CN116855423B - 一株植物乳杆菌yj6及其在禽类养殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌YJ6及其在禽类养殖中的应用，属于微生物技术领域。于2023年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63641。该菌株的单一益生菌制剂及复合益生菌制剂能有效提高肉鸡的生长性能，提高肉鸡肠道乳酸菌丰度，降低大肠杆菌数量，显著降低鸡舍氨气浓度。

Description

一株植物乳杆菌YJ6及其在禽类养殖中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株植物乳杆菌YJ6及其在禽类养殖中的应用。
背景技术
自抗生素作为饲料添加剂被禁用以来，在规模化养殖业中，动物死淘率高、生产性能低、饲料转化率低等问题突出。同时，畜禽排泄物大量堆积，向环境中释放了大量有害气体(主要成分为氨气、硫化氢、吲哚等)，这对人类和动物的健康构成威胁的同时，造成了严重的环境污染问题。
益生菌是指在给予足够的量时，对宿主健康产生有益影响的活的微生物。乳酸菌是最常用的益生菌，也是人类和动物肠道的常驻菌，包括植物乳杆菌、干酪乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌等。研究表明，益生菌能够产生抑菌物质，调节宿主肠道菌群平衡，提高畜禽饲料利用率，促进畜禽免疫器官发育，提高畜禽生产性能等。益生菌作为饲料添加剂表现出绿色、安全优势，利用益生菌提高畜禽的健康水平、净化环境污染也得到国内外养殖行业的高度重视。目前，在家禽(尤其肉鸡)养殖中，其促进生产和减少粪尿异味的益生菌产品较少。因此，有关肉鸡益生菌菌株的筛选和及其益生菌制剂的研发具有非常重要的现实意义，并助力我国家禽养殖的健康发展。
发明内容
本发明的目的是提供一株植物乳杆菌YJ6及其在禽类养殖中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株植物乳杆菌YJ6(Lactiplantibacillus plantarum)，该菌株于2023年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63641。
本发明还提供一种微生物菌剂，包括所述植物乳杆菌YJ6。
优选的是，还包括干酪乳杆菌BK1。
优选的是，所述植物乳杆菌YJ6和干酪乳杆菌BK1的活菌数比例为1:1。
本发明还提供所述植物乳杆菌YJ6或所述微生物菌剂在禽类养殖中的应用。
本发明还提供所述植物乳杆菌YJ6或所述微生物菌剂在提高禽类生长性能中的应用。
本发明还提供所述植物乳杆菌YJ6或所述微生物菌剂在调整禽类肠道菌群中的应用。
本发明还提供所述植物乳杆菌YJ6或所述微生物菌剂在降低禽类养殖氨气排放中的应用。
本发明还提供所述植物乳杆菌YJ6或所述微生物菌剂在降低禽类血清中尿酸、氨态氮和尿素氮浓度中的应用。
本发明还提供一种禽类养殖方法，饲喂含有所述植物乳杆菌YJ6或所述微生物菌剂的饲料。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一株植物乳杆菌YJ6，该菌株的单一益生菌制剂及复合益生菌制剂能有效提高禽类的生长性能，提高禽类肠道乳酸菌丰度，降低大肠杆菌数量，显著降低养殖环境中的氨气浓度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为植物乳杆菌YJ6的菌落形态图；
图2为植物乳杆菌YJ6的革兰氏染色镜检图；
图3为植物乳杆菌YJ6的PCR扩增图，其中，M代表Marker，1代表菌株YJ6，2代表植物乳杆菌YJ3。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
本发明中实施例使用的培养基包括：
