CN102154384A

CN102154384A - 一种生产手性纯(2s,3s)-2,3-丁二醇的方法

Info

Publication number: CN102154384A
Application number: CN2011100210665A
Authority: CN
Inventors: 马翠卿; 许平; 李理想; 王钰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shanghai Sipeng Technology Co ltd
Priority date: 2011-01-19
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-01-19
Also published as: CN102154384B

Abstract

本发明公开了一种生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，是将(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌全细胞为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇。本发明方法中参与菌株要求的培养基简单、成本低，并且生产过程及产物分离方便。生产的手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇最高产量可达到26gL^-1以上，ee值大于99％，具有推广应用价值和可观的经济效益。

Description

一种生产手性纯(2S,3S)-2,3-丁二醇的方法

技术领域

本发明涉及一种生产手性纯2，3-丁二醇(2，3-BD)的方法，尤其涉及一种生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇(2S，3S-BD)的方法，具体说，是将(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶(2S，3S-BDH)基因在大肠杆菌(E.coli)中表达，并以此重组E.coli全细胞为生物催化剂，以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物高效生产手性纯2S，3S-BD的方法。

背景技术

2，3-BD在常温下是一种无色无味透明的液体，有三种同分异构体：meso-2，3-丁二醇(meso-BD)、(2R，3R)-2，3-丁二醇(2R，3R-BD)和2S，3S-BD。2，3-BD广泛应用于化工、食品、燃料及航天航空等多个领域(Syu M J.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001，55：10-18)。具有光学活性的2R，3R-BD和2S，3S-BD还可用作防冻剂，由于其具有手性碳原子，在不对称合成中也有重要用途(Celinska E.& Grajek W.，Biotechnol.Adv.，2009，27：715-725)。除此之外，2S，3S-BD可抑制腺嘌呤环化酶(Adenylyl cyclase)7，同时刺激Adenylyl cyclase 6和Adenylyl cyclase 9，这对cAMP产生系统具有重要意义(Hasanuzzaman M.，Yoshimura M.，Alcohol.Clin.Exp.Res.，2010，34：743-749)。

在发酵生产2，3-BD的菌种中，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)以meso-BD为主要代谢产物，只有少量的2S，3S-BD(CelinskaE.& Grajek W.，Biotechnol.Adv.，2009，27(6)：715-725；Qin J.et al.，Chinese J.Chem.Eng.，2006，14：132-136)；多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)发酵主要代谢产物为2R，3R-BD(Nakashimada Y.et al.，J.Biosci.Bioeng.，2000，90：661-664)。因此，采用菌株进行发酵生产不能得到手性纯的2S，3S-BD。

2001年，Ui等将解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)中2S，3S-BDH编码基因在E.coli中表达，以外消旋的乙偶姻(AC)为底物，可生产3.7g L^-1的2S，3S-BD(ee值为95％)(Ui et al.，Lett.Appl.Microbiol.，2001，32(2)：93-98)。2004年，Ui等将K.pneumoniae中meso-2，3-丁二醇脱氢酶(meso-BDH)和B.saccharolyticum中2S，3S-BDH编码基因在E.coli中共表达，以DA为底物，可生产2.2g L^-1的2S，3S-BD(ee值为96％)(Uiet al.，Lett.Appl.Microbiol.，2004，39(6)：533-537)。2010年，Xiao等将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中2R，3R-2，3-丁二醇脱氢酶(2R，3R-BDH)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)中NADH氧化酶编码基因在E.coli中表达，拆分混合2，3-BD，可生产2.4g L^-1的2S，3S-BD(ee值＞99％)(Xiao Z.et al.，PLoS One，2010，5(1)，e8860)。但由于产物浓度和光学纯度的限制，使上述方法无法满足工业生产需求。因此有必要寻找更好的方法，以实现手性纯2S，3S-BD的高效生产。

近年来，生物催化剂由于其具有高立体选择性和底物选择性，更多的被应用于高值化合物合成；全细胞作为一种常用的生物催化剂，在有机合成中被广泛应用。全细胞常被应用于需要辅因子再生的合成反应，比如还原酶催化的反应，只需加入廉价的葡萄糖，就可达到细胞内部辅因子再生(Goldberg K.et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2007，76：249-255)。此外，全细胞催化法产物分离较简单，具有工业化应用前景(Schmid A.et al.，Nature，2001，409：258-268)。

发明内容

针对上述现有方法中，2S，3S-BD的产量低、ee值低，难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一种生产手性纯2S，3S-BD的方法。

