CN114075526B - 一种高效生产(2s,3s)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效生产(2S,3S)‑2,3‑丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明在大肠杆菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3‑丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3‑丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3‑丁二醇脱氢酶，构建了新的基因工程菌，通过双酶协同作用，降低细胞内双乙酰的积累，强化双乙酰转化为(2S,3S)‑2,3‑丁二醇，从而提高底物浓度，提高底物转化率，进而实现了(2S,3S)‑2,3‑丁二醇产量的提升，达到了7.85g/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
2,3-丁二醇是分子式为(CH3CHOH)2的有机化合物，在常温下是一种无色无味的液体或者晶体。2,3-丁二醇拥有两个手性碳原子，因此它有三种立体异构体，分别是meso-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和(2R,3R)-2,3-丁二醇。并且2,3-丁二醇的三种立体异构体由于存在不同的手性基团而各自拥有不同的性质，这一特性使得光学纯2,3-丁二醇在不对称合成中备受关注。
2,3-丁二醇在航空燃料，医药，食品，化妆品等多个方面具有广泛的应用。具有光学活性的2,3-丁二醇在不对称合成有价值的手性化合物方面具有很好的应用前景。(2S,3S)-2,3-丁二醇可用于药物阿司匹林的关键中间体--对甲苯磺酸酯，其低凝固点(-60℃)的特性，使其可作为抗冻剂，并且它也是合成手性试剂和配体的重要前体物质。(2S,3S)-2,3-丁二醇还可用于电镀业中用作光亮剂，聚氨酯橡胶与纤维生产中的扩连剂，也用作溶剂和增湿剂，在制增塑剂、医药、聚酯树脂、聚氨基甲酸树脂等方面也具有广泛的应用。
现阶段生产单一构型2,3-丁二醇主要有生物法和化学合成方法。化学合成2,3-丁二醇的立体异构体选择性生产工艺复杂，控制困难，实施成本高。此外，通过化学路线生产的2,3-丁二醇的光学纯度相当低。所以生物技术路线已成为手性2,3-丁二醇的首选方法，但是大多数天然微生物发酵会产生两种不同构型的2,3-丁二醇并且天然微生物产生的2,3-丁二醇中(2S,3S)-2,3-丁二醇的占比通常较小，例如，克雷伯氏菌和肠杆菌属的菌株主要产(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇，芽孢杆菌属主要生产(2R,3R)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇，至今未发现产单一构型2,3-丁二醇的天然微生物。这是由于双乙酰的生成是由α-乙酰乳酸自发氧化脱羧产生，并且双乙酰浓度过高会对微生物正常生长代谢产生影响，因此在正常条件下双乙酰很难积累到较高的浓度，进而只能产生少量的(2S,3S)-2,3-丁二醇。
全细胞作为一种在有机合成中被广泛应用的生物催化剂，常应用于需要辅因子再生的合成反应比如还原酶催化的反应，只需在反应液中加入廉价的葡萄糖，就可达到细胞内部辅因子再生。此外，全细胞催化法产物分离较简单，具有工业化应用前景。并且，在单一构型(2S,3S)-2,3-丁二醇的生产中，菌株发酵时由于双乙酰对菌体生长代谢的抑制，菌株只能在非常低的双乙酰浓度下进行发酵，而在全细胞催化反应时细胞可以在较高浓度的双乙酰中进行反应。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3-丁二醇脱氢酶在大肠杆菌中表达，构建以双乙酰为底物的(2S,3S)-2,3-丁二醇代谢途径，从而实现以双乙酰为底物转化生产(2S,3S)-2,3-丁二醇。
本发明的技术方案如下：
一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶。
根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
根据本发明优选的，所述2,3-丁二醇脱氢酶为来自肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌的2,3-丁二醇脱氢酶，其编码基因分别为KbudC，GbudC，LbudC，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。
根据本发明优选的，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，KbudC位于pETDuet-1质粒；所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet-1质粒；所述基因工程菌同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因KbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet-1质粒。
上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC，GbudC，LbudC分别插入pET28a，构建表达载体质粒pET28a-KbudC，pET28a-GbudC和pET28a-LbudC；
(2)将肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC和GbudC分别插入pETDuet-1质粒，构建表达载体质粒pETDuet-KbudC和pETDuet-GbudC；
(3)将表达载体pET28a-KbudC、pET28a-GbudC、pET28a-LbudC转化进大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性重组子，得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC；
(4)将表达载体pETDuet-KbudC转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC，将表达载体pETDuet-GbudC分别转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，挑选阳性重组子，得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC。
