催化过程具有不确定性、细胞壁和细胞膜的通透性较低、副反应会导致产物降解以及副产物积累严重等，严重影响了L-赖氨酸的转化率，降低了戊二胺生产强度，增加了生产成本。Chen等(Enhancing catalytic stability and cadaverine tolerance by whole-cell immobilization and the addition of cell protectant during cadaverineproduction,Appl Microbiol Biotechnol 2018,102,7837-7847)通过冻融的方法，可以提高赖氨酸脱羧酶的活性，但是需要离心、缓冲液清洗细胞、-20/-80℃冷冻，然后进行全细胞催化合成戊二胺；上述反应需要反复离心，工序非常复杂，用时长、能耗高、浪费发酵用水、成本高，因此，该过程难以进行工程化应用。
因此，开发一种反应工序简单、成本低、产率高的戊二胺合成方法，实现戊二胺的规模化生产，是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，所述方法通过低成本促进剂的引入，显著提升了细胞膜的通透性和1,5-戊二胺的转化率，能够得到高收率的目标产物，且工艺简单、能耗低，高度适于1,5-戊二胺的规模化生产。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：将底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5-戊二胺；所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂。
本发明提供的全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法中，将底物赖氨酸、辅酶磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂进行混合，通过一步催化反应即可得到目标产物1,5-戊二胺；其中，所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂，能够显著改善细胞膜的通透性，增强物质的传递速率，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤十分简单，原料成本低，无需多次离心、冲洗、冷冻等耗时耗能的工序，节约了生产成本，能够快速、高效地获得高收率的1,5-戊二胺，有利于戊二胺合成的工程化放大。
本发明中，所述有机溶剂包括丙酮、甲醇或乙醇中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠、聚乙二醇600、曲拉通X-100、十六烷基三甲基溴化铵、二辛基琥珀酸磺酸钠、甘胆酸钠、十八烷基硫酸钠、硬脂酸钠、三乙醇胺皂、硬脂酸、脂肪酸甘油酯或脂肪酸山梨坦中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述表面活性剂包括消泡剂，所述消泡剂示例性地包括但不限于有机硅类消泡剂。
本发明中，所述混合液中促进剂的体积百分浓度为0.0001～50％，例如0.0003％、0.0005％、0.0008％、0.001％、0.003％、0.005％、0.008％、0.01％、0.03％、0.05％、0.08％、0.1％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或48％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为0.001～10％。
优选地，所述促进剂为表面活性剂。
优选地，所述底物赖氨酸包括L-赖氨酸盐酸盐。
优选地，所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L，例如1.2mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L、2.4mol/L、2.5mol/L、2.6mol/L、2.8mol/L或2.9mol/L，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述混合液中磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，例如0.002mM、0.004mM、0.006mM、0.008mM、0.01mM、0.012mM、0.015mM、0.018mM、0.02mM、0.04mM、0.05mM、0.07mM、0.09mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.35mM、0.4mM或0.45mM，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述混合液的OD600为0.5～30，例如0.6、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、22、24、25、27或29，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的酶。
优选地，所述赖氨酸脱羧酶包括来源于微生物的赖氨酸脱羧酶及其突变体。
优选地，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、耐碱芽胞杆菌(Bacillus halodurans)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、毛链霉菌(Streptomycespolosus)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、邦戈沙门氏菌(Salmonella bongori)、沙雷氏菌属(Serratia)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、博代氏杆菌属(Bordetella)、气单胞菌属(Aeromonas)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述基因工程菌细胞悬液的制备方法为：将基因工程菌株置于含有氨苄抗生素的LB培养基中培养，获得种子液；将所述种子液接种于含有氨苄抗生素的LB培养基中发酵培养，至OD600为0.6～1(例如0.7、0.8、0.9或1等)时加入诱导剂进行诱导培养，然后离心收集菌体，将菌体重悬，得到所述基因工程菌细胞悬液；