本发明是利用2S，3S-BDH可催化DA生成S-乙偶姻(S-AC)，同时可催化S-AC和2S，3S-BD之间转化的性质，加入葡萄糖补充该过程消耗的NADH，使细胞中NADH再生。将2S，3S-BDH基因在E.coli中表达，以此重组E.coli全细胞为生物催化剂，以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物，实现手性纯2S，3S-BD的高效生产。

本发明所述生产手性纯2S，3S-BD的方法，其特征在于：将2S，3S-BDH基因在E.coli中表达，并以此重组E.coli全细胞为生物催化剂，以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物转化生产手性纯2S，3S-BD。

其中：所述2S，3S-BDH基因来源于肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和棒杆菌属(Corynebacterium)、泛菌属(Pantoea)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)。

进一步的，所述2S，3S-BDH基因来源菌株优选是E.cloacae ssp.dissolvens SDM、K.pneumonia ATCC 49790或C.glutamicum ATCC 13032。

上述的重组E.coli是采用常规(参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南)的方法先克隆到2S，3S-BDH基因，再构建重组质粒，转化到E.coli(优选E.coli BL21)中，然后经筛选获得；其含有2S，3S-BDH基因，为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，较佳培养温度为37±1℃，可以在含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB培养基上生长，可以用于催化双乙酰(DA)和葡萄糖生产手性纯2S，3S-BD。

本发明所述生产手性纯2S，3S-BD的方法中：以重组E.coli全细胞为生物催化剂，以双乙酰(DA)和葡萄糖为底物转化生产手性纯2S，3S-BD的具体方法是：

(1)平板培养：将重组E.coli菌株划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含有100μgmL^-1氨苄青霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；

(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床震荡培养12±1小时；

(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比1～3％的接种量，接种到30～500mL含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床震荡培养12±1小时；

(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为6～10％的接种量接种到2～10L的含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37±1℃培养5～20小时，然后再加入终浓度为1mM的IPTG，10～37℃诱导5～24小时，停止发酵；

其中，上述步骤(1)～(4)中所述的LB培养基配方为：1L蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，121℃条件下灭菌15分钟。

(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000±500rpm离心15分钟；并用0.85wt％的生理盐水洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到pH 7、200mM的Tris-HCl缓冲液中，使细胞的终浓度为2～10g L^-1；将菌体置于4℃的冰箱中保藏，即得到重组E.coli全细胞生物催化剂，待用；

(6)转化实验制备产物：以浓度为2～10g L^-1的生物催化剂，在10～42℃、pH 5.0～9.0条件下，180rpm摇床震荡，转化初始浓度为5～20g L^-1的DA，并加入5～120g L^-1的葡萄糖以补充反应所需辅因子的消耗；每隔2小时取样，样品以8,000±500rpm离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，检测上清中DA和葡萄糖浓度，根据DA和葡萄糖浓度补加DA和葡萄糖，使DA浓度达到5～20g L^-1，葡萄糖浓度达到5～120g L^-1；对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S-BD的浓度及光学纯度；当2S，3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。

上述底物DA的检测方法是：

样品进行设定的稀释后，取680μL样品加入20μL 0.5％的3，3′-二氨基联苯胺盐酸盐，室温下，黑暗处理1分钟；加入200μL 3M的硫酸和100μL的水，室温下黑暗处理10分钟；366nm处检测吸光度(Pien J.et al.，Lait，1937，17：673-698)。

上述底物葡萄糖的检测方法是：

样品进行设定的稀释后，采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。测定原理为利用固定化葡萄糖氧化酶膜专一性测定葡萄糖含量。

上述转化产物2S，3S-BD的检测方法是：

每500mL乙酸乙酯中加入1mL异戊醇，作为萃取剂；利用该萃取剂，对步骤(6)中转化产物的样品进行等体积萃取，利用涡旋振荡器对萃取的样品震荡1分钟，然后静置，取上层样品进行气相检测。具体的气相检测条件如下：

所用气相色谱仪的型号为Agilent 6820，氮气作为载气，进样器和检测器的温度均设为280℃，检测过程的柱温设定为：40℃保持3分钟；然后以每分钟1.5℃的速率升温到80℃；以每分钟0.5℃的速率升温到86℃；以每分钟30℃的速率升温到200℃。进样量1.5μL，进行气相检测。

