CN106047759B - 一株戊糖片球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于饲料用乳酸菌技术领域，具体公开了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09，于2016年5月23日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：12487，该菌株是是分离自健康猪肠道的乳酸菌，安全性高，该菌株可产酸不产气，能水解精氨酸，并能耐受动物常用药物；本发明还公开了该菌株在微生物饲料添加剂方面的应用，将生产的微生物饲料添加剂用于动物的日粮中，可增加动物机体肠道中的乳酸菌数量，降低动物粪便中的大肠杆菌数量，提高动物机体采食量，促进动物生长发育。

Description

一株戊糖片球菌及其应用
技术领域
本发明涉及饲料用乳酸菌技术领域，尤其涉及一株戊糖片球菌及其应用。
背景技术
自20世纪中期开始，人们逐渐在动物的饲料中添加抗生素，用来预防机体感染疾病，促进动物快速地生长发育，使饲料的利用率提高，提高畜产品的产量等都起到了积极的作用。抗生素过度使用而表现出来的弊端也日益明显，例如，动物肠道内的菌群处于动态平衡的状态，长期食用抗生素后会导致动物正常菌群失衡，且长期使用后容易对机体产生抗药性和药物残留等缺点，使机体的免疫力下降，从而降低了动物产品的质量，如果人们食用饲喂抗生素的动物，人类的健康也会受到威胁。人们对抗生素所带来的弊端逐渐了解之后，开发出能够取代抗生素的新产品，首先开发的就是微生态制剂。微生态制剂又可称为促生素、益生素、活菌制剂等，微生态制剂是以微生态学理论为指导，采用单一菌种或很多菌种复合培养，经过发酵技术制备而成，微生态制剂具有高效、无残留等特点，逐渐取代了抗生素的位置。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株戊糖片球菌及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09，于2016年5月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12487，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09分离自健康猪肠道，其形态学特征为：在MRS琼脂培养基上呈现乳白色的圆形菌落，菌落表面湿润无褶皱，边缘整齐，革兰氏染色为阳性。
所述MRS琼脂培养基包含：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温801mL/L，琼脂20g/L。
所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09的葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵为阳性，淀粉水解为阴性，明胶液化呈阳性，V-P试验和M-R试验呈阳性，硝酸盐还原为阴性，能水解精氨酸。
所述MRS液体培养基包含：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温801mL/L。
所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1所示，具体为：
CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGGAACTGTTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG。
所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09产酸产气，在MRS液体培养基上37℃培养24小时后，有效活菌数为1.1×1010cfu/mL，产酸量为151.8°T；
所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09耐受动物常用药物，所述动物常用药物包括四环素、氯霉素、红霉素、复方新诺明、先锋噻肟、氟哌酸、氟嗪酸、痢特灵、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、万古霉素、氨苄青霉素、青霉素G、先锋V和利福平。
所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09在微生物饲料添加剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的戊糖片球菌R09是分离自健康猪肠道的乳酸菌，安全性高，培养基培养24小时后，有效活菌数达到1.1×1010cfu/mL；同时，该菌的产酸量较高，培养24小时后，产酸量为151.8°T，能水解精氨酸，是同型发酵乳酸菌。
本发明的戊糖片球菌R09用于生产微生物饲料添加剂，将生产的微生物饲料添加剂用于动物的日粮中，可增加动物机体肠道中的乳酸菌数量，降低动物粪便中的大肠杆菌数量，提高动物机体采食量，促进动物生长发育。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明的一株戊糖片球菌R09在MRS琼脂培养基上的菌落形态图；
图2为本发明的一株戊糖片球菌R09在100倍油镜下的菌体特征图；
图3为本发明的一株戊糖片球菌R09在扫描电镜下的菌体特征图；
图4为本发明的一株戊糖片球菌R09的系统发育树。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
下述实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09的分离：
本发明的戊糖片球菌R09分离自健康猪肠道，分离采用平板稀释法，分离用培养基为含有2％CaCO3的SL培养基，M17培养基和MRS琼脂培养基。
