CN103911398A - 用于增加2，3-丁二醇产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于增加2，3-丁二醇产量的方法，主要解决现有技术中2，3-丁二醇产量较低的问题。本发明通过采用一种用于增加2，3-丁二醇产量的方法，首先对微生物菌种进行耐高糖驯化，然后在驯化好的菌种进行发酵培养的过程中加入抗生素；其中所述抗生素选自等抑制细胞壁合成的青霉素类、头孢菌素类、杆菌类、D-环丝氨酸、影响细胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、两性霉素或缬氨霉素中的至少一种，抗生素的添加浓度为0.0001-5g/L的技术方案较好地解决了上述问题，可用于2，3-丁二醇的生产中。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于增加2，3-丁二醇产量的方法。
背景技术
2,3-丁二醇是一种重要的化合物，可广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域（Syu M J.Applied Microbiology and Biotechnology,2001,55(1):10-18）。其脱水产物甲乙酮是一种低沸点的溶剂，可用于涂料、粘结剂、润滑剂、染料、油墨等行业，同时又能用作有机合成香料、抗氧剂等的中间体；同时它还可以用来生产2-丁烯和1,3-丁二烯等橡胶单体；酯化形式的2,3-丁二醇是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗液等；通过催化脱氢得到的二乙酰化形式的2,3-丁二醇可以用做具有高价值香料的食品添加剂。2,3-丁二醇自身可以还可作为单体用来合成高分子化合物；左旋形式的2,3-丁二醇由于其较低的凝固点可用做抗冻剂；同时因其热值较高（27,200kJ/kg），同乙醇（29,100kJ/kg）相当，可作为燃料添加剂使用（Garg S,Jain A.Bioresour Technol,1995,51(2):103-109）；此外,2,3-丁二醇还在染料、炸药、香水、药物载体等领域显示出潜在的应用价值。
目前对微生物发酵法生产2,3-丁二醇主要集中于利用农业废弃物进行发酵，内容包括不同农业废弃物的利用，发酵条件下的优化，反应器的设计优化及发酵模式的优化等。比如专利CN200910012176.821、CN200910012175.3和CN200910012168.3选用农作物玉米秸、麦秆、稻草等为原料，通过纤维素酶解，进行2，3-丁二醇发酵生产；CN200910015400.9和CN200810228100.4是将淀粉类原料经过液糖化处理作为发酵底物，用以发酵产2，3－丁二醇；而CN200810011692.4以菊芋块茎为原料，将其制备成菊芋汁或菊芋浆，向菊芋汁、浆中添加菊糖酶，可得到菊糖水解液，并以之为碳源进行发酵；也有关于利用玉米芯糖化发酵产2，3－丁二醇的相关专利，如CN201210134936.4。
现有技术均存在2,3-丁二醇产量较低的问题，本发明有针对性的解决了该问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有技术中2，3-丁二醇产量较低的问题，提供一种新的用于增加2，3-丁二醇产量的方法。该方法用于2，3-丁二醇的生产中，具有2，3-丁二醇产量较高的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于增加2，3-丁二醇产量的方法，首先对微生物菌种进行耐高糖驯化，然后在驯化好的菌种进行发酵培养的过程中加入抗生素；其中所述抗生素选自抑制细胞壁合成的青霉素类、头孢菌素类、杆菌类、D-环丝氨酸、影响细胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、两性霉素或缬氨霉素中的至少一种，抗生素的添加浓度为0.0001-5g/L。
上述技术方案中，优选地，所述微生物菌种选自产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌、产气气杆菌、多粘类芽孢杆菌或解淀粉芽胞杆菌中的至少一种。
上述技术方案中，优选地，所述耐高糖驯化是指分别将种子依次连续转接培养至糖浓度梯度分别为50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L和350g/L的液体培养基中，每次培养时间24小时，之后将能够存活的最高糖浓度中菌液稀释涂布于琼脂平板，分离单菌落，之后于液体培养基培养，并用作发酵种子。
上述技术方案中，优选地，所述抗生素的加入的方式是直接加入到培养基中、单独加入或与补料营养液一起加入。
上述技术方案中，优选地，所述抗生素加入过程是一次性加入、分批加入或连续流加。
本发明通过在发酵过程中添加抗生素的方法，大幅提高底物的利用率，提高目标产物2,3-丁二醇的终发酵浓度和生产产量，降低下游分离纯化工段的能耗，减少废水处理量。本发明操作简单，不增加额外的设备与人工，仅通过较低的附加投入，就可以提高目标产物合成浓度与转化率，从而降低生产成本，提高目标产物产量，取得了较好的技术效果。
下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不仅限于本实施例。
具体实施方式
一般性说明
本发酵实施例中所用菌种为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ME-303，该菌种在中国典型培养物保藏中心保藏，编号为CCTCC NO：M207023。
培养基：
固体种子培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，琼脂18；
液体种子培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl5，K2HPO42；
