CN113215053A - 一种嗜热链球菌imau 80287y菌株及其应用、酸奶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种嗜热链球菌(Streptococcu sthermophilus)IMAU80287Y菌株及其应用、酸奶及其制备方法。本发明提供一种嗜热链球菌IMAU80287Y菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.22260。本发明提供的IMAU80287Y菌株不仅发酵性能良好，而且可以代谢半乳糖；由实施例可知，本发明提供的IMAU80287Y菌株在牛乳发酵和贮藏期间代谢乳糖和半乳糖的能力较原始菌株分别提高了6.2％和25％。利用本发明所述IMAU80287Y发酵得到的酸奶，持水能力显著高于原始株发酵乳，发酵性能良好。

Description

一种嗜热链球菌IMAU 80287Y菌株及其应用、酸奶及其制备 方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种嗜热链球菌IMAU 80287Y菌株及其应用、酸奶及其制备方法。

背景技术

嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)从属于链球菌属，是一种嗜热乳酸菌，革兰氏阳性菌，呈圆形或椭圆形。嗜热链球菌作为主要的发酵剂菌株，被广泛的应用于发酵乳制品中，被称为乳酸乳球菌之后的第二重要的工业乳制品发酵剂。

嗜热链球菌作为酸奶发酵剂中的必备菌种之一，广泛的应用于各种乳制品的加工生产中。然而现有的发酵乳中仍含有残留的乳糖和半乳糖，对人体健康造成危害。因此，为了提高嗜热链球菌利用半乳糖的能力，改善发酵乳制品的品质，筛选出一种发酵性能良好，还可以代谢半乳糖的嗜热链球菌，是成功制备酸奶发酵剂的基础，也为国内发酵剂的生产提供指导和菌种资源。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种嗜热链球菌IMAU 80287Y菌株、酸奶及其制备方法。本发明提供的嗜热链球菌不仅发酵性能良好，而且可以代谢半乳糖。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU 80287Y菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.22260。

本发明还提供了上述菌株在制备分解半乳糖制剂中的应用。

本发明还提供了上述菌株在制备乳制品中的应用。

优选的，所述乳制品包括酸奶。

本发明还提供了一种利用上述菌株制备得到的酸奶，所述酸奶的酸度为72～89°T，半乳糖含量为0.34g/100g～0.64g/100g。

本发明还提供了上述酸奶的制备方法，包括以下步骤：

将水、全脂乳粉和蔗糖混合后，均质，灭菌得到混合液；所述水、全脂乳粉和蔗糖的质量比为100:(10～13):(0.08～0.12)；

将上述菌株接种于所述混合液中，42℃发酵，得到酸奶；所述菌株的接种量为5×10⁶CFU/mL。

优选的，所述均质的温度为60～70℃，均质的次数为2次，均质的低压为15MPa，均质的高压为35MPa。

优选的，菌株接种前还包括菌株的活化；所述活化包括：将上述菌株接种于含2wt.％乳糖的M17液体培养基中，42℃下培养24h，连续传代3次，得到活化的菌株。

优选的，所述灭菌包括巴氏灭菌。

有益效果：

本发明提供一种嗜热链球菌IMAU 80287Y菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.22260。本发明提供的IMAU 80287Y菌株不仅发酵性能良好，而且可以代谢半乳糖；由实施例可知，本发明提供的IMAU 80287Y菌株在牛乳发酵和贮藏期间代谢乳糖和半乳糖的能力较原始菌株分别提高了6.2％和25％。利用本发明所述IMAU 80287Y菌株发酵得到的酸奶，持水能力显著高于原始株发酵乳，发酵性能良好。

生物保藏说明：

嗜热链球菌IMAU 80287Y菌株，拉丁名为Streptococcus thermophilus，于2021年4月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22260。

