CN101688202A - 异丙醇生产细菌及使用其的异丙醇生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种异丙醇生成细菌，所述细菌被赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性，可以由来自植物的原料生成异丙醇。本发明还提供一种包括使用所述异丙醇生产细菌由来自植物的原料生产异丙醇的异丙醇生产方法及用于该方法的装置。

Description

异丙醇生产细菌及使用其的异丙醇生产方法

技术领域

本发明涉及一种异丙醇生产细菌及使用其的异丙醇生产方法。

背景技术

因为由来自植物的原料制备的异丙醇可以经脱水步骤转化为丙烯，所以有希望作为碳中和的丙烯的原料。目前，根据京都议定书有义务于2008年至2012年间所有发达国家二氧化碳排放量与1990年相比削减5％，碳中和的丙烯由于其广泛适用性对地球环境极其重要。

将来自植物的原料同化生产异丙醇的菌已经存在于自然界中(例如参见中国专利申请公开第CN1043956A及日本特开昭61-67493号公报)。但是，已知异丙醇的生产率低，并且副生出丁醇或乙醇等醇类。由于丁醇及乙醇与水的共沸点和异丙醇与水的共沸点相近，所以难以通过简单蒸馏等方法容易地将丁醇或乙醇与异丙醇分离。因此，认为为了从丁醇或乙醇与异丙醇共存的现有菌的发酵液中回收异丙醇，必须进行附加有精馏塔等设备的蒸馏，所以推测这一精制过程变得复杂。

中国专利申请公开第CN1043956A中记载了下述方法，所述方法将Clostridium Butanoiacetonicus G.V在添加有玉米和糖蜜的培养液中培养后，对所得的培养液进行蒸馏、再蒸馏、分馏，制备丁醇、乙醇、丙酮、异丙醇。但是，在该文献记载的实施例中，完全没有记载培养液中的丁醇、乙醇、丙酮及异丙醇的生成量，也没有记载最终利用分馏应得到的各成分的量。因此，由该文献实际上不能确认生产了异丙醇、丁醇、乙醇、丙酮。

在日本特开昭61-67493号公报中，记载了在培养梭状芽孢杆菌属细菌所得的培养液中，同时伴有与异丙醇相比大量的丁醇、和少量的乙醇及丙酮。根据该文献，作为从所得的培养液得到异丙醇的方法，记载了将培养液过滤，进行数次蒸馏，浓缩，通过盐析分离得到油分后，将得到的油分用具有分馏塔的装置进行分馏的方法是通常的分离精制方法。

另一方面，已知将来自梭状芽孢杆菌属细菌(丙酮丁醇梭菌：Clostridium Acetobutylicum)的乙酰乙酸脱羧酶、CoA转移酶及硫解酶的基因导入大肠杆菌中，培养所得的重组大肠杆菌来生产丙酮(例如，Lourdes L Bermejo et al.：Applied and EnvironmentalMicrobiology，Vol.64，NO.3，p.1079-1085，(1998)。

发明内容

如上所述，由于现有的异丙醇生产菌的异丙醇生产率低，并且培养液中副生大量的丁醇及乙醇等醇类，因此难以从培养液中回收异丙醇，在工业生产异丙醇方面存在问题。

本发明是鉴于上述情况而研究得到的，目的在于提供一种细菌，所述细菌副生醇类少、无需用于分离副生醇的特别步骤、能够生产进一步精制得到的异丙醇；以及使用该细菌的异丙醇生产方法及异丙醇生产装置。

本发明的第一方案提供一种被赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性，可以由来自植物的原料生产异丙醇的异丙醇生产细菌。

在本发明的第一方案中，优选上述乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性分别通过导入编码来自下述细菌的各酶的基因而得到，所述细菌选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少一种。

本发明的第二方案提供异丙醇生产方法，所述方法包括使用上述异丙醇生产细菌，由来自植物的原料生产异丙醇。

在本发明的第二方案中，优选包括边向含有上述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中供给气体边培养该异丙醇生产细菌的培养步骤，和回收通过上述培养生成的异丙醇的回收步骤。

本发明的第三方案提供异丙醇生产装置，所述装置具有收纳含有上述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物的培养部，和与上述培养部连接同时在上述培养部中收纳的混合物中的位置处开口、向上述混合物中供给气体的气体供给部，和收纳捕集异丙醇的捕集液的捕集部，和连接上述培养部和上述捕集部、同时可以将在上述培养部内蒸发的异丙醇移动至上述捕集部的连接部。

附图说明

[图1]为表示本发明的异丙醇生产装置的一个实施方案的简要示意图。

具体实施方式

本发明的异丙醇生产细菌被赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性，可以由来自植物的原料生产异丙醇。

本发明的异丙醇的生产方法包括使用上述异丙醇生产细菌，由来自植物的原料生产异丙醇。

本发明的异丙醇生产装置具有收纳含有上述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物的培养部，和与上述培养部连接同时在上述培养部中收纳的混合物中的位置开口，向上述混合物中供给气体的气体供给部，和收纳捕集异丙醇的捕集液的捕集部，和连接上述培养部和上述捕集部同时可以将在上述培养部内蒸发的异丙醇移动至上述捕集部的连接部。

需要说明的是，在本说明书中标记数值范围时，若无特别说明，则表示以其前后记载的数值分别作为最小值及最大值包含的范围。

另外，在本说明书中所谓“步骤”表示实现本步骤所期望的作用的阶段，多个阶段在时间上同时进行的情况等不能与其他步骤区分的情况也包括在本说明书中步骤的概念中。

在本说明书中所谓“vvm”表示在1分钟内通入液容量的几倍的气体，例如，对10升的培养液进行2vvm的通气表示每分钟通入20升的气体。

以下，说明本发明。

[异丙醇生产细菌]

本发明的异丙醇生产细菌是被赋予了乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性，可以由来自植物的原料生产异丙醇的异丙醇生产细菌。

本发明的异丙醇生产细菌被全部赋予了乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶四种异丙醇生成酶。本发明人等发现使用该异丙醇生产细菌生产异丙醇时，不副生丁醇或乙醇等醇类。由此，与现有的异丙醇生产微生物相比可以特别简便地回收异丙醇。

本发明中所谓来自植物的原料为由植物获得的碳源，只要是细菌可以代谢转化为异丙醇的物质即可，没有特别限定。在本发明中指根、茎、秆、枝、叶、花、种子等器官、含有它们的植物体、所述植物器官的分解产物，进而在由植物体、植物器官或它们的分解产物得到的碳源中，微生物在培养中可以用作碳源的物质也包含在来自植物的原料中。

在包含于所述来自植物的原料中的碳源中，作为通常物质可以举出淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、或者含有较多所述成分的草木质分解产物及纤维素水解物等。进而来自植物油的丙三醇及脂肪酸也属于本发明的碳源。

作为本发明中的来自植物的原料，可以优选使用谷物等农作物、玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等，作为这些原料的使用形态为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，可以为仅是上述碳源的形态。

本发明的异丙醇生产细菌只要具有由所述来自植物的原料生成异丙醇的能力即可，例如可以举出通过培养将来自植物的原料同化，一定时间后在培养液中分泌异丙醇的细菌。

本发明中的异丙醇生产细菌被赋予了乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性四种酶活性。

本发明中的活性的“赋予”除了包括将编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内之外，还包括通过强化宿主细菌在基因组中保有的酶基因的启动子活性或与其他启动子置换使酶基因强表达。

本发明中的乙酰乙酸脱羧酶是指分类为基于国际生化学联盟(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号4.1.1.4、催化由乙酰乙酸生成丙酮的反应的酶的总称。

作为所述乙酰乙酸脱羧酶，例如可以举出来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)等芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶。

作为本发明的被导入宿主细菌中的乙酰乙酸脱羧酶的基因，可以利用具有编码从上述各来源生物得到的乙酰乙酸脱羧酶的基因的碱基序列的DNA或基于其公知的碱基序列合成得到的合成DNA序列。作为优选基因，可以举出来自梭状芽孢杆菌属细菌或芽孢杆菌属细菌的DNA，例如可以举出具有来自丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢杆菌的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有来自丙酮丁醇梭菌的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的异丙醇脱氢酶是指分类为基于国际生化学联盟(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.80、催化由丙酮生成异丙醇的反应的酶的总称。

作为所述异丙醇脱氢酶，例如可以举出拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)等来自梭状芽孢杆菌属细菌的异丙醇脱氢酶。

作为被导入本发明的宿主细菌中的异丙醇脱氢酶的基因，可以利用具有编码从上述各来源生物得到的异丙醇脱氢酶的基因的碱基序列的DNA或基于其公知的碱基序列合成得到的合成DNA序列。作为优选基因，可以举出来自梭状芽孢杆菌属细菌的DNA，例如具有来自拜氏梭菌的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的CoA转移酶是指分类为基于国际生化学联盟(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.8.3.8、催化由乙酰乙酰基CoA生成乙酰乙酸的反应的酶的总称。

