CN108359624A - 一株高产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株高产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其应用。本发明提供的乳杆菌为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3 CGMCC No.15447。通过实验证明：本发明的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3 CGMCC No.15447可分泌阿魏酸酯酶，具有降解植物细胞壁致密网状结构的功能，可用于提高高纤维青贮原料中纤维素消化率、改善青贮原料适口性、提高青贮原料利用率及提高动物体生长性能，同时还具有产酸快、生长快，对人畜无毒害，不污染环境等特点，不仅对提高农牧产品的品质和保护环境具有非常重要的意义，而且还有助于促进农业可持续发展。

Description

一株高产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株仔猪肠道来源的约氏乳杆菌，可高产阿魏酸酯酶，具有降解植物细胞壁致密网状结构的功能，应用于青贮、黄贮等高纤维饲草的深加工。
背景技术
我国作为农业大国，秸秆资源极为丰富，仅小麦的年产量可达到1.154亿吨。然而，这种丰富的农作物副产品中，约有50％直接被丢弃在田地里，或被焚烧，造成了严重的资源浪费及环境污染问题。面对如此巨大的秸秆数量，如何有效的、合理的利用是亟待解决的问题。秸秆综合利用方法有很多，其中生物处理法不仅对环境友好，并且有效地缓解了我国北方冬季饲草供应不足的现象。
秸秆等高纤维青贮原料由于纤维素、半纤维素和木质素之间存在着不同的结合力，使得其结构稳定，生物降解效果较差，利用率较低。秸秆预处理能够降低酶解底物中纤维素的结晶度，减少木质素的含量，增加酶水解底物的比表面积，从而提高纤维素酶对纤维素的可及度，更加迅速地将碳水化合物转化为单糖。阿魏酸酯酶可催化水解植物细胞壁中多糖与木质素之间的酯键交联，破坏植物细胞壁的致密网状结构，释放阿魏酸、二聚阿魏酸等酚酸类物质，且释放出来的阿魏酸具有抗炎、防止动脉硬化等生理作用，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放、其它纤维素酶的可及性、提高高纤维青贮饲料的消化率和改善动物生长性能。但是由于阿魏酸酯酶价格昂贵，使得其在实际应用中受到了制约。因此越来越多的研究集中在寻找可产阿魏酸酯酶、降解植物细胞壁、提高青贮饲料消化率的微生物上。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株仔猪肠道来源的高产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3。
本发明提供的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3的保藏编号为CGMCCNo.15447。
本发明提供的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3的分类命名为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii，该菌株已于2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15447。
本发明的另一个目的是提供上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液的新用途。
本发明提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在产阿魏酸酯酶中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备产阿魏酸酯酶的产品中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在降解植物细胞壁中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备降解植物细胞壁的产品中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在降解阿魏酸乙酯中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备降解阿魏酸乙酯的产品中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在提高动物体生长性能中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备提高动物体生长性能的产品中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在提高青贮原料消化率或改善青贮原料适口性或提高青贮原料利用率中的应用。
本发明还提供了上述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备提高青贮原料消化率或改善青贮原料适口性或提高青贮原料利用率的产品中的应用。
上述应用中，所述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCC No.15447。
本发明还有一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液；
所述产品具有如下1)-7)中任一种的功能：
1)产阿魏酸酯酶；
2)降解植物细胞壁；
3)降解阿魏酸乙酯；
4)提高青贮原料消化率；
5)改善青贮原料适口性；
6)提高青贮原料利用率；
7)提高动物体生长性能。
上述产品中，所述提高青贮原料消化率为提供高纤维青贮原料的纤维素消化率。
上述产品中，所述约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCC No.15447。
上述应用或产品中，所述约氏乳杆菌制剂的制备方法如下：将约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCC No.15447接种至MRS液体培养基或改良的MC液体培养基或营养肉汤中，在30或37℃恒温箱中发酵培养24h，得到HCOM3发酵液，HCOM3发酵液在10000-12000rpm条件下离心2-5min，收集上清液，即为所述约氏乳杆菌制剂。