其中，每升SL培养基包括：酪蛋白水解物10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠25g，硫酸镁0.58g，琼脂15g，葡萄糖20g，吐温801.0ml，磷酸氢二钾6g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.15g，蒸馏水1000ml。
每升M17培养基包括：植质蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，聚蛋白胨5.0g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，琼脂15g，硫酸镁0.58g，蒸馏水1000mL。
每升MRS琼脂培养基包含：蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，吐温801mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
具体的分离过程按以下步骤进行：
在无菌室中称取10g健康猪肠道粪便样品，放入装有90mL无菌水的三角瓶中振荡1h，用无菌水进行稀释，选10-4、10-5、10-6稀释度，每个稀释度取1滴稀释液分别涂布和倾注在M17、MRS和SL平板上，于37℃条件下恒温培养48h，形成菌落后，观察其形态，挑取有透明钙溶圈的菌落到MRS平板，并对所获得的菌株采用MRS琼脂平板划线法进行纯化，将纯培养的菌株接种到MRS琼脂斜面培养基上，37℃恒温培养48h后置于4℃冰箱中保存备用。
实施例2
本发明戊糖片球菌R09的形态学鉴定按以下步骤进行：将分离纯化的菌株分别涂布到MRS固体培养基，37℃培养1～2d，观察菌落特征，如图1所示，其在MRS琼脂培养基上呈现乳白色的圆形菌落，菌落表面湿润无褶皱，边缘整齐，革兰氏染色为阳性；取典型菌落涂片，并进行革兰氏染色，油镜下观察其菌体形态，如图2所示，戊糖片球菌R09的菌体呈杆状，无芽孢；扫描电镜下观察其菌体形态，如图3所示，图3为戊糖片球菌R09的菌体正在分裂时的状态，以二分裂方式繁殖，菌体为杆状。
生理生化鉴定按以下步骤进行：生理生化实验方法参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(凌代文1999)进行鉴定。
对本发明的戊糖片球菌R09进行精氨酸水解试验，CK为培养基中不接戊糖片球菌R09的对照组，与对照组相比，本发明的戊糖片球菌R09在MRS液体培养基上于37℃、150r/min，培养24h后，其培养基没有发生颜色变化，表明精氨酸经细菌酶水解，释放有碱性物质，发生的是阳性反应。
因此，本发明戊糖片球菌R09的生理生化特征为：葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵为阳性，淀粉水解为阴性，明胶液化呈阳性，V-P试验和M-R试验呈阳性，硝酸盐还原为阴性，能水解精氨酸。
对本发明的戊糖片球菌R09进行分子生物学鉴定，按以下步骤进行：通过16S rDNA序列分析，由上海生物工程股份有限公司进行测序，测得的序列为：
CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG。
对测序结果进行比对，最后再用MEGA5.05作图软件进行系统发育树的绘制，所得本发明戊糖片球菌R09的系统发育树如图3所示。通过各序列间的进化距离，得知各菌株间的亲缘关系远近。
实施例3
本发明的戊糖片球菌R09的性质。
对本发明的戊糖片球菌R09进行葡萄糖发酵产酸产气试验，CK为培养基中不接戊糖片球菌R09的对照组，与对照组相比，本发明的戊糖片球菌R09在MRS液体培养基上，37℃、150r/min培养3天后，戊糖片球菌R09的培养基变黄，表明本发明的戊糖片球菌R09产酸，试验试管的顶部出现大量气泡，表明戊糖片球菌R09产气。本发明的戊糖片球菌R09在MRS液体培养基上37℃培养24小时后，有效活菌数为1.1×1010cfu/mL，产酸量为151.8°T。
对本发明的戊糖片球菌R09进行药敏试验研究，挑取菌株R09少许制成菌悬液，均匀涂布于MRS平板培养基上，将四环素、氯霉素、红霉素、复方新诺明、先锋噻肟、氟哌酸、氟嗪酸、痢特灵、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、万古霉素、氨苄青霉素、青霉素G、先锋V和利福平共16种药敏片置于平板上，37℃培养24h后，所有平板上均未出现抑菌圈，表明R09菌株具有很强的耐药性，在用于动物防病治病时可与多数抗生素同时使用。
实施例4
本发明的戊糖片球菌R09在微生物饲料添加剂方面的应用。
本实施例将本发明的戊糖片球菌R09应用于微生物猪饲料添加剂中，在断奶仔猪的日粮中添加6％的含有戊糖片球菌R09菌株数量2×106的发酵饲料，然后在喂养该生物饲料的第0、14、28、35天时，对仔猪粪便中的大肠杆菌和菌落总数进行测定，并对仔猪肠道中该乳酸菌的数量和日增重进行测定，喂养35天时测定结果如下：断奶仔猪肠道中的乳酸菌数量由7.5×103cfu/g增加到3.6×104cfu/g，仔猪粪便中大肠杆菌的数量由lg4.81cfu/g减少到lg4.08cfu/g，机体采食量由445.02g/d增加到455.91g/d。
本发明的戊糖片球菌R09分离自健康猪肠道，安全性高，可产生有机酸，这些酸类物质本身既是营养物质又可降低肠道pH值，对病原菌和腐败菌有抑制作用，因此将其应用于微生物添加剂或发酵饲料中，最终再输送至猪肠道中，提高了机体免疫力，预防机体感染疟疾，促进猪的生长发育。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09，于2016年5月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12487；其16S rDNA序列为SEQ ID NO：1所示，具体为：
CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG。
2.权利要求1所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09在制备微生物饲料添加剂方面的应用。
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