CN102965318A - 一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用。所述嗜热链球菌为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）TIMR0705-6，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6646。该菌株在42℃条件下用M17培养液发酵30小时产胞外多糖达到最高值，为148mg/L；在原料乳鲜奶中按体积百分含量为3—5%添加含109—1010cfu/mL所述嗜热链球菌TIMR0705-6的工作发酵剂和相同体积的含保加利亚乳杆菌1010cfu/mL的发酵剂获得的以乳酸计酸度为0.6—0.7的发酵酸乳，与对照相比，在冷藏期间（第1天—第28天），粘度和凝胶强度明显提高，持水力在冷藏第21天以后也有明显提高。本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株产胞外多糖的嗜热链球菌及其应用。
背景技术
乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides,EPSs）是乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞外的黏液多糖或荚膜多糖的总称。上世纪70年代初，微生物多糖作为一个新兴的发酵行业，相继在美国、法国、日本和意大利等国家发展起来。乳酸菌EPS作为一种新型的天然食品添加剂，近几年来以其独特的理化学特性和生物学功能倍受青睐。乳酸菌EPS能够提高菌体对胃肠道表面的非特异性粘附能力，改善肠道菌群和功能，提高机体免疫功能，抗肿瘤等。乳酸菌是食品级有机体，具有重要的工艺学功能，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变性质、质构、口感以及风味具有重要的影响。在食品工业中可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、起泡剂和凝胶剂，取代或降低工业稳定剂和增稠剂的用量，可进一步发挥产品的成本优势。
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）为革兰氏阳性菌，通常与保加利亚乳杆菌共同用作酸奶的发酵剂。有些嗜热链球菌能够在乳基质中原位产生胞外多糖，这些胞外多糖的量虽然很低，但是其天然的增稠作用能够增加乳制品的粘度；赋予酸乳更强的持水力，从而避免乳清析出；此外，产胞外多糖而产生的持水性增强有助于提高干酪等产品的得率。现在人们更喜欢滑润、粘稠的天然酸乳制品，EPS无需添加其他稳定剂，在低浓度情况下即可改善酸乳产品的品质。随着消费者对纯天然食品的需求，这种发酵剂和酸乳生产方式在明令禁止使用添加剂的一些欧洲国家已被普遍使用。
乳酸菌原位发酵产生的胞外多糖可应用于全天然发酵乳品的生产，这将从市场角度拉动乳酸菌胞外多糖的研究。因此，开展产胞外多糖乳酸菌的研究，对于改善乳制品生产力、开发具有特定功能性质的乳酸菌发酵乳制品，具有十分重要的研究意义和经济价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株胞外多糖产量高的嗜热链球菌,即嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）TIMR0705-6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6646，可用于制备发酵酸乳。
所述嗜热链球菌TIMR0705-6具有如下生物学特性：在M17培养基平板上划线分离，42℃培养48h，菌落（图1）为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑，菌体呈球状（图2），多排列成长短不一的链状，不产芽孢。过氧化氢酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性。在45℃生长良好，15℃不生长。最适生长温度为37-42℃；最高和最低初始生长pH为9.0和4.0，最适生长初始pH为6.5-7.0；在42℃条件下用M17培养液进行培养的延迟期相对较短，培养2小时即进入对数生长期，10小时达到稳定期；产生的胞外多糖在42℃条件下用M17培养液发酵培养30小时达到最高值，为148mg/L（图3）。
本发明的另一个目的是提供一种嗜热链球菌工作发酵剂，其活性成分为所述嗜热链球菌TIMR0705-6。
所述嗜热链球菌工作发酵剂中所述嗜热链球菌TIMR0705-6的含量为109—1010cfu/mL，如109cfu/mL、5×109cfu/mL或1010cfu/mL。
所述嗜热链球菌发酵剂的制备方法具体如下：将所述嗜热链球菌TIMR0705-6接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8-10小时进行活化，连续活化两代，获得活化培养液；将所述活化培养液按体积比为（2—4）:100的量接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8—10小时，4℃条件下6000r/min离心10min，将沉淀用无菌乳悬浮。
本发明保护所述嗜热链球菌TIMR0705-6和所述嗜热链球菌工作发酵剂在制备发酵食品中的应用。
在上述应用中，所述的发酵食品具体可为发酵酸乳。