附图说明

图1为实施例1中纯化后的诱变株IMAU 80287Y菌株；

图2为实施例3中根据测定结果绘制的β-GAL标准曲线；

图3为实施例3中在M17培养基中培养12h时原始株和诱变株的HK、PK和β-GAL活性图，其中1，2为HK活力；3，4为PK活力；5，6为β-GAL活力；

图4为实施例4中原始株和诱变株在牛乳发酵和贮藏期间pH值变化图；

图5为实施例4中原始株和诱变株在牛乳发酵和贮藏期间滴定酸度变化图；

图6为实施例4中原始株和诱变株发酵乳在牛乳发酵和贮藏期间粘度的变化图；

图7为实施例4中在牛乳发酵和贮藏期间原始株和诱变株发酵乳脱水收缩性的变化图；

图8为实施例4中在发酵乳制作和贮藏期间原始株和诱变株活菌数的变化；

图9为实施例5中葡萄糖、乳糖和半乳糖标准样品的高效液相色谱图；

图10为实施例5中乳酸、乙酸和柠檬酸标准样品的高效液相色谱图；

图11为实施例6中原始株和诱变株PM1板的碳代谢动力学曲线；其中横坐标表示发酵时间，纵坐标表示染料反应量；A01为空白对照，A06为原始株和诱变株对半乳糖的利用能力；蓝色曲线为原始株，红色曲线为诱变株；

图12为实施例7中β-GAL基因序列比对结果，其中黄色代表突变位点；

图13为实施例7中PK基因序列比对结果，其中黄色代表突变位点。

具体实施方式

本发明提供一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU 80287Y菌株，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.22260。

本发明提供的IMAU 80287Y菌株的筛选方法优选包括：

将活化的嗜热链球菌IMAU80287菌株接种至2-DG浓度为10mmol/L的半乳糖M17平板，42℃培养48h后，接种于半乳糖为唯一碳源M17平板上，选择直径较大的菌落进行复筛；

将复筛得到的诱变菌株在M17液体培养基中进行菌株的纯化培养，得到所述IMAU80287Y菌株。

本发明所述IMAU 80287Y菌株优选具有以下性质：

(1)菌体特性为单菌形态为圆形或椭圆形，直径0.7μm～0.9μm，呈对或链状排列，无芽孢和鞭毛，无运动性。

(2)菌落特性为菌落形态为底部略带微黄色，表面多为乳白色，边缘不整齐，表面较光滑、湿润，中间凸起。

(3)生长特性为兼性厌氧，同型乳酸发酵，最适温度为42℃，最适培养基为含2wt.％乳糖的M17培养基。

(4)在M17培养基中培养12h后己糖激酶和丙酮酸激酶的活力分别为0.0267U/10⁴cell、0.0627U/10⁴cell，β-GAL酶的活力为0.329nmol/h/10⁴cell；

(5)利用IMAU 80287Y菌株制备的发酵乳在4℃贮藏14d时，滴定酸度仍维持在90°T以下；

(6)碳代谢表型分析结果为本发明所述IMAU 80287Y菌株与原始株相比，代谢乳糖和半乳糖能力明显增加，而对葡萄糖的利用率没有明显变化。

本发明提供的IMAU 80287Y菌株不仅发酵性能良好，而且可以代谢半乳糖，相对于原始菌株其代谢乳糖和半乳糖的能力分别提高了6.2％和25％。利用本发明所述IMAU80287Y发酵得到的酸奶，持水能力显著高于原始株发酵乳，发酵性能良好。

本发明还提供了上述菌株在制备分解半乳糖制剂中的应用。本发明所述IMAU80287Y菌株代谢半乳糖能力强，可用于制备分解半乳糖的制剂。

本发明还提供了上述菌株在制备乳制品中的应用，所述乳制品优选包括酸奶。利用本发明提供的IMAU 80287Y菌株可以制备酸度为72～89°T，半乳糖含量为0.34g/100g～0.64g/100g的乳制品，制备的乳制品不仅酸度低，容易被消费者接受，且能降低半乳糖对人体的危害。