MRS液体培养基：葡萄糖20.0g、牛肉浸粉10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、K2HPO4·3H2O 2.0g、吐温80 1.0mL、MgSO4·7H2O 0.29g、MnSO4·H2O 0.058g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH为7.2，于121℃高压灭菌20min。
MRS固体培养基：在液体MRS培养基成分基础上加入琼脂15.0g，调节pH为6.3，于121℃高压灭菌20min。
含0.75％碳酸钙MRS固体培养基：在液体MRS培养基成分基础上加入碳酸钙7.5g，琼脂15.0g，调节pH为6.3，于121℃高压灭菌20min。
R3发酵培养基：葡萄糖70.0g、牛肉膏20.0g、蛋白胨20.0g、酵母浸粉20.0g、乙酸钠4.0g、磷酸氢二钾1.0g、柠檬酸三铵1.0g、硫酸镁0.6g、硫酸锰0.6g、吐温80 1.0mL、碳酸钙20.0g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH为8.0，于121℃高压灭菌30min。
实施例1菌株的分离与鉴定
1.1菌株的分离
取10g健康肉鸡的新鲜粪便样品与90mL无菌PBS混匀、过滤；取1mL滤液进行梯度稀释，取0.1mL梯度稀释液涂布于含0.75％碳酸钙的MRS平板上，37℃厌氧培养24h；选择有溶钙圈且形态、色泽不同的单菌落，分别在MRS平板上划线纯化；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，共计初步分离得到208株新分离株。
1.2菌株的形态观察
菌株YJ6在MRS平板上呈乳白色或微黄色，菌落成圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落(如图1所示)。在油镜下，YJ6的菌体呈蓝紫色，直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状(如图2所示)。
1.3耐胆盐和耐酸的初步筛选
用0.1mol/L的HCl调节MRS液体培养基pH为2.5，无菌条件下分别接种1mL上述新分离株的菌液；37℃培养3h后平板计数；结果显示，其中135株新分离株在pH＝2.5的条件下存活率高于80％。
配制含0.3％牛胆盐的MRS液体培养基，无菌条件下分别接种1mL上述135株新分离株的菌液；37℃培养3h后平板计数；结果显示，其中58株新分离株在含0.3％牛胆盐的条件下存活率高于80％。
1.4菌株的分子生物学鉴定
提取上述58株新分离株的基因组，用细菌16S rDNA通用引物27F及1492R进行PCR扩增。
PCR反应体系如下：模板DNA1μL、10μmol/L上下游引物各2μL、2×Taq Master Mix25μL、ddH2O补足至50μL；
PCR反应程序如下：95℃，5min；95℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；共35个循环；72℃，8min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到约为1500bp的目的片段(如图3所示)，测序结果提交NCBI进行Blast分析，共鉴定得到10株植物乳杆菌。
实施例2植物乳杆菌的益生特性研究
1.植物乳杆菌的表面性质测定
制备植物乳杆菌(本实验室分离)和大肠杆菌ATCC43888新鲜菌液，6000r/min离心10min收集菌体。
植物乳杆菌自凝集率测定：调节波长600nm处植物乳杆菌的吸光值为0.5±0.02(A0)，静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)＝(A0-A24)/A0×100％。
植物乳杆菌与大肠杆菌共聚集率测定：1：1制备植物乳杆菌和大肠杆菌ATCC43888的混合悬菌液，并调节其在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A0)，静置24h后测定吸光值A24，共聚集率(％)＝(A0-A24)/A0×100％。