本发明从健康仔猪结肠中分离得到一株约氏乳杆菌Lactobacillus johnsoniiHCOM3，其保藏编号为CGMCC No.15447。通过实验证明：本发明提供的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCC No.15447可高效分泌阿魏酸酯酶，具有降解植物细胞壁致密网状结构的功能，可提高高纤维青贮原料中纤维素消化率、改善青贮原料适口性、提高青贮原料利用率及提高动物体生长性能，同时本发明提供的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCC No.15447还具有产酸快、生长快，对人畜无毒害，不污染环境等特点，不仅对提高农牧产品的品质和保护环境具有非常重要的意义，而且还有助于促进农业可持续发展，在农牧业生产中具有较好的应用前景。
附图说明
图1为HCOM3产酸速度的分析结果。
图2为HCOM3发酵液上清降解阿魏酸乙酯产生透明圈的分析结果。
图3为HCOM3发酵液上清中的阿魏酸含量的分析结果。
保藏说明
菌种名称：约氏乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus johnsonii
菌株编号：HCOM3
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年3月12日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15447
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、HCOM3菌株的分离与鉴定
一、HCOM3菌株的分离
HCOM3分离自1个半月龄的健康仔猪结肠。具体分离方法如下：取解剖后的一个半月龄的健康仔猪结肠部位内容物，将其用生理盐水按照10-1到10-7进行梯度稀释，选取适宜的梯度涂布于1L MRS培养基(1L MRS培养基配方为牛肉膏10g，酪蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二胺2g，Tween80 1mL，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·7H2O 0.25g，琼脂粉1.5％，双蒸水定容到lL，高压灭菌)或改良的MC培养基(1L改良的MC培养基配方为大豆蛋白胨5g，牛肉浸粉3g，酵母浸粉3g,葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂粉1.5％，双蒸水定容到lL，高压灭菌)或营养琼脂(1L营养琼脂培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉1.5％，双蒸水定容到lL，高压灭菌)。平板置于30℃或37℃培养箱中培养24h后，挑取边缘圆滑的单克隆在MRS液体培养基或改良的MC液体培养基或营养肉汤中培养。过夜培养后检测培养液上清是否降解阿魏酸乙酯产生透明圈或HPLC法检测阿魏酸浓度。最终发现有一株菌的发酵液上清可降解阿魏酸乙酯产生明显的透明圈，且其阿魏酸浓度很高，将其命名为HCOM3。
二、HCOM3菌株的鉴定
提取HCOM3菌株的基因组DNA，利用引物(27F：5’-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)对16S rRNA序列进行扩增，得到PCR产物。并对PCR产物进行测序。
测序结果表明：PCR产物的核苷酸序列如序列1所示，将此序列在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析。
经过比对，鉴定HCOM3菌株为约氏乳杆菌，其分类命名为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii，该菌株已于2018年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15447。
实施例2、HCOM3菌株的产酸速度检测
将实施例1中分离纯化到的HCOM3菌株接种至MRS液体培养基中，37℃恒温箱中发酵培养4h、16h、28h、40h或52h，各时间段分别取样检测发酵液的pH值，并以发酵时间为横坐标，发酵液pH值为纵坐标绘制变化曲线图。
结果如图1所示(图1为HCOM3菌株在MRS培养基中37℃培养52h的曲线图)。从图中可以看出：本发明的HCOM3菌株产酸快、生长快，具有良好的生长性能。
实施例3、微生物制剂HCOM3的制备
1、将实施例1中分离纯化到的HCOM3菌株接种至MRS液体培养基中，37℃恒温箱中发酵培养24h，得到HCOM3发酵液；
2、HCOM3发酵液在10000-12000rpm条件下离心2-5min，收集上清液，得到HCOM3发酵液上清(HCOM3菌株浓度为1014-1018CFU/L)。将HCOM3发酵液上清命名为微生物制剂HCOM3。
实施例4、HCOM3发酵液上清在降解阿魏酸乙酯中的应用
一、HCOM3发酵液上清降解阿魏酸乙酯产生透明圈
1、将不含有葡萄糖的MRS培养基冷却到50-55℃，然后将阿魏酸乙酯按1％(质量分数)的量加入到培养基中，倒板，制备得到阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板。
2、用挖井打孔法在阿魏酸乙酯为唯一碳源的平板上打孔，然后取80-100ul实施例3中制备的微生物制剂HCOM3加入孔中，37℃恒温箱中放置48-72小时，同时以生理盐水作为阴性对照。
结果如图2所示。结果表明：微生物制剂HCOM3可降解阿魏酸乙酯，产生明显的透明圈。
二、阿魏酸含量分析
1、将不含有葡萄糖的MRS培养基冷却到50-55℃，然后将阿魏酸乙酯按1％(质量分数)的量加入到培养基中，制备得到阿魏酸乙酯为唯一碳源的培养基。
2、将HCOM3接种至阿魏酸乙酯为唯一碳源的培养基中，在37℃恒温箱中发酵培养24h，得到HCOM3发酵液。
3、将HCOM3发酵液在10000-12000rpm条件下离心2-5min，收集上清液，得到HCOM3发酵液上清(HCOM3菌株浓度为1014-1018CFU/L)。
4、将HCOM3发酵液上清稀释并过0.22um滤膜后，利用HPLC法(岛津LC-20AT)定量分析HCOM3发酵液上清中的阿魏酸含量。HPLC检测仪器型号及检测条件如下：Wondasil C18-S/N 4K9702-03，Made in Japan，检测波长：320nm；流动相：含有1‰三氟乙酸的100％乙腈；柱温：40℃；洗脱浓度：30％乙腈。
结果如图3所示。结果表明：HCOM3发酵液上清中阿魏酸峰面积为33629624，阿魏酸浓度可达到483.8673mg/L。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一株高产阿魏酸酯酶的约氏乳杆菌及其应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1452
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
tataatgcaa gtcgagcgag cttgcctaga tgattttagt gcttgcacta aatgaaacta 60