本发明还提供一种利用上述菌株生产的酸奶，所述酸奶的酸度为72～89°T，半乳糖含量为0.34～0.64g/100g。

本发明还提供了上述酸奶的制备方法，包括以下步骤：

将水、全脂乳粉和蔗糖混合后，均质，灭菌得到混合液；所述水、全脂乳粉和蔗糖的质量比为100:(10～13):(0.08～0.12)；

将权利要求1所述菌株接种于所述混合液中，42℃发酵，得到酸奶；所述菌株的接种量为5×10⁶CFU/mL。

本发明将水、全脂乳粉和蔗糖混合后，均质，灭菌得到混合液。在本发明中，所述水、全脂乳粉和蔗糖的质量比为100:(10～13):(0.08～0.12)，优选为100:(11～12):(0.09～0.11)，更优选为100:11.5:0.1；所述混合前优选还包括：将水加热至45～55℃，优选为50℃；混合后优选还包括静置25～35min，优选为30min。本发明通过混合前加热和混合后静置水合的方式，可以使全脂乳粉和蔗糖充分溶解。本发明对所述全脂乳粉和蔗糖的来源没有限定，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。

在本发明中，均质的温度优选为60～70℃，更优选为65℃，所述均质的次数优选为2次，所述均质的低压优选为15MPa，所述均质的高压优选为35MPa；所述灭菌优选包括巴氏灭菌，更优选为在95℃下灭菌5min。

得到混合液后，本发明将上述菌株接种于所述混合液中，42℃发酵，得到酸奶；所述菌株的接种量为5×10⁶CFU/mL。在本发明中，菌株接种前优选还包括菌株的活化；所述活化优选包括：将上述菌株接种于含2wt.％乳糖的M17液体培养基中，42℃下培养24h，连续传代3次，得到活化的菌株。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种嗜热链球菌IMAU80287Y菌株及其应用、酸奶及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

IMAU 80287Y菌株的筛选

(1)原始菌株的处理

在10％(w/w)脱脂乳培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，在温度115℃下灭菌7min，制备得到活化培养基；

以体积比2％的接种量将在-80℃冷冻保藏的嗜热链球菌IMAU80287(由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育重点实验室提供，该菌种的分离地为四川省阿坝州红原县瓦切乡二队，分离源为曲拉，GenBank序列号为HM058569)接种于活化培养基中，42℃培养24h，然后按照M17液体培养基(购自赛默飞世尔科技(北京)有限公司)体积比2％的接种量，连续传代培养3次，使其活菌数达到10⁸CFU/mL以上，得到活化菌株。

(2)2-DG诱变

将活化的菌株接种至2-DG浓度为10mmol/L的半乳糖M17平板，42℃培养48h后，接种于半乳糖为唯一碳源M17平板上，选择直径在0.7～0.9μm的菌落进行复筛；

将挑选的菌落接种于M17液体培养基中，42℃培养12h，离心(4000×g，10min)收集菌体，加入2500μLPBS缓冲液(pH7.2)进行稀释；

取100μL稀释液涂布于2-DG浓度为10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L和300mmol/L的M17平板上，42℃培养48h后，从菌落分布均匀的平板上挑取单个菌落于半乳糖浓度为2％的M17液体培养基中，在相同条件下继续培养24h。

(3)诱变株的纯化

将复筛得到的诱变菌株在M17液体培养基中继续培养，使用PBS缓冲液适当稀释后，取100μL稀释液涂布于M17平板上，42℃培养48h，然后挑取单菌落于M17液体培养基中，重复上述步骤，直至镜检为纯培养物为止，纯化的诱变株见图1。

(4)诱变株的保存

将纯化后的IMAU 80287Y菌株(以下实施例中所述的诱变株)接种于M17液体培养基中，42℃培养24h，经4000×g离心10min，弃上清，在菌体沉淀中加入约5mL的灭菌生理盐水进行洗涤；重复2次后，在收集的菌体中加入乳酸菌保护剂(10％脱脂乳粉，0.1％酵母粉)。采用冻结法冻结菌体，保存于-20℃的冰箱中待用。

实施例2

诱变株的生长稳定性

根据【

Kim I,Curic-Bawden Mirjana,Junge Mette P,etal.Enhancing the Sweetness of Yoghurt through Metabolic Remodeling ofCarbohydrate Metabolism in Streptococcus thermophilus and Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus[J].Applied and environmental microbiology,2016,82(12).】报道的试验方法检测诱变株的生长稳定性，具体实验方法如下：将低温保存的原始株和诱变株活化后，按2％的接种量接入M17乳糖和半乳糖培养基中，连续传代30次，每代均在42℃下培养24h，选取第3代、第15代和第30代测定各代菌株的生长情况，实验结果见表1。