作为所述CoA转移酶，例如可以举出来自下述细菌的CoA转移酶，所述细菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌、Roseburiaintestinalis等罗斯氏菌属细菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium属细菌、粪球菌(Coprococcus)属细菌、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)等锥虫、大肠杆菌(Escherichia coli：大肠杆菌)等埃希氏菌属细菌。

作为本发明的被导入宿主细菌中的CoA转移酶的基因，可以利用具有编码从上述各来源生物得到的CoA转移酶的基因的碱基序列的DNA或基于其公知的碱基序列合成得到的合成DNA序列。作为优选的基因，可以举出具有来自下述细菌的基因的碱基序列的DNA，所述细菌为丙酮丁醇梭菌等梭状芽孢杆菌属细菌、Roseburiaintestinalis等罗斯氏菌属细菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium属细菌、粪球菌属细菌、布氏锥虫等锥虫、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌。作为较优选基因，可以举出来自梭状芽孢杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌的基因，特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。

本发明中的硫解酶是指分类为基于国际生化学联盟(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.3.1.9、催化由乙酰基CoA生成乙酰乙酰基CoA的反应的酶的总称。

作为所述硫解酶，例如可以举出来自下述物质的硫解酶，所述物质为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属细菌、盐杆菌种(Halobacterium sp.)细菌、生枝动胶菌(zoogloea ramigera)等动胶菌属细菌、根瘤菌种(Rhizobium sp.)细菌、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌属细菌、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)等链霉菌属细菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等肠球菌属细菌、热带假丝酵母(candida tropicalis)等假丝酵母菌属、向日葵(Helianthus annuus)等菊科向日葵属、红原鸡(Gallus gallus)等雉科原鸡属、褐家鼠(Rattusnorvegicus)等鼠科鼠属、野猪(Sus scrofa)等猪科猪属、欧洲牛(Bostaurus)等牛科牛属。

作为本发明的被导入宿主细菌中的硫解酶的基因，可以利用具有编码由上述各来源生物得到的硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于其公知的碱基序列合成得到的合成DNA序列。作为优选基因，可以举出具有来自下述物质的基因的碱基序列的DNA，所述物质为丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭状芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、盐杆菌种的细菌、生枝动胶菌等动胶菌属细菌、根瘤菌种的细菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌属细菌、新月柄杆菌等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌等链霉菌属细菌、粪肠球菌等肠球菌属细菌、热带假丝酵母等假丝酵母菌属、向日葵等菊科向日葵属、红原鸡等雉科原鸡属、褐家鼠等鼠科鼠属、野猪等猪科猪属、欧洲牛等牛科牛属。作为较优选基因，可以举出来自梭状芽孢杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌的基因，特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。

其中，从酶活性的观点考虑优选上述四种酶分别为来自选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少一种的酶，其中，更优选乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶来自梭状芽孢杆菌属细菌、CoA转移酶活性及硫解酶活性来自埃希氏菌属细菌，和所述四种酶均来自梭状芽孢杆菌属细菌。

其中从酶活性的观点考虑优选本发明中的四种酶分别来自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大肠杆菌中的任一种；较优选乙酰乙酸脱羧酶为来自丙酮丁醇梭菌的酶，CoA转移酶及硫解酶分别为来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的酶，异丙醇脱氢酶为来自拜氏梭菌的酶；上述四种酶从酶活性的观点考虑，特别优选乙酰乙酸脱羧酶活性来自丙酮丁醇梭菌，上述异丙醇脱氢酶活性来自拜氏梭菌，CoA转移酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌。

本发明中的所述酶的活性可以从菌体外向菌体内导入，或者通过强化宿主细菌在基因组中保有的酶基因的启动子活性或与其他启动子置换使酶基因强表达。

酶活性的导入可以通过例如使用基因重组技术将编码所述四种酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内而进行。此时，被导入的酶基因与宿主细胞同种或不同种均可。从菌体外向菌体内导入基因时需要的基因组DNA的制备、DNA的切断及连接、转化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可以按照本领域技术人员所公知的通常的方法来进行。所述方法记载于Sambrook，J.，et.al.，”Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等中。

作为用于强化启动子活性或使酶基因强表达的启动子，只要为可以在大肠杆菌等宿主中表达的启动子即可，可以使用任意物质。例如可以使用trp启动子、lac启动子、P_L启动子、P_R启动子等来自大肠杆菌或噬菌体的启动子。可以使用如tac启动子等那样被人为设计改变的启动子。另外也可以如本发明实施例中记载的那样，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、谷氨酸脱羧酶A(gadA)启动子、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)启动子。它们可以根据所使用的酶的来源及种类适当选择。

例如为了强化来自大肠杆菌的硫解酶或CoA转移酶的活性，只要为在大肠杆菌等宿主中可以表达的启动子就可以使用任意的启动子，可以从下述启动子组成的组的示例启动子中适当选择一种以上，所述启动子为trp启动子、lac启动子、P_L启动子、P_R启动子、tac启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、谷氨酸脱羧酶A(gadA)启动子、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)启动子等。另外，trp启动子、lac启动子、P_L启动子、P_R启动子、tac启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、谷氨酸脱羧酶A(gadA)启动子、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)启动子等启动子可以用于与来自大肠杆菌的硫解酶或CoA转移酶的启动子置换。

只须按照通常的方法将所述启动子导入宿主细胞，使成为对象的酶基因可以表达即可，例如，可以与成为对象的酶基因连接于同一载体上，与酶基因一起导入宿主细胞。

本发明中所谓宿主细菌是指成为用于导入编码乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶四种酶的基因的或强化启动子活性或置换启动子的对象的原核生物。作为所述宿主细菌，可以举出埃希氏菌属(Escherichia)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、棒杆菌(Corynebacterium)属细菌等，特别优选使用便利性高、工业使用的实际成果丰富的大肠杆菌(Escherichia coli：大肠杆菌)。

[异丙醇的生产方法]

本发明的异丙醇的生产方法包括使用上述本发明的异丙醇生产细菌由来自植物的原料生产异丙醇。

由此，可以不副生其他醇类地以高纯度生产异丙醇。因此根据本发明，可以无需用于分离副生醇的复杂的步骤，简便、效率良好地生产异丙醇。

所述生产方法包括下述方法，在含有异丙醇生产细菌和来自植物的原料的混合物中培养异丙醇生产细菌，由此将来自植物的原料同化，一定时间后使用蒸馏、膜分离、提取等公知技术将在培养液中分泌得到的异丙醇进行精制的方法。

异丙醇的生产方法中的混合物只要是以在细菌类的培养中通常使用的基本培养基作为主体的混合物即可，只要是对应于异丙醇生产细菌的种类通常使用的培养基即可，可以使用任意物质。

所述基本培养基只要是含有碳源、氮源、无机离子及根据需要含有的其他微量成分的培养基即可，没有特别限定。作为碳源，可以适当使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸、甲醇、乙醇、丙三醇等醇类及其他。

作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、硝态氮、氨气、氨水、蛋白质水解物等无机及有机氮源及其他。作为无机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子、锰离子及其他。

作为有机微量成分，可以适当使用维生素、氨基酸等及含有它们的酵母提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、玉米浸渍液(Corn SteepLiquor)、酪蛋白分解物及其他。

多聚蛋白胨是将蛋白质用酶或酸水解得到的产物，其氮源例如有根据由日本制药(株)生产的多聚蛋白胨LotO586A的分析值虽然少但产生氨型氮的例子，但是可以说全部来自蛋白质。作为多聚蛋白胨的成分，可以举出相对于多聚蛋白胨的总质量，总氮量12.5质量％～14.5质量％、氨基氮5.0质量％～6.5质量％、灼烧残留物4.0质量％～7.0质量％、干燥损失3.5质量％～5.5质量％的多聚蛋白胨。在培养基中通常在0.02～2％(w/w)的范围内使用，优选在0.1～1％(w/w)的范围内使用。

玉米浸渍液是将含有在玉米的浸渍步骤中溶出的可溶性成分和在乳酸发酵中生成的成分的浸渍液进行浓缩而得到的产物，根据Microbio l.Mol.Biol.Rev.，Dec 1948；Vol.12：pp297-311.，作为成分，可以举出相对于玉米浸渍液总质量，水分45质量％～55质量％、总氮量2.7质量％～4.5质量％、氨基氮1.0质量％～1.8质量％、挥发性氮0.15质量％～0.40质量％、还原糖分0.1质量％～11.0质量％、乳酸5质量％～15质量％、灰分9质量％～10质量％、挥发性酸类0.1质量％～0.3质量％、二氧化硫0.009质量％～0.015质量％的物质。根据上述成分，作为挥发性氮，有可能最大含有0.40％(w/w)的在水中能够生成铵离子的含氮化合物，但即使假设其全部为铵离子，在含有2％玉米浸渍液的培养基中铵离子的含量也只有0.008％。玉米浸渍液在培养基中通常在0.1～20％(w/w)的范围内进行使用，优选在0.5～7％(w/w)的范围内进行使用。