优选地，所述种子液的接种量为0.5～5％，例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.7％或4.9％，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述诱导剂包括异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。
优选地，所述诱导培养的时间为5～30h，例如6h、8h、10h、12h、14h、15h、17h、19h、20h、22h、24h、25h、27h或29h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述诱导培养的温度为15～25℃，例如16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明中，所述基因工程菌株的构建方法包括：将携带有赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因的表达载体转入大肠杆菌菌株中，得到所述基因工程菌株。
作为本发明的优选技术方案，所述基因工程菌株能够表达赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-戊二胺反向转运蛋白CadB，从而有效增加了全细胞催化合成中的物质传递。本发明对于表达载体的种类没有特殊要求，包括能够在大肠杆菌中表达目的基因的各种常用表达载体，例如质粒等。表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中。
优选地，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)菌株。
优选地，所述表达载体的制备方法为：将赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，得到质粒pETDuet-ldc-cadB；然后在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到所述表达载体pETDuet-ldc-pelB-cadB。
优选地，所述混合液的溶剂为缓冲液。
优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述缓冲液的pH值为5～11，例如5.5、6、6.2、6.5、6.8、7、7.2、7.5、7.8、8、8.5、9、9.5、10、10.5，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，进一步优选为6～8。
本发明中，所述催化反应的温度为35～65℃，例如38℃、40℃、42℃、45℃、47℃、49℃、50℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、60℃、62℃或64℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选为45～55℃；
优选地，所述催化反应的时间为0.5～24h，例如0.8h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、14h、15h、17h、19h、20h、21h或23h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述催化反应在振荡的条件下进行。
优选地，所述振荡的转速为100～800rpm，例如150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm或750rpm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述催化反应完成后还包括终止反应的步骤。
优选地，所述终止反应的方法为离心。
优选地，所述方法具体包括：将底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂混合，得到OD600为0.5～30的混合液；所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，促进剂的体积百分浓度为0.0001～50％；所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂。
所述混合液在35～65℃、振荡条件下催化反应0.5～24h，离心终止反应，得到所述1,5-戊二胺。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法中，将底物赖氨酸、辅酶磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂进行混合，通过一步催化反应即可得到目标产物，所述促进剂能够显著改善细胞膜的通透性，增强物质的传递速率，提升赖氨酸脱羧酶的催化效率。所述方法的工艺步骤简单，原料成本低，无需多次离心、冲洗、冷冻等耗时耗能的工序，节约了生产成本，能够快速、高效地获得高收率的1,5-戊二胺，在低细胞浓度下(OD600约为1.5)得到的1,5-戊二胺浓度达到92.35g/L，高细胞浓度下(OD600约为15)催化反应1h得到的1,5-戊二胺浓度达到175.37g/L，产率达到85.8％，催化反应2h的1,5-戊二胺产率能够达到100％，有利于戊二胺合成的工程化放大。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
一种基因工程菌株，制备方法如下：