上述生产手性纯2S，3S-BD的方法中，

步骤(4)所述诱导培养温度优选10～30℃；诱导培养时间优选10～20小时。

步骤(6)所述转化实验优选以浓度为3.0～8.0g干细胞L^-1的生物催化剂，在20～37℃，pH 6.0～8.0，180rpm震荡条件下对底物进行转化。

步骤(6)所述初始DA浓度优选10～25g L^-1，初始葡萄糖浓度优选20～100g L^-1。

步骤(6)所述转化实验过程中补加DA和葡萄糖，使DA浓度优选达到10～25g L^-1，葡萄糖浓度优选达到20～100g L^-1。

本发明成功的实现了将2S，3S-BDH基因在E.coli中表达，并以此重组E.coli全细胞为生物催化剂，以DA和葡萄糖为底物高效生产手性纯2S，3S-BD。

本发明具有以下特点：

(1)应用表达2S，3S-BDH的重组E.coli全细胞为生物催化剂，催化DA生产手性纯2S，3S-BD。

(2)在转化体系中加入葡萄糖，实现细胞内辅因子的再生。

(3)参与菌株要求的培养基简单、成本低。

(4)利用全细胞生产手性纯2S，3S-BD，操作过程简单，产物分离方便。

(5)本发明的生物催化剂能转化DA生产手性纯2S，3S-BD，最高产量可达到26gL^-1以上，ee值大于99％。

附图说明

图1重组E.coli的蛋白电泳图，M：Maker；1：E.coli；2：未加IPTG诱导的重组E.coli；3：IPTG诱导的重组E.coli；4：2S，3S-BDH纯酶。

图2标准品的气相色谱图谱，其中*为内标异戊醇，其他各物质的保留时间分别为：R-AC：14.240；S-AC：：16.036；2S，3S-BD：32.909；2R，3R-BD：34.175；meso-BD：36.034。

图3重组E.coli催化DA生产2S，3S-BD转化液的气相色谱图谱。

具体实施方式

下面通过实施例进一步阐明本发明，但不仅限于此。

实施例1：E.cloacae ssp.dissolvens SDM中的2S，3S-BDH在生产2S，3S-BD中的应用

1、重组基因工程菌的构建

采用常规的方法制备菌株e.cloacae ssp.dissolvens SDM(CGMCC No.4230)的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取E.cloacae ssp.dissolvens SDM的基因组DNA；使用合成的引物从E.cloacaessp.dissolvens SDM基因组DNA中PCR扩增得到2S，3S-BDH基因(budC)。

budC基因的来源菌E.cloacae ssp.dissolvens SDM(CGMCC No.4230)为申请人实验室前期筛选得到的一株高产2，3-BD菌株，其已进行了保藏但未进行基因组测序。

根据已测序的Enterobacter sp.638的基因组序列，设计引物；

上游引物5’-GAATTCAATGCAAAAAGTTGCTCTCG-3’，携带一个EcoRI位点；

下游引物5’-AAGCTTTTAATTGAATACCATCCCACCGT-3’，携带一个HindIII位点。

上述budC基因序列长度为771个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所不。

将PCR扩增得到的片段连接到pEasy-blunt(购自北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组质粒pEasy-blunt-budC；使用EcoRI、HindIII双酶切质粒pETDuet(购自德国默克Merck集团)和pEasy-blunt-budC，回收片段budC及pETDuet，连接，得到重组质粒pETDuet-budC；将上述重组质粒经过转化导入宿主E.coli BL21，得到工程菌株E.coliBL21/pETDuet-budC。该菌株在含100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养4小时，加入终浓度为1mM的IPTG，16℃诱导10小时，得到表达有2S，3S-BDH的重组基因工程菌细胞，经12.5％的SDS-PAGE验证，结果如图1所示。

上述重组基因工程菌株为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，可以用于催化DA生产手性纯2S，3S-BD。

2、重组E.coli全细胞催化剂的制备

(1)平板培养：将上述方法得到的重组E.coli菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的并含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12小时；

(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12小时；

(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比2％的接种量，接种到30～500mL含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12小时；

(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的菌液以体积比为8％的接种量接种到2～10L的含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养10小时，然后再加入终浓度为1mM的IPTG，16℃诱导14小时，停止发酵。

(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000rpm离心15分钟；并用0.85wt％的生理盐水洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到pH 7、200mM的Tris-HCl缓冲液中，使细胞的终浓度为8g L^-1；将菌体置于4℃的冰箱中保藏，即得到重组E.coli全细胞生物催化剂，待用。

3、利用重组E.coli全细胞催化剂制备2S，3S-BD

选择上述获得的重组E.coli全细胞作为催化剂，以浓度为8g L^-1进行如下转化过程：

在30℃、pH 7.0条件下，180rpm摇床震荡，转化初始浓度为20g L^-1的DA，并加入40g L^-1的葡萄糖以补充反应所需辅因子的消耗；发酵中每隔2小时取样，样品以8,000rpm离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，检测上清中DA和葡萄糖浓度，根据DA和葡萄糖浓度补加DA和葡萄糖，使DA浓度达到10g L^-1，葡萄糖浓度达到20g L^-1；对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S-BD的浓度及光学纯度，当2S，3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。

