KR102273179B1 - 클로스트리디움 속 신균주 awrp 및 이를 이용한 바이오 알코올의 선택적 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 속 신균주 AWRP 및 이를 이용한 합성 가스에서 바이오 알코올의 선택적 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주는 배양기간 동안 아세트산 축적으로 인한 세포 생장 저해가 일어나지 않고, 고농도의 바이오 에탄올의 생산이 가능하다.
따라서, 본 발명의 클로스트리디움 속 신균주 AWRP를 이용하여 합성 가스로부터 바이오 에탄올을 선택적으로 생산하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

클로스트리디움 속 신균주 AWRP 및 이를 이용한 바이오 알코올의 선택적 생산방법{Novel Strain of Clostridium sp. AWRP and Method for Selectively Producing Bio-alcohol Using the Same}

본 발명은 클로스트리디움 속 신균주 AWRP 및 이를 이용한 바이오 알코올의 선택적 생산방법에 관한 것이다.

지구 온난화는 이미 파리 협약의 21차 당사국 총회에서 채택되어 제안된 바와 같이 인류의 지속 가능성에 큰 위협이 되는 현실적인 문제이다. 한편, 화석 연료 사용으로 인한 이산화탄소 배출은 지구 온난화의 주요 원인이며, 재생 가능한 폐자원을 활용하여 부가가치가 높은 화학 물질의 생산으로 전환하는 공정 개발이 시급히 필요하며, 이러한 관점에서 재생 가능한 바이오매스의 발효를 이용하여 값싼 비식용 바이오매스, 폐기물 또는 석탄의 불완전 연소로 얻어지는 폐자원에서 분리된 기체 공급 원료(CO, CO₂ 및 H₂)에 대한 생물학적 전환이 최근 상당한 관심을 끌고 있다.

한편, 가스 발효 아세토젠(Gas-fermenting acetogens)은 다양한 합성 가스 및 일산화탄소가 함유된 폐가스를 사용하여 유용한 화학 물질을 생산할 수 있으므로 최근 큰 주목을 받고 있다. 기체 기질을 동화시키는 미생물 중에서 아세토젠은 아세트산을 합성하기 위해 일산화탄소 또는 이산화탄소와 수소를 이용할 수 있는 점에서 연구자들의 흥미를 유발하는 균주들이다. 이 미생물은 이산화탄소를 아세틸-CoA에 동화시키기 위해 WL(Wood-Ljungdahl) 경로를 사용하므로 아세트산이 주요 생성물이다. 일산화탄소가 이 경로에서 아세틸-CoA의 합성을 위한 전구체로 사용되기 때문에, 몇몇 아세토젠은 유일한 탄소원으로 일산화탄소를 이용할 수 있다

또한, 클로스트리디움 속(Clostridium genus)에 속하는 아세토산 생성 균주(Acetogens)들은 아세트산 이외에 에탄올, 부탄올, 2,3-부탄다이올과 같은 여러 종류의 알코올을 자연적으로 생성하기 때문에 지속적으로 연구되고 있다. 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주는 카복실산(carboxylic acid)뿐만 아니라 연료로 사용할 수 있는 알코올을 생산하기 때문에 많은 관심을 받고 있다.

이와 관련하여 C. ljungdahlii 균주를 이용한 석탄 합성 가스의 연속 발효를 통해 다량의 에탄올(48g/L)이 생산될 수 있음이 이미 보고된 바 있으며, 다른 잠재적 알코올 생산자로는 C. autoethanogenum, C. ragsdalei 및 C. carboxidivorans 균주가 보고된 바 있다(Kundiyana DK 등, Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor: Design and process considerations, J Biosci Bioeng, 2010;109:492-8 // Liew F 등, Metabolic engineering of Clostridium autoethanogenum for selective alcohol production, Metab Eng, 2017;40:104-14 // Saxena J 등, Effect of trace metals on ethanol production from synthesis gas by the ethanologenic acetogen, Clostridium ragsdalei, J Ind Microbiol Biot, 2011;38:513-21).

그러나, 최근 많은 노력에도 불구하고, 이들 종을 이용한 알코올 생산 공정은 낮은 생산력과 아세트산 축적으로 인한 부작용으로 인하여 ATP 생산 효율이 감소하고, 이로 인해 전반적으로 알코올 생산 수율이 낮아지는 문제점이 있으며, 이를 해결하기 위해서는 더 좋은 표현형을 가진 개량된 클로스트리디움(Clostridium) 속 균주의 개발이 필요한 실정이다.

또한, 생화학적 연구에 더하여, 지난 10년간 시스템 생물학(systems biology)과 대사공학(metabolic engineering) 분야에서 큰 노력이 집중되었으나, 아직까지 제한된 지식으로 인하여 대사공학의 관점을 통해서만 관련 균주의 알코올 생산성을 개선하는 데는 상당한 시간이 소요되고 있다.

예를 들어, 최근의 연구는 C. autoethanogenum 균주에서 에탄올 생산의 유전적 특성을 확인하였지만 그러한 유전자의 불활성화는 자가영양 생장기(autotrophic growth) 동안 지속적인 래그 페이스(lag phase)를 초래한 바 있다. 따라서, 유용한 화학 물질의 생산에 활용할 뿐만 아니라, 가스 발효 미생물의 생리적 현상을 이해하기 위하여 더 바람직한 형질(예를 들면, 보다 높은 기체 소비율, 에탄올 선택성, 발효 생성물에 대한 내성 등)을 갖는 새로운 균주를 발굴하는 것은 여전히 매우 중요하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 알코올 생성 아세트젠 균주인 클로스트리디움 속 AWRP 균주를 한국 안산(Ansan)의 습지에서 분리하여 그 게놈 서열을 동정한 바 있으며, 동 균주의 16S 리보솜 RNA 서열에 기초하여, 동 균주가 C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. ragsdalei 및 C. coskatii 균주들과 공통의 조상으로부터 진화된 생물 분류군(clade)에 속함을 밝힌 바 있다.

본 발명자들은 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 자가 영양 성장 동안 그 배양 특성을 조사하였고, AWRP 균주가 선택적으로 고농도의 에탄올을 생산할 수 있음을 확인한 바 있다. 또한, 생물 반응기 실험에서 AWRP 균주는 선택적으로 고농도의 에탄올을 생산했을 뿐만 아니라 다른 가스 발효 클로스트리디움 속 균주에서는 보고되지 않은 특이적인 알코올 생성 프로파일을 나타냄을 확인하여 알코올 생성에 뛰어난 효과가 있음을 확인하고, 상기 AWRP 균주를 이용한 효과적인 알코올 생성 방법을 개발하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 알코올 선택적 생산능이 우수하고 알코올 생산과정에서 아세트산 축적에 의한 부작용이 없는 클로스트리디움 속 신균주 AWRP 및 이를 이용한 에탄올의 선택적 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주를 제공한다.

