CN109856127A - 一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，属于生物检测技术领域；本发明将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD522，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量；本发明方法具有直观、简便快速、重复性好和检测成本低等特点，适用于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法。
背景技术
乙偶姻（Acetoin，AC），又名为3-羟基-2-丁酮，是一种淡黄色或无色液体，具有令人愉快的奶油香气。根据JECFA（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会）和美国FDA（Food andDrug Administration，食品药品监督管理局）规定，乙偶姻是一种公认安全（GenerallyRecognized as Safe，GRAS）的食品级香料，添加到食物中，可提升食物中的奶香味。同时，乙偶姻是美国能源部优先开发的平台化合物之一，广泛应用于功能材料、手性药物和化学中间体合成等领域。
乙偶姻天然痕量存在于葡萄、草莓、苹果、香蕉、蜂蜜、咖啡和奶酪等食物中，同时是众多微生物的次生代谢产物。在微生物细胞中，糖酵解后产生的丙酮酸，在α-乙酰乳酸合酶作用下生成α-乙酰乳酸，后者在α-乙酰乳酸脱羧酶（Alpha-acetolactatedecarboxylase，Ald）催化作用下生成乙偶姻。目前，ald基因被广泛克隆进大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸乳球菌和丙酮丁醇梭菌等模式微生物中，通过增强ald基因表达，以提高乙偶姻产量（Kandasamy et al., 2016；马红武等，2014；Shen et al., 2016；张显等，2015）。
全细胞生物催化是利用微生物细胞将底物转化为特定产物，其本质是利用微生物细胞内的酶进行催化；相比酶催化，全细胞生物催化免去了酶分离纯化等过程，并且不需要额外提供催化过程中所需要的辅因子，所以有效降低了催化成本、提高了催化效率。构建ald基因和其他基因同时过表达菌株，以这些基因工程菌进行全细胞生物催化反应，不仅能提高反应的稳定性，还能极大提高乙偶姻产量（Kandasamy et al., 2016；Li et al.,2014；李欣等，2017）。
目前，生物产乙偶姻检测方法主要有气相色谱法、蒸馏比色法和高效液相色谱法等，这些方法均较为繁琐复杂。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，在碱性条件下，乙偶姻能与α-萘酚和肌酸制备的显色剂反应生成红色物质，且在一定范围内乙偶姻的量和红色物质颜色的深浅程度成正比关系，可用于比色测定，因此检测OD522值的变化就可测定样品中乙偶姻生成的量，即本发明是将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD522，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量；该方法具有直观、简便快速、重复性好和检测成本低等特点。
所述显色剂是按体积比1:1～2:1的比例，将质量体积浓度0.07～0.5%肌酸-NaOH溶液与质量体积浓度0.5～2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，现配现用。
上述方法的具体步骤如下：
（1）底物α-乙酰乳酸的制备
按体积比55:40:5的比例，将NaOH溶液、灭菌蒸馏水和α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯充分混匀后，在冰水浴中反应15～20 min制得，其中NaOH溶液的浓度为0.5～2 mol/L；该底物现配现用。
（2）全细胞生物催化剂的制备
按体积比1～4‰的比例，将产乙偶姻的能力菌接种于该能力菌生长培养基中，静置培养12～16 h；取活化好的菌液接种于液体生长培养基中，再静置培养至OD600为0.4～0.5；按10 mL/管分装培养菌液，在每管培养菌液中加入乳酸链球菌素至其终浓度为15～25 ng/mL，静置诱导4～6 h；离心收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤1～2次，离心去上清后，再用24mL PBS缓冲液重悬菌体，即得全细胞生物催化剂液体；
所述产乙偶姻的能力菌为含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald或其他能合成乙偶姻的菌种。
（3）全细胞生物催化合成乙偶姻的方法选自如下之一：
A、取1管步骤（2）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，以该菌体量为全细胞生物催化产生乙偶姻的基准菌体量，再从全细胞生物催化剂液体中分别取6 mL、3 mL、1.5 mL、0.75 mL、0.325 mL、0.1625 mL离心收集菌体，收集的菌体量为基准菌体量的1/4～1/128；另外，用MES缓冲液稀释底物α-乙酰乳酸100倍；取该底物溶液3 mL，分别加入上述离心收集的菌体中，在能力菌培养温度下转化40～60 min；将2 mL转化后反应液转移至离心管中，置于冰水浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，然后离心收集上清液，即得到全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；
