CN1160467C - 一种生产腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用甲醇利用型酵母，尤其是转化了带有外源SAM(S-adenosyl-menthionine)合成酶表达载体的重组菌，来生产SAM的方法和如何构建这样一种表达载体和转化细胞的方法。具有该特性的重组菌在含有甲醇和适量甲硫氨酸和一定氮源的培养基中发酵，可以获得高产量的SAM，细胞内的SAM含量可达10～20%细胞干重。本发明还提供了一种新的甲醇利用型的巴斯德毕赤酵母菌株，它的种属为Pichia pastoris，菌种保藏号为：CGMCC，NO.0648。

Description

一种生产腺苷甲硫氨酸的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和代谢工程，具体地说，本发明涉及利用DNA重组技术构建基因工程甲醇利用型酵母新菌株，并用该新菌株来生产腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的方法。

背景技术

腺苷甲硫氨酸(SAM)是生物体中重要的中间代谢物质，参与众多生物反应，它也是细胞内的主要甲基供体。已知的许多含氮物质的合成都要从SAM中获取甲基，包括肌酸，肾上腺素，松果素，胆碱等重要的生理活性物质。SAM还参与核酸和蛋白质的甲基化修饰，并且是诸如谷胱甘肽，半胱氨酸，牛磺酸和辅酶A这类含硫化合物的前体。

SAM的含量，在一般的生物细胞内都很低，但在某些微生物尤其是酵母Saccharomyces属的一些菌株，能够在含有甲硫氨酸的生长时，在细胞内积累较高浓度的SAM(Shiozaki S et al.Agric Biol Chem，1984，48：2293-2300)，从而能够通过对它们的发酵，方便地获得SAM。细胞内的SAM主要累积在细胞的液泡中(Svihla G，Schlenk F，JBacteriol 1960，79：841)。

SAM的生产一直以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的发酵为主(Shiozaki S，Yamada H et al.，US4562149，1985；Shiozaki S，Yamada H et al.Arig Biol Chem，1989，53：3269-3274)。早期的SAM生产菌都是通过大规模地筛选不同种属的野生菌分离得到的，Shiozaki通过筛选300多株不同种属的菌株，分离到一株Saccharomyces sake K-6菌(Shiozaki S et al.，Agric Biol Chem，1984，48(9)：2293-2300)，在10ml培养基小量发酵时可以产出1.55g/L的SAM，细胞内SAM的含量达0.153g/g干细胞；进一步优化培养条件，该菌在10L发酵罐中培养7天后的SAM产量高达10.8g/L(菌体达到53克)(Shiozaki S et al.Journal of Biotechnology，1986，4：345-354)。这是目前从各种专利和期刊上所查到的最高的产量。

Pajares Maria Angeles等(Pajares Maria Angeles，1995，EP0647712)通过在细菌中表达大鼠肝脏来源的SAM合成酶，使得细胞内的SAM含量大大提高，但其单位发酵体积中的SAM产量仍然很低，只有28nmol/ml发酵液，按照SAM盐酸盐的分子量来计算，只有0.012克/升发酵液。这样低的发酵产量，一方面会增加发酵成本，另一方面会使得后期的纯化很麻烦。

SAM这类中间代谢物的生产成本，取决于三方面的因素：1.目的产物在生产菌中的含量，即产物占细胞干重的百分比；2.单位发酵体积中生产菌的生物累积量，即单位发酵体积的菌体量；3.生产菌的发酵培养基的成本。近年来在生物工程领域迅速发展起来的甲醇利用型酵母(methylotrophicyeast)，包括Hansenula，Candida，Pichia和Torulopsis属的酵母，是一类能够利用甲醇作为单一碳源来生长的酵母，相比较于传统的酿酒酵母具有培养基成本低、生物累积量高的特点，大规模发酵可得到极高的细胞密度(＞130g/L的细胞干重)和生物转化率(12g干细胞/L·hour)(Wegner G H，FEMSMicrobiol Rev，1990，279-284)。这个特性使得它具备以极低的价格生产细胞内中间代谢产物的潜力。然而野生型的甲醇利用型酵母其细胞内的SAM含量极低，我们实验所测定的巴斯德毕赤酵母GS115菌株的SAM含量只有0.0039克/克干细胞，即只有0.39％的含量。