公开了酵母提取物由氨基酸及其聚合物、核酸、维生素、有机酸、无机盐构成，根据BD(Becton，Dickinson and Company)公司的酵母提取物分析数据(Catalog#211929、211931、211930)，作为无机盐记载了由钙、镁、钾、钠、氯化物、硫酸、磷酸构成的盐，没有记载能够生成铵离子的化合物。作为成分，可以举出相对于酵母提取物总质量，总氮量11.4质量％、氨基氮6.9质量％、灰分13.1质量％、干燥损失1.0质量％、氯化钠0.2质量％、总无机盐10.5质量％的物质。

混合物中来自植物的原料的量根据其种类及混合物中含有的异丙醇生产细菌的活性及数量而不同，但通常按葡萄糖换算，可以使开始的糖浓度相对于混合物的总质量为20质量％以下，从细菌的耐糖性的观点考虑优选可以使开始的糖浓度为15质量％以下。其他各成分只要以在微生物的培养基中通常添加的量进行添加即可，没有特别限定。

在含有异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中，从提高异丙醇的生产率的观点考虑，优选进一步添加含有氮的化合物。所谓“进一步添加”是指以比通常培养基中含有的含量高的含量在混合物中含有在水中能够生成铵离子的含氮化合物。由此，异丙醇的生产细菌可以在含有比通常的培养条件高的浓度的除氨基酸之外的含氮化合物的培养基中被培养。将除氨基酸之外的含氮化合物加入培养基中的时间可以是开始培养前，也可以是培养过程中。

所谓在水中能够生成铵离子的含氮化合物，可以举出含有硫酸铵、硝酸铵等铵盐的无机及有机化合物、氨气、氨水。在水中能够生成铵离子的含氮化合物在细菌用的一般的培养基M9中以0.02％(w/w)的含量被含有，在其他一般的培养基MS中以0.02％(w/w)的含量被含有，但在本发明中，为了增加异丙醇的生成量，可以比所述量多地含有在水中能够生成铵离子的含氮化合物。在本发明中，从提高异丙醇的生产率的观点考虑，优选在水中能够生成铵离子的含氮化合物的添加量以氮原子的总质量％计，相对于混合物中培养开始时的培养基的总质量为0.04％～10.6％(w/w)进行添加并培养。更优选为0.04％～5.30％(w/w)，特别优选为0.04％～4.24％(w/w)。此时，液体1mL换算为1g。

另外，可以以通常使用的量含有通常被添加到微生物的培养基中的其他添加成分，例如抗生素等。需要说明的是，优选为了抑制反应时的发泡适当添加消泡剂。

作为本发明中使用的培养基，可以举出以水性介质为基本的液体培养基及以琼脂等固相为基本的固体培养基，但若从用于工业生产方面考虑优选液体培养基。作为构成液体培养基的水性介质，可以使用蒸馏水、缓冲液等通常使用的介质。

在进行本发明的培养时，培养条件没有特别限定，例如可以在需氧条件下，在pH4～9、优选pH6～8、温度20℃～50℃、优选25℃～42℃的范围内边适当控制pH与温度边培养。

作为回收在培养液中蓄积的异丙醇的方法，没有特别限定，但可以采用下述方法，例如通过离心分离等从培养液中除去菌体后，通过蒸馏或膜分离等通常的分离方法分离异丙醇。

需要说明的是，本发明的异丙醇的生产方法可以在用于生产异丙醇的培养步骤之前包括前培养步骤，所述前培养步骤用于将使用的异丙醇生产细菌制成适当的菌数或适度的活性状态。前培养步骤只要为利用对应于异丙醇生产细菌的种类的通常使用的培养条件进行的培养即可。

本发明的异丙醇的生产方法优选包括一边向含有上述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中供给气体一边培养该异丙醇生产细菌的培养步骤，和将通过上述培养生成的异丙醇从混合物中分离并回收的回收步骤。

根据所述方法，边向混合物中供给气体边培养生产细菌(通气培养)。通过所述通气培养，生产得到的异丙醇被释放到混合物中同时从混合物中蒸发，结果，可以将生成的异丙醇从混合物(培养基)中容易地分离。另外，因为生成的异丙醇从混合物中连续地分离，所以可以抑制混合物中异丙醇的浓度上升。由此，不需要特别考虑异丙醇生产细菌对异丙醇的耐性。

作为在培养步骤中供给于混合物中的气体，只要为含有氧的气体即可，可以使用氧或空气、或二者中的一方与惰性气体的混合气体。所述气体优选被除菌。

作为上述惰性气体，可以使用N₂气或稀有气体(例如，Ar、He、Ne、Kr或Xe)，其中，从操作的观点考虑，优选N₂气或Ar气，较优选N₂气。

使用混合气体时，只要不损害成为培养对象的细菌的生理活性即可，可以为任意的混合比，但为了适度抑制异丙醇生产细菌的活性，从而可以进行长时间的处理，优选使惰性气体的混合比相对于混合气体总质量为10％～90％。

另外，为了确保向混合物中通气，可以向特定混合物中投入陶瓷体等多孔物体。

向上述混合物中的气体的通气量没有特别限定，但作为气体仅使用空气时，通常为0.02vvm～2.0vvm(vvm；通气容量[mL]/液容量[mL]/时间[分钟])，从抑制对细菌的物理损伤的观点考虑，优选以0.1vvm～1.5vvm进行。

需要说明的是，优选边搅拌全部混合物边进行培养步骤。由此，可以良好地进行异丙醇生产细菌和来自植物的原料的混合，同时使被供给于混合物中的气体效率良好地遍布到全部混合物中。

可以使培养步骤从培养开始继续至混合物中的来自植物的原料被消耗，或继续至异丙醇生产细菌的活性消失。培养步骤的时间根据混合物中异丙醇生产细菌的数量及活性以及来自植物的原料的量而不同，但通常可以为1小时以上、优选为4小时以上。另一方面，通过进行来自植物的原料或异丙醇生产细菌的再投入，可以使培养时间无限制地连续进行，但从处理效率的观点考虑，通常可以为5日以下、优选为55小时以下。

在回收步骤中，回收在培养步骤中生成的、从混合物分离得到的异丙醇。作为所述回收方法，只要可以收集通过通常培养从混合物中蒸发的气体状或飞沫状的异丙醇即可。作为所述方法，可以举出收纳到通常使用的密闭容器等收集构件中等，其中，从可以只将异丙醇高纯度地回收的观点考虑，优选为包括使用于捕集异丙醇的捕集液与从混合物中分离得到的异丙醇接触的方法。

作为用于捕集异丙醇的捕集液，可以举出水或有机溶剂。作为捕集液的有机溶剂只要为可以容易地溶解异丙醇，并且具有将捕集后的捕集液在含水或非含水状态下进行蒸馏时可以与异丙醇容易地分离的沸点的溶剂即可，没有特别限定。作为所述有机溶剂，例如可以举出甲苯、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等。作为捕集液的有机溶剂可以适当地与水混合使用。

作为捕集液，优选水。由于设想的与异丙醇一起生成的挥发性杂质比异丙醇难溶于水，所以可以效率良好地将异丙醇从杂质中分离并回收。

可以使异丙醇与捕集液的接触进行足以使异丙醇溶解于捕集液的时间。异丙醇向捕集液的溶解只要为水或上述有机溶剂则不会进行很长时间，通常2小时左右即为充分。

为了促进异丙醇溶解于捕集液，优选向捕集液中直接注入从混合物中分离得到的气体状或飞沫状的异丙醇。通过所述注入发生起泡，可以促进异丙醇在捕集液中的溶解速度。

在本发明的异丙醇的生产方法中，为了进一步提高回收效率，优选包括在与捕集液接触前将从混合物中分离得到的异丙醇进行液化的液化步骤。

异丙醇的液化只要是可以将气化或飞沫化状态的异丙醇进行液化的方法即可，例如可以举出异丙醇的相变化所需要的充分程度的冷却。作为所述冷却方法，可以举出空气冷却、或使用冷却后的水或醇类的方法。

另外，可以使用吸附剂回收从混合物中分离得到的异丙醇。作为所述吸附剂，可以使用为了吸附液体或气体而通常使用的沸石或硅胶等多孔物体。

根据本异丙醇的生产方法，可以以溶解于捕集液或混合物后的状态回收异丙醇。回收得到的异丙醇可以使用HPLC等通常的检测方法进行确认。回收得到的异丙醇可以根据需要进一步进行精制。作为所述精制方法，可以举出蒸馏等。