在上述应用中，所述发酵食品的制备包括如下步骤：将权利要求2或3所述嗜热链球菌工作发酵剂和与嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂分别按体积比为（3—5）:100的量加入原料乳中进行发酵，获得滴定酸度以乳酸计为0.6—0.7的发酵产物即为所述发酵食品。
所述嗜热链球菌工作发酵剂与所述保加利亚乳杆菌发酵剂加入所述原料乳的体积比为1:1。
所述与嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂中的保加利亚乳杆菌具体为中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的保藏编号为6047的德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）；其在所述保加利亚乳杆菌发酵剂中的活菌含量为1010cfu/mL。
本发明还提供一种胞外多糖，所述胞外多糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将所述嗜热链球菌TIMR0705-6进行液体发酵，收集所有发酵液，从所述发酵液中提取胞外多糖。
所述液体发酵的温度具体可为42℃，发酵的时间具体可为30小时，所述液体发酵的发酵培养基具体可为M17培养液；
所述提取包括如下步骤：将所述发酵液煮沸后用三氯乙酸沉淀离心，取上清液用乙醇沉淀，将所述沉淀溶解于水后再用水透析，即获得所述胞外多糖；
和/或，所述离心的条件为4℃、10000r/min、离心30min；
和/或，所述三氯乙酸的使用终浓度为40g/L；
和/或，所述乙醇的添加终浓度为体积百分含量75%。
本发明保护所述胞外多糖在制备发酵食品中的应用；所述发酵食品具体可为发酵酸乳。
本发明所提供的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）T IMR0705-6在42℃条件下用M17培养液发酵30小时产胞外多糖的量达到最高值，为148mg/L；在原料乳鲜奶中按体积比为(3—5):100的量添加含109—1010cfu/mL所述嗜热链球菌TIMR0705-6的工作发酵剂和相同体积的含保加利亚乳杆菌1010cfu/mL的发酵剂获得的以乳酸计酸度为0.6—0.7的发酵酸乳，与对照1（添加不产胞外多糖的嗜热链球菌）和对照2（添加不产胞外多糖的嗜热链球菌和稳定剂）相比，在冷藏期间（第1天—第28天），粘度和凝胶强度明显提高，持水力在第21天以后也明显提高。利用本发明所提供的菌株制备发酵酸乳可降低增稠剂和稳定剂的用量，本发明在发酵食品领域具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：嗜热链球菌
拉丁名：Streptococcus thermophilus
菌株编号：TIMR0705-6
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区大屯路
保藏日期：2012年10月8日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.6646
附图说明
图1为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646的菌落形态。
图2为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646的细胞形态(×1000)。
图3为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646的生长曲线及多糖含量变化曲线。
图4为发酵酸乳保藏期间的持水力变化。
图5为发酵酸乳保藏期间的粘度变化。
图6为发酵酸乳保藏期间的凝胶强度变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用培养基的制备方法如下：
还原脱脂乳培养基(RSM)：将脱脂乳粉按照110g/L用水还原制成脱脂乳培养基，115℃灭菌15min，冷却备用。
MRS培养基：蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,酵母膏5.0g,柠檬酸铵2.0g,葡萄糖20.0g,吐温801.0mL,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.5g,硫酸锰0.25g,蒸馏水1L。将各成分加入水中加热溶解，调pH6.6，121℃灭菌15min，冷却备用。
纯化增菌培养基（M17培养液）：大豆蛋白胨5.0g，蛋白胨2.5g，酵母提取物5.0g，酪蛋白胨2.5g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏5.0g，β-甘油磷酸二钠19g，MgSO4·7H2O0.25g，蒸馏水1L。将各成分加入水中加热溶解，调pH7.0，121℃灭菌15min，冷却备用。
纯化培养基平板（M17培养基平板）：上述1L的M17培养液中加入琼脂15g后121℃灭菌15min，冷却备用。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)KC5：文献：李达等.西藏灵菇中产胞外多糖嗜热链球菌的分离筛选及其发酵性能测定.食品科学.2011，32（13）:225-228.公众可从吉林省农业科学院获得。
实施例1、嗜热链球菌菌株的分离和鉴定
一、菌株的分离
本发明从中国传统发酵制品西藏灵菇的微生物群落中分离筛选菌株。将西藏灵菇接种至RSM中，于42℃培养8h至牛乳凝固。取凝乳逐级稀释涂布于M17培养基平板，42℃培养48-72h，待菌落形成后，用接种环或接种针挑取可疑菌落，接种于M17培养液中，置42℃培养8-10h。待分离菌株生长良好后，再次划线接种于M17培养基平板，置42℃培养48-72h。将培养好的单菌落接种M17培养液纯化增菌培养的同时进行涂片，筛选出多株革兰氏阳性、过氧化氢酶实验阴性双球状或链状排列的乳酸球菌。纯化后的菌株接种到M17培养液培养后，加入20%甘油，-80℃冰箱保存备用。