植物乳杆菌疏水性测定：调节波长600nm处植物乳杆菌的吸光值为0.5±0.02(A0)；分别取1mL二甲苯加入到3mL植物乳杆菌悬液中，室温预培养10min后涡旋振荡2min将两相体系充分混匀；37℃静置共培养1h后去除有机相，测定水相的吸光值A1，疏水率(％)＝(A0-A1)/A0×100％。
结果表明如表1所示，6株植物乳杆菌有较高的表面性质。植物乳杆菌YJ6自凝集率为75.82％，与大肠杆菌ATCC43888的共凝集率为65.17％，疏水性为55.82％。
表1植物乳杆菌表面性质测定结果
菌株 自凝集率 共凝集率 疏水率
植物乳杆菌YJ3(自分离) 68.53％ 67.38％ 49.55％
植物乳杆菌YJ6(自分离) 75.82％ 65.17％ 55.82％
植物乳杆菌YJ11(自分离) 55.95％ 53.25％ 56.73％
植物乳杆菌YJ19(自分离) 70.22％ 38.55％ 40.28％
植物乳杆菌YJ25(自分离) 49.67％ 50.74％ 39.58％
2.植物乳杆菌的抑菌特性
用琼脂平板扩散法测定10株植物乳杆菌的抑菌活性。
将10株植物乳杆菌的单菌落接种于MRS培养基中，37℃静置培养36h；4℃，6 000r/min离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤上清液。
本实施例用指示菌包括大肠杆菌、沙门氏菌等10株病原菌，其中大肠埃希氏杆菌ATCC43888、金黄色葡萄球菌ATCC6538、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鲍氏志贺氏菌ATCC9207、以及普通变形杆菌ATCC29905购自中国兽医药品监察所；大肠埃希氏杆菌LXR3、鸭疫里氏杆菌A3、克雷伯肺炎杆菌ZY1、鸡支原体ZFY1由本实验室分离；大肠杆菌K88由扬州大学惠赠。吸取100μL浓度约为1×106CFU/mL的指示菌于琼脂平板上，均匀涂布后室温静置10min；用孔径为7mm的打孔器均匀打孔，分别向孔中加入150μL上述10株植物乳杆菌的上清液；37℃培养18h后，用游标卡尺测量抑菌圏直径大小。
抑菌结果显示(见表2)，植物乳杆菌YJ6较其他5株植物乳杆菌具有更广泛的抑菌性，对10株常见致病菌表现出不同程度的抑制作用，抑菌作用显著。植物乳杆菌YJ6对克雷伯肺炎杆菌ZY1的抑制作用最强，抑菌圈直径为26.20mm；对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的抑菌圈直径为18.24mm。
表2菌株YJ6的抑菌能力测定(mm)
致病菌菌株 抑菌圈直径 致病菌菌株 抑菌圈直径
大肠埃希氏杆菌ATCC43888 17.28 鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028 18.24
大肠埃希氏杆菌LXR3 15.25 大肠杆菌K88 13.80
鸭疫里氏杆菌A3 19.87 鸡支原体ZFY1 12.85
金黄色葡萄球菌ATCC6538 16.51 鲍氏志贺氏菌ATCC9207 15.29
克雷伯肺炎杆菌ZY1 26.20 普通变形杆菌ATCC29905 18.41
3.植物乳杆菌YJ6的黏附性测定
用工作浓度为500μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)溶液标记植物乳杆菌YJ6及对照菌株鼠李糖乳杆菌GG；用RPMI-1640细胞培养液重悬菌体并调节浓度为2×108CFU/mL。吸取100μL标记的菌液测定其在吸收光波长为485nm、发射光波长为530nm时的荧光强度，即为初始相对荧光值R0。
分别向培养至单层的上皮细胞Caco-2细胞中加入0.5mL FITC标记的植物乳杆菌YJ6或鼠李糖乳杆菌GG；37℃，5％CO2条件下封闭孵育2h，无菌PBS漂洗4次去；每孔中加入300μL胰酶，5min后加入1mL细胞培养液终并吹打混匀细胞悬液。吸取100μL细胞悬液于96孔板中并测定荧光强度，即为黏附后相对荧光值R2。