(1)构建表达载体：将来源于迟缓爱德华氏菌的赖氨酸脱羧酶基因(LdcEdw)和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB(GenBank：WP_000092909.1)基因分别插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，构建质粒pETDuet-ldcEdw-cadB，再在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到表达载体pETDuet-ldcEdw-pelB-cadB；
(2)构建基因工程菌株：将步骤(1)中得到的表达载体pETDuet-ldcEdw-pelB-cadB转入BL21(DE3)菌株中，得到基因工程菌株I。
制备例2
一种基因工程菌株，制备方法如下：
(1)构建表达载体：将来源于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶基因EcCadA(GenBank：WP_001295383.1)和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB(GenBank：WP_000092909.1)基因分别插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，构建质粒pETDuet-EcCadA-cadB，再在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到表达载体pETDuet-EcCadA-pelB-cadB；
(2)构建基因工程菌株：将步骤(1)中得到的表达载体pETDuet-EcCadA-pelB-cadB转入BL21(DE3)菌株中，得到基因工程菌株II。
实施例1
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，具体步骤如下：
(1)将制备例1提供的基因工程菌株I置于5mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃过夜培养，获得种子液；将种子液按1％体积的接种量转接入50mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃发酵培养，至OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，20℃诱导培养20h，4000rpm离心，收集菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH值为8)重悬细胞，得到含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液；
(2)在2mL离心管加入300μL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、10μL浓度为5mM的磷酸吡哆醛溶液(PLP，溶剂为纯水)、5μL浓度为1％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液和185μL步骤(1)得到的基因工程菌细胞悬液，振荡混匀，得到的混合液OD600约为1.5；将混合液在恒温混匀仪中以50℃、500rpm催化反应1h；12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。
采用反相高效液相色谱法测试本实施例得到的1,5-戊二胺的浓度及产率，方法如下：
将本实施例得到的反应液按照高效液相色谱的进样要求进行稀释，得到稀释反应液；将600μL硼酸缓冲液(50mM，pH值为9)、200μL甲醇、60μL稀释反应液和130μL双蒸水(ddH2O)和10μL浓度为1M的乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM，溶剂为甲醇)，室温下反应10min后，转移至70℃水浴中，静置2h终止反应，并用高效液相色谱(HPLC)进行检测。
色谱条件如下：
HPLC检测器：SPD-20A二极管阵列检测器；检测柱：C18色谱柱(2.1×100mm)；检测温度：35℃；进样量：5μL，波长：284nm。其中，流动相A：乙腈；流动相B：醋酸钠缓冲液(25mM，pH值为4.8)；流速0.5mL/min；时间程序(流动相B所占比例)：0min 80％；2min 75％；22min51.7％；22.01min80％；27min 80％。
戊二胺的产率＝100％×实测浓度×稀释倍数/底物浓度；其中，实测浓度为通过液相色谱测试得到的浓度。
通过上述检测和计算可知，本实施例中得到的1,5-戊二胺浓度为67.69g/L，产率为44.2％。
实施例2～5
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例1的区别仅在于，将步骤(2)中的CTAB用其他促进剂替换，具体组分如表1所示；其他步骤均与实施例1相同。
对比例1
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例1的区别仅在于，将步骤(2)中的CTAB用等体积的磷酸盐缓冲液替换。
表1
Figure BDA0002566949450000111
根据表1的数据可知，与不添加任何促进剂的对比例1相比，本发明实施例1～5中，促进剂的引入能够明显提高1,5-戊二胺的浓度及产率，其在0.01％添加量的条件下可以使1,5-戊二胺的浓度达到32.65～87.98g/L，产率达到21.3～57.4％；其中，曲拉通X-100的促进效果最为显著。
实施例6～8
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例3的区别仅在于，将步骤(2)中的浓度为1％的曲拉通X-100溶液分别用浓度为0.5％、5％、10％的曲拉通X-100溶液替换，具体组分如表2所示；其他步骤均与实施例3相同。
表2
Figure BDA0002566949450000112
Figure BDA0002566949450000121
根据表2的数据可知，曲拉通X-100对于全细胞催化合成1,5-戊二胺的过程具有明显的促进作用，且促进作用具有一定的浓度依赖性，其在添加量为0.05％时具有更优的促进效果，能够使目标产物1,5-戊二胺的浓度达到92.35g/L，产率为60.3％。