表142℃连续培养24h原始株和诱变株的OD₆₀₀动态变化

注：结果表示为3个单独实验的平均值±标准偏差,表中小写字母表示同一时间点两种菌株显著性(P＜0.05)。

由表1可知，除发酵开始时诱变株培养基的OD₆₀₀值略低于原始株外，其余各时间点的OD₆₀₀值明显高于原始株，说明第3、第15和第30代的诱变株代谢乳糖的能力明显高于原始株。类似的结果在M17半乳糖培养基中也有发现，诱变株在各时间点的OD₆₀₀值明显高于原始株，说明第3、第15和第30代的诱变株代谢半乳糖的能力明显高于原始株，可见，本发明筛选得到的IMAU 80287Y菌株在传代过程中具有良好的遗传稳定性。

实施例3

酶活性的鉴定

采用北京Solarbio科技有限公司提供的己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒(Solarbio)检测上述三种酶的酶活性，具体试验方法参照试剂盒提供的说明书进行。原始株和诱变株利用用实施例1中所述的活化培养基活化后，42℃培养12h，收集菌体，用灭菌的PBS缓冲液洗涤两次后采用上述试剂盒检测酶活，测定结果见图2和图3。

由图2和图3可知，原始株和诱变株在M17培养基中培养12h后，原始株的HK和PK的活力分别为0.0356U/10⁴cell、0.1463U/10⁴cell，而诱变株的HK和PK的活力分别为0.0267U/10⁴cell、0.0627U/10⁴cell，分别下降了25％和57.14％(图2中的1-4)。原始株的β-GAL活力为0.308nmol/h/10⁴cell，诱变后上升到0.329nmol/h/10⁴cell，增加了6.81％(图2中的5-6)，因此，本发明筛选的IMAU 80287Y菌株提高了代谢乳糖的能力；同时，利用本发明筛选的IMAU 80287Y菌株制备的乳制品时，不仅可以降低乳制品的乳糖含量，而且可以提高乳制品的甜度。

实施例4

原始株和诱变株的发酵特性

全脂乳培养基的制备：取适量蒸馏水加热至50℃，加入11.5wt.％全脂乳粉搅拌溶解，当水温升高到60℃，加入0.1％wt.蔗糖，使其充分溶解；然后在65℃，低压15MPa和高压35MPa条件下连续均质两次，将均质后的全脂乳进行巴氏杀菌(95℃，5min)，随后快速置于冷水中冷却至4℃，得到全脂乳培养基，备用。

将原始株和诱变株以5×10⁶CFU/mL的接种量接入全脂乳培养基中，42℃发酵，得到发酵乳(酸奶)，测定在发酵0h、3h、6h、8h和贮藏0d(pH4.5)、12h、1d、3d、7d、14d时发酵乳的pH值、滴定酸度、黏度、脱水收缩性以及活菌数的变化。

(1)pH值的测定

使用pH计测定原始株和诱变株发酵乳样品的pH值，测定结果见图4。

(2)滴定酸度的测定

根据【王丹.发酵乳中挥发性风味物质的测定及其色谱指纹图谱分析[D].内蒙古农业大学,2017.】中的方法测定滴定酸度，测定结果见图5。

(3)黏度的测定

取40g发酵乳样品置于50mL离心管中，使用BROOKFIELD DV-1型粘度仪测定粘度，每个发酵乳样品重复测定三次，取平均值。测定条件为4#转子，转速100r/min，扭矩20％～100％，温度20℃～22℃，测定时间30s，测定结果见图6。

(4)脱水收缩性的测定

根据【Benateya A,Bracquart P,Linden G.Galactose-fermenting mutants ofStreptococcus thermophilus[J].Canadian Journal of Microbiology,2011,37(2):136-140.】的方法测定脱水收缩性，测定结果见图7。

