CN104059863A - 一种高效提高钝齿棒杆菌sypa5-5 l-精氨酸生产能力的代谢改造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效提高钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA5-5L-精氨酸生产能力的代谢改造策略，属于生物技术领域。将SYPA5-5的N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamatekinase,NAGK,argB)中268位的组氨酸突变为天冬酰胺，可有效解除L-精氨酸对NAGK的反馈抑制作用；将突变位点精确引入SYPA5-5基因组的相应位置，获得的抗反馈抑制菌株(H-7)L-精氨酸产量降低，中间代谢产物(L-鸟氨酸及L-瓜氨酸)大量积累。对H-7的arg基因簇进行转录分析，发现argGH转录水平降低。在H-7中对argGH加强表达，获得的重组菌株H-7-GH，L-精氨酸生产能力较SYPA5-5提高99.0%。对H-7-GH的发酵培养基进行初步优化，L-精氨酸产量达45.1g/L，较优化前提高了49.8%，较SYPA5-5提高了1.13倍。解除L-精氨酸对NAGK的反馈抑制，同时加强表达argGH基因的代谢改造策略，有效提高SYPA5-5的L-精氨酸生产能力。

Description

一种高效提高钝齿棒杆菌 SYPA5-5 L- 精氨酸生产能力的代谢改造方法

技术领域

本发明以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5为出发菌株，通过应用解除L-精氨酸对其合成途径限速酶—N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase, NAGK, argB)的反馈抑制作用，同时加强表达argGH基因的代谢改造策略，可有效提高该菌株L-精氨酸生产能力，属于生物技术领域。

背景技术

L-精氨酸(L-Arginine)为半必须氨基酸，是尿素循环的重要中间代谢产物，因具有多种重要的生理功能而广泛应用于医药、食品及化工领域。微生物发酵法有节能环保、易提取分离等优点，具有重要的工业化应用价值。

目前，全世界L-精氨酸需求量在15000吨以上，而实际发酵法生产L-精氨酸达仅有8000吨，生产地主要集中于日本及欧洲等国家，而且需求量以12%-15%的速度增长。我国虽然有一些厂家可以生产L-精氨酸，但是大多数厂家都是粗品氨基酸精制，且产量非常有限，绝大多数L-精氨酸依赖于进口，L-精氨酸的价格约为14万人民币/吨。L-精氨酸是国内氨基酸发酵工业的瓶颈，通过选育L-精氨酸高产菌株，实现发酵法生产迫在眉睫。

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5是本研究室经过多级诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，以葡萄糖为主要碳源，发酵96h，可积累约30 g/L L-精氨酸。与工业生产的L-精氨酸生产菌株相比，该菌株仍然存在L-精氨酸生产能力低，发酵周期长的缺点，仍需进一步改造以提高L-精氨酸生产能力及缩短发酵周期。

代谢工程技术作为理性改造的重要手段广泛应用于工业微生物的改造，也成功应用于L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸等氨基酸高产菌株的构建。本研究以SYPA5-5为出发菌株，运用代谢工程手段，对其L-精氨酸合成途径的限速步骤实施改造，探讨改造后菌株代谢发生变化的机制，强化L-精氨酸的合成途径。

发明内容

本发明提供一种有效提高钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5积累L-精氨酸的代谢改造策略。该策略以SYPA5-5为出发菌株，通过应用解除L-精氨酸对其合成途径限速酶—N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase, NAGK, argB)的反馈抑制作用，同时加强表达argGH基因的代谢改造策略，可有效提高该菌株L-精氨酸生产能力。本发明提供的方法属于基金项目：国家863资助项目（No. 2012AA022102）的研究内容。

具体的发明方案如下：

1.在SYPA5-5中解除L-精氨酸对NAGK的反馈抑制作用

(1) 构建重组质粒pK18mobsacB-argB_H268N

从NCBI中获取argBD序列，设计相关引物，以SYPA5-5基因组为模板，并以argB-F/H268N-R、H268N-F/argD-R为引物，分别扩增获得H268N-5'/ H268N-3'同源片段，以同源片段为模板，以argB-F/argD-R为引物，扩增获得有H268N突变点的argBD片段，约1863 bp。将该突变片段连入pK18mobsacB质粒，获得重组质粒pK18mobsacB-argB_H268N。