发明内容

本发明的目的是通过重组表达外源SAM合成酶，强化细胞内的SAM合成酶活力，改变细胞自身的代谢途径，从而研制新的基因改造的菌株来生产SAM的方法；另一方面利用甲醇利用型酵母本身的高密度、低成本的发酵特点，大幅度降低SAM的生产成本，满足日益增加的SAM需求，促进国内SAM的开发，增强国际竞争力。

SAM的生物合成是由底物L一甲硫氨酸(Met)和ATP经SAM合成酶[EC2.5.1.6]酶促合成。酿酒酵母细胞中有两种SAM合成酶的同功酶SAM合成酶1和SAM合成酶2，两者的氨基酸序列的一致序列高达92％。SAM合成酶1负责合成细胞内的大部分SAM，但SAM合成酶1表现出较强的产物抑制现象，而SAM合成酶2则没有。Thomas等发现SAM合成酶1的转录调控的方式同其他参与含硫氨基酸和SAM代谢的基因一样，在过量甲硫氨酸存在下，它的转录受到抑制；而SAM合成酶2则表现出不同的调控方式，它的转录不受甲硫氨酸的抑制，并随生长曲线增长(Thomas，D.et al.，1991，Mol.Gen.Genet.226，224-232)。

本发明利用甲醇利用型酵母为宿主，通过克隆已知的SAM合成酶基因，本发明实施例利用的是来源于酿酒酵母的SAM合成酶2，但不限于此酶，也可以是其他生物来源的SAM合成酶，或是人工合成的SAM合成酶的突变体。将此酶装配入甲醇利用型酵母的表达载体，并置于强启动子的控制下，这个载体的启动子可以是AOX1也可以是GAP启动子或者是其它任何可以在甲醇利用型酵母细胞内发挥作用的启动子。

此质粒经过线性化后，通过原生质体或电转化的方法转化入甲醇利用型酵母细胞，得到的转化子即为本发明方法所需的基因工程菌株。本发明实施例提供了一种新的菌株，即甲醇利用型的巴斯德毕赤酵母，它的种属为Pichiapastoris。(菌种保藏号为：CGMCC，NO.0648，日期：2001年10月29日，保藏地：北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏条件为：低温冷冻保藏，以甘油或DMSO作为保护剂。)这样该质粒通过同源重组的方式被整合入细胞的染色体DNA，从而使得外源的SAM合成酶能够在重组细胞内稳定地得到表达。这种整合于染色体的重组表达方式比单独复制的质粒表达形式的稳定性强，Hideyuki Ohi的实验表明此类重组菌即便经过83代的连续传代后，染色体组型和蛋白表达量都没有明显的变化(HideyukiOhi，1998，yeast，14：895-903)。

在不少情况下，外源基因整合的拷贝数高的菌株蛋白表达量大于低拷贝或单拷贝的菌株(Clare JJ et al.，1991，Gene，105：205-212)。因此在甲醇利用型酵母中外源蛋白质表达的优化，常常包括分离含有多拷贝基因的菌株。利用带有G418的抗性基因的表达质粒，如pPIC3.5K，可以方便的筛选多拷贝重组菌株，因为重组菌对G418的抗性程度大致与载体的拷贝数相关。故而在一系列不同浓度的G418平板上进行抗性筛选后，我们得到几百株多拷贝的菌株，并通过dot-blot法确定了它们的拷贝数。

在含有适量的甲硫氨酸的液体培养基中培养该工程菌，细胞可以利用培养基中的甲硫氨酸做底物在SAM合成酶的催化下，合成大量的SAM。通过比较培养基中没有甲醇和添加甲醇的不同情况下，细胞内的SAM产量，可以确证外源SAM合成酶在重组细胞中的表达促进了细胞内SAM产量的提高：在没有加入甲醇诱导的条件下，细胞内外源SAM合成酶基本不表达，细胞内的SAM产量和野生宿主细胞相比，也无明显地变化；但当培养基中加入甲醇做碳源后，细胞内的SAM合成酶活力和SAM产量都有了较大的提高。

另外细胞内的SAM含量不仅与SAM合成酶活力有关，还和培养基中的碳源有关，当发酵培养基中不仅补充甲醇作为碳源及诱导剂的同时，还加入甘油这种对甲醇利用型酵母来说是快速利用的碳源时，SAM的产量会有一定的提高。这可以理解为细胞利用这些碳源合成了足量的ATP来供给SAM合成所需。