(5)活菌计数

采用稀释平皿倾注法检测原始株和诱变株发酵乳中活菌数的变化。取1mL发酵乳样品于9mL灭菌生理盐水中，震荡摇匀，进行梯度稀释，采用M17固体培养基倾注法，42℃培养48h，计算菌落总数，测定结果见图8。

由图4和图5可知，在发酵及贮藏期间，原始株和诱变株发酵乳的pH和滴定酸度变化趋势基本相同；在发酵过程中，原始株和诱变株发酵乳的pH值明显下降而滴定酸度显著上升，贮藏期间pH值的下降和滴定酸度的上升趋势变缓；尽管诱变株的产酸速率略低于原始株，仍能维持较快的产酸速率，在发酵8h时达到了发酵终点(pH 4.5)；一般认为发酵乳的滴定酸度大于120°T时，不易被消费者接受。本实验中诱变株发酵乳在4℃贮藏14d时滴定酸度仍维持在90°T以下，说明该诱变株发酵乳的后酸化程度较弱，可作为酸奶发酵剂应用于乳制品生产中。

由图6可知，原始株和诱变株在发酵3h后发酵乳的粘度开始上升，在贮藏12h时达到峰值，随后略有下降；原始株和诱变株在牛乳发酵和贮藏期间，诱变株发酵乳的粘度始终显著高于原始株，这是由于发酵乳在贮藏期继续产酸使得酪蛋白的Ca和P逐渐游离出来，改变酪蛋白胶束结构进而影响其凝乳性质。

由图7可知，在发酵过程中，原始株和诱变株发酵乳的脱水收缩性整体呈先下降再上升的趋势，原始株发酵乳在发酵终点时脱水收缩性为最低(15.68％)，而诱变株发酵乳的脱水收缩性在发酵8h时最低，为13.74％，这是因为在菌株在发酵过程中产生多聚体和酪蛋白相互作用，在发酵乳中形成了稳定的蛋白质网状结构，增强了发酵乳的持水力；在4℃贮藏期间，原始株发酵乳的脱水收缩性的变化范围在19.23％～35.43％之间，之后随着发酵乳pH值的下降，胶体结构发生改变，致使持水能力下降；可见本发明筛选得到的诱变株和原始株相比，诱变株发酵乳的持水能力较好，其脱水收缩性的变化范围在14.69％～31％之间，特别是在贮藏0d时，其发酵乳样品的脱水收缩性为14.69％。

由图8可知，在牛乳发酵和贮藏期间，原始株和诱变株的活菌数变化趋势相似，即发酵3h后开始进入对数期，在贮藏12h时达到峰值。发酵开始时，原始株和诱变株分别以5×10⁶CFU/mL接种量接入全脂乳培养基中，到达发酵终点时，其活菌数分别为8.92log10CFU/mL、8.96log10CFU/mL。在贮藏期间，原始株和诱变株发酵乳中活菌数总数逐渐下降，原始株发酵乳中的活菌数由8.96log10 CFU/mL降至8.23log10 CFU/mL，而诱变株发酵乳中的活菌数由8.92log10 CFU/mL降至8.13log10 CFU/mL。一般认为发酵乳中乳酸菌的活菌数应保持在6log10 CFU/mL以上，可见本发明筛选的诱变株在牛乳发酵和贮藏期间活菌数始终维持在较高的水平，说明这诱变菌株具有良好的活力，可作为潜在的发酵剂菌株用于发酵乳的生产。

实施例5

代谢产物的HPLC分析

将原始株和诱变株以5×10⁷CFU/mL的接种量接种于全脂乳培养基(按实施例4中的制备方法制备)中，在发酵0h、3h、6h、8h和贮藏0d(pH4.5)、12h、1d、3d、7d、14d时取样，利用高效液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)法检测原始株和诱变株发酵乳中残糖(乳糖、半乳糖和葡萄糖)及有机酸(乳酸、乙酸和柠檬酸)的含量，每组样品重复三次试验；此外，为促进发酵，在实验开始时在全脂乳培养基中添加0.01％的蔗糖。

(1)乳糖、半乳糖和葡萄糖含量的测定

①前处理方法：称取混合均匀的适量试样，加入30mL一级水，然后加入2mL亚铁氰化钾、2mL乙酸锌，涡旋混匀，超声30min，用一级水定容至50mL，6000r/min离心5min，上清液过0.45μm滤膜后，上机测定。