引物序列如下所示：

引物名称	引物序列 (5′-3′)
		argB-F	GCGGATCCATGAATGACTTGATCAAAG
argD-R	CTGGATCCCTCGAGGAAGATAGCAGC
		argB-R	GAGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG
H268-F	GTAAGTGCTGCTAACGTCATTGAC
		H268-R	GTCAATGACGTTAGCAGCACTTAC

(2) 抗反馈抑制菌株SYPA5-5-NAGK_H268N (简称：H-7)的构建

将pK18mobsacB- argB_H268N电转化入SYPA5-5中。经两次同源重组，对获得的转化子抽提基因组，以argB-F/argB-R引物扩增argB序列，PCR产物经纯化后测序，选取正确突变的转化子，保存，备用。

2. 重组菌株H-7的发酵特性研究

通过摇瓶分批发酵的方式，比较出发菌株SYPA5-5及重组菌株H-7的发酵过程。每隔8h取一次样，检测发酵液中相关参数。具体发酵方案如下所示：

(1) 摇瓶种子培养：保存于斜面的菌株，划线到肉汤平板上，置于30 ℃培养箱中培养24 h，挑取菌体，接种至摇瓶种子培养基中，置于30 ℃ 120 rpm往复式摇床上培养12-16 h，至OD_562nm约为15。肉汤培养基组分(g/L)：葡萄糖 20；蛋白胨 10；牛肉膏 10；酵母粉5；NaCl 5；琼脂粉20；pH 7.0～7.2；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。种子培养基组分(g/L)：葡萄糖 30；玉米浆 20；(NH₄)₂SO₄ 20；KH₂PO₄ 1；MgSO₄·7H₂O 0.5；尿素 1.5；pH 7.0～7.2；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

(2) 摇瓶分批发酵：将培养好的种子按5%的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，置于30 ℃ 120 rpm往复式摇床上培养96 h，发酵至24 h补加50 g/L葡萄糖。摇瓶发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖(分消) 100；酵母粉10g/L；(NH₄)₂SO₄ 50；KH₂PO₄ 1.5；MgSO₄.7H₂O 0.5；FeSO₄·7H₂O 0.02；MnSO₄·H₂O 0.02；生物素 8 ×10^-5；L-组氨酸5×10^-4；CaCO₃ 30；pH 7.0～7.2；115 ℃高压蒸汽灭菌7 min。

(3) 发酵参数检测：

A. 生物量：用0.25 mol/L HCl对发酵液进行适当倍数稀释后，紫外分光光度计测定OD_562nm，OD值与菌体干重的关系为1 OD_562nm = 0.375 g(DCW)/L。

B.游离氨基酸含量：将发酵液进行适当倍数稀释后，用异硫氰酸苯酯对氨基酸进行衍生化，以HPLC检测各游离氨基酸的含量。

C. 葡萄糖含量：将发酵液进行适当倍数稀释后，用DNS方法测定。

D. 硫酸铵含量：将发酵液进行适当倍数稀释后，用苯酚次氯酸钠方法测定。

3. 重组菌株H-7中L-精氨酸生物合成相关基因的转录分析

将重组菌H-7及出发菌SYPA5-5培养至对数生长期，抽提总RNA，经DNaseI消化后，经逆转录得cDNA，以SYBR Green荧光染料法对L-精氨酸生物合成相关的8个基因进行相对定量分析。

4. argGH基因在重组菌H-7中的加强表达

从NCBI中获得argGH的基因序列，设计引物P-F-10∆17及P-R-10，以SYPA5-5基因组DNA为模板扩增argGH序列，与表达质粒pDXW-10连接，构建重组质粒pDXW-10-argGH。将该重组质粒电转至H-7及SYPA5-5中，涂布于含卡那霉素抗性的平板上，获得转化子经培养后，抽提质粒并酶切验证，获取重组菌株SYPA5-5-argGH (简称：5-GH)及H-7-argGH(简称H-7-GH)。测定重组菌株argGH的转录水平，及其编码的精胺琥珀酸合成酶及精胺琥珀酸裂解酶的酶活。