本发明的效果：

本发明克服了现有的生产SAM的方法中，酿酒酵母细胞内SAM含量很高但单位发酵体积中菌种含量低的缺点，利用甲醇利用型酵母具有的培养基成本低、生物积累量高，大规模发酵可得到极高的细胞密度和生物转化率的特点，运用在甲醇利用型酵母的细胞内表达来源于酿酒酵母的SAM合成酶的技术路线，通过将其置于强启动子的调控下，使细胞内能够产生出大量SAM合成酶，从而使细胞内合成大量的SAM。通过筛选高拷贝转化子，我们得到了比野生菌细胞内SAM合成酶活力提高了10～40倍，其细胞内的SAM含量也相应提高了10～40多倍的重组菌。在优化了试管培养条件后，该菌的SAM产量最高达到1.3-2.1克/升，SAM含量达到0.10-0.20克/克干细胞。

附图说明

图1为重组表达pPIC3.5K-SAM质粒的构建示意图；

图2为重组菌的SAM生产曲线。

具体实施方式

本发明可以通过下述实施例进一步阐明

实验材料和方法简要说明：

1、试剂：实验所用的Taq DNA聚合酶和限制性内切酶均购自GIBCOLBRL和Takara公司。DNA胶回收试剂盒和质粒DNA抽提试剂盒为Promega公司产品。巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris宿主菌GS115以及表达质粒pPIC3.5K为本实验室所保存。其余试剂均为国产分析纯。

2、常规分子生物学操作

酿酒酵母基因组DNA的抽提，酵母细胞转化，基因克隆，斑点杂交法按Ausubel等的方法(Ausubel，F.M.et al，1992，Short protocols in MolecularBiology，2nd edition，P13-43)进行。

实施例1

重组表达SAM合成酶质粒pPIC3.5K-SAM的构建(参见图1)

1、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae染色体DNA的抽提

按照Ausubel等的方法(Ausubel，F.M.et al，1992，Short protocols inMolecular Biology，2nd edition，P13-43)，抽提酿酒酵母染色体DNA。接种酿酒酵母菌株YPH499于5ml YPD培养基(10克/升酵母膏、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖)，28-30℃培养16-24小时。5000rpm/min离心5min，收集菌体。菌体沉淀用0.5ml冷无菌水洗涤后，重悬于0.5ml山梨醇溶液(0.9M山梨醇、0.1MTris-Cl，ph 8.0、0.1MEDTA)，加入50ul的0.3mg/ml的Zymolase和50ul的0.28 M的2-巯基乙醇，混匀后37℃反应1小时。5000rpm离心5min，收集菌体，用0.5ml Tris/EDTA溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)20ml)冷无菌水和20ml 1mol/L的冷山梨醇各洗一次。每次洗后均在5000rpm离心5min并收集菌体。加入50ul 10％SDS，混匀后65℃温育20min。随后加入200ul 5M的醋酸钾，颠倒混匀后，冰上放置30min以上。室温离心3min。将上清转入一个新的离心管，加入1ml的无水乙醇室温离心5min，吸去上清，真空抽干DNA沉淀。加入300ul TE缓冲液重新溶解DNA沉淀。用适量的RNase消化RNA后，加入0.5ml的100％异丙醇，混合溶液直至DNA沉淀析出。将沉淀转移至一个新的离心管，并溶于125ul TE缓冲液中。

2、引物设计及PCR反应

根据GenBank中的Saccharomyces cerevisiae来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶2(SAM合成酶2)基因(登录号为M23368)，设计两条PCR引物：

引物1  5’CA GGATCCACCATGGCCAAGAGCAAAACT3’

引物2  5’ GCGGCCGCGA ATTCAGCCTAGCATAAAGAAA3’

在设计基因5’端引物(引物1)包含了核糖体结合位点，同时引入了一个EcoRI酶切位点。基因3’端引物(引物2)包含了终止密码子TAG附近的序列，并引入了一个BamHI酶切位点。

以酿酒酵母染色体DNA为模板，加入一定量的引物1、引物2、Taq DNA聚合酶及dNTP混合物，PCR反应条件如下：

            94℃，30sec 5个循环  94℃，30sec 30个循环94℃ 5min→→ 40℃，30sec →→→→ 50℃，30sec →→→→ 72℃，10min