根据本发明优选的，所述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC序列，PCR引物序列如下：
Primer1:5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACC-3′(含EcoRI酶切位点)，
Primer2:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTAAATACCATCCCGCCG-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃55sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将载体质粒pET28a，pETDuet-1和PCR扩增产物分别用EcoR I和Sac I双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-KbudC和pETDuet-KbudC质粒；
(2)以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到2,3-丁二醇脱氢酶基因GbudC序列，PCR引物序列如下：
Primer3:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCATGAGCAAAGTTGCAATGGTTACC-3′(含EcoRI酶切位点)，
Primer4:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTGTAGAGCATGCCGCC-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，68℃30sec；延伸，72℃55sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和载体质粒pET28a分别用EcoR I和Sac I双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-GbudC和pETDuet-GbudC质粒；
(3)在NCBI查找得到金黄色葡萄球的2,3-丁二醇脱氢酶基因LbudC序列，经上海生工进行密码子优化合成后连接到pET28a，得到pET28a-LbudC质粒；
(4)将步骤(1)(2)(3)得到的pET28a-KbudC、pET28a-GbudC、pET28a-LbudC质粒热激转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性重组子，得重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC；
(5)将步骤(4)得到的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和E.coliBL21(DE3)/pET28a-KbudC制备成电转感受态；
(6)将步骤(1)得到的pETDuet-KbudC质粒转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC，将步骤(2)得到的pETDuet-GbudC质粒分别转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，挑选阳性重组子，得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC、E.coliBL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC。
上述基因工程菌在生产(2S,3S)-2,3-丁二醇中的应用。
根据本发明优选的，所述应用是以上述基因工程菌为生物催化剂，以双乙酰为底物转化生产(2S,3S)-2,3-丁二醇。
根据本发明优选的，所述生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的具体工艺如下：
(1)平板划线培养：将上述基因工程菌划线到含有质量体积比为2％琼脂的并含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温过夜培养12h；
(2)一级种子：在无菌条件下，挑取步骤(1)LB固体培养基上的一个单菌落，然后接种到50mL的含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养12h；
(3)发酵培养：在无菌环境下，取步骤(2)所得的菌液以体积比为0.5～1.5％的接种量接种到300mL含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD为0.8～1.0，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16～20℃诱导20h，停止培养；
(4)收集菌体：将步骤(3)得到的培养物5500rpm离心15分钟，并用0.85％的NaCl溶液洗涤菌体2遍，然后将菌体重悬于pH7.0～7.4，100mM的磷酸盐缓冲液中，将收集的菌体放置于4℃冰箱中备用；
(5)转化：以收集的菌体作为全细胞催化剂，以浓度为15g/L的双乙酰为底物，并加入60g/L的葡萄糖补充辅酶因子的消耗，在30℃下200rpm摇床振荡反应12～48h，全细胞催化双乙酰生产(2S,3S)-2,3-丁二醇。
本发明的有益效果：
1、本发明在大肠杆菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，构建了新的基因工程菌，克服了直接强化表达来自肺炎克雷伯氏菌的2,3-丁二醇脱氢酶，来自谷氨酸棒杆菌的2,3-丁二醇脱氢酶和来自金黄色葡萄球的2,3-丁二醇脱氢酶所得菌株只能在较低的底物浓度下转化双乙酰，且(2S,3S)-2,3-丁二醇产物产量较低的问题，通过双酶协同作用，降低细胞内双乙酰的积累，强化双乙酰转化为(2S,3S)-2,3-丁二醇，从而提高产物浓度，提高底物转化率，最终(2S,3S)-2,3-丁二醇产量的提升，达到了7.85g/L。
2、本发明在构建基因工程菌时选用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主菌，该菌株不具有(2S,3S)-2,3-丁二醇生产能力，并且属兼性菌，可在微氧或厌氧条件下生长，这就为菌种的基因改良和利用基因工程构建新的菌种提供了便利。
附图说明
图1为五种重组质粒图谱；
图中，A为pET28a-KbudC质粒，B为pET28a-GbudC质粒，C为pET28a-LbudC质粒，D为pETDuet-KbudC质粒，E为pETDuet-GbudC质粒；