본 발명의 상기 클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주는 아세트산 대비 알코올의 선택적 생산이 가능한 것을 특징으로 한다. 이로 인해 아세트산 축적으로 인한 부작용으로 인하여 ATP 생산 효율이 감소하지 않으며, 아세트산 축적으로 인한 세포 생장 저해가 일어나지 않는다. 따라서, 본 발명의 상기 클로스트리디움 속 AWRP 균주는 아세트산 축적 없이 높은 알코올 생산 수율을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시예를 참조하면, 본 발명의 상기 클리스티리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주의 대사체 생성 프로파일을 분석한 결과, 본 균주의 배양 기간 동안 아세트산 축적으로 인한 세포 생장 저해가 일어나지 않으며, 고농도로 바이오 에탄올이 생성되고, 2,3-부탄다이올의 합성됨을 확인한 바 있다.

따라서, 본 발명의 상기 클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주가 생산하는 상기 알코올은 에탄올 및 2,3-부탄다이올인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제1항의 균주에 가스를 공급하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 알코올을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 알코올의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 용어 ‘가스’는 고체를 불완전 연소시켜 발생하는 일산화탄소를 포함하는 기체를 의미하며, ‘합성 가스’를 포함하는 개념이다.

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 바이오 알코올 생산방법에 투입되는 가스는 일산화탄소를 필수적으로 포함하며, 바람직하게는 일산화탄소, 수소, 이산화탄소, 및 질소 등의 가스를 포함할 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계의 바이오 알코올 생산방법에 투입되는 가스는 50%(v/v) 내지 100%(v/v)의 일산화탄소를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 합성 가스의 공급은 50%(v/v) 일산화탄소, 10%(v/v) 수소, 10%(v/v) 이산화탄소 및 30%(v/v) 질소로 조성된 합성가스를 50kPa 내지 150kPa로 압축하여 연속적으로 공급할 수 있다.

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 균주 배양은 Ni 농도가 0.83μM 내지 10μM, Fe 농도가 20μM 내지 100μM, W 농도가 0.68μM 내지 10μM인 배지를 사용하여 배양할 수 있다.

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 균주 배양은 AM 배지, AMv2 배지, PETC 배지, 또는 RM 배지를 사용하여 배양할 수 있으며, 바람직하게는 PETC 배지 또는 RM 배지를 사용하여 상기 균주를 배양할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 4종 배지를 사용하여 아세트산 축적에 의한 부작용이 없이 본 발명의 클로스트리디움 속 AWRP 균주를 배양하여 알코올 생성이 가능함을 확인할 수 있었고, PETC 배지와 RM 배지를 사용하는 경우 각각 에탄올 생산 역가가 80mM 및 70mM 수준으로 고농도의 알코올을 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 PETC 배지는 리터 당 KH₂PO₄ 0.1g; MgSO₄·7H₂O 0.2g; CaCl₂·2H₂O 0.02g; NaCl 0.8g; KCl 0.1g; 효모 추출물 0.5g; 미량원소 용액(ATCC 1754) 10mL; Wolfe’s 비타민 용액 10mL; 및 환원제 10mL;를 포함하고, 상기 미량원소 용액(ATCC 1754)은 니트릴로아세트산(nitrilotriacetic acid) 25g/L; MnSO₄·H₂O 15g; Fe(SO₄)₂(NH₄)₂·6H₂O 0.85g; CoCl₂·6H₂O 0.25g; ZnSO₄·7H₂O 0.00025g; CuCl₂·2H₂O 0.000025g; NiCl₂·6H₂O 0.000025g; Na₂MoO₄·2H₂O 0.000025g; Na₂SeO₄ 0.000025g; Na₂WO₄ 0.000025g;으로 구성되고, 상기 Wolfe’s 비타민 용액은 바이오틴 2g/L; 엽산 2g/L; 피리독신·HCl 10g/L; 티아민·HCl 5g/L; 리보플라빈 5g/L; 니코틴산 5g/L; 칼슘 D-판토텐산염 5g/L; 비타민 B12 0.1g/L; p-아미노벤조산 5g/L; 및 리포산 5g/L로 구성되고, 상기 환원제는 NaOH 9g/L; L-시스테인·HCl 40g/L; 및 Na₂S·9H₂O 40g/L;로 구성된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 RM 배지는 리터 당 MgSO₄·7H₂O 0.2g; NaCl 1g; KCl 0.2g; 효모 추출물 0.5g; 인산 용액 10mL; 미량원소 I 용액 1mL; 미량원소 II 용액 1mL; Wolfe’s 비타민 용액 10mL; 및 환원제 10mL;를 포함하고, 상기 인산 용액은 NaH₂PO₄·2H₂O 0.8g/L; 및 K₂HPO₄ 0.4g/L로 구성되고, 상기 미량원소 I 용액은 35% HCl 10mL/L; FeSO₄·7H₂O 27.8g/L; MnCl₂·4H₂O 9.9g/L; ZnCl₂ 4.09g/L; CoCl₂·6H₂O 11.9g/L; 및 NiCl₂·6H₂O 2.38g/L;로 구성되고, 상기 미량원소 II 용액은 Na₂MoO₄·2H₂O 0.24g/L; Na₂SeO₃·5H₂O 1.32g/L; 및Na₂WO₄·2H₂O 3.3g/L;로 구성되고, 상기 Wolfe’s 비타민 용액은 바이오틴 2g/L; 엽산 2g/L; 피리독신·HCl 10g/L; 티아민·HCl 5g/L; 리보플라빈 5g/L; 니코틴산 5g/L; 칼슘 D-판토텐산염 5g/L; 비타민 B12 0.1g/L; p-아미노벤조산 5g/L; 및 리포산 5g/L로 구성되고, 상기 환원제는 NaOH 7.61g/L; L-Cysteine·HCl 30g/L; 및 Na₂S·9H₂O 30g/L;로 구성되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 RM 배지에 L-메티오닌을 15 내지 25mg/L 농도로 더 포함하게 되면, 2,3-부탄다이올 생성능을 역가 6.5mM까지 증가시킬 수 있다.

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 균주 배양은 4.5 내지 6.0의 pH 조건을 갖는 배지에서 배양되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바이오 알코올의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 균주 배양은 -200mV 내지 -450mV의 ORP(oxidoreduction potential) 값을 갖는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 한다.

본 발명이 선행특허들과 차별화된 점의 하나로 종래 클로스트리듐 균주들은 배지 내 일산화탄소의 분압이 높은 경우에 오히려 생장이 저해되어 일산화탄소에서 알코올로 변환되는 알코올 생산 과정이 수행되지 않으나, 본 발명의 클로스트리디움 속 AWRP 균주는 본 발명의 배지 및 배양 조건에서 일산화탄소의 공급을 증가시켜줄 때 세포 생장이 저해되지 않고, 알코올 전환 과정이 무리 없이 수행되어 에탄올의 선택적 생산이 가능하다는 것이다.

종래 알려진 LanzaTech 社의 클로스트리듐 균주를 이용한 일산화탄소의 생산 과정에서는 상기 문제점을 해결하기 위해 Cr^{2 +} 등의 강력한 환원제를 사용하여 ORP(oxidoreduction potential) 값을 낮추어 주면서 알코올 생산이 가능했으나, 본 발명에서는 본 발명의 클로스트리디움 속 AWRP 균주가 갖는 특징으로 인해 Cr^{2 +} 등의 강력한 환원제를 별도로 공급하지 않고도 배지의 ORP(oxidoreduction potential) 값이 200mV 내지 -450mV로 유지될 수 있으므로 일산화탄소의 공급만으로도 에탄올 생산에 필요한 충분히 낮은 ORP가 형성될 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주는 배양기간 동안 아세트산 축적으로 인한 세포 생장 저해가 일어나지 않고, 고농도의 바이오 에탄올의 생산이 가능하다.