14小时后检测结果显示：2S，3S-BD的浓度为26.8g L^-1，其ee值大于99％。该样品的气相色谱图谱见图3，保留时间为：32.909的峰即是2S，3S-BD的峰。

实施例2：K.pneumonia ATCC 49790中的2S，3S-BDH在生产2S，3S-BD中的应用

方法同实施例1的操作，只是将2S，3S-BDH的来源菌株改为K.pneumonia ATCC 49790，根据已测序的该菌的基因组序列设计引物如下：

上游引物5’-CCCGGATCCAATGAAAAAAGTCGCAC-3’，携带一个BamHI位点；

下游引物5’-CCCAAGCTTTTAGTTAAACACCATCCCGC-3’，携带一个HindIII位点。

上述2S，3S-BDH基因序列长度为771个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

同实施例1的操作获得重组E.coli全细胞作为催化剂，并进行转化反应。

对上清进行气相色谱分析测定转化液中2S，3S-BD的浓度及光学纯度，当2S，3S-BD的浓度不再增加时，停止转化。

18小时后检测显示：转化产物中2S，3S-BD的浓度为15.3g L^-1，其ee值大于99％。

实施例3：C.glutamicum ATCC 13032中的2S，3S-BDH在生产2S，3S-BD中的应用

方法同实施例1的操作，只是将2S，3S-BDH的来源菌株改为C.glutamicum ATCC13032，根据已测序的该菌的基因组序列设计引物如下：

上游引物5’-AAAGAATTCAATGAGCAAAGTTGCAATGGT-3’，携带一个EcoRI位点；

下游引物5’-TTTAAGCTTCTAGTTGTAGAGCATGCCGC-3’，携带一个HindIII位点。

上述2S，3S-BDH基因序列长度为777个碱基，其核苷酸序列Genebank编号为3345609。

18小时后检测显示：转化产物中2S，3S-BD的浓度为9.1g L^-1，其ee值大于99％。

Claims

1.一种生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于：将(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中表达，并以此重组大肠杆菌为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇。

2.如权利要求1所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于：所述(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因来源于肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和棒杆菌属(Corynebacterium)、泛菌属(Pantoea)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)。

3.如权利要求2所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于：所述(2S，3S)-2，3-丁二醇脱氢酶基因来源菌株是E.cloacae ssp.dissolvens SDM、Klebsiellapneumonia ATCC 49790或Corynebacterium glutamicum ATCC 13032。

4.如权利要求1所述生产手性纯(2S，3S))-2，3-丁二醇的方法，其特征在于：所述以重组大肠杆菌全细胞为生物催化剂，以双乙酰和葡萄糖为底物转化生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法是：

(1)平板培养：将重组大肠杆菌菌株划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂的并含有100μg mL^-1氨苄青霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；

(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物8,000±500rpm离心15分钟；并用0.85wt％的生理盐水洗涤菌体2～3遍，然后将细胞悬起到pH 7、200mM的Tris-HCl缓冲液中，使细胞的终浓度为2～10g L^-1；将菌体置于4℃的冰箱中保藏，即得到重组大肠杆菌全细胞生物催化剂，待用；

(6)转化实验制备产物：以浓度为2～10g L^-1的生物催化剂，在10～42℃、pH 5.0～9.0条件下，180rpm摇床震荡，转化初始浓度为5～20g L^-1的双乙酰，并加入5～120g L^-1的葡萄糖以补充反应所需辅因子的消耗；每隔2小时取样，样品以8,000±500rpm离心10～15分钟，去除所加入的生物催化剂，检测上清中双乙酰和葡萄糖浓度，根据双乙酰和葡萄糖浓度补加双乙酰和葡萄糖，使双乙酰浓度达到5～20g L^-1，葡萄糖浓度达到5～120g L^-1；对上清进行气相色谱分析测定转化液中(2S，3S)-2，3-丁二醇的浓度及光学纯度；当(2S，3S)-2，3-丁二醇的浓度不再增加时，停止转化。

5.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(4)所述诱导培养温度为10～30℃；诱导培养时间为10～20小时。

6.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(6)所述转化实验是以浓度为3.0～8.0g干细胞L^-1的生物催化剂，在20～37℃，pH 6.0～8.0，180rpm震荡条件下对底物进行转化。

7.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(6)所述初始双乙酰浓度为10～25g L^-1，初始葡萄糖浓度为20～100g L^-1。

8.如权利要求4所述生产手性纯(2S，3S)-2，3-丁二醇的方法，其特征在于，步骤(6)所述转化实验过程中补加双乙酰和葡萄糖，使双乙酰浓度达到10～25g L^-1，葡萄糖浓度达到20～100g L^-1。