图2为阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli DH5α/pETDuet-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC的菌落PCR凝胶电泳图。图中，各泳道均为KbudC基因片段条带；
图3为阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC，E.coli DH5α/pETDuet-GbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC菌落PCR凝胶电泳图；
图中，各泳道均为GbudC基因片段条带；
图4为阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC菌落PCR凝胶电泳图；
图中，各泳道均为LbudC基因片段条带；
图5为阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-GbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC的2,3-丁二醇脱氢酶蛋白电泳图。
图中，泳道1为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC的蛋白条带，泳道2为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC，泳道3为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC的蛋白条带；泳道4为纯化后重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC的蛋白条带；泳道5为纯化后重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC的蛋白条带；泳道6为纯化后重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC的蛋白条带。
图6为阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-KbudC/pETDuet-GbudC，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC的2,3-丁二醇脱氢酶蛋白电泳图。
图中，泳道1为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-KbudC/pETDuet-GbudC的蛋白条带，泳道2为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-LbudC/pETDuet-KbudC的蛋白条带的蛋白条带，泳道3为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-LbudC/pETDuet-GbudC的蛋白条带；泳道4为纯化后重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC的蛋白条带；泳道5为纯化后重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-LbudC/pETDuet-KbudC的蛋白条带的蛋白条带；泳道6为纯化后重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-LbudC/pETDuet-GbudC的蛋白条带。
图7为重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC以双乙酰为底物和以乙偶姻为底物时的酶活对比图。
具体实施方法
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
本发明中使用的肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌为实验室保藏菌株，E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)均为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。
实施例1：重组质粒pET28a-KbudC/pETDuet-KbudC的构建：
将肺炎克雷伯氏菌的2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC克隆入pET28a质粒和pETDuet质粒，构建pET28a-KbudC质粒和pETDuet-KbudC，pET28a-KbudC质粒的图谱如图1A所示，pETDuet-KbudC质粒的图谱如图1D所示。具体操作步骤如下：
以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，利用生物信息学软件设计基因KbudC序列的扩增引物，扩增得到基因KbudC序列，引物序列如下：
Primer1:5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACC-3′(含EcoRI酶切位点)，
Primer2:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTAAATACCATCCCGCCG-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃55sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，得到大小约为771bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a和pETDuet分别用EcoR I和SacI双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-KbudC质粒和pETDuet-KbudC，将pET28a-KbudC质粒用热激转化法转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mL卡那霉素固体LB固体培养基上，将pETDuet-GbudC质粒用热激转化法转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素固体LB固体培养基上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存；重组菌命名为E.coli DH5α/pET28a-KbudC和E.coli DH5α/pETDuet-KbudC；采用质粒提取试剂盒从重组菌E.coli DH5α/pET28a-KbudC和E.coli DH5α/pETDuet-KbudC中提取pET28a-KbudC和pETDuet-KbudC质粒。