超声波细胞粉碎机破碎细胞条件为超声温度20～25℃，超声功率316～475 W，超声程序：变幅杆Φ3 mm，超声开5～7 s，超声关3～5 s，共超声2～3 min；
B、取步骤（2）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体至OD600为130～150，制得菌悬液；在60 g蒸煮大豆中加入2～3 mL菌悬液，再添加37.5～50 ng 乳酸链球菌素，搅拌混匀后，置于30～40℃下发酵24 h，然后在4～5℃下后发酵24 h；称取发酵大豆10～12 g，充分研磨后转入离心管中，加入10～12 mL灭菌蒸馏水进行超声处理，离心收集上清液，残渣再加入10 mL灭菌蒸馏水超声提取1次，合并上清液，并用灭菌蒸馏水定容至25 mL，即得全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；
所述蒸煮大豆是选取颗粒饱满、粒径大小基本一致，没有虫蛀、霉变，表皮不皱缩、有光泽的大豆，将大豆与蒸馏水按质量体积比1:3～1:6的比例混合，室温下浸泡12～16 h，沥干后置于加压蒸汽灭菌锅中115～121℃蒸煮30～40 min制得；
所述超声处理条件为功率200 W，工作频率53 kHz，超声时间30 min～35 min。
（4）制备浓度在0～16 mg/L范围内的乙偶姻标准品溶液，取400 μL乙偶姻标准品溶液与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴显色反应40～60 min，测定OD522值，以乙偶姻浓度为横坐标，OD522值为纵坐标绘制标准曲线，制作工作曲线，得到线性回归方程；
（5）乙偶姻产量检测
取步骤（2）全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液400 μL与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴中显色反应40～60 min，立刻在522 nm处测吸光度值；同时设置对照组，即用400μL MES缓冲液代替乙偶姻溶液进行显色反应；根据步骤（3）乙偶姻标准品的线性回归方程，计算得到样品中乙偶姻含量，其中针对步骤（2）A方法选取OD522值为0.8～1.4的样品作为计算样品；由于乙偶姻与显色剂显色反应会随温度变化而变化，温度越高颜色越深，故每次实验均设置对照组进行平行试验，即用400 μL MES缓冲液代替乙偶姻溶液进行显色反应；所以计算乙偶姻含量时，样品实际OD522值为样品测量值减去对照组测量值。
所述离心收集菌体的离心是在4℃、10,000 rpm下进行10min。
本发明所述重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald为本实验室前期利用常规基因工程手段构建；将来源于食源性植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L8（保藏号为CCTCC M2017457，该菌株已经在其他文献中公开过）的α-乙酰乳酸脱羧酶基因（见SEQ ID NO:1）克隆至乳酸菌表达质粒pNZ8048（市购）中，然后将该质粒转化至乳酸乳球菌NZ9000（市购）中，得到含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald，该重组菌被nisin诱导产生α-乙酰乳酸脱羧酶，该酶催化α-乙酰乳酸产生乙偶姻。
上述重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald培养用的GM17C培养基包含：胰蛋白胨5g/L、大豆蛋白胨5 g/L、Lab-Lemco powder 5 g/L、酵母粉2.5 g/L、抗坏血酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、甘油磷酸二钠19 g/L、葡萄糖5 g/L、氯霉素0.01 g/L。
本发明中所用到的PBS缓冲液配方为：2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、137mmol/L NaCl、2 mmol/L KH2PO4，pH=7.4。
本发明中所用到的MES缓冲液配方为：0.05 mol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸（即MES）、0.5 mol/L NaCl、0.05% Brij 35、pH=6.0，0.45μm滤膜过滤除菌后，4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
（1）本发明提供了一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法；（2）本发明所述方法使乙偶姻测定更直观、简便快速，重复性好；与GC-MS分析方法相比，本方法需要的仪器设备简单，检测成本更低，对操作人员要求不高；（3）本发明所述方法不仅适用于测定全细胞生物催化合成的乙偶姻，还适用于发酵豆制品、饮料、乳制品、泡菜等食品中乙偶姻的日常检测。
附图说明
图1为温度对全细胞生物催化α-乙酰乳酸底物产生乙偶姻的影响结果；**表示相对于28℃，乙偶姻浓度在0.01水平具有显著性差异；