回收得到的异丙醇为水溶液的状态时，本异丙醇的生产方法除了包括回收步骤之外还可以进一步包括脱水步骤。可以通过常用方法进行异丙醇的脱水。

图1概念地图示了可以适用本发明的异丙醇的生产方法的生产装置10之一例。边参照图1边说明本异丙醇的生产方法。

生产装置10具有培养槽12和捕集槽40，培养槽12与捕集槽40由连接管30连接。培养槽12及捕集槽40可以密闭，使内部的气氛气体不会漏到槽外部。

在培养槽12的内部收纳有含有异丙醇生产细菌B和来自植物的原料M的混合物14。混合物14的量只要以为培养槽12的容量的约一半量的量被填充即可，可以根据培养槽12的容量及生产装置10的规模进行适当调整。培养槽12只要由为了使用微生物工业生产物质而通常使用的物质构成即可，没有特别限定。另外，本生产装置10只要可以在常温常压下处理即可，但也可以为了能够根据需要进行加热加压而具有加热装置或加压装置。

在培养槽12上连接有用于从装置外部注入气体的注入管16。注入管16的一端被连接于在生产装置10的外部具有的没有图示的充气装置。注入管16的另一端在培养槽12的内部的底部周边开口。预先调整混合物14的容量，使得收纳于培养槽12的混合物14的液面在注入管16的开口部的上方。

另外在培养槽12中具有搅拌装置20，所述搅拌装置20具有设置于培养槽12的外部的电动机部22和连接于电动机部22的搅拌部24。搅拌部24采用螺旋桨叶等形状，被配置于培养槽12的底部周边。

在电动机部22上连接有没有图示的驱动控制装置，控制电动机部22的驱动使搅拌部24以规定的转速旋转。搅拌部24的转速没有特别限定，但通常为100rpm～1,000rpm，优选以200rpm～800rpm进行。

在捕集槽40的内部收纳有作为捕集液的捕集液42。在捕集槽40的上部安装有用于将捕集槽40内的气体排出到捕集槽40外部的排出管44。

连接管30的一端在培养槽12的上部开口，使得可以将培养槽12内填充的气体引导向培养槽12外部。另外连接管30的另一端向捕集槽40的底部周边延伸并开口，预先调整收纳于捕集槽40中的捕集液的液面，使其位于连接管30的开口部的上方。

需要说明的是，在连接管30中可以具有积极地冷却连接管30的内部的冷却器。由此可以在气体通过连接管30时，积极地液化气体。

接下来，说明本生产装置10的作用。

向本生产装置10的培养槽12中，注入含有异丙醇生产细菌B和来自植物的原料M的混合物14，直至混合物14的液面位于比注入管16的端部充分靠上的位置。开启搅拌装置20的电动机部22的电源，使搅拌部24以规定的转速旋转。需要说明的是，可以预先在培养槽12中收纳规定量的培养基，调整至适宜温度后，添加混合物14使其达到规定的总和量。

将规定量的混合物14收纳在培养槽12中，开启没有图示的充气装置的电源，向培养槽12中注入气体。由此，在培养槽12的内部，向混合物中注入气体，开始通气培养。

开始通气培养时，在混合物14中，异丙醇生产细菌B边同化来自植物的原料边开始生产异丙醇。生产得到的异丙醇被从菌体释放到混合物中，但其中的一部分溶解于混合物，大部分从混合物中蒸发。由此，异丙醇从混合物中分离。从混合物中分离得到的异丙醇从培养槽12上部作为通气培养的排气进入连接管30，向捕集槽40移动。

通过连接管30时，排气中的异丙醇的一部分被冷却并液化。

移动到了捕集槽40的排气中的异丙醇从在捕集槽40的底部开口的连接管30的另一端进入捕集槽40，被注入捕集液42中。此时在捕集液42中，由于注入排气发生起泡。此时异丙醇溶解于捕集液42。另一方面，由于与异丙醇一起从培养槽12移动到了捕集槽40的排气中的挥发性杂质难溶于捕集液42，所以从捕集液42中释放，通过在捕集槽40上部开口的排出管44，最终作为排气被排出到捕集槽40的外部。

边利用没有图示的采集装置采集边确认在培养槽12内产生的异丙醇的量，在可以确认到异丙醇的生产结束或降低时，或经过规定时间后，结束处理。

由于在处理结束后的捕集液42中，溶解有高浓度的异丙醇，所以可以作为高浓度异丙醇溶液回收。另外，可以回收该捕集液42，根据需要进一步分离精制异丙醇。另外，由于也有一部分异丙醇溶解于培养槽12的混合物14中，所以根据需要回收混合物14，分离精制异丙醇。

由此，通过使用本生产装置10，可以在常温常压(例如25℃、101,325Pa)下容易地分离回收使用异丙醇生产细菌生产得到的异丙醇。因此，不必设置复杂的分离步骤及精制步骤，可以使生产装置为简单的结构。

说明图1中的符号。分别如下所示，10表示本生产装置(异丙醇生产装置)、12表示培养槽(培养部)、14表示混合物、16表示注入管(气体供给部)、20表示搅拌装置(搅拌部)、30表示连接管(连接部)、40表示捕集槽(捕集部)、42表示捕集液(捕集液)、44表示排出管。

需要说明的是，本实施方案的生产装置10中设置的培养槽12、捕集槽40、连接管30等各部件、构件的形状，只要不损害预期的作用就可以适当改变。

另外，可以在本实施方案的生产装置10中设置用于将混合物14或异丙醇生产细菌连续地投入培养槽12中的投入部及排出部。由此，可以连续地生产异丙醇。

在本发明中，如上所述，可以副生醇类少、无需副生醇的分离步骤地生产被进一步精制的异丙醇。

另外，在本发明的优选实施方案中，可以连续且简便地生产被进一步精制的异丙醇。

实施例

以下，记载了本发明的实施例，但本发明不限于所述实施例。需要说明的是，记载中的“％”若没有特别说明则为质量基准。

[实施例1]

<来自梭状芽孢杆菌属细菌的异丙醇生成酶基因组表达载体及该表达载体转化体的构筑>

已经报道了梭状芽孢杆菌属细菌的四种异丙醇生成酶的氨基酸序列和基因的碱基序列。即，硫解酶被记载于在GenBank accessionnumber AE001437中记载的基因组序列的互补链3005963～3007364中。另外CoA转移酶被记载于GenBank accession number X72831中，乙酰乙酸脱羧酶被记载于GenBank accession number M55392中，并丙醇脱氢酶被记载于GenBank accession number AF157307中。进而为了使所述四种基因表达所需的启动子的碱基序列，可以使用在上述硫解酶的碱基序列中存在的硫解酶启动子的序列。

为了取得硫解酶启动子和硫解酶基因，将Clostridiumacetobutylicum ATCC824的基因组DNA用作模板，通过TTT GAATTC CAT GAT TTT AAG GGG GTT AGC ATA TGC A(序列号1)、及TTT GGT ACC CTA GCA CTT TTC TAG CAA TAT TGC TGTTCC(序列号2)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶EcoRI及KpnI进行消化，由此得到含有编码硫解酶启动子的DNA序列的约1.5kbp的硫解酶片段。

另外为了取得CoA转移酶基因，将Clostridium acetobutylicumATCC824的基因组DNA用作模板，通过TTT GGT ACC CAA CCTTAA ACC TTC ATA TTT CAA CTA CTT(序列号3)、及TTT GGATCC CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG TTC(序列号4)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶KpnI及BamHI进行消化，由此得到约1.4kbp的CoA转移酶片段。

为了取得乙酰乙酸脱羧酶基因和终止子序列，将Clostridiumacetobutylicum ATCC824的基因组DNA用作模板，通过TTT GGATCC AGC TAA ACA TTA TTA AAT TTA GGA AGG TG(序列号5)、及TTT GTC GAC CCA ATG AAC TTA GAC CCA TGG CTG(序列号6)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶BamHI及SalI进行消化，由此得到含有编码终止子的DNA序列的约880bp的乙酰乙酸脱羧酶片段。

需要说明的是，Clostridium acetobutylicum ATCC824可以从作为细胞·微生物·基因库的美国标准生物品收藏中心(American TypeCulture Collection)获得。

进而，为了取得异丙醇脱氢酶基因，将Clostridium beijerinckiiNRRL B-593的基因组DNA用作模板，通过TTT GGT ACC GCGAAA TAG CGA TGA ACA GGC AG(序列号7)、及TTT GGT ACCGCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(序列号8)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶KpnI进行消化，由此得到约1.4kbp的异丙醇脱氢酶片段。

需要说明的是，Clostridium beijerinckii NRRL B-593可以从作为细胞·微生物库的VTT生物品收藏中心(Culture Collection)获得。

将上述四个DNA片段、和用限制酶EcoRI及SalI消化质粒pUC19所得的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的、表面涂布有40mg/mL的X-gal和20％IPTG各40μL的LB Broth，Miller培养液(Difco244620)琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pIPA。

将所述质粒pIPA转化到大肠杆菌B株(ATCC11303)感受态细胞中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller培养液琼脂板上，于37℃下培养一夜，由此得到异丙醇生成酶基因组表达载体转化体pIPA/B株。

需要说明的是，大肠杆菌B株(ATCC11303)可以从作为细胞·微生物·基因库的美国标准生物品收藏中心获得。

[实施例2]