따라서, 본 발명의 클로스트리디움 속 신균주 AWRP를 이용하여 합성 가스로부터 바이오 에탄올을 선택적으로 생산하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 클로스트리디움 속 신균의 AWRP의 계통 발생도를 도시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 클로스트리디움 속 신균의 AWRP의 염색체의 전체 게놈 서열을 해석하여 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 클로스트리디움 속 신균의 AWRP와 관련 종들의 이종상동성 유전자(orthologous gene) 분석 결과를 정리하여 나타낸 벤 다이어그램이다.
도 4는 본 발명의 클로스트리디움 속 신균의 AWRP의 유전정보를 이용하여 작성한 주요 대사경로를 설명하여 나타낸 그림이다.
도 5는 4종 배지에 본 발명의 클로스트리디움 속 신균주를 4종 배지에서 배양한 후 대사체 프로파일을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 RM 배지에서 효모 추출물, 칼슘이온, 구리이온, 및 Met 첨가 유무에 따른 대사체 프로파일을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 클로스트리디움 속 신균의 AWRP를 바이오리액터에서 배양하면서 시간 경과에 따른 대사체 프로파일을 분석하여 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 균주 분리 및 동정

독립 영양 미생물의 농축 및 분리를 위해 다음과 같은 AM 기본 배지[NH₄Cl 1.0g; K₂HPO₄ 0.33g; MgCl₂ 0.52g; CaCl₂·2H₂O 0.1g; KCl 0.33g; NaCl 1.0g; NaHCO₃ 1.0g; L-cysteine-HCl 0.5g; Bacto^TM yeast extract 0.5g; 미량원소 솔루션(DSM 141) 10 mL; 0.1% resazurin solution 1mL; 1L당 함유량]가 사용되었다.

1N HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정한 후, 배지를 휘톤(Wheaton) 세럼 바이알에 분배하고, 질소(N₂)로 퍼징한 후, 오토클레이브로 멸균하였다. 마지막으로 멸균된 Na₂S·9H₂O 용액(0.05g/L의 최종 농도) 및 100x 울프(Wolfe) 비타민 용액을 배지에 첨가하였다.

퇴적물과 가축 슬러지 샘플은 해양 퇴적물, 논, 호수, 습지, 가금류 및 소 농장에서 수집되었다. 샘플을 무균 샘플링 백에 보관하고 95% N₂ 및 5% H₂를 함유하는 혐기성 챔버(Coy Laboratory Products, MI, USA)로 이동하였다.

샘플을 20mL의 AM 배지가 들어있는 50mL 세럼 바이알에 옮기고 각각의 슬러리를 2개의 다른 희석액(10^-1 및 10^{- 2})을 포함한 접종원으로 각각 2회 사용하였다. 농축 배양을 위해 5mL의 배지가 들어있는 25mL 세럼 바이알을 이용하여 30℃에서 2주간 배양하였다. 헤드 스페이스 가스는 합성 가스(50% CO, 10% H₂, 10% CO₂ 및 30% N₂; 150kPa)의 조성을 모방한 합성 합성 가스로 즉시 교환되었다. 양성 배양물(positive cultures)이 탁도 증가에 의해 확인될 때마다, 이들은 새로운 배지(10% 이노큘럼)로 옮겼다. 농축된 샘플을 AM 아가 플레이트 상에 치상하여 저장하고, 150kPa의 합성 가스가 들어있는 혐기성 용기(jar)에서 배양했다.

농축 배양 후, 각각의 샘플로부터 총 37종의 균주를 수득한 후, CO 가스의 이용을 통해 개별적으로 성장시켰다.

이러한 과정을 통해 빠른 CO 가스의 소비와 짧은 래그 페이스(lag phase)를 보인 AWRP 균주가 선택되었다. AWRP 균주는 중온성이고, 약산성의 특성을 보였으며, 최적 성장 온도는 37℃, pH는 6.0 내지 6.5로 확인되었다.

분리된 AWRP 균주는 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 거쳐 클로스트리디움 속 (Clostridium)에 속하는 균주로 확인되었다.

상기 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 전체 서열을 분석하였고, 16S rRNA 서열을 다른 클로스트리디움 속 균주들의 16S rRNA 서열과 비교하였다.

그 결과, 클로스트리디움 속 AWRP 균주는 C. ljungdahlii 균주, C. autoethanogenum 균주, C. ragsdalei 균주 및 C. coskatii 균주의 4종 균주들과 99% 이상의 염기 서열 동일성을 갖는 동일한 클레이드에 속하는 것으로 나타났으며, 분석된 유전자 서열을 토대로 계통도를 작성하였다(도 1 참조).

또한, 이렇게 밀접하게 관련된 종들 사이의 차이를 구별하기 위해 전체 게놈 시퀀싱 후에 게놈 전체 평균 뉴클레오타이드 동일성(gANI, genome-wide average nucleotide identity) 분석을 수행하였다(표 1 참조).

[표 1]

그 결과, 클로스트리디움 속 AWRP 균주는 다른 균주들과 pairwise gANI 값이 95 내지 96%이며, 종에 대한 ANI 기반 cutoff(96.5%) 값 보다 약간 낮은 것으로 나타났다. 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 gANI 값은 C. ragsdalei(95.5%) 균주에서 가장 높았으나, 정렬 비율은 52%로 최소 임계값(60%) 보다 작은 값을 기록하였다

실시예 2. 유전정보 분석

계통 발생도 구축을 위해, AWRP 균주의 모든 16S 리보솜 RNA 유전자의 공통 서열(consensus sequence)을 사용하였다. 다른 종들의 16S rRNA 염기 서열은 NCBI 데이터베이스에서 얻었고, 이들 서열을 ClustalX 프로그램을 사용하여 정렬하였다. 또한, 정렬된 결과 파일은 PHYLIP 3.695 패키지를 사용하여 F84 모델에 따라 진화 거리 매트릭스(evolutionary distance matrix)를 계산하였고, neighbor-joining 방법으로 계통 발생도를 구축하였다. 트리 위상배치(neighbor-joining tree topology)는 1,000 복제본(replicate)의 부트스트랩 분석(bootstrap analysis)을 사용하여 검증하였다. 계통 발생도를 시각화하기 위해 ETE 3 Python 패키지를 사용하였다. 이종상동성 유전자 분석(Orthologous gene analysis)은 Proteinortho 6.0b 프로그램을 사용하여 수행하였으며, 종래 연구들에서 사용된 것과 동일한 매개 변수를 사용하였다.

실시예 3. 게놈 시퀀싱

게놈 시퀀싱을 위해 RNA가 없는 게놈 DNA는 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 사용하여 추출되었다.