实施例2：重组质粒pET28a-GbudC/pETDuet-GbudC的构建：
将谷氨酸棒杆菌的2,3-丁二醇脱氢酶基因GbudC克隆入pET28a质粒和pETDuet质粒，构建pET28a-GbudC质粒和pETDuet-GbudC，pET28a-GbudC质粒的图谱如图1B所示，pETDuet-GbudC质粒的图谱如图1E所示。具体操作步骤如下：
以谷氨酸棒杆菌基因组为模板进行PCR扩增，利用生物信息学软件设计基因GbudC序列的扩增引物，扩增得到基因GbudC序列，引物序列如下：
Primer3:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCATGAGCAAAGTTGCAATGGTTACC-3′(含EcoRI酶切位点)，
Primer4:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTGTAGAGCATGCCGCC-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增体系按照试剂盒说明书配制；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃55sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温。
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，得到大小约为771bp的电泳条带，将目的片段通过胶回收试剂盒回收，将载体质粒pET28a和pETDuet分别用EcoR I和SacI双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-GbudC质粒和pETDuet-GbudC，将pET28a-GbudC质粒用热激转化法转入E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mL卡那霉素固体LB固体培养基上，将pETDuet-GbudC质粒用热激转化法转入E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素固体LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存；重组菌命名为E.coli DH5α/pET28a-GbudC和E.coli DH5α/pETDuet-GbudC；采用质粒提取试剂盒从重组菌E.coli DH5α/pET28a-GbudC和E.coli DH5α/pETDuet-GbudC中提取pET28a-GbudC和pETDuet-GbudC质粒。
实施例3：质粒pET28a-LbudC的构建
在NCBI查找得到金黄色葡萄球的2,3-丁二醇脱氢酶基因序列，经上海生工进行密码子优化合成后连接到pET28a，得到pET28a-LbudC质粒，pET28a-LbudC质粒的图谱如图1C所示。以pET28a-LbudC质粒为模板进行PCR验证，引物序列如下
Primer5:5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAACCTGAAAGATGCGAAAAT-3′
Primer6:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTACTGCGCCGCCCACGG-3′
所得的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析检测，得到大小约为711bp的电泳条带。将pET28a-LbudC质粒用电转化法转入E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mL卡那霉素固体LB固体培养基上37℃过夜培养，挑取阳性重组子-80℃保存；重组菌命名为E.coli DH5α/pET28a-LbudC；采用质粒提取试剂盒从重组菌E.coli DH5α/pET28a-LbudC中提取pET28a-LbudC质粒。
实施例4：重组大肠杆菌基因工程菌的构建
(1)转化感受态细胞，制备重组菌
取实施例1制备的pET28a-KbudC质粒、实施例2制备的pET28a-GbudC质粒、实施例3制备的pET28a-LbudC质粒各10μL，取E.coli BL21(DE3)感受态细胞90μL，将各质粒载体分别与感受态细胞混合，放置冰上30min，然后42℃水浴热激45s，放置冰上冰浴2～3min，无菌条件下加入900μL LB液体培养基，37℃，200rpm摇床复苏1h，然后涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素LB固体培养基固体培养基上37℃培养过夜。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，其中E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC单菌落采用实施例1中的Primer1、Primer2进行PCR扩增，鉴定结果如图2所示；E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC单菌落采用实施例2中的Primer3、Primer4进行PCR扩增，鉴定结果如图3所示；E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC菌落采用实施例3中的Primer5、Primer6进行PCR扩增，上述凝胶电泳图中均出现目的条带且条带单一，鉴定结果如图4所示。E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC单菌落的目的片段长度约为771bp，E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC单菌落的目的片段长度约为777bp，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC单菌落的目的片段长度约为711bp，均显示菌落为阳性克隆，得阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC，将重组菌保存于-80℃。