<利用大肠杆菌pIPA/B株、大肠杆菌B野生株生产异丙醇>

作为前培养，在14mL容量的塑料管(FALCON公司制2057)中加入5mL含有0.1g/L氨苄青霉素、2g/L葡萄糖的LB Broth，Miller培养液，接种在实施例1中得到的大肠杆菌pIPA/B株，在培养温度37℃、120rpm的条件下振荡培养一夜。另外除不含氨苄青霉素之外在相同的培养基组成及培养条件下振荡培养大肠杆菌B野生株。将全部量的各前培养液移至300mL容积的锥形瓶中，所述锥形瓶中加入了60mL含有0.1g/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的LB Broth，Miller培养液，进行培养。在搅拌速度120rpm、培养温度37℃下进行培养。培养开始48小时后对菌体培养液取样，通过离心操作除去菌体后，通过HPLC按照常用方法测定所得的培养上清液中的异丙醇、丁醇、乙醇、丙酮的蓄积量。结果示于表1。在大肠杆菌pIPA/B株中，在培养48小时后确认了蓄积有2.1g/L的异丙醇。此时丁醇及乙醇没有蓄积。

[表1]HPLC测定结果

[实施例3]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pIPA/B株生产异丙醇(1)>

在本实施例中，使用图1所示的生产装置10进行处理。培养槽12使用1升容积的槽，捕集槽40使用500mL容积的槽。培养槽12、捕集槽40、注入管16、连接管30、排出管44均为玻璃制。在捕集槽40中，以400mL的量注入作为捕集液42的水(捕集水)。

作为前培养，在试验管中加入4mL含有0.1g/L氨苄青霉素、2g/L葡萄糖的LB Broth，Miller培养液，接种在实施例1中得到的大肠杆菌pIPA/B株，在培养温度37℃、120rpm的条件下搅拌培养18小时。将全部量的前培养液接种到1L培养槽中进行培养，所述培养槽中加入了500mL含有0.1g/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LB Broth，Miller培养液。在搅拌速度500rpm、培养温度37℃下进行培养，使用12.5％氨溶液将培养液的pH控制为7.0。另外，在从培养开始的第25小时添加20mL浓度为0.5g/mL的葡萄糖。从培养开始48小时后对菌体培养液进行取样，通过离心操作除去菌体后，通过HPLC按照常用方法测定所得的培养上清液中的异丙醇、丁醇、乙醇、丙酮的蓄积量。结果示于表2。在大肠杆菌pIPA/B株中，在培养48小时后确认了蓄积有3.0g/L的异丙醇。此时丁醇及乙醇没有蓄积。需要说明的是，表2中的各测定值为培养后的培养液与捕集水(400mL)中的合计值。

[表2]HPIC测定结果

[实施例4]

<来自大肠杆菌的硫解酶基因、来自大肠杆菌的CoA转移酶基因、来自梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭状芽孢杆菌属细菌的异丙醇脱氢酶基因表达载体及该表达载体转化体的构筑>

已经报道了大肠杆菌的硫解酶及大肠杆菌的CoA转移酶的氨基酸序列和基因的碱基序列。即，编码硫解酶的基因记载于在GenBankaccession number U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2324131～2325315中。另外编码CoA转移酶的基因记载于上述大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322781中。使它们与实施例1记载的来自梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、异丙醇脱氢酶基因一同表达，由此可以生产异丙醇。作为使上述基因组表达所必需的启动子的碱基序列，可以使用在GenBankaccession number X02662的碱基序列信息中，记载于397-440中的来自大肠杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子序列。

为了取得GAPDH启动子，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，通过CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号9)及CGCGCGCATGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号10)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶NdeI、SphI进行消化，由此得到约110bp的对应于GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段、和用限制酶NdeI及SphI消化质粒pBR322(GenBank accession numberJ01749)而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pBRgapP。

为了取得异丙醇脱氢酶基因，将Clostridium beijerinckii NRRLB-593的基因组DNA用作模板，通过AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(序列号11)、及GCGGATCCGGTACCTTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC(序列号12)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶SphI、BamHI进行消化，由此得到约1.1kbp的异丙醇脱氢酶片段。将所得到的DNA片段、与用限制酶SphI及BamHI消化之前制备的质粒pBRgapP而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh。

为了取得来自大肠杆菌的硫解酶基因，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，根据ATGGATCCGCTGGTGGAACATATGAAAAATTGTGTCATCGTCAG(序列号13)、及GCAGAAGCTTGTCTAGATTAATTCAACCGTTCAATCACCATC(序列号14)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶BamHI、HindIII进行消化，由此得到约1.2kbp的硫解酶片段。将得到的DNA片段、与用限制酶BamHI及HindIII消化之前制备的质粒pGAP-IPAdh而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-atoB。

为了取得来自大肠杆菌的CoA转移酶基因，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，根据GCTCTAGAGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAATTGATGACATTACAAGAC(序列号15)、及TAGCAAGCTTCTACTCGAGTTATTTGCTCTCCTGTGAAACG(序列号16)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶XbaI、HindIII进行消化，由此得到约600bp的CoA转移酶α亚基片段。将得到的DNA片段、与用限制酶XbaI及HindIII消化之前制备的质粒pGAP-IPAdh-atoB而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD。

进而将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，通过AAGTCTCGAGCTGGTGGAACATATGGATGCGAAACAACGTATTG(序列号17)、及GGCCAAGCTTCATAAATCACCCCGTTGC(序列号18)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶XhoI、HindIII进行消化，由此得到约600bp的CoA转移酶β亚基片段。将得到的DNA片段与用限制酶XhoI及HindIII消化之前制备的质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA。

为了取得乙酰乙酸脱羧酶基因，将Clostridium acetobutylicumATCC824的基因组DNA用作模板，根据CAGGTACCGCTGGTGGAACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAGC(序列号19)、及GCGGATCCTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGC(序列号20)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶KpnI、BamHI进行消化，由此得到约700bp的乙酰乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段、与用限制酶KpnI及BamHI消化之前制备的质粒pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA而得到的片段进行混合，用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pGAP-Iaaa。

将所述质粒pGAP-Iaaa转化到大肠杆菌B株(ATCC11303)感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂板上于37℃下培养一夜，由此得到大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株。

需要说明的是，大肠杆菌MG1655株、Clostridium acetobutylicumATCC824、大肠杆菌B株可以从作为细胞·微生物·基因库的美国标准生物品收藏中心获得。

[实施例5]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(1)>

与实施例3同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。其中，作为前培养，使用加入到锥形瓶中的25mL含有0.1g/L氨苄青霉素的LB Broth，Miller培养液，接种在实施例4中得到的大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株，在培养温度35℃、120rpm下搅拌培养16小时。将全部量的前培养液接种到1L培养槽中进行培养，所述培养槽中加入了475mL含有50g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LB Broth，Miller培养液。在搅拌速度500rpm、培养温度35℃下进行培养，使用24wt/wt％氢氧化钠溶液将培养液的pH控制为7.0。从培养开始24小时后对菌体培养液进行取样，通过离心操作除去菌体后，通过HPLC按照常用方法测定所得的培养上清液中的异丙醇、丁醇、乙醇的蓄积量。在培养24小时后确认了蓄积有5.5g/L的异丙醇。此时丁醇及乙醇没有蓄积。另外48小时后的异丙醇的蓄积量为5.0g/L。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(改变为500mL)中的合计值。

[实施例6]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(2)>

与实施例5同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。但是，在1L培养槽中的培养使用475mL在表3中所示的组成的培养基。此时来自硫酸铵的氮原子的质量％相对于培养开始时的培养基总质量为0.04质量％。另外以10g/L/小时的流速添加50wt/wt％的葡萄糖水溶液。结果，在培养24小时后确认了蓄积有7.4g/L的异丙醇。此时没有蓄积丁醇及乙醇。另外48小时后的异丙醇的蓄积量为6.2g/L。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(500mL)中的合计值。

[表3]培养基组成

(剩余：水)

[实施例7]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(3)>

与实施例6同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。但是，在1L培养槽中的培养在30小时后追加0.2质量％(2g/L)(NH₄)₂SO₄。本实施例中的来自硫酸铵的氮原子的质量％的总和相对于培养开始时的培养基总质量为0.08质量％。结果，在培养24小时后确认了蓄积有7.2g/L的异丙醇。此时没有蓄积丁醇及乙醇。另外48小时后的异丙醇的蓄积量为13.4g/L。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(500mL)中的合计值。表明通过加入适量的硫酸铵这样的氮源而提高了生产率。

[实施例8]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(4)>

与实施例6同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。但是，在1L培养槽中的培养中的培养基组成内，使(NH₄)₂SO₄的量为0.4质量％(4g/L)。本实施例中的来自硫酸铵的氮原子的质量％相对于培养开始时的培养基总质量为0.08质量％。结果，培养24小时后确认了蓄积有11.6g/L的异丙醇。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(500mL)中的合计值。表明通过加入适量硫酸铵这样的氮源生产速度提高。