클로스트리디움 속 AWRP 균주의 전체 게놈 서열은 DNALink 사(서울, 한국)에 의뢰하여 PacBio 단일 분자 실시간(SMRT, single-molecule real-time) 시퀀싱에 의해 결정하였다. PacBio 표준 프로토콜에 따라 SMRTbell 템플릿 준비 키트 1.0 (Pacific Biosciences, CA, USA)을 사용하였다. 라지-인서트 라이브러리(large-insert library)의 제작을 위해 BluePippin 크기 선택 시스템(Sage Science, Inc., MA, USA)을 사용하여 작은 단편(Small fragments, <20kb)를 제외하였다.

SMRT 세포는 P6-C4 화학 조합을 사용하여 PacBio RSII 장치(Pacific Biosciences, CA, USA)에서 수행하였다. 새로운 에셈블리(De novo assembly)가 HGAP(Hierarchical Genome Assembly Process, 버전 2.3) 및 Quiver 프로그램을 사용하여 수행되었다. 자동 어노테이션 파이프라인(GenBank, automatic annotation pipeline)을 사용하여 전체 게놈 서열을 해석하였다.

상기 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 완전한 게놈의 4.58 Mbp의 크기의 원형 염색체로 30%의 GC 함량을 갖는 것으로 나타났다(도 2 참조). 상기 염색체는 각각 4,037개의 단백질과 리보솜 27개의 rRNA 및 72개의 tRNA를 암호화하는 유전자를 포함하여 구성된 것으로 분석되었다.

다음으로 본 발명자들은 클로스트리디움 속 AWRP 균주와 동일한 계통 발생 그룹에 속하는 4개의 유전적으로 가까운 균주들에 대한 이종상동성 유전자 분석(orthologous gene analysis)을 수행했다.

그 결과, 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 게놈은 3,691개의 이종상동성(orthologous) 그룹 중 596개의 단일체(singletons)(즉, 변형-특이적 그룹, strain-specific groups)를 포함하며, 이는 분석된 5종 균주 중에서 가장 높은 수치이다(도 3 참조).

또한, 동 균주의 게놈은 이동성 그룹 II 인트론(mobile group II intron)의 LtrA 유사 역전사 효소를 암호화하는 8개의 유전자를 보유하고 있는 것으로 분석되었으며, 그들 중 일부는 다른 균주에서 발견되지 않았다.

그리고, 동 균주는 3개의 CRISPR 어레이가 예측되나, Cas2 단백질(DMR38_05220)을 코딩하는 하나의 유전자만을 보유하기 때문에, 동 균주의 CRISPR 시스템은 기능적 장애가 있는 것으로 추정된다. 또한, 동 균주의 게놈에 3개 프로파아지 영역(DMR38_09360-DMR38_09475, DMR38_15615-DMR38_15715 및 DMR38_20795-DMR38_20915)이 추정된다.

게놈 주석(genome annotation)에 기초하여 AWRP 균주의 주요 대사(central metabolism) 경로를 도 4에 요약하여 나타내었다. WL(Wood-Ljungdahl) 경로의 메틸 및 카르보닐 분지를 위한 효소를 코딩하는 모든 유전자는 동 균주의 게놈 상에 존재하는 것으로 확인되었다.

또한, 아세틸-CoA 합성 효소 복합체에서 니켈 의존성 혐기성 CO 탈수소 효소(CODH, CO dehydrogenase)를 코딩하는 acsA1(DMR38_18780) 유전자 이외에, 게놈 내에 3개의 추가 CODH 유전자 카피가 존재하는 것으로 확인되었다. 이들 중 두 개(DMR38_04285 및 DMR38_08960)의 유전자 카피는 C. autoethanogenum 균주의 각각 cooS1 유전자와 cooS2 유전자와 이종상동성 유전자(orthologous gene)다. 그리고, 나머지 하나(DMR38_21405)의 유전자 카피는 C.ljungdahlii 균주와 C. autoethanogenum 균주의 게놈에는 존재하지 않으나, C. ragsdalei 균주의 게놈에 존재하는 acsA 유전자의 유사 유전자(paralogous gene)로 추정된다.

C. autoethanogenum 균주 및 C. ljungdahlii 균주처럼 포름산 탈수소효소 복합체(formate dehydrogenase complex)를 암호화하는 것을 제외하고, 두 가지 분지(branches)(DMR38_18710-DMR38_18780)에 대한 유전자를 포함하는 큰 규모의 단일 클러스터가 본 AWRP 균주의 게놈에 존재하는 것으로 확인되었다.

또한, 본 AWRP 균주의 게놈은 포름산 탈수소효소를 암호화하는 3개의 유전자를 포함하는데, 그 중 2개(DMR38_03345 및 DMR38_10270) 유전자는 셀레노시스테인(selenocysteine)을 포함하며, 나머지 다른 하나(DMR38_16370)의 유전자는 셀레노시스테인(selenocysteine)을 포함하지 않는 것으로 분석되었다.

WL 경로 자체가 기질 수준의 인산화에 의해 네트 ATP 획득(net ATP gain)을 산출하지 않으므로, 모든 아세토제닉 박테리아(acetogenic bacterium)는 독립영양 세포성장(autotrophic growth) 기간 동안 추가적인 에너지 보존 반응(energy-conserving reactions)이 필요한 것이 잘 알려져 있다.

본 AWRP 균주의 게놈에는 Rnf 복합체(DMR38_05715-DMR38_05740)와 ATP 합성 효소(DMR38_01075-DMR38_01110)를 코딩하는 유전자가 포함되어 있으나, Moorella 속 균주에서 사용하는 Ech-타입 수소화효소를 코딩하는 유전자는 포함되지 않는 것으로 분석되었다.

또한, C. kluyveri 균주에서 처음 발견된 에너지 보존형(energy-conserving) 트랜스하이드로게나아제(transhydrogenase) NfnAB 유전자는 본 AWRP 균주의 게놈에서 단일 유전자(DMR38_18560)에 의해 코딩되는 것으로 분석되었다.

AWRP 균주의 게놈은 5종의 철 단일 수소화효소(iron-only hydrogenases)(DMR38_07425-07435, DMR38_03365-03390, DMR38_08575-08585, DMR38_10370 및 DMR38_18550)와 하나의 니켈-철 수소화효소(nickel-iron) (DMR38_14570-DMR38-14575)를 코딩하는 유전자를 보유한다. 철 단일 수소화효소의 처음 두 개의 클러스터는 NAD(P)H 산화환원 효소 도메인을 갖는 유전자를 포함하고 있으므로, 전자-분지형(electron-bifurcating)인 것으로 보인다. 또한, 니켈-철 수소화효소는 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 클러스터에 인접하며 C. autoethanogenum 균주에서 보고된 포름산:수소리아제 복합체[formate : hydrogen lyase complex]를 형성할 가능성이 있다.

또한, AWRP 균주의 게놈은 인산아세틸기전달 효소(phosphotransacetylase)와 아세트산 키나아제(acetate kinase)를 코딩하는 오페론(DMR38_06445-DMR38_06450)을 포함하는 것으로 분석되었다(도 4 참조).

또한, AWRP 균주의 게놈은 알데하이드:페레독신 산화환원효소(AOR, aldehyde:ferredoxin oxidoreductase)를 코딩하는 3개의 유전자를 포함하는데, 그 중 두 개의 유전자(DMR38_10295와 DMR38_10330)는 텅스텐산 ABC 트랜스포터(tungstate ABC transporter)를 암호화하는 오페론에 인접해있고, 나머지 하나의 AOR 유전자(DMR38_08915)는 다른 AOR 유전자들과 떨어져 위치하는 것으로 분석되었다.