用苯酚硫酸法测定多株纯培养菌种胞外多糖的产量，筛选出一株胞外多糖产量高的菌株，将其命名为TIMR0705-6。
二、菌株的鉴定
1、形态特征
将步骤一分离获得的菌株TIMR0705-6在M17培养基平板上划线分离，42℃培养48h，菌株生长良好。其菌落形态如图1所示。菌落为圆形，凸起，边缘整齐，颜色乳白色，挑取能拉丝，不透明，表面湿润光滑。菌体呈球状（图2），多排列成长短不一的链状，不产芽孢。
2、生理生化试验
步骤一分离获得的菌株TIMR0705-6为H2O2酶实验阴性，革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验阴性，无运动性、需氧或兼性厌氧生长，不液化明胶，不产生硫化氢，吲哚实验阴性。
3、培养特性
步骤一分离获得的菌株TIMR0705-6在45℃生长良好，15℃不生长。最适生长温度为37—42℃；最高和最低初始生长pH为9.0和4.0，最适生长初始pH为6.5-7.0；菌株TIMR0705-6在42℃条件下用M17培养液进行培养的延迟期相对较短，培养2小时即进入对数生长期，10小时达到稳定期；产生的胞外多糖在42℃条件下用M17培养液发酵培养30小时达到最高值，为148mg/L（图3）。
4、糖发酵试验鉴定菌株
挑取少许菌株TIMR0705-6培养物划线于M17培养基平板是上42℃培养48-72小时。从平板上挑取单菌落，接入API 50CH液体培养基（生物梅里埃中国有限公司，API50CH Medium）中制成菌悬液，接入API 50CH鉴定试剂条(生物梅里埃中国有限公司)，42℃培养48-72小时，记录菌株对49种碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件API LAB PLUS，反应结果如表1所示。经数据库查询，菌株TIMR0705-6与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）具有99.9%的相似性，因此，将菌株TIMR0705-6初步鉴定为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。
表1.菌株TIMR0705-6碳源利用结果
| 检测项目 | 结果 | 检测项目 | 结果 |
| 甘油 | - | 苦杏仁苷 | - |
| 赤癣醇 | - | 七叶灵 | - |
| D-阿拉伯糖 | - | 熊果苷 | - |
| L-阿拉伯糖 | - | 柳醇 | - |
| 核糖 | - | 纤维二糖 | - |
| D-木糖 | - | 麦芽糖 | - |
| L-木糖 | - | 乳糖 | + |
| 阿东醇 | - | 蜜二糖 | - |
| β-甲基-D-苷 | - | 蔗糖 | + |
| 半乳糖 | - | 海藻糖 | - |
| 葡萄糖 | + | 菊糖 | - |
| 果糖 | - | 松叁糖 | - |
| 甘露糖 | - | 棉籽糖 | - |
| 山梨糖 | - | 淀粉 | - |
| 鼠李糖 | - | 糖原 | - |
| 卫茅醇 | - | 木糖醇 | - |
| 肌醇 | - | 拢牛儿糖 | - |
| 甘露醇 | - | D-松二糖 | - |
| 山梨醇 | - | D-来苏糖 | - |
| α-甲基-D-甘露糖苷 | - | D-塔格糖 | - |
| α-甲基-D-葡萄糖苷 | - | D-岩糖 | - |
| D-阿拉伯糖醇 | - | L-岩糖 | - |
| L-阿拉伯糖醇 | - | 2-酮基-葡萄糖酸盐 | - |
| 葡萄糖酸盐 | - | 5-酮基-葡萄糖酸盐 | - |
| N-乙酰-葡萄胺 | - |
注：“+”反应阳性；“-”反应阴性。
依据上述形态特征、生理生化特征等微生物学特性将菌株TIMR0705-6鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，并于2012年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6466。
实施例2、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646的生长曲线测定及胞外多糖产生曲线测定
1、菌种活化
将实施例1的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCCNo.6646接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8-10小时进行活化，连续活化两代，获得活化培养液。
2、生长曲线绘制
将步骤1获得的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCCNo.6646活化培养液按体积比为3:100的量接种于M17培养液中，42℃培养36小时，每隔2小时测定培养液的活菌数，用OD600值表示，得到嗜热链球菌TIMR0705-6在M17培养液中的生长曲线（图3），嗜热链球菌在M17培养液中生长迅速，在2小时进入对数期，10小时进入稳定期；同时测定培养液中的pH值，随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，进入稳定期后，pH下降趋势渐缓。培养12小时时，培养液中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646的OD值为1.31，活菌浓度为109—1010cfu/mL。