[实施例9]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(5)>

与实施例6同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。但是，在1L培养槽中的培养中的培养基组成内，使(NH₄)₂SO₄的量为0.5质量％(5g/L)。本实施例中的来自硫酸铵的氮原子的质量％相对于培养开始时的培养基总质量为0.11质量％。结果，培养24小时后确认了蓄积有11.2g/L的异丙醇。另外在55小时后确认了蓄积有21.3g/L的异丙醇。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(500mL)中的合计值。

[实施例10]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(6)>

与实施例6同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。但是，pH调节剂使用12.5质量％的氨水。结果，培养24小时后确认了蓄积有13.3g/L的异丙醇。另外55小时后确认了蓄积有28.4g/L的异丙醇。至培养55小时后添加的12.5质量％氨水的质量为69.0g，本实施例中的来自氨水的氮原子的质量％总和相对于培养开始时的培养基总质量为0.73质量％。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(500mL)中的合计值。

[实施例11]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株生产异丙醇(7)>

与实施例6同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产研究。但是，在1L培养槽中的培养中的培养基组成内，加入20g/L玉米浸渍液(日本食品化工制)代替2g/L多聚蛋白胨，使(NH₄)₂SO₄的量为5g/L。结果，培养24小时后确认了蓄积有10.9g/L的异丙醇。另外在55小时后确认了蓄积有17.8g/L的异丙醇。本实施例中的来自硫酸铵的氮原子的质量％的总和相对于培养开始时的培养基总质量为0.11质量％。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与捕集水(500mL)中的合计值。表明作为培养基营养源可以利用广泛的成分。

[实施例12]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pIPA/B株生产异丙醇(2)>

在与实施例3相同的条件下，进行使用1L培养槽的pIPA/B株的异丙醇培养研究。但是，培养开始时添加0.5％(5g/L)的(NH₄)₂SO₄。本实施例中的来自硫酸铵的氮原子的质量％相对于培养开始时的培养基总质量为0.11质量％。结果，培养48小时后确认了蓄积有4.5g/L的异丙醇。

[实施例13]

<利用蒸馏法从培养液中回收异丙醇>

作为供蒸馏的培养液，基于实施例3的方法培养pIPA/B株，得到180g培养液。将其作为培养液A。将178.6g培养液A放入200mL容量的茄形瓶中，在油浴下边搅拌边加热，按照常用方法进行简单蒸馏。培养液A的各步骤中的塔顶温度和液量示于表4。通过HPLC按照常用方法测定蒸馏前的培养液和通过蒸馏分离得到的液体及残液中含有的异丙醇、丁醇、乙醇的含量。结果示于表5。可以从本实施例中的培养pIPA/B株后的培养液中，在塔顶温度99.1～99.5℃下回收基本全部量的所含有的异丙醇。此时，从分离得到的溶液中未检测到丁醇及乙醇。

[比较例1]

模拟在日本特开昭61-67493号公报中记载的Clostridium·sp.172CY-02株的培养液组成，制备180g培养液，所述培养液在LBBroth，Miller培养液中加入了9.9g/L正丁醇、0.6g/L乙醇、7.2g/L异丙醇，将其作为比较培养液B。将177.9g比较培养液B加入200mL容量的茄形瓶中，在油浴下边搅拌边加热，按照常用方法进行简单蒸馏。在比较培养液B的各步骤中的塔顶温度和液量示于表4。通过HPLC按照常用方法测定在蒸馏前的溶液和通过蒸馏分离得到的液体及残液中含有的异丙醇、丁醇、乙醇的含量。结果示于表5。在比较培养液B中，三种混合醇成分中特别是异丙醇和丁醇显示出相同的馏出行为，不能单独分离并回收异丙醇。

从实施例13和比较例1的结果可知，由于本发明中的培养液不含除异丙醇之外的副生醇类所以可以容易地回收异丙醇。因此，可以从本发明的培养液中以简单蒸馏等简易的精制过程回收异丙醇。

另一方面，可知在利用现有菌的培养液中，难以分离异丙醇和副生醇类，不能容易地回收异丙醇。认为为了从利用现有菌的培养液中回收异丙醇，需要进行附加有精馏塔等设备的蒸馏，因而推测精制过程变得复杂。

由上述内容可以说明本发明的异丙醇生产细菌在来自植物的异丙醇生产的实用化方面显著优于现有技术。

[表4]培养液A和比较培养液B的塔顶温度和液量

[表5]HPLC测定结果

[实施例14]<试验例>

在本实施例中，使用图1所示的生产装置10进行处理。培养槽12使用1升容积的槽，捕集槽40使用500mL容积的槽。培养槽12、捕集槽40、注入管16、连接管30、排出管44均为玻璃制。向捕集槽40中，以400mL的量注入作为捕集液42的水(捕集水)。

将10g/L的异丙醇水溶液作为处理液注入500mL培养槽12中。在搅拌速度500rpm、处理温度37℃下进行处理。

然后，从注入管16以0.5L/min(1vvm)的速度向异丙醇水溶液中注入空气，开始处理。来自培养槽12的排气使捕集槽40中的捕集液42起泡。来自捕集槽40的排气释放到装置体系外的空气中。在处理开始0、2、4、8、24小时后对培养槽12内的处理液和捕集槽40内的捕集液42分别取样，通过HPLC测定来测定样品中异丙醇的蓄积量。需要说明的是，使用信和化工公司制、ULTRON PS-80H(8.0mm ID、300mm L)，作为洗脱液使用0.1％HClO₄，使流速为1.0mL/min、柱温为50℃，检测器使用示差折光率检测器(RI)，进行HPLC测定。结果示于表6。

[表6]

如表6所示，培养槽12内的异丙醇的浓度随时间减少，捕集液42中的异丙醇浓度慢慢增加。可知在经过24小时后的时间点培养槽内的异丙醇的70％由培养槽向水瓶移动。另外，此时的总异丙醇量为10.1g且物料平衡也基本一致。

因此，可知通过使培养槽12内的通气培养的排气在捕集槽40内的捕集液42中起泡，可以将处理液中的异丙醇从处理液中分离，使其溶解于捕集液42中。

[实施例15]

<异丙醇的生产>

在本实施例中，使用与实施例3中使用的装置相同的生产装置10生产异丙醇。需要说明的是，在捕集槽40中，以400mL的量注入作为捕集液42的水(捕集水)。

作为前培养，在φ19mm×长度175mm的试验管中，加入4mL含有0.1g/L氨苄青霉素和2g/L葡萄糖的LB Broth，Miller培养液，接种在实施例1中得到的pIPA/B株，在培养温度37℃、120rpm下振荡培养18小时。

在含有500mL LB Broth，Miller培养液的培养槽12中接种4ml前培养液，开始培养，所述LB Broth，Miller培养液含有0.1g/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖和1滴ADEKANOL。在搅拌速度500rpm、培养温度37℃下进行培养，使用12.5％氨水将培养液的pH调整为7.0。

然后，从注入管16以0.5L/min(1vvm)的速度将空气注入培养液中，开始通气培养。来自培养槽12的排气使捕集槽40中的捕集液42起泡。

在从开始培养经23小时后的时间点，向培养槽内中添加20mL0.5g/L的葡萄糖溶液。

<样品中的异丙醇的检测>

从培养开始0、7、23、30、47及52小时后，对培养槽12中的处理后的培养液和捕集槽40中的处理后的捕集液42进行取样。对取样得到的培养液进行离心操作，由此除去培养液中的菌体等固形物。

分别通过HPLC测定取样得到的培养液及水中的、异丙醇的蓄积量。结果示于表7。

进而，关于培养开始47小时后的培养液及捕集水，分别将培养液的HPLC测定时检测得到的峰的数量、Rt时间(Retention time；保留时间)及化合物名示于表8，将捕集水的上述项目示于表9。

需要说明的是，在表8及表9中“IPA”表示异丙醇。另外，在表8中，表示为“不明”的物质，推测为通过异丙醇的通气培养生成的杂质。

[表7]

培养时间(小时)	培养液中(g/L)	水中(g/L)
			0	0.0	0.0
7	0.0	0.0
			23	0.8	0.3
30	1.3	0.7
			47	1.4	1.7
52	1.0	2.0

[表8]

[表9]

如表7～表9所示，确认了使用异丙醇生产细菌生产得到的异丙醇，通过通气培养被蓄积在培养液和捕集水中。

另外，对于从培养开始47小时后的培养液，确认了葡萄糖和乙酸，除此之外确认了被推测为杂质的11个峰，但对于此时的捕集水，没有除对应于异丙醇的峰之外的峰。因此，可知根据本生产方法，通过使来自培养槽12的排气在捕集液42中起泡，可以容易地分离杂质和异丙醇。