gatacaagcg agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccaa gagactggga 120
taacacctgg aaacagatgc taataccgga taacaacact agacgcatgt ctagagtttg 180
aaagatggtt ctgctatcac tcttggatgg acctgcggtg cattagctag ttggtaaggt 240
aacggcttac caaggcaatg atgcatagcc gagttgagag actgatcggc cacattggga 300
ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga 360
aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa agctctgttg 420
gtagtgaaga aagatagagg tagtaactgg cctttatttg acggtaatta cttagaaagt 480
cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt 540
tattgggcgt aaagcgagtg caggcggttc aataagtctg atgtgaaagc cttcggctca 600
accggagaat tgcatcagaa actgttgaac ttgagtgcag aagaggagag tggaactcca 660
tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctctctg 720
gtctgcaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt 780
agtccatgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttgggaggt ttccgcctct cagtgctgca 840
gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900
tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960
ttaccaggtc ttgacatcca gtgcaaacct aagagattag gtgttccctt cggggacgct 1020
gagacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080
aacgagcgca acccttgtca ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta atgagactgc 1140
cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatgcccct tatgacctgg 1200
gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa cgagaagcga acctgcgaag gcaagcggat 1260
ctcttaaagc cgttctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg aagctggaat 1320
cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac catgagagtc tgtaacaccc aaagccggtg ggataacctt tataggagtc 1440
agccgtctaa gg 1452

Claims (9)

1.一株约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3，其保藏编号为CGMCC No.15447。
2.约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在产阿魏酸酯酶中的应用；
或，约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备产阿魏酸酯酶的产品中的应用。
3.约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在降解植物细胞壁中的应用；
或，约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备降解植物细胞壁的产品中的应用。
4.约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在降解阿魏酸乙酯中的应用；
或，约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备降解阿魏酸乙酯的产品中的应用。
5.约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在提高动物体生长性能中的应用；
或，约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备提高动物体生长性能的产品中的应用。
6.约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在提高青贮原料消化率或改善青贮原料适口性或提高青贮原料利用率中的应用；
或，约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备提高青贮原料消化率或改善青贮原料适口性或提高青贮原料利用率的产品中的应用。
7.根据权利要求2-6中任一所述的应用，其特征在于：所述约氏乳杆菌Lactobacillusjohnsonii为权利要求1所述的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCCNo.15447。
8.一种产品，其活性成分为约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液；
所述产品具有如下1)-7)中任一种的功能：
1)产阿魏酸酯酶；
2)降解植物细胞壁；
3)降解阿魏酸乙酯；
4)提高青贮原料消化率；
5)改善青贮原料适口性；
6)提高青贮原料利用率；
7)提高动物体生长性能。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述约氏乳杆菌Lactobacillusjohnsonii为权利要求1所述的约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii HCOM3CGMCCNo.15447。
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