5. 重组菌株H-7-GH的发酵特性研究

按照方法2中所述的发酵方案，对出发菌株SYPA5-5及重组菌株H-7及H-7-GH进行发酵过程研究。每隔8h取样，检测相关发酵参数。

6. 重组菌株H-7-GH的发酵培养基优化

按照方法2中所述的发酵方案，添加不同浓度酵母粉、牛肉膏及蛋白胨等对重组菌株H-7-GH的发酵培养基进行优化。

附图说明

图1 重组菌株H-7的构建过程；(A) pK18mobsacB-argB_H268N的构建过程; M: DL2000; 1: H268N-5'同源臂; 2: H268N -3'同源臂 (B) 转化子的筛选；M: DL2000; 1-8:以不同转化子的基因组扩增argB片段;

图2出发菌SYPA5-5及重组菌R-8、H-7发酵过程研究

■SYPH5-8; ●R-8; ▲H-7;

(A) 生物量; (B) L-精氨酸; (C) L-瓜氨酸; (D) L-鸟氨酸; (E) 葡萄糖; (F) 硫酸铵;

图3重组菌株H-7中与L-精氨酸合成相关基因的转录分析

分别表示 H-7和SYPA5-5 。

图4重组质粒pDXW-10-argGH的构建；M: DL5000； 1: 扩增argGH片段； 2: T-argGH单酶切； 3: T-argGH双酶切；4: pDXW-10-argGH双酶切；M:λHindⅢ。

图5对SYPA5-5、5-GH及H-7-GH发酵过程参数测定

■ SYPH5-8； ● 5-8-GH；▲ H-7-GH；

(A) 生物量； (B) L-精氨酸； (C) 葡萄糖； (D) 硫酸铵。

图6酵母粉对H-7-GH生长及发酵产L-精氨酸的影响

分别表示葡萄糖含量；L-精氨酸含量；生物量。

图7牛肉膏对H-7-GH发酵产L-精氨酸的影响

分别表示葡萄糖含量；L-精氨酸含量；生物量。

具体实施方式

实施例1. 在SYPA5-5中解除L-精氨酸对NAGK的反馈抑制作用

(1) 重组质粒pK18mobsacB-argB_H268N的构建

从NCBI中获取argBD序列，设计相关引物，以SYPA5-5基因组为模板，并以argB-F/H268N-R、H268N-F/argD-R为引物，分别扩增获得H268N-5'/ H268N-3'同源片段，以同源片段为模板，以argB-F/argD-R为引物，扩增获得有H268N突变点的argBD片段，约1863 bp。将该突变片段连入pK18mobsacB质粒，获得重组质粒pK18mobsacB-argB_H268N，结果如图1(A)所示。

(2) 抗反馈抑制菌株H-7的构建

将pK18mobsacB- argB_H268N重组质粒通过电转化入SYPA5-5中。经两次同源重组，各挑取12个经第二次重组的转化子，于液体LB中培养后，抽提基因组，分别以argB-F/argB-R扩增以上转化子的argB基因 (图1B)，PCR产物经纯化后，进行测序。测序结果显示H-7含有正确的突变位点。以筛选获得的突变株的基因组为模板，扩增argBD及上下游各700 bp的片段，获得长度为约为3200 bp的基因片段，经纯化后测序，除了相应位点存在突变外，其它位点均无任何突变，也没有引入任何序列，说明应用pK18mobsacB可将突变点精确引入argB基因内的相应位点。

实施例2. 重组菌株H-7的发酵特性研究

对出发菌株SYPH5-8及重组菌H-7进行摇瓶发酵，每隔8 h取样，结果如图2所示。由图2 (A)可见，在整个发酵过程中，重组菌株的生物量均较出发菌株低。由图2 (B)可见，重组菌株H-7的L-精氨酸产量为26.5 g/L，较出发菌株(30.6 g/L)分别降低了13.4%。如图2 (C, D)所示，重组菌株大量积累L-瓜氨酸及L-鸟氨酸，L-瓜氨酸的积累量达7.82 g/L，较出发菌株(1.56 g/L)分别提高4.0倍，L-鸟氨酸积累量达2.97 g/L，较出发菌株(0.80 g/L)分别提高了2.7倍。同时，重组菌株的葡萄糖[图2(E)]及硫酸铵[图2(F)]消耗速率均较出发菌株低。L-赖氨酸作为出发菌株主要的副产物，积累3.36 g/L，但重组菌株积累1.18 g/L，降低了1.8倍[图2(H)]。