基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖150，K2HPO4·3H2O13.7，KH2PO42.0，(NH4)2HPO43.3，(NH4)2SO46.6，MgSO4·7H2O0.25，FeSO4·7H2O0.05，ZnSO4·7H2O0.001，MnSO4·4H2O0.001。
以上各种培养基的初始PH均为6.8-7.0，121℃下灭菌15min（发酵培养基中葡萄糖分开灭菌，灭菌后再与其它组分混合）。
检测方法：
发酵液中残留的葡萄糖、产物2，3-丁二醇及副产物乙醇等，均采用HPLC（High-performance liquid chromatography）方法测定。色谱柱：BioRad公司AminexHPX-87H；流动相：5mmol/L H2SO4水溶液；流动相流速：0.5mL/min；检测器：SHODEXRI-101折光示差检测器；进样量：20μL；柱温：60℃。
【实施例1】
将甘油管保藏的菌种转接固体培养基在37℃下活化12h。接1环活化的菌种接于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在转速为120rpm的台式恒温(37℃)摇床中，培养12h获得种子细胞。
将活化后的菌体，转接1mL菌液至50mL葡萄糖浓度为50g/L的液体培养基中，摇瓶培养24h后，转接1mL菌液至50mL葡萄糖浓度为100g/L的液体培养基中，培养24h。依次下去，逐步提高培养基中葡萄糖的浓度，经过150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L的连续转接培养后，将菌液稀释涂布于葡萄糖浓度为300g/L的琼脂平板，分离单菌落，在相同的琼脂平板上继代培养16代，稳定其生理特征。
将上述驯化好的种子液培养于对数生长期，以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，37℃恒温培养，搅拌转速180rpm，通气量0.7VVM。发酵8h时一次性加入抗生素氨苄青霉素，使发酵液中的氨苄青霉素浓度为150mg/L。共发酵72小时，2，3-丁二醇平均浓度为72g/L。
【实施例2】
按照实施例1所述的方法和步骤，只是发酵8h时不添加抗生素氨苄青霉素，而在发酵16h时添加抗生素头孢菌素，使发酵液中的头孢菌素浓度为75mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为68g/L。
【实施例3】
按照实施例1所述的方法和步骤，只是发酵8h时不添加抗生素氨苄青霉素，而添加抗生素多粘菌素B，使发酵液中的多粘菌素B浓度为100mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为68.4g/L。
【实施例4】
按照实施例1所述的方法和步骤，只是发酵8h时不添加抗生素氨苄青霉素，而添加抗生素缬氨霉素，使发酵液中的缬氨霉素浓度为250mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为60.8g/L。
【实施例5】
按照实施例1所述的方法和步骤，使发酵液中的氨苄青霉素浓度为0.1mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为57g/L。
【实施例6】
按照实施例1所述的方法和步骤，使发酵液中的氨苄青霉素浓度为500mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为64.5g/L。
【实施例7】
按照实施例1所述的方法和步骤，只是发酵8h时不添加抗生素氨苄青霉素，而添加抗生素氨苄青霉素和抗生素缬氨霉素的混合物，氨苄青霉素与缬氨霉素的质量比为1：1，使发酵液中的抗生素浓度为200mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为57.8g/L。
【实施例8】
按照实施例1所述的方法和步骤，只是抗生素氨苄青霉素分别在发酵8h、9h、10h、11h时分四批加入，每次加入抗生素氨苄青霉素的25%，使发酵液中的氨苄青霉素浓度为500mg/L。2，3-丁二醇平均浓度为65.2g/L。
【比较例1】
按照实施例1所述的方法和步骤，只是发酵8h时不添加抗生素氨苄青霉素。2，3-丁二醇平均浓度为53g/L。
Claims (5)
1.一种用于增加2，3-丁二醇产量的方法，首先对微生物菌种进行耐高糖驯化，然后在驯化好的菌种进行发酵培养的过程中加入抗生素；其中所述抗生素选自抑制细胞壁合成的青霉素类、头孢菌素类、杆菌类、D-环丝氨酸、影响细胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、两性霉素或缬氨霉素中的至少一种，抗生素的添加浓度为0.0001-5g/L。
2.根据权利要求1所述用于增加2，3-丁二醇产量的方法，其特征在于所述微生物菌种选自产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、产气肠杆菌、产气气杆菌、多粘类芽孢杆菌或解淀粉芽胞杆菌中的至少一种。
3.根据权利要求1所述用于增加2，3-丁二醇产量的方法，其特征在于所述耐高糖驯化是指分别将种子依次连续转接培养至糖浓度梯度分别为50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L和350g/L的液体培养基中，每次培养时间24小时，之后将能够存活的最高糖浓度中菌液稀释涂布于琼脂平板，分离单菌落，之后于液体培养基培养，并用作发酵种子。
4.根据权利要求1所述用于增加2，3-丁二醇产量的方法，其特征在于所述抗生素的加入的方式是直接加入到培养基中、单独加入或与补料营养液一起加入。
5.根据权利要求1所述用于增加2，3-丁二醇产量的方法，其特征在于所述抗生素加入过程是一次性加入、分批加入或连续流加。
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