(2)重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC感受态细胞的制备
取保存在甘油中的重组大肠杆菌，取一环接种于固体LB无抗性培养板上37℃培养过夜；将固体培养基上的单个菌落接种到50mL液体LB培养基中，37℃、200r/min培养12h左右；按1％的接种量接种于50mL液体LB培养基中37℃、200r/min培养，并测定OD600值，当OD600达到0.7时冰浴放置30min；然后取出培养物10mL，4℃、10000r/min离心10min收集菌体，用4℃冰浴的10％的甘油5mL洗涤菌体，离心10min，弃上清，重复洗涤两次；将菌体重悬于500μL预冷的10％的甘油中，得重组大肠杆菌感受态细胞，100μL每管分装。
(3)转化感受态细胞，制备基因工程菌
取实施例1制备的pETDuet-KbudC质粒、实施例2制备的pETDuet-GbudC质粒、各10μL，取重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC感受态细胞90μL，将各质粒载体分别与感受态细胞混合，转入电转杯，放置冰上冰浴5min，擦拭干净后进行电转化，电击条件为2500V、5ms；取出混合液体立即加入到1mL LB液体培养基中37℃、200r/min振荡培养3-4h，然后涂布于LB固体培养基固体培养基上37℃培养过夜。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，其中基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC单菌落采用实施例1中的Primer1、Primer2进行PCR扩增，鉴定结果如图2所示；基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC单菌落采用实施例2中的Primer3、Primer4进行PCR扩增，鉴定结果如图3所示；基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC单菌落采用实施例3中的Primer5、Primer6进行PCR扩增，鉴定结果如图4所示。
上述凝胶电泳图中均出现目的条带且条带单一，基因KbudC目的片段长度为771bp，基因GbudC目的片段长度为777bp，基因LbudC目的片段长度约为711bp，均显示菌落为阳性克隆，得阳性基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC、E.coliBL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC，将重组菌保存于-80℃。
实施例5：重组大肠杆菌基因工程菌的表达
将实施例4中的阳性基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC以1％的接种量接种至50mL的含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中。将阳性基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC以1％的接种量接种至50mL的含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中在37℃、200rpm活化过夜培养12h；取活化菌株1mL接入100mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中和100mL的含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为0.6～0.8时，加入0.5M IPTG在16～20℃下诱导表达10～20h。
诱导表达结束后5500rpm、4℃离心15min，收集菌体，加入10mL磷酸盐缓冲液(pH7.0～7.4)重悬菌体；超声破碎菌体细胞：超声4s，间隔6s，400W，工作20min获得粗酶液；将获得的粗酶液用SDS-PAGE电泳检测目标蛋白大小，结果如图5中1、2、3泳道以及图6中1、2、3泳道所示。再将粗酶液加到5mL HisTrap HP柱上，该柱已用25mL结合缓冲液平衡。用洗杂缓冲液洗涤，然后用洗脱缓冲液洗脱蛋白质，收集纯化后的蛋白样品。将获得的纯化后的蛋白样品用SDS-PAGE电泳检测目标蛋白大小，结果如图5中4、5、6泳道以及图6中4、5、6泳道所示，目的条带单一。其中重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coliBL21(DE3)/pET28a-GbudC表达的2,3-丁二醇脱氢酶的蛋白大小约为27KDa，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC表达的2,3-丁二醇脱氢酶的蛋白大小约为25KDa。
其中，2,3-丁二醇脱氢酶活性的定义：当双乙酰或乙偶姻在室温下转化为2,3-丁二醇时，NADH在340nm处消耗产生的吸光度变化。
以E.coli BL21(DE3)/pET28a为对照，测定了以DA和AC为底物的重组大肠杆菌细胞提取物的酶活性。反应过程中NADH的氧化程度反映了酶的活性。通过分光光度法在340nm处测量NADH氧化时吸光度发生变化，结果如图7所示。重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC的粗提物均具有DA和AC还原活性，但重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coliBL21(DE3)/pET28a-GbudC具有较高的DA还原活性，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC具有较高的AC还原活性。
实施例6：2,3-丁二醇检测