알데히드 탈수소 효소와 알코올 탈수소 효소를 암호화하는 여러 유전자가 확인되었으며, 이 중 일부는 AWRP 균주에서 에탄올 생산에 관여할 수 있다. 또한, 본 AWRP 균주는 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol) 합성을 위한 아세토 락테이트 합성효소(acetolactate synthase)(DMR38_10440-DMR38_10445, DMR38_19400 및 DMR38_12130), 아세토 락테이트 탈카복실화 효소(acetolactate decarboxylase)(DMR38_03970) 및 2,3- 부탄디올 탈수소 효소(2,3-butanediol dehydrogenase)(DMR38_12050)의 유전자를 포함하는 것으로 분석되었다.

또한, 본 AWRP 균주의 게놈에는 각각 니트로게나아제(nitrogenase)(DMR38_02115-DMR38_02120 및 DMR38_11920-DMR38_11925로 인코딩됨)와 암모늄 트랜스포터(ammonium transporte)(DMR38_01655로 인코딩됨)를 포함하는 질소 동화 유전자를 포함하는 것으로 분석되었다.

그리고, 본 AWRP 균주는 질산염/아질산 트랜스포터(nitrate/nitrite transporter) 및 질산 환원 효소(nitrate reductase)(DMR38_12175-DMR38_12190에 인코딩됨)를 사용하여 질산염 또는 아질산염을 동화할 수 있는 것으로 분석되었다. 그러나, 아질산염 환원 효소(nitrite reductase)로 추정되는 유전자는 게놈에 존재하지 않았다. 아황산염 환원 효소(sulfite reductase)(DMR38_12195-DMR38_12205)를 코딩하는 유전자는 질산 환원 효소 유전자의 근처에 위치하며, 이들 유전자의 산물들은 아마도 아질산염 환원과 관련이 있음을 시사한다.

한편, 본 AWRP 균주는 L- 메티오닌(시스타티오닌 β- 리아제 부재로 인한), 티아민(thiamine), 바이오틴(pyridoxal), 피리독살, 판토텐산(pantothenate) 및 4- 아미노벤조에이트(4-aminobenzoate) 화합물의 생합성 경로가 불완전하므로 성장을 위해 몇 가지 유기 질소원이 필요할 수 있을 것으로 추정되었다.

실시예 4. 혐기성 배양(Anaerobic cultivation) 및 대사체 프로파일 분석

본 클로스트리디움 속 AWRP 균주는 같은 속의 다른 균주들과 구별되는 유전적 특성이 있으므로, 본 발명자들은 독립영양성장(autotrophic growth conditions) 조건 아래에서 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 대사산물 프로파일들을 분석하였다.

통상적인 증식 및 유전자 분석을 위해 클로스트리디움 속 AWRP 균주를 LBFA 배지에서 성장시켰다. LBFA 배지는 Bacto^TM 효모 추출물 5g/L, Bacto^TM 트립톤 10g/L, NaCl 0.5g/L, 프록토오스 5g/L, CH₃COONa·3H₂O 5g/L, 및 아가(선택적으로 첨가) 15g/L로 구성되었다. 사용 전, 멸균 LBFA 배지에 L-시스테인·HCl(0.5g/L)을 첨가하여 환원시켰다. 또한, 필요한 경우에, 항생제 티암페니콜(thiamphenicol 5μg/mL) 및 에리스로마이신(erythromycin 20μg/mL)을 배지에 첨가하여 사용하였다.

세럼 보틀(serum bottles)에서 대사 프로파일(metabolite profile)을 특정하기 위하여, 하기 AM, AMv2, 개량된 PETC 및 RM의 4종 배양 배지를 사용하였다.

[표 1] AM 배지 조성

- pH는 5.5로 조정되었고, 비타민과 Na₂S는 별도 멸균하여 autoclave 후 첨가

미량원소 용액: Nitrilotriacetic acid 1.5g/L; MgSO₄·7H₂O 3.0g/L; MnSO₄·H₂O 0.5g/L; NaCl 1.0g/L; FeSO₄·7H₂O 0.1g/L; CoSO₄·7H₂O 0.18g/L; CaCl₂·2H₂O 0.1g/L; ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L; CuSO₄·5H₂O 10mg/L; KAl(SO₄)₂·12H₂O 20mg/L; H₃BO₃ 10mg/L; Na₂MoO₄·2H₂O 10mg/L; NiCl₂·6H₂O 30mg/L; Na₂SeO₃·5H₂O 0.3mg/L; Na₂WO₄·2H₂O 0.4mg/L

[표 2] AMv2 배지 조성

- pH는 6.0으로 조정되었고, 비타민과 Na₂S는 별도 멸균하여 autoclave 후 첨가

- 미량원소 용액 Ⅰ: 35% HCl 10mL/L; FeSO₄·7H₂O 13.9g/L; MnCl₂·4H₂O 9.9g/L; ZnCl₂ 1.36g/L; CoCl₂·6H₂O 2.38g/L; CuCl₂·2H₂O 0.34g/L; NiCl₂·6H₂O 0.48g/L

- 미량원소 용액 Ⅱ: Na₂MoO₄·2H₂O 1.65g/L; Na₂SeO₃·5H₂O 0.86g/L; Na₂WO₄·2H₂O 1.65g/L; NaOH 0.4g/L

- Wolfe’s 비타민 용액: biotin 2g/L; folic acid 2g/L; pyridoxine·HCl 10g/L; thiamine·HCl 5g/L; riboflavin 5g/L; nicotinic acid 5g/L; Calcium D-pantothenate 5g/L; vitamin B12 0.1g/L; p-aminobenzoic acid 5g/L; lipoic acid 5g/L

[표 3] PETC 배지 조성

- pH는 5.9로 조정되었고, 비타민과 환원제는 멸균하여 사용함

- 미량원소 용액(ATCC 1754): nitrilotriacetic acid 25g/L; MnSO₄·H₂O 15g/L; Fe(SO₄)₂(NH₄)₂·6H₂O 0.85g/L; CoCl₂·6H₂O 0.25g/L; ZnSO₄·7H₂O 0.00025g/L; CuCl₂·2H₂O 0.000025g/L; NiCl₂·6H₂O 0.000025g/L; Na₂MoO₄·2H₂O 0.000025g/L; Na₂SeO₄ 0.000025g/L; Na₂WO₄ 0.000025g/L

- 환원제: NaOH 9g/L; L-Cysteine·HCl 40g/L; Na₂S·9H₂O 40g/L

[표 4] RM 배지 조성

- 비타민, 인산, 및 환원제는 멸균 후 첨가하였고, pH는 조정하지 않음

- 인산 용액: NaH₂PO₄·2H₂O 80 g/L; K₂HPO₄ 40g/L

- 미량원소 I 용액: 35% HCl 10mL/L; FeSO₄·7H₂O 27.8g/L; MnCl₂·4H₂O 9.9g/L; ZnCl₂ 4.09g/L; CoCl₂·6H₂O 11.9g/L; NiCl₂·6H₂O 2.38g/L

- 미량원소 II 용액: Na₂MoO₄·2H₂O 0.24g/L; Na₂SeO₃·5H₂O 1.32g/L; Na₂WO₄·2H₂O 3.3g/L

- 환원제: NaOH 7.61g/L; L-Cysteine·HCl 30g/L; Na₂S·9H₂O 30g/L

필요한 경우 배양액(culture broth)에 MES(10g/L)를 보충하였다. 이 경우, 멸균 전에 1N NaOH 용액을 사용하여 최종 pH를 6.0으로 조정하였다.