由此，从培养开始至异丙醇的回收，可以操作简便、效率良好地回收异丙醇。进而可知可以在异丙醇的回收中使用水，由此得到没有杂质的异丙醇水溶液。由此，在利用微生物培养的异丙醇生产的实用化中，可以说本发明是可以进行精制步骤负荷少的生产过程构筑的划时代的方法。

[比较例2]

<硫解酶基因缺失pIPA质粒的构筑及该质粒转化体的构筑>

制作了从实施例1中记载的质粒pIPA中除去了硫解酶基因的质粒pIPAΔthio。

为了从pIPA中分离硫解酶启动子，将pIPA用作模板，通过TTTGAA TTC CAT GAT TTT AAG GGG GTT AGC ATA TGC A(序列号21)、及TTT TCT AGA TCT AAC TAA CCT CCT AAA TTT TGA TACGGG(序列号22)按照PCR法进行扩增，将得到的片段用限制酶EcoRI和KpnI进行消化，由此得到约240bp的硫解酶启动子片段。

进而为了从pIPA中分离异丙醇脱氢酶基因，将pIPA用作模板通过TTT CTC GAG GCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(序列号23)、及TTT GGT ACC GCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(序列号24)按照PCR法进行扩增，将得到的片段用限制酶EcoRI和XbaI进行消化，得到约1.4kbp的异丙醇脱氢酶基因片段。

将上述两个DNA片段、与用限制酶EcoRI及KpnI消化质粒pIPA而得到的4.9kbp的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pIPAΔthio。根据常用方法确定pIPAΔthio的碱基序列，确认硫解酶启动子和异丙醇脱氢酶基因的DNA序列无误。

将所述质粒pIPAΔthio转化到大肠杆菌B株(ATCC11303)感受态细胞中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller培养液琼脂板上于37℃下培养一夜，由此得到转化体pIPAΔthio/B株。

<使用1L培养槽由大肠杆菌pIPAΔthio/B株生产异丙醇>

与实施例3同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产试验。作为前培养，在试验管中加入4mL的LB Broth，Miller培养液，所述LBBroth，Miller培养液含有0.1g/L氨苄青霉素、2g/L葡萄糖，接种大肠杆菌pIPAΔthio/B株，在培养温度37℃、120rpm下搅拌培养18小时。将全部量的前培养液接种到1L培养槽中进行培养，所述培养槽加入了500mL含有20g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LB Broth，Miller培养液。在搅拌速度500rpm、培养温度37℃下进行培养，使用12.5％氨溶液控制培养液的pH为7.0。另外，从培养开始至第72小时添加20mL浓度为0.5g/mL的葡萄糖。从培养开始经时地对菌体培养液进行取样，通过离心操作除去菌体后，通过HPLC按照常用方法测定所得的培养上清液中的异丙醇的蓄积量。结果示于表10。需要说明的是，表10中的异丙醇量为培养后的培养液和捕集水中的合计值。

由于在大肠杆菌pIPAΔthio/B株中导入了乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶及CoA转移酶的各基因，但没有导入硫解酶基因，所以所述酶的活性来自其本身。但是，大肠杆菌pIPAΔthio/B株即使在培养72小时后也没有异丙醇的蓄积。

[表10]HPLC测定结果

[比较例3]

<硫解酶基因及CoA转移酶缺失pIPA质粒的构筑及该质粒转化体的构筑>

制作了由实施例1中记载的质粒pIPA中除去了硫解酶基因和CoA转移酶的质粒pIPAΔthioΔctfAB。

将pIPAΔthio用限制酶KpnI及BamHI进行消化，使用DNABlunting Kit(TaKaRa BIO株式会社)使DNA的末端平滑化进行连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pIPAΔthioΔctfAB。

将所述质粒pIPAΔthioΔctfAB转化到大肠杆菌B株(ATCC11303)感受态细胞中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller培养液(Difco244620)琼脂板上于37℃下培养一夜，由此得到转化体pIPAΔthioΔctfAB/B株。

<使用1L培养槽由大肠杆菌pIPAΔthioΔctfAB/B株生产异丙醇>

与实施例3同样地进行使用1L培养槽的异丙醇生产试验。作为前培养，在试验管中加入4mL的LB Broth，Miller培养液接种大肠杆菌pIPAΔthioΔctfAB/B株，所述LB Broth，Miller培养液中含有0.1g/L氨苄青霉素、2g/L葡萄糖，在培养温度37℃、120rpm下培养18小时。将全部量的前培养液接种到1L培养槽中进行培养，所述培养槽加入了500mL含有20g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LB Broth，Miller培养液。在搅拌速度500rpm、培养温度37℃下进行培养，使用12.5％氨溶液控制培养液的pH为7.0。另外，从培养开始至第72小时添加20mL浓度为0.5g/mL的葡萄糖。

从培养开始经时地对菌体培养液进行取样，通过离心操作除去菌体后，通过HPLC按照常用方法测定所得的培养上清液中的异丙醇的蓄积量。结果示于表11。需要说明的是，表11中的异丙醇量为培养后的培养液和捕集水中的合计值。

由于在大肠杆菌pIPAΔthioΔctfAB/B株中导入乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶的基因，但没有导入硫解酶基因及CoA转移酶基因，所以所述酶活性来自其本身。但是，大肠杆菌pIPAΔthioΔctfAB/B株在培养72小时后没有异丙醇的蓄积。

[表11]

HPLC测定结果

由实施例1、2、3和比较例2及3的结果可知，根据本发明得到的大肠杆菌不仅要赋予乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶活性，还必须赋予由原本在大肠杆菌的基因组中存在的硫解酶基因及CoA转移酶基因所编码的所述酶的活性，否则不能生产异丙醇。

[实施例16]

<使用glyA启动子构筑来自大肠杆菌的硫解酶基因、来自大肠杆菌的CoA转移酶基因、来自梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭状芽孢杆菌属细菌的异丙醇脱氢酶基因表达载体及该表达载体转化体>

使用来自大肠杆菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)启动子代替实施例4的GAPDH启动子。

已知报道了大肠杆菌的丝氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列和基因的碱基序列。即，编码丝氨酸羟甲基转移酶的基因记载于GenBankaccession number V00283中。使用该启动子，可以使异丙醇的生产中必需的基因组表达。

为了取得glyA启动子，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，通过TCGACCGGCTCCAGTTCG(序列号25)、及CTGTCGCATGCTGACTCAGCTAACAATAAAATTTTTGG(序列号26)按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶SphI进行消化，由此得到约850bp的对应于glyA启动子的DNA片段。将得到的DNA片段和将质粒pBR322(GenBank accession number J01749)用限制酶NdeI处理后通过T4DNA聚合酶处理进行平滑末端化进而用SphI进行消化而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pBRglyP。

以下，与实施例4同样地操作，依次导入分别编码硫解酶、CoA转移酶、异丙醇脱氢酶、乙酰乙酸脱羧酶的基因，回收质粒pGly-Iaaa。

将所述质粒pGly-Iaaa转化到大肠杆菌B株(ATCC 11303)感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂板中于37℃下培养一夜，由此得到大肠杆菌pGly-Iaaa/B株。

[实施例17]

<使用gadA启动子构筑来自大肠杆菌的硫解酶基因、来自大肠杆菌的CoA转移酶基因、来自梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶基因、来自梭状芽孢杆菌属细菌的异丙醇脱氢酶基因表达载体及该表达载体转化体>

使用来自大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶A基因(gadA)启动子代替实施例4的GAPDH启动子。

已知报道了大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶A的氨基酸序列和基因的碱基序列。即，编码谷氨酸脱羧酶A的基因记载于GenBank accessionnumber M84024中。可以使用所述启动子，使异丙醇的生产中必需的基因组表达。

为了取得gadA启动子，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA用作模板，通过CGACTCGCATATGTCGTTTTTCTGCTTAGG(序列号27)、及CAGTCGCATGCTTCGAACTCCTTAAATTTATTTGAAGGC(序列号28)，按照PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制酶NdeI、SphI进行消化，由此得到约130bp的对应于gadA启动子的DNA片段。将得到的DNA片段、和用限制酶NdeI及SphI消化质粒pBR322(GenBank accession number J01749)而得到的片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pBRgadP。

以下，与实施例4同样地操作，依次导入分别编码硫解酶、CoA转移酶、异丙醇脱氢酶、乙酰乙酸脱羧酶的基因，回收质粒pGad-Iaaa。

将所述质粒pGad-Iaaa转化到大肠杆菌B株(ATCC11303)感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂板上于37℃下培养一夜，由此得到大肠杆菌pGad-Iaaa/B株。

[实施例18]

<使用1L培养槽由大肠杆菌pGly-Iaaa/B株及pGad-Iaaa/B株生产异丙醇>

与实施例5同样地进行使用1L培养槽利用大肠杆菌pGly-Iaaa/B株及pGad-Iaaa的异丙醇生产研究。结果，培养24小时后确认了pGly-Iaaa/B株蓄积有3.1g/L异丙醇，pGad-Iaaa/B株蓄积有2.6g/L异丙醇。需要说明的是，测定值为培养后的培养液和捕集水(500mL)中的合计值。