②仪器方法：色谱柱：Aglient氨基柱，(250×4.6mm，5μm)；检测器：示差检测器；柱温：35℃；进样量：10μL；流动相：乙腈：水＝70:30(体积比)；流速：1.0mL/min。

(2)乳酸、乙酸和柠檬酸含量的测定

①前处理方法：称取混匀的适量样品(1g左右)，加流动相定容到5mL，超声提取30min，6000r/min离心5min，上清液过0.45μm滤膜后上机测定。

②仪器方法：色谱柱：AgilentAQ(4.6mm×250mm，5μm)；检测器：DAD检测器；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；波长：210nm；流动相：10mM K₂HPO₄(pH＝2.55)。

葡萄糖、乳糖、半乳糖、乳酸、乙酸、柠檬酸标准样品的保留时间、回归方程、相关系数见表2，混合标准品色谱分离图见图9和图10。

表2标准品的线性回归方程及其相关系数

类别	保留时间(min)	回归方程	相关系数(R<sup>2</sup>)
				葡萄糖	10.913	y＝115.07178x	0.99991
乳糖	21.552	y＝71.09645x	0.99987
				半乳糖	11.751	y＝22.78373x	0.99905
乳酸	8.550	y＝(9.47675e-1)x+2.69355e-1	0.99998
				乙酸	9.140	y＝(9.20663e-1)x+5.02317	0.99992
柠檬酸	11.915	y＝1.95668x+5.49022e-1	0.99999

由表2可知各组分的质量浓度8.550～21.552ng/μL与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数在0.99987～0.99999之间，说明标准曲线具有较高精确度，符合定量要求。

诱变株和原始株发酵乳中的乳糖、半乳糖和葡萄糖的含量测定结果见表3，诱变株和原始株发酵乳中的乳酸、乙酸和柠檬酸含量的测定结果见表4。

表3诱变株和原始株发酵乳中的乳糖、半乳糖和葡萄糖的含量测定结果

注：表中“-”表示未检出(<0.02)；结果表示为3个单独实验的平均值±标准偏差,小写字母表示同一时间点两种菌株显著性(P＜0.05)，0d、12h、1d、3d、7d和14d均为贮藏时间。

由表3可知，诱变株发酵乳中乳糖含量始终低于原始株，说明诱变株代谢乳糖的能力要高于原始株，这与实施例3中诱变株β-GAL酶的活力高于原始株的结论是一致的。原始株和诱变株发酵乳中半乳糖含量的结果和乳糖的结果略有差异，说明在发酵期间诱变株代谢半乳糖的能力要低于原始株，而在贮藏期间诱变株代谢半乳糖的能力高于原始株；另外，原始株和诱变株在牛乳发酵和贮藏期间各个时间点均未检测到葡萄糖，这是因为葡萄糖经乳糖水解生成后，立即通过EMP途径瞬间转化而不会排放到细胞外，因此，原始株和诱变株发酵乳中残存的葡萄糖含量较低未到HPLC检出限(<0.02g/100g)，这和很多研究者认为的发酵乳中葡萄糖的含量极低或者根本检测不出来是一致的。本实验中嗜热链球菌IMAU80287经2-DG诱变后筛选出的诱变株嗜热链球菌IMAU 80287Y能代谢部分半乳糖，特别是在贮藏期间，诱变株代谢半乳糖的能力显著提高。

表4诱变株和原始株发酵乳中的乳酸、乙酸和柠檬酸含量的测定结果

注：结果表示为3个单独实验的平均值±标准偏差,表中小写字母表示同一时间点两种菌株显著性(P＜0.05)，0d、12h、1d、3d、7d和14d均为贮藏时间。

由表4可知，除发酵开始时，其余各时间点诱变株发酵乳中乳酸的含量要高于原始株。在牛乳发酵过程中，嗜热链球菌通过同型发酵产生乳酸，因此，乳糖的代谢量与发酵乳中乳酸的含量成正相关。本实施例中诱变株发酵乳中乳酸的含量始终高于原始株，说明诱变株代谢乳糖的能力高于原始株。类似的研究结果在柠檬酸中也有发现，在发酵和贮藏期间，诱变株发酵乳中柠檬酸的含量始终高于原始株。另外，利用本发明所述菌株IMAU80287Y制备的乳制品，有机酸总含量均高于原始菌株制备的乳制品，可见，利用本发明所述菌株IMAU 80287Y制备的乳制品抑制有害菌繁殖的能力更强，制备的乳制品安全性更高。