3、胞外多糖产生曲线绘制
将步骤1获得的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCCNo.6646活化培养液按体积比为3:100的量接种于M17培养液中，42℃培养36小时，每隔2小时取10mL培养液测定培养液中的多糖含量（mg/L），结果如图3所示，嗜热链球菌TIMR0705-6发酵液多糖含量在菌株对数生长期增长最为迅速，进入平稳期后，依然缓慢增长。发酵时间30小时后，菌株发酵液中多糖含量达到峰值148mg/L后，开始出现缓慢降低趋势。
上述多糖（即胞外多糖）含量的测定方法具体如下：将培养液首先经过沸水浴10min，以失活降解多糖的酶，添加80%（w/v）三氯乙酸至终浓度为40g/L，搅拌1-2小时，然后离心（10000r/min、30min、4℃）除去菌体和凝结蛋白，上清液加3倍体积无水乙醇震荡混匀，4℃静置过夜，离心（10000r/min、30min、4℃），将沉淀物用去离子水溶解，溶解后的液体用去离子水透析72小时（透析袋3500MW），每8小时换水一次，冷冻干燥得多糖样品称重。
实施例3、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646工作发酵剂的制备
将实施例1步骤1获得的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646活化培养液按体积比为（2—4）:100的量接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8—10小时，4℃条件下6000r/min离心10min，将沉淀用无菌乳悬浮，获得嗜热链球菌TIMR0705-6的工作发酵剂，使所述工作发酵剂中的嗜热链球菌TIMR0705-6的活菌浓度为109—1010cfu/mL。
实施例4、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646制备发酵酸乳
1、发酵酸乳的获得
实验设三个处理组（实验组、对照组1、对照组2），每个处理组重复三次，具体如下：
1）实验组：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将实施例2步骤2获得的嗜热链球菌TIMR0705-6活菌含量为5×109cfu/mL的工作发酵剂按体积比为4:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为4:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.6，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳A；
2）对照组1：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂（活菌含量为5×109cfu/mL）按体积比为4:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为4:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.6，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳B；
3）对照组2：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂（活菌含量为5×109cfu/mL）按体积比为4:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为4:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；再将商品稳定剂（安徽杜贝斯特食品工业有限公司，商品目录编号DB-J4159，主要成分为明胶和果胶）按体积比为2:100的量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.6，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳C；
上述保加利亚乳杆菌发酵剂的制备方法如下：
将德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）（中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的保藏编号为6047）接种于MRS培养基中，在37℃培养16-18小时进行活化，连续活化两代，获得活化培养液；将活化培养液按体积比为（2—4）:100的量接种于MRS培养液中，在37℃培养16-18小时；4℃条件下6000r/min离心10min，将沉淀用无菌乳悬浮，获保加利亚乳杆菌发酵剂，其中保加利亚乳杆菌的活菌浓度为1010cfu/mL。
上述不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂的制备方法如下：
将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)KC5接种于M17培养液中，在42℃条件下培养8-10小时进行活化，连续活化两代，获得活化培养液；将该活化培养液按体积比为（2—4）:100的量接种于M17培养液中，42℃培养8—10小时；4℃条件下6000r/min离心10min，将沉淀用无菌乳悬浮，获得嗜热链球菌KC5的发酵剂，使所述发酵剂中嗜热链球菌KC5的活菌浓度为109—1010cfu/mL。