将实施例4中的阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coliBL21(DE3)/pET28a-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-GbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC划线到含有质量体积比为2％琼脂的并含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上活化。在无菌条件下，挑取活化后的单菌落接入接种到50mL的含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养12h得种子液。将种子液按照0.5～1.5％的接种量接入含有300mL含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，测定2,3-丁二醇产量，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为0.8～1.0时，加入0.5mM IPTG在20℃下诱导表达10～20h。诱导得到的培养物5500rpm离心15分钟，并用0.85％的NaCl溶液洗涤菌体2遍，然后将菌体重悬于pH7.0～7.4，100mM的磷酸盐缓冲液中，将收集的菌体放置于4℃冰箱中备用。以收集的菌体作为全细胞催化剂，以浓度为15g/L的双乙酰为底物，并加入60g/L的葡萄糖补充辅酶因子的消耗，在30℃下200rpm摇床振荡反应12～48h。
生物转化反应中的样品以12000rpm离心5min。用气相色谱系统分析上清液中乙偶姻和2,3-丁二醇的浓度，在GC分析之前，离心的上清用乙酸乙酯萃取，萃取得到的上层。色谱系统由氢火焰离子化检测器和手性柱(Supelcoβ-DE120，长30m，内径0.25mm；Sigma-Aldrich)组成。检测条件为：氮气为载气，流速为1.2mL/min，进样器温度为215℃，检测器温度为245℃，柱温为50℃，保持1.5min，然后以15℃/min的速率升至180℃，每次进样量1μL。2,3-丁二醇的保留时间为2.5min，利用外标法来计算2,3-丁二醇的浓度，结果见表1和表2。
表1：重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC以双乙酰为底物时产物情况对比
表2：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC，E.coliBL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-KbudC，E.coli
BL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-GbudC以双乙酰为底物时产物情况对比
由表1可知，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC以双乙酰为底物时均能生产得到2,3二丁醇。由表2可知，基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC，E.coliBL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-GbudC以双乙酰为底物生产2,3二丁醇浓度分别可达6.57g/L、7.95g/L和7.87g/L，其中最主要成分为(2S,3S)2,3二丁醇，分别是6.11g/L、7.85g/L和7.8g/L。
尤其是基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC，E.coliBL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-GbudC增产量高于重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC的产量之和，表明了同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶(E.coli BL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-KbudC)，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶(E.coli BL21(DE3)/pET28a--LbudC/pETDuet-GbudC)，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶(E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC)后，KbudC，GbudC，LbudC会产生协同作用降低细胞内双乙酰的积累，强化双乙酰转化为2,3-丁二醇，从而提高底物浓度，提高底物转化率，其双乙酰转化率分别达到了60.1％、71.9％、62.7％，均在60％以上，从而提高了(2S,3S)-2,3-丁二醇的产量。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 1
atgaaaaaag tcgcacttgt taccggcgcc ggccagggga ttggtaaagc tatcgccctt 60
cgtctggtga aggatggatt tgccgtggcc attgccgatt ataacgacgc caccgccaaa 120
gcggtcgcct ccgaaatcaa ccaggccggc ggccgcgcca tggcggtgaa agtggatgtt 180
tctgaccgcg accaggtatt tgccgccgtc gaacaggcgc gcaaaacgct gggcggcttc 240
gacgtcatcg tcaacaacgc cggcgtggcg ccatccacgc cgatcgagtc cattaccccg 300
gagattgtcg acaaagtcta caacatcaac gtcaaagggg tgatctgggg catccaggca 360
gcggtcgagg cctttaagaa agagggtcac ggcgggaaaa tcatcaacgc ctgttcccag 420
gccggccacg tcggcaaccc ggagctggcg gtatatagct cgagtaaatt cgcggtacgc 480
ggcttaaccc agaccgccgc tcgcgacctc gcgccgctgg gcatcacggt caacggctac 540
tgcccgggga ttgtcaaaac gccgatgtgg gccgaaattg accgccaggt gtccgaagcc 600
gccggtaaac cgctgggcta cggtaccgcc gagttcgcca aacgcatcac cctcggccgc 660
ctgtccgagc cggaagatgt cgccgcctgc gtctcctatc ttgccagccc ggattctgat 720
tatatgaccg gtcagtcatt gctgatcgac ggcgggatgg tatttaacta a 771
<210> 2
<211> 777
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