LBFA 배지에서 배양된 활성 AWRP 배양물을 시드 컬쳐(seed culture, 5% 이노큘럼) 접종에 사용하였다.

시드 컬쳐는 20mL의 배지와 50kPa의 합성 가스가 헤드 스페이스에 들어있는 125mL 세럼 바이알(serum vial)에서 수행되었다. 활성 시드 컬쳐(10% 이노큘럼)를 동일한 배지 및 150kPa의 합성 가스를 함유한 3개의 125mL 세럼 바이알에 옮긴 후, 로터리 셰이커에서 37℃ 및 180 RPM으로 배양하였다.

클로스트리디움 속 AWRP 균주는 같은 속의 다른 균주들과 구별되는 유전적 특성이 있으므로, 본 발명자들은 독립영양성장(autotrophic growth conditions) 조건 하에서 클로스트리디움 속 AWRP 균주의 대사산물 프로파일들을 분석하였다.

본 발명자들은 아세토제닉 클로스트리디아(acetogenic clostridia) 균주의 알코올 생성이 당화성 생성물의 솔벤토제너시스(solventogenesis) 과정과 유사하다고 추정하였는데, 이러한 탄소원의 초기 투입량이 솔벤토제너시스(solventogenesis)에 영향을 미친다는 사실은 당업계에 이미 공지되어 있다. 탄소원이 너무 적으면 종종 알코올, 아세톤, 부탄올 등의 솔벤트(solvent) 생성에 대한 수율이 낮아지고 솔벤토제너시스(solventogenesis) 현상을 관찰할 수 없게 된다.

또한, 독립 영양성 아세토제닉 균주를 배양하는 데 있어서 실질적인 문제 중 하나는 특징(characterization) 및 성능 평가(performance evaluation)를 위해 충분한 양의 가스를 공급하는 방법이다.

솔벤트 생성이 종에서 종으로 다양할 수 있지만, 본 발명자들의 계산에 따르면 전형적인 배양 조건에서 기체 기질의 양이 불충분할 수 있다(표 5 참조).

[표 5]

상기 [표 5]는 다양한 배양량 및 헤드스페이스 압력으로 125mL 용량의 휘튼 세럼 보틀(Wheaton serum bottle)에서 필요한 일산화탄소의 양을 계산하여 나타낸 표이다.

예를 들어, 40mL의 배양 볼륨(culture volume)이 있는 125mL 세럼 보틀을 사용하는 경우, 헤드 스페이스에서 150kPa의 50%(v/v) 일산화탄소는 단지 149[CO mmol/배양 볼륨]에 상응하는데, 이는 일산화탄소만이 솔벤트 합성 과정에 사용되는 경우 37mM 아세트산으로 전환될 수 있는 수치이다.

그러나, 헤드 스페이스 압력을 높이면 고무마개를 통한 가스 누출이나 유리병 파손 등의 안전 문제가 발생할 수 있고, 일산화탄소에 의한 균주 성장 억제 현상이 발생할 수 있으므로 바람직하지 않다. 또한, 종종 발생하는 헤드 스페이스의 정기적인 교환은 힘든 일이며, 특히 큰 배양 시스템의 경우에 더욱 어려운 일이다.

따라서, AWRP 균주를 이용한 적절한 배양 프로토콜의 확립은 중요하다.

본 발명자들은 다양한 작업 볼륨으로 세럼 보틀 배양을 수행하였다. 헤드 스페이스 볼륨과 배양 볼륨(기체/액체 비율)의 비율은 3mL:40mL, 7mL:20mL, 및 15mL:10mL의 비율로 배양하였다.

[표 6]

그 결과, 에탄올과 2,3-부탄다이올의 역가는 10mL의 배양액에서 각각 94mM 및 6mM로 가장 높았고, 배양액의 증가에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 40mL 배양액에서 에탄올 역가는 8mM이었는데, 이는 아세트산 역가 수치의 28% 수준에 불과했다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 이하 본 실험 전체에 걸쳐 배양량 10mL의 배양 볼륨(culture volume)으로 세럼 보틀 배양을 수행하였다.

다음으로, 다양한 배양 배지에서 배양된 AWRP 균주의 솔벤트 생성 패턴을 비교한 결과, 가스 소비율(gas consumption rate)과 알코올 생성(alcohol formation)은 배지 조성에 영향을 받는 것으로 관찰되었다(도 5 참조).

0.5g/L의 효모 추출물(YE)을 함유한 상기 4종 배양 배지(AM, AMv2, PETC 및 RM)를 사용하여 대사산물의 프로파일을 분석하였다. AM 배지는 AWRP 균주의 분리 및 농축을 위해 사용되었으며, DSM 614 배지를 기본으로 하였다. AMv2 배지는 미량원소와 인산염 농도가 증가한 AM 배지의 변형 배지이며, RM 배지는 AMv2 배지를 기반으로 하나 다른 배지들보다 훨씬 더 많은 미량원소 농도를 갖는다.

그 결과, 배지 조성에 따라 AWRP 균주의 솔벤트 생성이 크게 영향을 받음이 확인되었다. 먼저 에탄올 역가는 PETC 배지와 RM 배지에서만 아세트산 역가보다 높은 것으로 관찰되었다(도 5 상단 참조). 최종 에탄올 역가는 PETC 배지(80mM)에서 가장 높은 것으로 관찰되었다.

또한, RM 배지에서의 평균 배양 시간은 7일로, PETC 배지에서의 평균 배양 시간 12일 보다 짧았으나, RM 배지의 에탄올(70mM) 생성량은 PETC 배지(80mM) 보다 낮은 것으로 관찰되었다. 소량의 2,3- 부탄다이올이 PETC 배지(5mM)와 RM 배지(2mM) 모두에서 검출되었다. 예상외로 AWRP 균주는 AM 배지에서 잘 생장하나, 아세트산이 가장 많은 대사 물질(41mM)이었고, 적은 양의 에탄올(5mM)만 검출되었다.

또한, 배양기간 동안 배지의 pH를 일정한 수준으로 유지할 수 없으므로, pH 완충제를 사용하는 경우의 효과를 테스트하였다. 본 발명자들은 배양물의 최종 pH가 종종 세포질의 pH 구배(pH gradient)를 없애고 세포 대사를 중단시킬 수 있는 pH4 이하임을 관찰한 바 있다. 따라서, 완충제로서 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)을 최종 농도 10g/L로 배지에 첨가하였다.

그 결과, 배지에 MES를 첨가하면 총 프로덕트의 생성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 5 하단 참조). 그러나, MES의 첨가는 에탄올 생산이 3배로 증가한 AMv2 배지(MES 첨가 60mM vs MES 무첨가 20mM)를 제외한 모든 배지에서 알코올 생성 증가에 부정적 영향을 미치는 것으로 나타났다.