2、发酵酸乳的检测
分别检测步骤1三种处理各重复获得的发酵酸乳A、B和C进行冷藏的第1天（即温度降为4℃时）、第7天、第14天、第21天和第28天的持水力、粘度、凝胶强度，结果用不同处理三次重复的平均值±标准差形式表示，如表1—表3和图4—图6所示，具体测定方法如下：
粘度：采用DV-ⅢUltra型粘度计（Brookfield公司）在25℃进行测定，采用LV3转子，转速100r/min，作用时间1min。
持水力：取重量W为5g发酵酸乳于离心管中，6000r/min，4℃，10min，称量上清液的重量W1，持水力（%）=(W-W1)/W×100%。
凝胶强度：利用质构仪测定发酵酸乳的凝胶强度，将发酵酸乳样品于室温（25℃）下回复一段时间，选用锥形探头P/45C（高4cm，底径3cm），下压模式，穿入未经搅拌的发酵酸乳样品，插入深度20mm，速度2mm/s，此过程所需最大的力即为发酵酸乳的凝胶强度（单位：GS）。
表1.发酵酸乳保藏期间的持水力（%）变化
| 发酵时间 | 1天 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 |
| 实验组 | 32.2±0.4a,A | 34.3±0.2C | 50.1±0.3C | 56.0±0.4a,A | 60.0±0.3a,A |
| 对照组1 | 28.6±0.2b,B | 38.4±0.3A | 54.2±0.4A | 54.0±0.3b,B | 58.0±0.2b,B |
| 对照组2 | 29.4±0.5b,B | 35.5±0.3B | 52.3±0.4B | 55.1±0.2c,AB | 59.4±0.3a,A |
注：表中结果在相同保藏期间下不含有相同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著；不含有相同大写字母表示在P＜0.01水平差异极显著。
表2.发酵酸乳保藏期间的粘度（单位：厘泊）变化
| 发酵时间 | 1天 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 |
| 实验组 | 489.5±7b | 510.0±5b | 665.8±8A | 675.8±7a,A | 700.6±6a,A |
| 对照组1 | 507.4±7a | 560.2±8a | 585.4±10C | 618.6±6c,B | 646.6±7c,B |
| 对照组2 | 490.8±8ab | 502.3±6b | 615.8±5B | 640.4±8b,B | 668.2±7b,B |
注：表中结果在相同保藏期间下不含有相同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著；不含有相同大写字母表示在P＜0.01水平差异极显著。
表3.发酵酸乳保藏期间的凝胶强度（单位：GS）变化
| 发酵时间 | 1天 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 |
| 实验组 | 32.3±0.2a | 33.4±0.1a | 34.0±0.2a | 35.4±0.1A | 36.7±0.2A |
| 对照组1 | 31.9±0.1a | 32.5±0.2b | 33.0±0.1b | 33.1±0.2B | 34.2±0.2B |
| 对照组2 | 32.0±0.2a | 32.7±0.2b | 33.1±0.1b | 34.6±0.2c | 35.9±0.1C |
注：表中结果在相同保藏期间下不含有相同小写字母表示在P＜0.05水平差异显著；不含有相同大写字母表示在P＜0.01水平差异极显著。
实施例5、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646制备发酵酸乳
1、发酵酸乳的获得
实验设三个处理组（实验组、对照组1、对照组2），每个处理组重复三次，具体如下：
1）实验组：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将实施例2步骤2获得的嗜热链球菌TIMR0705-6活菌含量为1010cfu/mL的工作发酵剂按体积比为3:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为3:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.65，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳A；
2）对照组1：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂（活菌含量为1010cfu/mL）按体积比为3:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为3:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.65，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳B；