atgagcaaag ttgcaatggt taccggtggt gcacaaggca tcggtcgtgg aatttctgag 60
aagctggcag cagatggttt cgatattgcc gtagccgacc tgccacaaca ggaagaacaa 120
gctgcagaga ccatcaagtt ggttgaagct gcaggtcaaa aggctgtatt cgttggatta 180
gatgtcaccg ataaggctaa tttcgacagt gcaattgatg aggcagcaga gaaacttggc 240
ggcttcgatg tgctagtaaa caacgccggc atcgcacaaa ttaagccact tctggaagtc 300
accgaagaag acctaaagca gatctactcc gtgaacgttt ttagcgtatt ttttggtatt 360
caagcagcat cccgaaagtt cgatgagctt ggcgtaaaag gcaagatcat caacgctgca 420
tcaatcgctg ctatccaagg tttcccaatc ttgagcgcct actccaccac caaattcgcg 480
gttcgtggcc tcacccaggc tgctgcgcaa gaactcgcac ccaagggtca caccgtgaat 540
gcctacgcac ctggcatcgt gggcaccgga atgtgggagc aaatcgatgc cgagctttcc 600
aagatcaacg gcaagccaat cggtgagaac ttcaaggagt actcctcctc aatcgcattg 660
ggccgaccat cattacctga ggatgtagcc ggtctggttt cgttcctggc ttctgaaaac 720
tccaactaca tcaccggaca ggtcatgctt gtcgacggcg gcatgctcta caactaa 777
<210> 3
<211> 711
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
atgaacctga aagatgcgaa aatcctgctg accggcggct ctagcggcct gggtaaagct 60
atggcggaag ttctgaccgc ggcgggcgcg aaagttctga tcaccggccg tgatgcggaa 120
aaagttgcga aagttgcgca ggaaatcggt tgcctgggcc tggctttcga tgttgcggat 180
tacgatgttc tggcgtctaa agcggcggaa tctgtgcagc agctgggtgg catcgatgtt 240
ctgatcaaca acgcgggcat cggcgaattc ccggcgctgg gcgaaatcaa actggaacac 300
ttcgaacgtg ttttctccat caacgttttc ggcctgaccc tgctgaccca ggaaatcctg 360
ccgcacttca aaaaacaggg cagcggtaac atcatcaaca tcgcgagcac cgcggcgctg 420
aaaggcttcg cgcgtggcag catctactct gcgagcaaat tcgcgctgcg tgcgctgacc 480
cagtgctggc aggcggaact gcgtccgctg aacatccgtg ttctgcaggt taacccgtct 540
gaagttccga ccgcgttcaa caacaccgat cgtgaagaaa aaccgaccga agcgcacaaa 600
ctgaccccga ccgaaatcgc gcactctatc aaaagcgttc tggaaatgga tgatcgtggc 660
atgatcccgg aactgagcgt ttgggcgacc aacccgtggg cggcgcagta a 711
Claims (7)
1.一种高效生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶，或者同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶；
所述2,3-丁二醇脱氢酶为来自肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌的2,3-丁二醇脱氢酶，其编码基因分别为KbudC，GbudC，LbudC，核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示；
所述基因工程菌为重组的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的2,3-丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，KbudC位于pETDuet-1质粒；所述基因工程菌同时表达金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因LbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet-1质粒；所述基因工程菌同时表达肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶时，基因工程菌构建所用的表达载体中编码基因KbudC位于pET28a质粒，GbudC位于pETDuet-1质粒。
3.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将肺炎克雷伯氏菌，谷氨酸棒杆菌以及金黄色葡萄球菌中的2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC，GbudC，LbudC分别插入pET28a，构建表达载体质粒pET28a-KbudC，pET28a-GbudC和pET28a-LbudC；
（2）将肺炎克雷伯氏菌和谷氨酸棒杆菌中的2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC和GbudC分别插入pETDuet-1质粒，构建表达载体质粒pETDuet-KbudC和pETDuet-GbudC；