菌株的黏附率＝(R2/R0)×100％
植物乳杆菌YJ6对上皮细胞Caco-2的黏附率为12.83％，略高于参考菌株鼠李糖乳杆菌GG，但无显著差异(表3)。
表3植物乳杆菌YJ6黏附率
菌株 黏附率(％)
植物乳杆菌YJ6 12.83±1.25
鼠李糖乳杆菌GG 12.22±0.30
4.植物乳杆菌YJ6抑制致病菌黏附Caco-2细胞的特性研究
用二甲基亚砜(DMSO)溶解异硫氰酸荧光素(FITC)配置成荧光标记液母液，浓度为500mg/mL，保存于4℃。用PBS稀释FITC母液，配置工作浓度为500μg/mL的荧光标记液，用0.22μm滤器过滤备用。新鲜传代的大肠杆菌和沙门氏菌离心(4℃，6000×g，5min)，用无菌PBS洗涤3次；用荧光标记液重悬菌体，37℃暗孵育2h；离心(4℃，6000×g)孵育后菌液并洗涤菌株3次，去除未结合的FITC标记液；用RPMI-1640细胞培养液重悬试验菌株并调节浓度为2×108CFU/mL。
设置竞争试验、排斥试验和置换试验。
竞争试验中，试验组向单层Caco-2细胞中分别加入0.25mL浓度为2×108CFU/mL的植物乳杆菌YJ6(或鼠李糖乳杆菌GG)和致病菌并混合均匀；空白孔加入0.5mL已标记的致病菌；37℃共孵育2h后，用无菌PBS洗涤4次。
排斥试验中，试验组向单层Caco-2细胞中加入0.5mL浓度为2×108CFU/mL植物乳杆菌YJ6(或鼠李糖乳杆菌GG)，空白孔加入0.5mL细胞培养液；于37℃孵育1h后弃去孔内液体，无菌PBS漂洗3次；每孔加入0.5mL致病菌，37℃封闭孵育1h后，用无菌PBS漂洗4次。
置换试验中，向单层Caco-2细胞中加入0.5mL致病菌，37℃CO2培养箱中封闭孵育1h；弃去孔内液体，无菌PBS漂洗3次；空白孔中加入0.5mL浓度为2×108CFU/mL植物乳杆菌YJ6(或鼠李糖乳杆菌GG)；37℃封闭孵育1h后，用无菌PBS漂洗4次。
试验结束后，每孔中加入300μL胰酶，5min后加入1mL细胞培养液终，吹打混匀细胞悬液。吸取100μL细胞悬液于96孔板中并测定荧光强度。
植物乳杆菌对致病菌黏附Caco-2的抑制率(％)＝1-(1-RT/RB)×100％
其中，RT为试验孔或对照孔细胞悬液的相对荧光值，RB为空白孔细胞悬液的相对荧光值。
如表4所示，植物乳杆菌YJ6和鼠李糖乳杆菌GG(由美国田纳西州立大学惠赠)均可通过竞争、排斥和置换的方式抑制大肠杆菌和沙门氏菌黏附Caco-2细胞，其主要通过竞争的方式抑制两种致病菌的黏附。植物乳杆菌YJ6对大肠杆菌的竞争抑制为54.37％，显著高于对照菌株鼠李糖乳杆菌GG(31.43％)。
表4植物乳杆菌YJ6抑制致病菌黏附Caco-2细胞
基于上述试验结果，最终筛选出植物乳杆菌YJ6作为禽用益生菌候选株。植物乳杆菌YJ6菌株于2023年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63641。
实施例3含有植物乳杆菌YJ6的单一及复合益生菌制剂的制备
将植物乳杆菌YJ6以2.5％的接种浓度接种至5L R3发酵培养基中，37℃、厌氧发酵36h；离心收集菌体、用MRS培养基重悬沉淀，调整菌液浓度为1×109CFU/mL，15％甘油保存，即含有植物乳杆菌YJ6的单一益生菌制剂。
将植物乳杆菌YJ6、干酪乳杆菌BK1以2.5％的浓度接种至5L R3发酵培养基中，37℃、厌氧发酵36h；离心收集菌体、用MRS培养基重悬沉淀，调整菌液浓度为1×109CFU/mL；植物乳杆菌YJ6(本实验室分离)和干酪乳杆菌BK1(本实验室分离)以活菌数比例为1:1配伍，15％甘油保存，即含有植物乳杆菌YJ6的复合益生菌制剂。
实施例4植物乳杆菌YJ6及其益生菌制剂在禽类养殖中的初步应用研究