实施例6

碳代谢表型分析

参照Biolog公司操作指南对原始株及其诱变株进行碳代谢表型分析，具体实验方法如下：将原始株与诱变株分别在M17和乳糖浓度为2％的M17液体培养基中连续活化两代后，再在对应固体培养基上连续划线两次，挑取单菌落根据说明书配制成浓缩液加入96微孔板(PM1)中，将准备好的PM1板放入Omnilog系统的恒温培养箱内，42℃培养3d，使用设备用自带的DataFile Converter、OL_FM_12、OL_PR_1软件收集数据，绘制原始株与诱变株碳代谢动力学曲线实验结果见图11，PM1微孔板中原始株和诱变株共同利用较多的碳源物质见表5。

表5PM1微孔板中原始株和诱变株共同利用较多的碳源物质

由图11可知，随着发酵时间延长，原始株和诱变株代谢半乳糖的量逐渐升高，特别是诱变株在发酵开始后半乳糖的代谢量始终高于原始株，但在发酵结束时，因培养基中的半乳糖已消耗尽，在发酵3d时原始株和诱变株的碳源消耗曲线逐渐趋于一致；C09表示的是原始株和诱变株对葡萄糖的利用能力，在42℃培养3d期间，原始株和诱变株代谢葡萄糖的量较低；D09表示的是原始株和诱变株代谢乳糖的量。原始株和诱变株代谢乳糖的动力学曲线与A06基本一致，说明嗜热链球菌IMAU80287经2-DG诱变后，诱变株代谢乳糖、半乳糖的能力明显增加，而对葡萄糖的利用率没有明显变化。

另外，由表5和图11可知，原始株和诱变株能够代谢PM1微孔板中包括糖类、核苷酸、羧酸类等36种物质，利用率达37.89％(图11)。其中诱变株在D-半乳糖(A06)、D-甘露糖(A11)、D-葡萄糖酸(B06)、α-D-乳糖(D09)、对丁酸(E08)和D-纤维二糖(F11)代谢能力强于原始株；相反，尿苷(D12)、麦芽三糖(E10)原始株代谢能力强于诱变株；D-甘露醇(B11)、D-果糖(C07)在发酵开始时诱变株的生长速率快于原始株，而在发酵后期则低于原始株。

实施例7

序列分析

(1)原始株和诱变株基因组DNA提取

将原始株和诱变株在M17和2％乳糖的M17的液体培养基中使菌活力达到最大后，收集菌泥(4000r/min,10min)，用PBS缓冲液洗涤两遍后，根据Bacteria Genomic DNAPreparationKit试剂盒(Promega，USA)提取DNA，具体步骤如下：

①取1mL的细菌培养液(最多提取的细菌数量为2×10⁹个)，13,000×g离心20分钟，弃上清，留细菌沉淀备用。

②加入480μL50mM EDTA吹打混匀，反复吹吸。

③提取的细菌为革兰氏阳性菌，必须要进行溶菌酶破壁处理。沉淀中加入200μL溶菌酶裂解液，吹打重悬细菌沉淀。37℃破壁处理30-60min破壁处理完成后便可以将水浴温度调至70℃备用。

④15,000×g离心2min，弃上清，向菌体沉淀中加入600μL裂解液Nuclei lysisSolution，反复抽打吹吸，充分混匀(至透明)。在80℃水浴孵育5min。