图2为发酵大豆中全细胞生物催化反应制备的乙偶姻含量结果；**和***分别表示乙偶姻浓度在0.01和0.001水平具有显著性差异。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂等，如无特殊说明均从商业途径得到；下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。
实施例中所用GM17C培养基（g/L）配方为：胰蛋白胨5 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、Lab-Lemco powder 5 g/L、酵母粉2.5 g/L、抗坏血酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、甘油磷酸二钠19 g/L、葡萄糖5 g/L、氯霉素0.01 g/L；
PBS缓冲液配方为：2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、137 mmol/L NaCl、2 mmol/LKH2PO4，pH=7.4；
MES缓冲液配方为：0.05 mol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸（即MES）、0.5 mol/L NaCl、0.05% Brij 35、pH=6.0，0.45μm滤膜过滤除菌后，4℃保存。
实施例1：显色剂的制备
按体积比1:1的比例，将质量体积浓度0.2%肌酸-NaOH溶液与质量体积浓度2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于1mol/L NaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于1mol/L NaOH溶液中制得，立即使用，即现配现用。
实施例2：乙偶姻标准曲线绘制
精确称取乙偶姻0.1 g移入100 mL容量瓶中，用灭菌蒸馏水溶解并定容至100 mL，由此制得乙偶姻储备液；使用时，用灭菌蒸馏水稀释成浓度为0、1、2、4、6、8、10、12、14和16 mg/L的乙偶姻工作液；分别取400 μL工作液于试管中，向每根试管中加入4.6 mL显色剂，混匀，25℃水浴显色反应50 min，在522 nm处测定吸光值；以乙偶姻浓度为横坐标，OD522值为纵坐标绘制标准曲线；此标准曲线的线性回归方程为：y=0.0195x+0.0025，R2=0.9992。由线性相关系数可以看出，乙偶姻浓度与OD522值之间均具有良好线性关系，可以用于样品中乙偶姻浓度测定。
实施例3：全细胞生物催化剂制备
从-80℃冰箱中取出含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald保藏液，按4‰体积比接种于GM17C培养基中，30℃静置培养15 h；取4 mL活化好的菌液接种于100 mL GM17C培养基中，30℃静置培养至OD600为0.4～0.5；按10 mL/管分装，然后每管加入乳酸链球菌素至终浓度为20 ng/mL，30℃静置诱导4 h；在4℃、10,000 rpm下离心10min，收集菌体，每管菌体用24 mL PBS缓冲液洗涤1次，离心去上清后，再用24 mL PBS缓冲液重悬菌体，得到全细胞生物催化剂液体；
其中含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald采用常规方法构建，将来源于食源性植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）L8的α-乙酰乳酸脱羧酶基因（见SEQ ID NO:1）克隆至市购乳酸菌表达质粒pNZ8048中，然后将该质粒转化至市购乳酸乳球菌NZ9000中，得到含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald。
实施例4：底物α-乙酰乳酸的制备
在三角瓶中按照体积比55:40:5的比例分别加入1 mol/L NaOH、去离子灭菌水和α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯，充分混匀后，在冰水浴中反应15 min，制得底物α-乙酰乳酸，制备好后，立即使用，即现用现配。
实施例5：全细胞生物催化α-乙酰乳酸制备乙偶姻及乙偶姻含量测定
取1管实施例3中制得的全细胞生物催化剂液体，在4℃、10,000 rpm下离心10 min，彻底弃上清，收集菌体，该菌体量为全细胞生物催化产生乙偶姻的基准菌体量；然后再从实施例3的另一管全细胞生物催化剂液体中分别取6 mL、3 mL、1.5 mL、0.75 mL、0.325 mL、0.1625 mL菌悬液，在4℃、10,000 rpm下离心10 min，收集菌体，这些菌体相当于基准菌体量的1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128倍；另外，用MES缓冲液稀释实施例4中制得的底物α-乙酰乳酸100倍；取稀释后底物溶液3 mL，分别加入上述7个离心收集的菌体中，在30℃下转化60 min；将2 mL转化后反应液转移至5 mL离心管中，再置于冰水浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，破碎条件为超声温度23℃，超声功率475 W，超声程序：变幅杆Φ3 mm，超声开6s，超声关4 s，共超声2 min；然后4℃、12,000 rpm下离心15 min，收集上清液，取上清液400μL与4.6 mL实施例1显色剂充分混匀，25℃水浴显色反应50 min，立刻在522 nm处测吸光度；根据标准曲线线性回归方程和OD522值，计算全细胞催化产生的乙偶姻含量；