实施例3. 重组菌株H-7中与L-精氨酸合成相关基因的转录分析

对重组菌H-7的arg 基因簇中各个基因的转录进行分析，结果如图3所示。argCJBDF转录单元中相关基因的转录水平无显著变化，但argG的转录水平分别下降4.3倍，argH的转录水平下降2.6倍。argG编码的精胺琥珀酸合成酶(ASS)及argH编码的精胺琥珀酸裂解酶(ASL)的酶活力也有下降。以上结果说明SYPA5-5基因组上的argB基因的H268N位点精确突变，解除L-精氨酸对NAGK的反馈抑制作用，可导致argGH的转录水平降低，进而引起ASS及ASL的酶活力降低，推测其可能是引起L-瓜氨酸积累的主要因素。

实施例4. argGH基因在重组菌H-7中的加强表达

从NCBI中获得argGH的基因序列，设计引物P-F-10∆17及P-R-10，以SYPA5-5基因组DNA为模板扩增argGH序列，共计2700 bp，将argGH与pDXW-10连接，获得重组质粒pDXW-10-argGH (图4)。将该重组质粒电转至H-7及SYPA5-5中，涂布于含卡那霉素抗性的平板上，获得转化子经培养后，抽提质粒并酶切验证，获取重组菌株SYPA5-5-argGH (简称：5-GH)及H-7-argGH(简称H-7-GH)。

实施例5. 重组菌H-7-GH的发酵特性研究

对SYPH5-8、5-GH、及H-7-GH进行发酵过程研究，每隔8 h取样检测，结果如图5所示。在发酵过程中，由于硫酸铵消耗速度较快，成为后期菌株发酵产L-精氨酸的主要限制因素，所以以硫酸铵耗尽为标志，终止发酵。

由图5(A)可见，H-7-GH菌体生长速率较出发菌株及5-GH均低，在整个发酵过程中，H-7-GH的最大比生长速率分别为0.550 h^-1，较SYPA5-5 (1.19 h^-1)降低了1.16倍，较5-GH(0.942 h^-1)降低了0.71倍，以上研究结果表明，argGH加强表达后可略微引起菌株生长速率降低，但解除L-精氨酸对NAGK反馈抑制作用仍是引起菌株生长延滞的主要因素，并且不能通过加强表达argGH解除。由图5(B)可见，H-7-GH的L-精氨酸生成速率显著提高，发酵至64 h即可达34.4 g/L，L-精氨酸生产能力为39.5 mg/(g h)，较SYPA5-5 [21.4 mg/(g h)]提高了84.6%，较5-GH [26.0 mg/(g h)]提高了约51.9%。由图5(C)可见，H-7-GH的葡萄糖消耗速率低，糖酸转化率(Yp/s)为0.609 g/g，较SYPA5-5 (0.306 g/g)提高了约99.0%，较5-GH (0.399 g/g)提高了约52.6%，与L-精氨酸生产能力的结果相一致。由图5(D)可见，上述两株菌的硫酸铵消耗速率高于SYPA5-5及5-GH。由于L-精氨酸含有一个胍基中存在三个N原子，主要来源于硫酸铵，L-精氨酸积累速率的提高可引起硫酸铵的消耗速率加快。

实施例6. 重组菌H-7-GH的发酵培养基优化

分别添加8、10、12、14、16、18、20 g/L酵母粉，发酵64 h后终止，结果如图6所示，酵母粉为14 g/L时，L-精氨酸的产量最高达39.4 g/L，较基础培养基(30.1 g/L)，提高了30.9%；生物量为19.9 g/L，较基础培养基(14.1 g/L)提高了41.1%；同时，葡萄糖消耗速率加快，糖酸转化效率为43.8%。而继续增加酵母粉浓度，L-精氨酸的产量降低。所以酵母粉的最适添加浓度为14 g/L。