          72℃，75sec          72℃，75sec

3、PCR产物的克隆

PCR产物经1％琼脂糖电泳后，采用Promega DNA回收试剂盒回收1.2kb大小的PCR扩增片段。回收的PCR产物经BamHI和EcoRI酶切后，与BamHI/EcoRI双酶切的pUC18相连。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用Promega质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，所得质粒用酶切鉴定。

得到的质粒pUC-SAM，经测序确证与GenBank中发表的SAM合成酶2的基因完全相同。为了筛选高拷贝的方便，选用pPIC3.5K质粒作为巴斯德毕赤酵母中胞内表达SAM合成酶2的载体，这样使得转化了该质粒的菌株具有剂量依赖的G418抗性，以BamHI和EcoRI将SAM合成酶2基因切出，装配入pPIC3.5K中。

实施例2  表达外源SAM合成酶的重组细胞的构建

1、电转化巴斯德毕赤酵母细胞的制备

接种巴斯德毕赤酵母菌株GS115于500ml YPD培养基(1克/升酵母膏、2克/升蛋白胨、2克/升葡萄糖)，28-30℃培养至OD₆₀₀为1.3-1.5，5000rpm/min离心5min，菌体沉淀分别用100ml冷冻无菌水、20ml冷冻无菌水和20ml1mol/L的冷冻山梨醇各洗一次，每次洗后均5000rpm/min离心5min并收集菌体，最后将离心的菌体细胞用200μl 1M冰冻的山梨醇悬浮，即获得电击感受态细胞。

2、重组表达质粒pPIC3.5K-SAM电转化酵母细胞

将构建的重组表达质粒pPIC3.5K-SAM约10μg用SalI酶切线性化，乙醇沉淀回收线性DNA并溶解于10μl无菌水中，同时将空载pPIC3.5K质粒相同酶切线性化并回收作为对照。将上述线性化DNA分别与80μl GS115电转化细胞混合，采用GIBCOL BRL电转化仪CELL-PORATOR电击转化，电转化条件为：电压1500V，电容50μF，电阻4KΩ。立即向电转化杯中加入0.5ml 1mol/L冰浴预冷的山梨醇，并将电转化产物分别转移到一无菌微量离心管中，取200-600μl涂布于MD(13.4g/LYNB，4×10^-4g/L生物素，10g/L葡萄糖，15g/L琼脂糖)平板。30℃培养直到出现单菌落。

3、高拷贝菌株的筛选

在生长出电转化细胞的MD平板上，加入1ml无菌水，用涂布棒耙下菌体。重悬菌液，离心。倾去上清，0.5ml无菌水再重悬。适当稀释后取100μl涂布含有G418(0，0.25，0.5，1.0mg/ml)的YPD平板。30℃培养4-6天。将筛选出的G418抗性菌株，接种于96孔板中的YPD培养基中，30℃培养2天。抽提总DNA，定量后调整各样品浓度相同后，将DNA样品点在尼龙膜上，用P³²标记的SAM合成酶2做探针杂交，根据杂交信号来确定SAM合成酶2的基因的拷贝数。

实施例3  小量快速抽提细胞内SAM

已知细胞浓度的发酵液离心收集菌体，加入与原始发酵液等体积的10％三氯乙酸于4℃抽提一小时以上，12,000g离心10分钟后，将上清用0.2μm的滤膜过滤后，从中取20微升，上样HPLC定量SAM。

实施例4  SAM的高效液相色谱(HPLC)法定量

SAM分子中的硫原子带有正电荷，它的这个特性使它可以用离子交换柱来分析检测。强阳离子型离子交换柱Hypercil 10 SCX(4.6×250mm)，流动相为：0.5M甲酸铵(pH4.0)，流速2.0ml/min，检测254nm的光密度。SAM保留时间为25.4分钟，由于室温和pH的轻微波动，前后偏差1分钟左右。采用外标法，根据不同浓度的SAM标准品的峰面积所做的标准曲线来定量。

实施例5 SAM合成酶活力的测定

在28℃培养5天后，离心收集菌体(3,000g×10min，4℃)，并用裂解缓冲液——含有50mM pH7.4的磷酸钾缓冲液，5％甘油(V/V)，5mM的巯基乙醇和1mM的EDTA(加入1mM的苯甲咪和1mM的PMSF作为蛋白酶抑制剂)，清洗一次。加入菌体一倍体积的酸洗玻璃珠和4倍体积的裂解缓冲液，用超声波(在最大输出，50％的工作周期)于0～4℃处理10分钟，裂解细胞。玻璃珠和细胞残片离心10000g×15分钟除去。粗抽提液经12000g×30分钟离心后，保留上清。