[实施例19]

<在通气量1vvm或2vvm下培养pGAP-Iaaa/B株时的异丙醇的生产率>

在本实施例中，使用2台除捕集槽的容量之外与在实施例5中使用的装置相同的生产装置10，生产异丙醇。需要说明的是，各捕集槽40的容量为2000mL，以2000mL的量注入作为捕集液42的水(捕集水)。

作为前培养，使用加入到锥形瓶中的含有0.1g/L氨苄青霉素的LB Broth，Miller培养液25mL，接种在实施例4中得到的大肠杆菌pGAP-Iaaa/B株，在培养温度35℃、120rpm下搅拌培养16小时。将全部量的前培养液接种到1L培养槽中进行培养，所述培养槽中加入了475mL含有50g/L葡萄糖、1滴ADEKANOL的LB Broth，Miller培养液。在搅拌速度500rpm、培养温度35℃下进行培养，使用NaOH将培养液的pH调整为7.0。

然后，在第一台生产装置中，从注入管16向培养液中注入空气，使空气为1vvm，开始通气培养。在第二台生产装置中，使用2根注入管16，向培养液中注入空气和氮气各1vvm、总通气量为2vvm，开始通气培养。来自培养槽12的排气使捕集槽40中的捕集液42起泡。

结果，培养24小时后，确认了通气量为1vvm时蓄积有5.5g/L的异丙醇，通气量为2vvm时蓄积有3.3g/L的异丙醇。需要说明的是，测定值为培养后的培养液和捕集水中的合计值。捕集水中的异丙醇量是使水中的异丙醇浓度乘以4，换算为相当于培养液量而算出的。

[实施例20]

<在通气量1vvm或0.75vvm下培养pIPA/B株时的异丙醇的生产率>

与实施例3同样地进行pIPA/B株的培养研究。但是，使葡萄糖为40g/L，pH调节剂使用氨水。需要说明的是，各捕集槽40的容量为500mL，以500mL的量注入作为捕集液42的水(捕集水)。气体使用空气，使通气量为1vvm或0.75vvm。结果，培养54小时后，确认了通气量为1vvm时蓄积有2.8g/L的异丙醇，通气量为0.75vvm时蓄积有2.8g/L的异丙醇。需要说明的是，测定值为培养后的培养液和捕集水中的合计值。

由实施例19和实施例20的结果，本申请发明人等发现存在适于异丙醇的生产的通气量。发现注入培养槽中的总通气量与2vvm相比为0.75～1vvm时更适于异丙醇的生产。

综上所述，根据本发明的实施方案，可以通过副生醇类少、无需副生醇的分离步骤仅进行简单的精制、即可简便且效率良好地生产进一步精制得到的异丙醇。

由本发明得到的异丙醇可以用于各种用途，例如可以优选用作丙烯的制备原料。

日本申请号2007-181571公开的全部内容通过参照被引入本说明书中。

对于本说明书中记载的全部的文献、专利申请及技术标准来说，各文献、专利申请及技术标准通过参照被引入本说明书中与具体且分别记载的情况同等程度地通过参照被引入本说明书中。

序列表

<110>三井化学株式会社

<120>异丙醇生产细菌及使用其的异丙醇生产方法

<130>MT-F03054-00

<150>JP2007-181571

<151>200707-11

<160>28

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>1

tttgaattcc atgattttaa gggggttagc atatgca    37

<210>2

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>2

tttggtaccc tagcactttt ctagcaatat tgctgtt cc    39

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>3

tttggtaccc aaccttaaac cttcatattt caactactt    39

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>4

tttggatccc taaacagcca tgggtctaag ttc    33

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>5

tttggatcca gctaaacatt attaaattta ggaaggtg    38

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>6

tttgtcgacc caatgaactt agacccatgg ctg    33

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>7

tttggtaccg cgaaatagcg atgaacaggc ag    32

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>8

tttggtaccg cagattttgc tactcttgga gc    32

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物DNA

<400>9

cgagctacat atgcaatgat tgacacgatt ccg    33

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>10

cgcgcgcatg ctatttgtta gtgaataaaa gg    32

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>入工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>11

aatatgcatg ctggtggaac atatgaaagg ttttgcaatg ctagg 45

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DNA

<400>12

gcggatccgg taccttataa tataactact gctttaatta agtc    44

<210>13

<211>44

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>13

atggatccgc tggtggaaca tatgaaaaat tgtgtcatcg tcag    44

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>14

gcagaagctt gtctagatta attcaaccgt tcaatcacca tc    42

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>15

gctctagagc tggtggaaca tatgaaaaca aaattgatga cattacaaga c    51

<210>16

<211>41

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>16

tagcaagctt ctactcgagt tatttgctct cctgtgaaac g    41

<210>17

<211>44

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>17

aagtctcgag ctggtggaac atatggatgc gaaacaacgt attg    44

<210>18

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>18

ggccaagctt cataaatcac cccgttgc    28

<210>19

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>19

caggtaccgc tggtggaaca tatgttaaag gatgaagtaa ttaaacaaat tagc    54

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>20

gcggatcctt acttaagata atcatatata acttcagc    38

<210>21

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>21

tttgaattcc atgattttaa gggggttagc atatgca    37

<210>22

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>22

ttttctagat ctaactaacc tcctaaattt tgatacggg    39

<210>23

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>23

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<210>24

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>24

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<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>25

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<210>26

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>26

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<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>27

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<210>28

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>28

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Claims (18)

1、一种异丙醇生成细菌，所述异丙醇生成细菌被赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性，可以由来自植物的原料生成异丙醇。

2、如权利要求1所述的细菌，所述乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性是分别通过导入编码来自下述细菌的各酶的基因而得到的，所述细菌是选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少一种。

3、如权利要求1所述的细菌，所述乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性是通过导入编码来自梭状芽孢杆菌属细菌的酶的基因而得到的，所述CoA转移酶活性及硫解酶活性是通过导入编码来自埃希氏菌属细菌的酶的基因而得到的。

4、如权利要求1所述的细菌，所述乙酰乙酸脱羧酶活性是通过导入编码来自丙酮丁醇梭菌的酶的基因而得到的，所述异丙醇脱氢酶活性是通过导入编码来自拜氏梭菌的酶的基因而得到的，所述CoA转移酶活性及硫解酶活性是通过导入编码来自大肠杆菌的酶的基因而得到的。

5、如权利要求1所述的细菌，所述乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性是分别通过导入编码来自梭状芽孢杆菌属细菌的各酶的基因而得到的。

6、如权利要求1所述的细菌，所述细菌为大肠杆菌，即Escherichia coli。

7、一种异丙醇生产方法，所述方法包括使用权利要求1～6中所述的异丙醇生成细菌，由来自植物的原料生产异丙醇。

8、如权利要求7所述的异丙醇生产方法，其中，在含有所述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中，进一步添加含有氮的化合物。

9、如权利要求7所述的异丙醇生产方法，其中，在含有所述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中添加在水中能够生成铵离子的含氮化合物，含氮化合物的添加量以氮原子的总质量％计，相对于混合物中培养开始时的培养基的总质量为0.04％～10.6％(w/w)。

10、如权利要求7所述的异丙醇的生产方法，所述方法包括一边向含有所述异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物中供给气体一边培养所述异丙醇生产细菌的培养步骤，和回收通过所述培养生成的异丙醇的回收步骤。

11、如权利要求10所述的异丙醇的生产方法，所述气体为含氧的气体。

12、如权利要求10所述的异丙醇的生产方法，其中，所述气体的供给量为0.02vvm～2.0vvm。

13、如权利要求10所述的异丙醇的生产方法，所述气体的供给量为0.1vvm～1.5vvm。

14、如权利要求10所述的异丙醇的生产方法，所述回收步骤包括使从在所述培养步骤中得到的培养物中蒸发的异丙醇与用于捕集异丙醇的捕集液接触。

15、如权利要求10所述的异丙醇的生产方法，所述回收步骤包括使所述蒸发的异丙醇液化，然后与所述捕集液接触。

16、一种异丙醇生产装置，所述装置具有

培养部，所述培养部收纳含有权利要求1～6中所述的异丙醇生产细菌及来自植物的原料的混合物，和

气体供给部，所述气体供给部与所述培养部连接的同时在所述培养部中收纳的混合物中的位置处开口，向所述混合物中供给气体，和

捕集部，所述捕集部收纳捕集异丙醇的捕集液，和

连接部，所述连接部连接所述培养部和所述捕集部，同时可以将在所述培养部内蒸发的异丙醇移动至所述捕集部。

17、如权利要求16所述的异丙醇生产装置，所述连接部为将在所述培养部内蒸发的异丙醇液化并供给于所述捕集部的液化部。

18、如权利要求16所述的异丙醇生产装置，所述装置进一步具有搅拌在所述培养部内收纳的所述混合物的搅拌部。

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