实施例9～11
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例1的区别仅在于，将步骤(2)中的浓度为1％的CTAB溶液分别用浓度为0.5％、5％、10％的CTAB溶液替换，具体组分如表3所示；其他步骤均与实施例1相同。
表3
Figure BDA0002566949450000122
根据表3的数据可知，CTAB能够有效提升细胞膜的通透性，对于全细胞催化合成1,5-戊二胺具有明显的促进作用，且该促进作用具有一定的浓度依赖性，其在添加量为0.05％时具有更优的促进效果。
实施例12～14
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例2的区别仅在于，将步骤(2)中的浓度为1％的十二烷基苯磺酸钠溶液(SDBS)分别用浓度为0.5％、5％、10％的十二烷基苯磺酸钠溶液替换，具体组分如表4所示；其他步骤均与实施例1相同。
表4
Figure BDA0002566949450000131
根据表4的数据可知，SDBS对于全细胞催化合成1,5-戊二胺具有明显的促进作用，且该促进作用在较低的浓度(0.01％)下更加显著。
实施例15
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，具体步骤如下：
在100mL锥形瓶中加入16mL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、400μL浓度为5mM的PLP、20μL曲拉通X-100和3.58mL基因工程菌细胞悬液(制备方法与实施例1中相同)，振荡混匀，得到的混合液OD600约为15，其中促进剂曲拉通X-100的浓度为0.1％；将混合液在摇床中以50℃、250rpm催化反应1h；12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。
实施例16
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，具体步骤如下：
在100mL锥形瓶中加入16mL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、400μL浓度为5mM的PLP、100μL曲拉通X-100和3.5mL基因工程菌细胞悬液(制备方法与实施例1中相同)，振荡混匀，得到的混合液OD600约为15，其中促进剂曲拉通X-100的浓度为0.5％；将混合液在摇床中以50℃、250rpm催化反应1h；12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。
实施例17
本实施例与实施例15的区别仅在于，催化反应的时间为2h；其他实验步骤及参数均相同。
实施例18
本实施例与实施例16的区别仅在于，催化反应的时间为2h；其他实验步骤及参数均相同。
对比例2
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，具体步骤如下：
在100mL锥形瓶中加入16mL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、400μL浓度为5mM的PLP和3.6mL基因工程菌细胞悬液(制备方法与实施例1中相同)，振荡混匀，得到的混合液OD600约为15；将混合液在摇床中以50℃、250rpm催化反应1h；12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。
对比例3
本对比例与对比例2的区别仅在于，催化反应的时间为2h；其他实验步骤及参数均相同。
对比例4
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，具体步骤如下：
(1)将制备例1提供的基因工程菌株I置于5mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃过夜培养，获得种子液；将种子液按1％体积的接种量转接入50mL含有100mg/L氨苄抗生素的LB培养基中，37℃发酵培养，至OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃诱导培养20h，4000rpm离心，收集菌体后置于-80℃冰箱中冻存16h；用磷酸盐缓冲液(50mM，pH值为8)重悬细胞，得到含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液；
(2)在100mL锥形瓶中加入16mL浓度为2.5M的L-赖氨酸盐酸盐(溶剂为50mM、pH值为8的磷酸盐缓冲液)、400μL浓度为5mM的PLP和3.6mL步骤(1)得到的基因工程菌细胞悬液，振荡混匀，得到的混合液OD600约为15；将混合液在摇床中以50℃、250rpm催化反应1h；12000rpm离心2min，终止反应，得到1,5-戊二胺。
对比例5
本对比例与对比例4的区别仅在于，步骤(2)中催化反应的时间为2h；其他实验步骤及参数均相同。
采用反相高效液相色谱法测试实施例15～18、对比例2～5得到的1,5-戊二胺的浓度及产率，方法与实施例1中相同，测试结果如表5所示。
表5
Figure BDA0002566949450000151
Figure BDA0002566949450000161
根据表5的数据可知，与不进行其他处理的对比例2和3相比，本发明所述全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法中，促进剂能够在高细胞浓度(OD600约为15)下显著提升1,5-戊二胺的浓度和收率，催化反应1h后目标产物的浓度达到172.92～175.37g/L，产率达到84.6～85.8％，收率与进行低温冻存处理的对比例3基本相当。当催化反应的时间为2h时，添加0.1％和0.5％的曲拉通X-100均能实现底物的100％转化。但是，本发明提供的方法工艺更加简单，无需反复离心和冻存，能耗和生产成本更低，更有利于大规模的工业化生产。
实施例19
一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其与实施例1的区别仅在于，将步骤(1)中基因工程菌株I用制备例2提供的基因工程菌株II替换，其他步骤均与实施例1相同。