设定1ml的反应混合物，其中含有20mM的L-甲硫氨酸，20mM的ATP，8mM的还原型谷胱甘肽，20mM的MgCl₂，100mM的KCl，150mM的pH7.4的Tris-HCl和适量的细胞裂解液，在37℃温育60分钟。不加入L-甲硫氨酸的反应作为空白对照。反应结束后，加入0.5ml的20％高氯酸溶液，离心除去沉淀。所得到的上清通过HPLC分析SAM的含量。

经过5天的培养及诱导后，测定得到的宿主菌GS115的SAM合成酶活力为0.241μmol/hour/mg，而重组菌的酶活力可达8.87μmol/hour/mg，活力提高了30多倍，参见表1。在没有甲醇诱导的条件下，重组菌中没有外源SAM合成酶表达，细胞内的SAM含量和宿主菌没有显著的差别；而当培养基中加有甲醇时，细胞内的SAM合成酶活力与宿主菌相比提高了30多倍，细胞内的SAM产量也提高了30倍左右。

表1  野生型与重组菌的SAM产量和SAM合成酶活力的比较

	宿主菌GS115	重组菌经甲醇诱导	重组菌不经甲醇诱导
				SAM产量	0.040mg/ml	1.34mg/ml	0.116mg/ml
SAM含量	3.9mg/g dry cell	132mg/g dry cell	12.3mg/g dry cell
				SAM合成酶活力	0.241μmol/hr/mg	8.87μmol/hr/mg	0.534μmol/hr/mg

实施例6  重组菌的SAM生产发酵

将筛选出的Pichia pastoris转化子接种3ml YPD试管，30℃ 300r/min培养过夜，以1％接种量接入含10mL培养基(10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，0.05mol/l磷酸钾缓冲液pH6.0，13.4g/L含有硫酸铵的酵母基本氮源，4×10^-4g/L生物素，2g/L甘油，20g/L甲醇，7.5g/L的L-甲硫氨酸)的50mL离心管中。30℃ 300r/min培养。从第48小时开始每24h补加甲醇到0.5％，补加甘油到0.2％，连续培养6天后，SAM产量达到最高(参见图2)。重组菌的SAM的产量达到1.58克/升，相比较于宿主菌的0.04克/升，产量提高了30多倍(参见表1)。在上述培养条件下，第6天补加0.15％的甲硫氨酸，该重组菌第8天的SAM产量达到1.72克/升。

同样的重组菌在没有甲醇诱导时，也就是说没有重组的SAM合成酶2被诱导表达的情况下，SAM的量与宿主菌比较接近(参见表1)，这正说明正是由于外源SAM合成酶2的表达，直接促进了细胞内SAM累积量的大幅度提高。

需要说明的是，本实施例的巴斯德毕赤酵母在发酵时是个高消耗氧的过程，尤其是在以甲醇作为单一碳源的时候——甲醇的代谢是一个高耗氧的过程，在小试管中发酵并没有完全发挥其高生物累积量的优势(其发酵罐中最高可超过130克/升干细胞)，在本实施例中，菌体干重最高只达到15克/升，因此将本发明的方法运用于工业生产中，基因工程菌的SAM产量还会大大的的增加。

Claims (7)

1.一种生产腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，是用甲醇利用型酵母发酵来生产的，所述的甲醇利用型酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株，由重组表达外源腺苷甲硫氨酸合成酶的载体转化后获得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体包含一个编码腺苷甲硫氨酸合成酶的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体中的腺苷甲硫氨酸合成酶是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的腺苷甲硫氨酸合成酶2。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸序列连接有可以在甲醇利用型酵母细胞内发生作用的AOX1诱导型启动子序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甲醇利用型酵母在发酵生产腺苷甲硫氨酸时利用甲醇作碳源。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的甲醇利用型酵母在发酵生产腺苷甲硫氨酸时补加甘油作碳源以提高腺苷甲硫氨酸产量。

7.一种甲醇利用型的巴斯德毕赤酵母菌株CGMCC No.0648，其种属为Pichia pastoris，其特征在于细胞内转化有重组表达质粒pPIC3.5K-SAM。

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