在含有14 g/L酵母粉的培养基中，分别添加0、2、4、6、8、10、12 g/L牛肉膏，发酵64 h后终止，结果如图7所示。当牛肉膏添加量为8 g/L时，L-精氨酸产量最高达45.1 g/L，较对照(不添加牛肉膏)的38.5 g/L提高了17.1%，糖酸转化率为44.7%。所以选择牛肉膏的添加量为8 g/L。

综上所述，通过培养基逐级优化的策略，发现酵母粉及牛肉膏的添加有利于菌体的生长及L-精氨酸的积累。培养基中酵母粉的最适添加量为14 g/L，牛肉膏的最适添加量为8 g/L，菌体生物量约为19.9 g/L，与优化前提高了约41.1%，L-精氨酸产量为45.1 g/L，较优化前(30.1 g/L)提高了约49.8%，糖酸转化率为44.7%，较原SYPA5-5的21.2g/L提高了1.13倍。

Claims (9)

1.一种高效提高钝齿棒杆菌SYPA5-5 L-精氨酸生产能力的代谢改造方法，其特征为：通过应用解除L-精氨酸对钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5合成途径限速酶—N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase, NAGK, argB)的反馈抑制作用，同时加强表达argGH基因的代谢改造策略，有效提高其L-精氨酸生产能力。

2. 根据权利要求1中的代谢改造方法，其特征为：将SYPA5-5的NAGK中的268位组氨酸突变为天冬酰胺(H268N)，有效降低NAGK对L-精氨酸的敏感性。

3.根据权利要求1中的代谢改造方法，其特征为应用pK18mobsacB质粒将H268N的突变位点精确引入SYPA5-5的基因组argB中的相应位点，获得抗反馈抑制菌株。

4. 权利要求3中所述的重组菌株进行发酵的方法，其特征为：

(1) 种子活化：将斜面保存的菌种划线于肉汤斜面中，30℃静置培养24 h；肉汤培养基组分 (g/L)：葡萄糖 20；蛋白胨 10；牛肉膏 10；酵母粉5；NaCl 5；琼脂粉20；pH 7.0～7.2；121 ℃ 高压蒸汽灭菌20 min；

(2) 摇瓶种子：将活化后的种子，挑取一环接种摇瓶种子培养基中，30℃ 120 rpm往复式摇床培养 12-16 h，至OD_562nm约为15；种子培养基组分(g/L)：葡萄糖 30；酵母粉 10；(NH₄)₂SO₄20；KH₂PO₄ 1；MgSO₄·7H₂O 0.5；尿素 1.5；pH 7.0～7.2；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min；

(3) 摇瓶发酵：将液体种子按5%的接种量接种至发酵培养基，30℃ 120 rpm往复式摇床培养 96 h；摇瓶发酵培养基组分 (g/L)：葡萄糖(分消) 150；酵母粉 10；(NH₄)₂SO₄ 50；KH₂PO₄1.5；MgSO₄.7H₂O 0.5；FeSO₄·7H₂O 0.02；MnSO₄·H₂O 0.02；生物素 8 ×10^-5；L-组氨酸5×10^-4；CaCO₃ 30；pH 7.0～7.2；115 ℃高压蒸汽灭菌7 min。

5.权利要求4中所述的抗反馈抑制菌株的发酵方法，其特征为：菌株生长缓慢，L-精氨酸产量降低，中间代谢产物L-鸟氨酸及L-瓜氨酸大量积累。

6.权利要求3中所述抗反馈抑制菌株负责L-精氨酸合成的arg基因簇进行转录的方法，其特征为：argCJBDF的转录水平基本不变，argGH的转录水平大幅度降低。

7.根据权利要求1中所述的代谢改造方法，其特征为：在抗反馈抑制菌株中加强表达argGH基因，获得重组菌株。

8.权利要求7中所述重组菌株，其特征为：argGH的编码基因ASS及ASL的转录水平及酶活水平大幅度提高；L-瓜氨酸及L-鸟氨酸的积累量降低；L-精氨酸的生产能力大幅度提高，但菌体生物量仍较低。

9.权利要求7中所述重组菌株的发酵方法，其特征为，优化培养基中酵母粉的浓度并添加适量的牛肉膏进行发酵，菌体生物量及L-精氨酸的产量均大幅度提高。