3）对照组2：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂（活菌含量为1010cfu/mL）按体积比为3:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为3:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；再将商品稳定剂（安徽杜贝斯特食品工业有限公司，商品目录编号DB-J4159，主要成分为明胶和果胶）按体积比为2:100的量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.65，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳C；
上述保加利亚乳杆菌发酵剂及不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂的制备方法与实施例4相同。
2、发酵酸乳的检测
方法与实施例4的步骤2相同，结果与实施例4的结果无显著差异。
实施例6、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)TIMR0705-6CGMCC No.6646制备发酵酸乳
1、发酵酸乳的获得
实验设三个处理组（实验组、对照组1、对照组2），每个处理组重复三次，具体如下：
1）实验组：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将实施例2步骤2获得的嗜热链球菌TIMR0705-6活菌含量为109cfu/mL的工作发酵剂按体积比为5:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为5:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.7，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳A；
2）对照组1：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂（活菌含量为109cfu/mL）按体积比为5:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为5:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.7，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳B；
3）对照组2：将原料乳鲜奶（不经过任何处理的新鲜牛奶）在95℃加热灭菌20min后，再冷却至42℃；将不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂（活菌含量为109cfu/mL）按体积比为5:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；并将与嗜热链球菌可共生的制备发酵酸乳的保加利亚乳杆菌发酵剂按体积比为5:100的接种量加入所述原料乳鲜奶中；再将商品稳定剂（安徽杜贝斯特食品工业有限公司，商品目录编号DB-J4159，主要成分为明胶和果胶）按体积比为2:100的量加入所述原料乳鲜奶中；42℃发酵培养至发酵产物以乳酸计的滴定酸度为0.7，4℃冷藏保存该发酵产物即得到发酵酸乳C；
上述保加利亚乳杆菌发酵剂及不产胞外多糖的嗜热链球菌KC5的发酵剂的制备方法与实施例4相同。
2、发酵酸乳的检测
方法与实施例4的步骤2相同，结果与实施例4的结果无显著差异。
Claims (10)
1.一株产胞外多糖的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）TIMR0705-6，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6646。
2.一种嗜热链球菌工作发酵剂，其特征在于：所述工作发酵剂的活性成分为权利要求1所述的嗜热链球菌TIMR0705-6。
3.根据权利要求2所述的嗜热链球菌工作发酵剂，其特征在于：所述嗜热链球菌工作发酵剂中的所述嗜热链球菌TIMR0705-6的活菌含量为109—1010cfu/mL。
4.权利要求1所述嗜热链球菌TIMR0705-6和权利要求2或3所述嗜热链球菌发酵剂在制备发酵食品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的发酵食品为发酵酸乳。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵食品的制备包括如下步骤：将权利要求2或3所述嗜热链球菌工作发酵剂和与嗜热链球菌共生的保加利亚乳杆菌发酵剂分别按体积比为（3—5）:100的量加入原料乳中进行发酵，获得滴定酸度以乳酸计为0.6—0.7的发酵产物即为所述发酵食品。
7.一种胞外多糖，其特征在于：所述胞外多糖是按照包括如下步骤的方法制备得到的：将权利要求1所述嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）TIMR0705-6进行液体发酵，收集所有发酵液，从所述发酵液中提取胞外多糖。
8.根据权利要求8所述的胞外多糖，其特征在于：所述提取包括如下步骤：将所述发酵液煮沸后用三氯乙酸沉淀离心，取上清液用乙醇沉淀，将所述沉淀溶解于水后再用水透析，即获得所述胞外多糖；
和/或，所述离心的条件为4℃、10000r/min、离心30min；
和/或，所述三氯乙酸的使用终浓度为40g/L；
和/或，所述乙醇的添加终浓度为体积百分含量75%。
9.权利要求7或8所述胞外多糖在制备发酵食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述发酵食品为发酵酸乳。
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