选取某养殖场1日龄600只肉鸡，随机分为3组：对照组、植物乳杆菌YJ6组和复合益生菌制剂组，每组200只，设4个重复，每个重复50只。对照组饲喂基础日粮；植物乳杆菌组在基础日粮中以1×108CFU/mL/只/天的剂量添加植物乳杆菌YJ6；复合益生菌制剂组在基础日粮中添加实施例三中制备的配伍菌剂。试验期为30d。
1.益生菌制剂对肉鸡生长性能的影响
分别在1d、15d和30d，肉鸡空腹10h后以每个分组的重复为单位进行称重。结果显示(表5)，YJ6组和YJ6复合益生菌制剂组肉鸡的平均日增重均高于对照组，1-30d平均日增重分别提高了15.50％、22.03％，其中1-15d平均日增重分别提高了5.29％、11.5％，16-30d平均日增重分别提高了13.56％、23.19％。上述结果表明植物乳杆菌YJ6及其复合益生菌制剂可有效提高肉鸡的生长性能。
表5益生菌制剂对肉鸡生长性能的影响
2.肉鸡肠道菌群的变化
试验结束后，每组屠宰5只鸡，取盲肠内容物各1g，加入9mL无菌PBS，混匀后梯度稀释，平板计数。结果显示(表6)，植物乳杆菌YJ组和复合益生菌制剂组肉鸡盲肠中乳酸菌的数量分别是对照组的3.16倍和5.62倍；大肠杆菌的数量分别是对照组的0.56倍和0.26倍。
表6肉鸡盲肠内容物中乳酸菌和大肠杆菌含量(log cfu/g)
乳酸菌 大肠杆菌
对照组 7.05±0.24 5.79±0.60
植物乳杆菌YJ6组 7.55±0.61 5.54±0.38
复合益生菌制剂组 7.80±0.19 5.20±0.45
3.肉鸡舍内氨气浓度的变化
氨气是肉鸡养殖过程中产生的对健康和环境有害的气体，由表7可知，与对照组相比，植物乳杆菌YJ6组和复合益生菌制剂组鸡舍内的氨气浓度在逐渐下降，试验第30d，氨气浓度分别降低32.09％、52.58％，表明植物乳杆菌YJ6及其复合益生菌制剂有减少氨气浓度，净化肉鸡养殖环境的效果。
表7试验期肉鸡舍内氨气浓度的变化(ppm)
1d 15d 30d
对照组 15.83±1.55 17.29±2.06 18.05±1.59
植物乳杆菌YJ6组 16.08±0.23 13.37±1.77 10.92±1.63
复合益生菌制剂组 15.88±1.04 11.84±1.34 7.53±0.94
4.肉鸡血清中氮代谢相关产物的变化
结果表明(表8)，植物乳杆菌YJ6及其复合益生菌制剂有效降低了肉鸡血清中尿酸、氨态氮和尿素氮的浓度。
表8肉鸡血清中氮代谢相关产物的变化
尿酸(mg/L) 氨态氮(μmol/L) 尿素氮(mg/L)
对照组 53.29±6.22 295.93±16.57 1.30±0.18
植物乳杆菌YJ6组 51.68±3.83 277.69±19.29 1.14±0.15
复合益生菌制剂组 48.39±4.67 256.10±10.43 0.95±0.22
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌YJ6(Lactiplantibacillus plantarum)，其特征在于，该菌株于2023年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63641。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述植物乳杆菌YJ6。
3.如权利要求1所述植物乳杆菌YJ6或权利要求2所述微生物菌剂在肉鸡养殖中的应用。
4.如权利要求1所述植物乳杆菌YJ6或权利要求2所述微生物菌剂在提高肉鸡生长性能中的应用。
5.如权利要求1所述植物乳杆菌YJ6或权利要求2所述微生物菌剂在调整肉鸡肠道菌群中的应用。
6.如权利要求1所述植物乳杆菌YJ6或权利要求2所述微生物菌剂在降低肉鸡养殖氨气排放中的应用。
7.如权利要求1所述植物乳杆菌YJ6或权利要求2所述微生物菌剂在降低肉鸡血清中尿酸、氨态氮和尿素氮浓度中的应用。
8.一种肉鸡养殖方法，其特征在于，饲喂含有权利要求1所述植物乳杆菌YJ6或权利要求2所述微生物菌剂的饲料。
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