在底物稀释100倍前提下，配比不同稀释倍数的菌体悬浮液，以确保底物过量；结果显示，菌体稀释到8倍以后，OD522值越来越小（下表），说明从8倍起，底物就已经过量了；为保证底物在多种实验条件下均充足，选取OD522值为1.269的稀释16倍的样品作为测定样品，进行后续实验；
。
实施例6：温度对全细胞生物催化α-乙酰乳酸底物产生乙偶姻的影响
从实施例3制得的全细胞生物催化剂液体中取1.5 mL菌悬液，即菌体稀释16倍，在4℃、10,000 rpm下离心10 min收集菌体；将实施例4制得底物稀释100倍，取3 mL加入收集的菌体中，在28、30、35、37和40℃下转化60 min；然后将2 mL转化后反应液转移至5 mL离心管中，再置于冰水浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声温度为23℃，超声功率为475 W，超声程序：变幅杆Φ3 mm，超声开6 s，超声关4 s，共超声2 min；然后4℃、12,000 rpm下离心15 min收集上清液；取上清液400 μL与4.6 mL实施例1显色剂充分混匀，25℃水浴显色反应50 min，立刻在522nm处测吸光度；根据标准曲线线性回归方程和OD522值，计算乙偶姻含量；结果如图1所示，随着转化温度升高，乙偶姻产量先增加后减少，在35℃达到最高值，为103.513 mg/L，说明本发明建立的方法具有可行性。
实施例7：发酵大豆全细胞生物催化反应制备乙偶姻及乙偶姻含量测定
选取颗粒饱满、粒径大小基本一致，没有虫蛀、霉变，表皮不皱缩、有光泽的大豆，置于敞口烧杯中，按大豆与蒸馏水的质量体积比为1:3的比例，向烧杯中加入蒸馏水，室温下浸泡16 h，沥干水分后用纱布将烧杯口封闭，置于加压蒸汽灭菌锅中121℃蒸煮40 min，制得蒸煮大豆；取3管实施例3的全细胞生物催化剂液体，在4℃、10,000 rpm下离心10 min收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体至OD600为140，制得菌悬液；取2.5 mL该菌悬液接种于60 g冷却至室温的蒸煮大豆中，灭菌玻璃棒搅拌混匀，分别置于30℃和40℃恒温培养箱中发酵24 h，然后在4℃冷库中后发酵24 h，该组实验作为实验组1；
同时，在60 g蒸煮大豆中除加入2.5 mL菌悬液外，再添加50 ng乳酸链球菌素（nisin），灭菌玻璃棒搅拌混匀后，分别置于30℃和40℃恒温培养箱中发酵24 h，然后在4℃冷库中后发酵24 h，该组实验作为实验组2；
分别称取实验组1和实验组2发酵后的大豆10 g，充分研磨后分别转入50 mL离心管中，加入10 mL灭菌蒸馏水，于超声波清洗器中处理30 min（超声功率200 W，工作频率53 KHz），然后在4℃、10,000 rpm下离心10 min收集上清液，残渣再加入10 mL灭菌蒸馏水超声提取一次，合并两次上清液，并用灭菌蒸馏水定容至25 mL；取该溶液400 μL与4.6 mL显色剂充分混匀，25℃水浴显色反应50 min，测定OD522值；根据标准曲线线性回归方程和OD522值，测定全细胞生物催化大豆产生的乙偶姻含量。
结果发现，在相同发酵温度下，实验组2乙偶姻产量高于实验组1；在相同实验组中，30℃发酵温度利于乙偶姻产生；实验组2在30℃发酵时，乙偶姻产量最高，为79.427 mg/L（图2），说明在全细胞生物催化剂制备过程和大豆发酵过程中添加nisin会促进乙偶姻产生，这应该与nisin诱导重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald表达产生α-乙酰乳酸脱羧酶密切相关。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌L8(Lactobacillus plantarum L8)
<400> 1
atggacacaa caacaatttt tcaacacggc acattaggct tacttgttcc cggattattt 60
gacgggacga ttacggctgg tgaactctta acccatggtg atacgggtat tgggacgtta 120
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acggcaacac aaccggaatt caccggtgaa catgttgacg gaacgattat tggctactac 480
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caacattttg ctgactttca tgtgcacttg ccaatcgaca atgaagcgta cttacaagaa 660
caatttgata atgaaaccat tgatcatgcc attaataaag ctgaacgttg a 711
Claims (9)
1.一种快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：将全细胞生物催化反应合成的乙偶姻与显色剂混合进行显色反应，测定反应后混合液的OD522，并根据乙偶姻标准品的吸光度标准曲线，计算合成样品中乙偶姻含量。
2.根据权利要求1所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：显色剂是按体积比1:1～2:1的比例，将质量体积浓度0.07～0.5%肌酸-NaOH溶液与质量体积浓度0.5～2% α-萘酚-NaOH溶液混合制得，其中肌酸-NaOH溶液是肌酸溶解于0.5～2 mol/LNaOH溶液中制得，α-萘酚-NaOH溶液是α-萘酚溶解于0.5～2 mol/L NaOH溶液中制得，现配现用。