本实施例得到的目标产物1,5-戊二胺的浓度为63.81g/L，产率为41.6％；同样显著高于不添加任何促进剂的对比例1。由此可以证明，本发明提供的添加促进剂的方法对于不同的基因工程菌株均能发挥显著的促进效果，获得高收率的目标产物。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种全细胞催化合成1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述方法包括：将底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂混合，得到的混合液进行催化反应，生成所述1,5-戊二胺；所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括丙酮、甲醇或乙醇中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述表面活性剂包括十二烷基苯磺酸钠、聚乙二醇600、曲拉通X-100、十六烷基三甲基溴化铵、二辛基琥珀酸磺酸钠、甘胆酸钠、十八烷基硫酸钠、硬脂酸钠、三乙醇胺皂、硬脂酸、脂肪酸甘油酯或脂肪酸山梨坦中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述表面活性剂包括消泡剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述混合液中促进剂的体积百分浓度为0.0001～50％，优选为0.001～10％；
优选地，所述促进剂为表面活性剂。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述底物赖氨酸包括L-赖氨酸盐酸盐；
优选地，所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L；
优选地，所述混合液中磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM；
优选地，所述混合液的OD600为0.5～30。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述赖氨酸脱羧酶为将赖氨酸转化为1,5-戊二胺的酶；
优选地，所述赖氨酸脱羧酶包括来源于微生物的赖氨酸脱羧酶及其突变体；
优选地，所述微生物包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜂房哈夫尼菌、耐碱芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、尸杆菌、伯克霍尔德氏菌、青紫色素杆菌、霍乱弧菌、毛链霉菌、反刍动物月形单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、邦戈沙门氏菌、沙雷氏菌属、迟缓爱德华氏菌、博代氏杆菌属、气单胞菌属或克雷伯氏菌属中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌细胞悬液的制备方法为：将基因工程菌株置于含有氨苄抗生素的LB培养基中培养，获得种子液；将所述种子液接种于含有氨苄抗生素的LB培养基中发酵培养，至OD600为0.6～1时加入诱导剂进行诱导培养，然后离心收集菌体，将菌体重悬，得到所述基因工程菌细胞悬液；
优选地，所述种子液的接种量为0.5～5％；
优选地，所述诱导剂包括异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；
优选地，所述诱导培养的时间为5～30h；
优选地，所述诱导培养的温度为15～25℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌株的构建方法包括：将携带有赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因的表达载体转入大肠杆菌菌株中，得到所述基因工程菌株；
优选地，所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)菌株；
优选地，所述表达载体的制备方法为：将赖氨酸脱羧酶LDC基因和赖氨酸-戊二胺反向转运CadB基因插入pETDuet质粒的NcoI/SacI、BglII/PacI限制性酶切位点之间，得到质粒pETDuet-ldc-cadB；然后在cadB序列前引入pelB，通过NdeI/BglII限制性酶切位点连接，得到所述表达载体pETDuet-ldc-pelB-cadB。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述混合液的溶剂为缓冲液；
优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述缓冲液的pH值为5～11，进一步优选为6～8。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述催化反应的温度为35～65℃，优选为45～55℃；
优选地，所述催化反应的时间为0.5～24h；
优选地，所述催化反应在振荡的条件下进行；
优选地，所述振荡的转速为100～800rpm；
优选地，所述催化反应完成后还包括终止反应的步骤；
优选地，所述终止反应的方法为离心。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：将底物赖氨酸、磷酸吡哆醛、含有赖氨酸脱羧酶的基因工程菌细胞悬液和促进剂混合，得到OD600为0.5～30的混合液；所述混合液中底物赖氨酸的浓度为1～3mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.001～0.5mM，促进剂的体积百分浓度为0.0001～50％；所述促进剂包括有机溶剂和/或表面活性剂；
所述混合液在35～65℃、振荡条件下催化反应0.5～24h，离心终止反应，得到所述1,5-戊二胺。
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