（3）将表达载体pET28a-KbudC、pET28a-GbudC、pET28a-LbudC转化进大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性重组子，得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a- KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC；
（4）将表达载体pETDuet-KbudC转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC，将表达载体pETDuet-GbudC分别转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，挑选阳性重组子，得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a -LbudC/pETDuet-GbudC。
4.如权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到2,3-丁二醇脱氢酶基因KbudC序列，PCR引物序列如下：
Primer1:5′-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACC-3′，
Primer2:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTAAATACCATCCCGCCG-3′；
PCR扩增程序：预变性，95℃ 5min；变性，95℃ 30sec；退火，60℃ 30sec；延伸，72℃55sec，30个循环；终止延伸，72℃ 10min；最后4℃保温；
将载体质粒pET28a，pETDuet-1和PCR扩增产物分别用EcoR I和Sac I双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-KbudC和pETDuet-KbudC质粒；
（2）以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到2,3-丁二醇脱氢酶基因GbudC序列，PCR引物序列如下：
Primer3:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCATGAGCAAAGTTGCAATGGTTACC-3′，
Primer4:5′-GCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAGTTGTAGAGCATGCCGCC-3′；
PCR扩增程序：预变性，95℃ 5min；变性，95℃ 30sec；退火，68℃ 30sec；延伸，72℃55sec，30个循环；终止延伸，72℃ 10min；最后4℃保温；
将PCR扩增产物和载体质粒pET28a分别用EcoR I和Sac I双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-GbudC和pETDuet-GbudC质粒；
（3）在NCBI查找得到金黄色葡萄球的2,3-丁二醇脱氢酶基因LbudC序列，经上海生工进行密码子优化合成后连接到pET28a，得到pET28a- LbudC质粒；
（4）将步骤（1）（2）（3）得到的pET28a-KbudC、pET28a-GbudC、pET28a-LbudC质粒热激转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑选阳性重组子，得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a- LbudC；
（5）将步骤（4）得到的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC制备成电转感受态；
（6）将步骤（1）得到的pETDuet-KbudC质粒转化进重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC，将步骤（2）得到的pETDuet-GbudC质粒分别转化进重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC和重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC，挑选阳性重组子，得基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbudC/pETDuet-KbudC、E.coli BL21(DE3)/pET28a-KbudC/pETDuet-GbudC和E.coli BL21(DE3)/pET28a -LbudC/pETDuet-GbudC。
5.权利要求1所述的基因工程菌在生产(2S,3S)-2,3-丁二醇中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是以权利要求1所述基因工程菌为生物催化剂，以双乙酰为底物转化生产(2S,3S)-2,3-丁二醇。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生产(2S,3S)-2,3-丁二醇的具体工艺如下：
（1）平板划线培养：将权利要求1所述基因工程菌划线到含有质量体积比为2%琼脂的并含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温过夜培养12h；
（2）一级种子：在无菌条件下，挑取步骤（1）LB固体培养基上的一个单菌落，然后接种到50mL的含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养12h；
（3）发酵培养：在无菌环境下，取步骤（2）所得的菌液以体积比为0.5~1.5%的接种量接种到300mL含有50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD为0.8~1.0，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16~20℃诱导20h，停止培养；
（4）收集菌体：将步骤（3）得到的培养物5500rpm离心15分钟，并用0.85%的NaCl溶液洗涤菌体2遍，然后将菌体重悬于pH7.0~7.4，100mM的磷酸盐缓冲液中，将收集的菌体放置于4℃冰箱中备用；
（5）转化：以收集的菌体作为全细胞催化剂，以浓度为15g/L的双乙酰为底物，并加入60g/L的葡萄糖补充辅酶因子的消耗，在30℃下200rpm摇床振荡反应12~48h，全细胞催化双乙酰生产(2S,3S)-2,3-丁二醇。
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