또한, AWRP 균주가 PETC 배지보다 RM 배지에서 CO 소비율(consumption rate)이 더 높았으므로, RM 배지에서 효모 추출액, L-메티오닌(게놈 서열에 의해 확인된 영양 요구성의 잠재적 후보자), 및 RM 배지에 함유되어 있지 않지만 PETC 배지에는 함유된 금속 이온들을 포함하여 다양한 보조 첨가제의 영향을 추가로 조사하였다(도 6 참조).

그 결과, 흥미롭게도, L-메티오닌의 첨가는 2,3-부탄다이올 역가를 대조군의 2.7mM에서 실험군의 6.5mM로 2배 이상 증가시켰다. 이러한 2,3-부탄다이올의 역가 증가는 효모 추출물의 농도가 증가할 때에는 관찰되지 않았고, 효모 추출물의 첨가는 아세트산 역가(0.5g/L 23mM; 1g/L 50mM; 및 2g/L 60mM)를 증가시키는 것으로 관찰되었다.

또한, Ca^{2 +} 또는 Cu^{2 +} 이온의 첨가는 L-메티오닌과 함께 첨가되었을 때에는 대사 산물 프로파일에 거의 영향을 주지 않았으나, Cu²⁺의 단독 첨가는 2,3-부탄다이올 역가를 약간 증가시키는 것으로 나타났다.

실시예 5. 바이오리액터 배양

AWRP 균주의 배양을 위하여 2.5-L의 항온 교반 배양조(BioCNS, Daejeon, Korea)가 사용되었으며, 가스 전달의 효율을 높이기 위하여 배양조의 내부에는 3개의 배플, 미세 스파저를 장착하였고, 교반을 위해 6개의 블레이드를 가진 러시톤 터빈(Rushton turbine)을 3개 장착하였다. 최초 가압 단계에서 가스 기질의 양을 충분히 확보하기 위하여 배양조의 배기구 후단에는 2.5L의 철제 용기를 저장소(reservoir)로서 장착하였다. 배기가스의 유량은 습식 가스미터(W-NK-0.5; Shinagawa Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였으며, 배양조 내의 pH와 산화환원 전위(oxidoreduction potential; ORP)는 각각 Mettler Toledo 사의 pH ORP probe를 이용하여 측정하였다. 배양 중 발생하는 거품은 Antifoam 204(Sigma)를 소포제로서 수동으로 주입하여 제거하였다. pH는 관측값을 바탕으로 하여 하한 pH 5.0 및 상한 pH 5.8로 자동 제어하였으며, 산과 염기로서 각각 2N HCl과 5N NH₄OH 용액을 사용하였다.

배양조 실험을 위한 접종균의 배양은 40mL의 RM 배지가 포함된 4개의 125mL 세럼 보틀을 이용하여 진행하였다. RM 배지에는 0.5g/L의 효모 추출액, 20mg/L의 L-methionine을 첨가하였다. 접종된 세럼 보틀은 100kPa의 CO₂:H₂(20:80) 합성 가스 A로 치환 및 가압하고, 37℃, 180rpm으로 24시간 동안 초기 배양을 진행한 후, 내부 기체를 100kPa의 합성 가스 B(50% CO, 10% H₂, 10% CO₂, 및 30% N₂)로 치환하고, OD600 값이 약 1~2 정도가 될 때까지 배양을 지속하였다. 일산화탄소의 내부 농도가 초기의 절반 이하로 감소하는 경우 새 기질(합성 가스 B)로 100kPa 압력으로 치환 및 가압하여 CO가 고갈되지 않게 하였다. 배양된 종균은 1.44L의 RM 배지(yeast extract 0.5 g/L, L-met 50mg/L)가 포함된 배양조에 접종하여 본 배양을 수행하였다. 배양조는 배지 멸균 후 내부를 99.999%의 N₂로 약 2시간 치환하여 산소를 제거하였으며, 이후 접종 1시간 전에 미리 합성 가스 B로 내부를 치환하였다. 치환을 진행하면서 습식 가스 미터를 이용하여 실제 공급 유량이 설정값과 맞는지 확인 한 후, 멸균된 100x인산 용액과 100 x Wolfe’ vitamin 용액을 주입하였다. 이후 배양조를 50kPa로 가압하고 환원제를 첨가한 후, 최종적으로 종균을 접종하였다.

시간에 따른 AWRP 균주의 배양양상을 확인하기 위하여 회분식 배양을 진행하였다(가스는 최초 가압에서 연속 공급 전환하였음). 배양은 1.6L의 RM 배지가 포함된 2.5L 항온 배양조를 이용하여 진행하였고, 배지에는 0.5g/L의 효모 추출액과 50mg/L의 L-메티오닌을 생장에 필요한 보조 인자로 첨가하였다.

회분식 배양에서 접종 후 처음부터 가스 기질(합성 가스 B)을 공급할 경우, 일산화탄소에 의한 생장 저해로 배양이 실패하였다.

이러한 생장 저해를 피하고자 접종 후 초기에는 헤드 스페이스(headspace)를 50kPa로 가압한 후, 교반으로만 가스를 공급하였다. 배양양상은 도 7에 도시되어 있으며, ORP(oxidoreduction potential)에 따라서 AWRP 균주가 생산하는 대사산물의 양상이 크게 달라지는 것을 확인하였다. 가스 공급 조건에 따라 이를 크게 3단계로 나누어 아래에 설명하였다.

- 1단계 I(30~57.5시간): 최초 가압 단계에서 약 30시간 배양 후 연속 가스 공급으로 전환하였으며, 이 시점에서 AWRP 균주는 알코올만을 선택적으로 생산하기 시작하였다. 특히 에탄올의 비생산성(specific production rate)은 191~217mM/(g DCW)/day였으며, 57.5 시간 경과 시점에서 에탄올과 2,3-부탄다이올의 농도는 각각 42mM 및 5mM로 측정되었다. 아세트산의 경우 1단계 배양에서 최대 9mM 정도 수준에서 더 증가하지 않았고 유지되었다. 알코올의 생산 여부는 배양액의 ORP(oxidoreduction potential) 수치와 연관이 있는 것으로 보이는데, 최초 가스를 연속 공급으로 전환한 시점에서 -450mV로 감소하였고, 교반 수치를 감소시키는 경우 ORP가 약 -400mV까지 증가하였다. 49시간부터 50.5시간까지 300 RPM으로 일시적으로 교반 속도를 증가시킬 경우 ORP가 다시 감소하였으며, 이는 가스의 전달 및 소모를 통하여 AWRP 균주가 ORP를 감소시키는 것으로 보인다. 비생장 속도의 경우 30~35 시간 구간에서 0.8d^-1, 35~49 시간 구간에서 1.4d^-1로 증가하였으며, 이는 초기 균체량이 적은 조건에서 일산화탄소로 인한 저해가 더 크게 나타난 것으로 추정된다. 0.05vvm의 유량에서는 가스 공급을 교반으로 조절하기 어려워 57.5 시간부터 유량을 0.025vvm으로 낮추고 교반 속도를 변화시키면서 배양양상을 관찰하였다.