⑤离心数秒去除管壁上的水珠，加入5μLRNase Solution，轻柔颠倒混匀2～5次，置于37℃水浴15～60min，冷却至室温。

⑥加入200μLProterinPrecipition Solution，充分振荡20s混匀，冰孵育5～10min，此时可见大量白色沉淀。

⑦15,000×g离心3min,上清转移至新的1.5mLEP管中，加入600μL异丙醇颠倒混匀3min。

⑧15,000×g离心2min，除去上清(轻柔倾倒，避免沉淀倒出)。

⑨加入600μL70％的乙醇，颠倒离心管3～5次，15,000×g离心2min，倒掉上清。15,000×g离心数秒，用吸去乙醇。室温放置10～15min。

⑩待乙醇挥发干净后，加入100μL Rehychation Solution，65℃水浴1h或TE过夜后在2～8℃储藏DNA。

取2μLDNA进行1.0％琼脂糖电泳检测提取DNA的完整性和质量。

(2)HK、PK和β-GAL基因引物设计及PCR扩增

①引物设计

根据Genbank中已公布的带注释基因组嗜热链球菌CNRZ1066全基因组(GenBank登录号NC_006449)中HK、PK和β-GAL基因序列，利用Primer 6.0设计特异性引物，具体信息如表6所示，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成购买。

表6PCR扩增引物

②PCR扩增

表7PCR扩增体系(50μL)

体系成分	剂量
		10×Buffer	5μL
dNTP(2.5mμ)	4μL
		PrimerF	1.5μL
PrimerR	1.5μL
		基因组DNA模板(100ng/μL)	2μL
TaKaRaExTaq酶(5U/μL)	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	35.5μL

以表6所示的引物，按上述方法提取的DNA为模板，采用表7所示的PCR扩增体系进行扩增；PCR反应条件:94℃预变性5min，94℃变性1min，95℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次，72℃末端延伸10min。

取1μLPCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检验。检验成功后送至上海派森诺生物科技有限公司进行测序，测序结果见图12和图13。

由图12和图13可知，三个目的基因中只有HK基因序列没有发生变化，另外两个基因的核苷酸序列都有变化(图12、图13)。图12为部分β-GAL基因序列比对结果，可以看出诱变后β-GAL基因中galR启动子接近-10、-35区的位置有两处碱基缺失；图13为部分PK基因序列比对结果，发现有一处碱基颠换(“TGCGAC”中的“G”突变为“T”)，在起始编码区也发生连续碱基缺失。上述表明嗜热链球菌IMAU80287存在galR-galK启动子基因，说明化学诱变剂2-DG可以改变菌株的基因序列。

综上所述，本发明提供的IMAU 80287Y菌株不仅发酵性能良好，而且可以代谢半乳糖，相对于原始菌株其代谢乳糖和半乳糖的能力分别提高了6.2％和25％。利用本发明所述IMAU 80287Y发酵得到的酸奶，持水能力显著高于原始株发酵乳，发酵性能良好。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种嗜热链球菌IMAU 80287Y菌株及其应用、酸奶及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgggtaaa aggctcta 18

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtttttcaa caaaaaagtg ctac 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaattccttt cccagcac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcattgtcg catcagta 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaaggac gttacctc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgatgtcta gtatcctc 18

Claims (9)

1.一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)IMAU 80287Y菌株，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.22260。

2.权利要求1所述的菌株在制备分解半乳糖制剂中的应用。

3.权利要求1所述的菌株在制备乳制品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乳制品包括酸奶。

5.一种利用权利要求1所述的菌株制备得到的酸奶，其特征在于，所述酸奶的酸度为72～89°T，半乳糖含量为0.34g/100g～0.64g/100g。

6.权利要求5所述酸奶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将水、全脂乳粉和蔗糖混合后，均质，灭菌得到混合液；所述水、全脂乳粉和蔗糖的质量比为100:(10～13):(0.08～0.12)；

将权利要求1所述的菌株接种于所述混合液中，42℃发酵，得到酸奶；所述菌株的接种量为5×10⁶CFU/mL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述均质的温度为60～70℃，均质的次数为2次，均质的低压为15MPa，均质的高压为35MPa。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，菌株接种前还包括菌株的活化；所述活化包括：将权利要求1所述的菌株接种于含2wt.％乳糖的M17液体培养基中，42℃下培养24h，连续传代3次，得到活化的菌株。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌包括巴氏灭菌。

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