3.根据权利要求1或2所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）全细胞生物催化剂的制备
按体积比1～4‰的比例，将产乙偶姻的能力菌接种于该能力菌生长培养基中，静置培养12～16 h；取活化好的菌液接种于液体生长培养基中，再静置培养至OD600为0.4～0.5；按10 mL/管分装培养菌液，在每管培养菌液中加入乳酸链球菌素至其终浓度为15～25 ng/mL，静置诱导4～6 h；离心收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤1～2次，离心去上清后，再用24mL PBS缓冲液重悬菌体，即得全细胞生物催化剂液体；
（2）全细胞生物催化合成乙偶姻的方法选自如下之一：
A、取1管步骤（1）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，以该菌体量为全细胞生物催化产生乙偶姻的基准菌体量；再从全细胞生物催化剂液体中分别取6 mL、3 mL、1.5 mL、0.75 mL、0.325 mL、0.1625 mL离心收集菌体，收集的菌体量为基准菌体量的1/4～1/128；另外，用MES缓冲液稀释底物α-乙酰乳酸100倍；取该底物溶液3 mL，分别加入上述离心收集的菌体中，在能力菌培养温度下转化40～60 min；将2 mL转化后反应液转移至离心管中，置于冰水浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，然后离心收集上清液，即得到全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；
B、取步骤（1）全细胞生物催化剂液体，离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体至OD600为130～150，制得菌悬液；在60 g蒸煮大豆中加入2～3 mL菌悬液，再添加37.5～50 ng乳酸链球菌素，搅拌混匀后，置于30～40℃下发酵24 h，然后在4～5℃下后发酵24 h；称取发酵大豆10～12 g，充分研磨后转入离心管中，加入10～12 mL灭菌蒸馏水进行超声处理，离心收集上清液，残渣再加入10 mL灭菌蒸馏水超声提取1次，合并上清液，并用灭菌蒸馏水定容至25 mL，即得全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液；
（3）制备浓度在0～16 mg/L范围内的乙偶姻标准品溶液，取400 μL乙偶姻标准品溶液与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴显色反应40～60 min，测定OD522值，以乙偶姻浓度为横坐标，OD522值为纵坐标绘制标准曲线，制作工作曲线，得到线性回归方程；
（4）乙偶姻产量检测
取步骤（2）全细胞生物催化产生的乙偶姻溶液400 μL与4.6 mL显色剂充分混匀，25～30℃水浴中显色反应40～60 min，立刻在522 nm处测吸光度值；同时设置对照组，即用400μL MES缓冲液代替乙偶姻溶液进行显色反应；样品OD522值为样品测量值减去对照组测量值，然后根据步骤（3）乙偶姻标准品的线性回归方程，计算得到样品中乙偶姻含量，其中针对步骤（2）A方法选取OD522值为0.8～1.4的样品作为计算样品。
4.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于，底物α-乙酰乳酸的制备如下：按体积比55:40:5的比例，将NaOH溶液、灭菌蒸馏水和α-乙酰氧基-α-甲基-乙酰乙酸乙酯充分混匀后，在冰水浴中反应15～20 min制得，其中NaOH溶液的浓度为0.5～2 mol/L。
5.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：离心收集菌体的离心是在4℃、10,000 rpm下进行10 min。
6.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：步骤（2）中超声波细胞粉碎机破碎细胞条件为超声温度20～25℃，超声功率316～475 W，超声程序：变幅杆Φ3 mm，超声开5～7 s，超声关3～5 s，共超声2～3 min。
7.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：蒸煮大豆是将大豆与蒸馏水按质量体积比1:3～1:6的比例混合，室温下浸泡12～16 h，沥干后置于加压蒸汽灭菌锅中115～121℃蒸煮30～40 min制得。
8.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：步骤（2）B中超声处理条件为功率200 W，工作频率53 kHz，超声时间30 min～35 min。
9.根据权利要求3所述的快速测定全细胞生物催化合成乙偶姻的方法，其特征在于：产乙偶姻的能力菌为含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-ald。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张健: "α-乙酰乳酸脱羧酶的粗酶提取优化研究", 《现代食品科技》 * |
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