- 2단계(57.5~85.3시간): 교반을 200RPM으로 유지하면서 가스 유량을 0.025vvm으로 감소시키는 경우 알코올 생산이 감소하고 아세트산이 주산물로 다시 생성되었으며, 비생산성은 약 100mM/(gDCW)/(day)로 측정되었다. 유기산의 생산과 함께 pH의 감소가 확인되었으며, ORP의 경우 -360mV까지 증가하였다. 따라서 2단계 발효의 경우 가스 전달 속도가 균체의 최대 가스 소모 속도에 미치지 못한 것으로 판단된다. 균체의 경우 1단계에 비해 크게 증가하지 않고 건조 균체량 약 0.4g/L를 기록하였다.

- 3단계(85.3~121.8시간): 2단계의 아세트산 생산 상황에서 가스 전달을 높임으로써 알코올 생산이 다시 진행되는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 가스 공급 유량을 유지하고 교반 속도를 증가시켰으며, pH의 증가와 ORP(oxidoreduction potential)의 감소를 확인할 수 있었다. ORP(oxidoreduction potential)는 약 -420mV까지 감소하였으며, 이와 함께 알코올이 다시 생산되는 것을 확인하였다. 다만 1단계와 달리 3단계에서는 2단계에서 누적된 아세트산도 에탄올로 전환되는 것을 확인할 수 있었다. 3단계에서 에탄올의 비생산성은 약 170mM/(gDCW)/(day)였으며, 102.8 시간 경과 시점에서 교반 속도를 증가시켜도 ORP(oxidoreduction potential)이나 알코올 생산성에서는 큰 변화를 보이지 않았다. 최종 대사산물의 농도는 에탄올: 119mM, 2,3-부탄다이올 12mM, 아세트산 1.4mM로 측정되었다.

상기 실험들을 통해 본 발명의 클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주는 배양기간 동안 아세트산 축적으로 인한 세포 생장 저해가 일어나지 않고, 고농도의 바이오 에탄올의 생산이 가능함을 확인할 수 있었고, 본 발명의 클로스트리디움 속 신균주 AWRP를 이용하여 합성 가스로부터 바이오 에탄올을 선택적으로 생산하는 공정에 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC13908BP 20190806

Claims (13)

1. 아세트산 대비 알코올의 선택적 생산이 가능하여 아세트산 축적으로 인한 세포 생장 저해가 일어나지 않고,
   상기 알코올은 에탄올 및 2,3-부탄다이올인 것을 특징으로 하며,
   상기 에탄올에 대한 비생산성(specific production rate)이 100~217mM/(g DCW)/day 인 것을 특징으로 하는,
   클로스트리디움 속 AWRP(수탁번호: KCTC 13908BP) 균주.
2. 삭제
3. 삭제
4. (a) 제1항의 균주에 가스를 공급하여 배양하는 단계; 및
   (b) 상기 배양물로부터 알코올을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하되,
   상기 (a) 단계의 가스는 일산화탄소, 수소, 이산화탄소, 및 질소를 포함하거나, 50%(v/v) 내지 100%(v/v)의 일산화탄소를 포함하는 것을 특징으로 하고,
   상기 (a) 단계의 균주 배양은,
   Ni 농도가 0.83μM 내지 10μM, Fe 농도가 20μM 내지 100μM, W 농도가 0.68μM 내지 10μM인 PETC 배지 또는 RM 배지를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하며,
   상기 (a) 단계의 배양 배지는 -200mV 내지 -450mV의 ORP(oxidoreduction potential) 값을 갖는 것을 특징으로 하는,
   바이오 알코올의 생산방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제4항에 있어서,
   상기 PETC 배지는 리터 당 KH₂PO₄ 0.1g; MgSO₄·7H₂O 0.2g; CaCl₂·2H₂O 0.02g; NaCl 0.8g; KCl 0.1g; 효모 추출물 0.5g; 미량원소 용액(ATCC 1754) 10mL; Wolfe’s 비타민 용액 10mL; 및 환원제 10mL;를 포함하고,
   상기 미량원소 용액(ATCC 1754)은 니트릴로아세트산(nitrilotriacetic acid) 25g/L; MnSO₄·H₂O 15g; Fe(SO₄)₂(NH₄)₂·6H₂O 0.85g; CoCl₂·6H₂O 0.25g; ZnSO₄·7H₂O 0.00025g; CuCl₂·2H₂O 0.000025g; NiCl₂·6H₂O 0.000025g; Na₂MoO₄·2H₂O 0.000025g; Na₂SeO₄ 0.000025g; Na₂WO₄ 0.000025g;으로 구성되고,
   상기 Wolfe’s 비타민 용액은 바이오틴 2g/L; 엽산 2g/L; 피리독신·HCl 10g/L; 티아민·HCl 5g/L; 리보플라빈 5g/L; 니코틴산 5g/L; 칼슘 D-판토텐산염 5g/L; 비타민 B12 0.1g/L; p-아미노벤조산 5g/L; 및 리포산 5g/L로 구성되고,
   상기 환원제는 NaOH 9g/L; L-시스테인·HCl 40g/L; 및 Na₂S·9H₂O 40g/L;로 구성된 것을 특징으로 하는 바이오 알코올의 생산방법.
10. 제4항에 있어서,
    상기 RM 배지는 리터 당 MgSO₄·7H₂O 0.2g; NaCl 1g; KCl 0.2g; 효모 추출물 0.5g; 인산 용액 10mL; 미량원소 I 용액 1mL; 미량원소 II 용액 1mL; Wolfe’s 비타민 용액 10mL; 및 환원제 10mL;를 포함하고,
    상기 인산 용액은 NaH₂PO₄·2H₂O 0.8g/L; 및 K₂HPO₄ 0.4g/L로 구성되고,
    상기 미량원소 I 용액은 35% HCl 10mL/L; FeSO₄·7H₂O 27.8g/L; MnCl₂·4H₂O 9.9g/L; ZnCl₂ 4.09g/L; CoCl₂·6H₂O 11.9g/L; 및 NiCl₂·6H₂O 2.38g/L;로 구성되고,
    상기 미량원소 II 용액은 Na₂MoO₄·2H₂O 0.24g/L; Na₂SeO₃·5H₂O 1.32g/L; 및Na₂WO₄·2H₂O 3.3g/L;로 구성되고,
    상기 Wolfe’s 비타민 용액은 바이오틴 2g/L; 엽산 2g/L; 피리독신·HCl 10g/L; 티아민·HCl 5g/L; 리보플라빈 5g/L; 니코틴산 5g/L; 칼슘 D-판토텐산염 5g/L; 비타민 B12 0.1g/L; p-아미노벤조산 5g/L; 및 리포산 5g/L로 구성되고,
    상기 환원제는 NaOH 7.61g/L; L-Cysteine·HCl 30g/L; 및 Na₂S·9H₂O 30g/L;로 구성된 것을 특징으로 하는 바이오 알코올의 생산방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 RM 배지는 L-메티오닌을 15 내지 25mg/L 농도로 더 포함하고,
    2,3-부탄다이올 생성능을 역가 6.5mM까지 증가시키는 것을 특징으로 하는 바이오 알코올의 생산방법.
12. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 균주 배양은 pH 4.5 내지 pH 6.0의 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 바이오 알코올의 생산방법.
13. 삭제

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