CN106701698A

CN106701698A - 羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

Info

Publication number: CN106701698A
Application number: CN201611026745.0A
Authority: CN
Inventors: 郁惠蕾; 商曰朋; 潘江; 许建和; 钱小龙
Original assignee: Fuan Suzhou Hundred Zymotechnic Co Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2016-11-15
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2036-11-15
Also published as: CN106701698B

Abstract

本发明涉及羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用。具体公开了木糖发酵酵母羰基还原酶及其活性提高的突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用所述木糖发酵酵母羰基还原酶或相应的重组表达转化体作为催化剂用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原，特别是催化2‑氯‑2',4'‑二氟苯乙酮和2,2',4'‑三氯苯乙酮还原制备抗真菌化合物前体(R)‑2‑氯‑1‑(2',4'‑二氟苯基)乙醇和(R)‑2‑氯‑1‑(2',4'‑二氯苯基)乙醇的应用。与现有不对称还原的其他方法相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有很好的应用前景。

Description

羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及木糖发酵酵母羰基还原酶及其催化性能提高的突变体，该羰基还原酶及其突变体的编码基因和氨基酸序列，含有所述编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该羰基还原酶或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物不对称还原，制备光学纯手性醇，特别是催化2-氯-2’,4-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮不对称还原以制备光学纯抗真菌类药物中间体(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的应用。

背景技术

(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇是合成咪康唑、嗌康唑及氟康唑等众多抗真菌类咪唑药物的重要手性中间体。这类抗真菌咪唑类药物合成的手性羟基砌块的光学纯度对药物的药效有极其重要的影响。

潜手性羰基化合物的不对称还原是制备高光学纯度手性醇的重要方法。手性醇的获得主要分为化学法和生物法。在化学方法中，常用硼氢化钠作为还原剂，在金属催化剂与相应手性配体配合作用下，催化生成相应的手性醇，但产品光学纯度往往不高，并且贵重的手性催化剂以及极端的催化条件限制了工业化的应用。

作为化学催化法强有力的竞争者，生物催化法正在起着越来越重要的作用。2005年，杨立荣等将2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮用硼氢化钠还原为消旋的2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇，再利用脂肪酶催化动力学转酯化拆分得到相应的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇乙酸酯，然后在室温下将(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇乙酸酯水解为(S)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇，ee值分别为90.2％和94.5％。该方法操作步骤复杂，酶法拆分的理论得率仅为50％，并且反应的对映选择性偏低(CN 1765887B)。2009年，方岩雄等利用面包酵母中的氧化还原酶合成了(S)-2-氯-1-苯基乙醇衍生物，且ee值在97％以上。但是野生型面包酵母中还原酶表达量较低，并且本身含有多种杂酶，反应副产物较多。在所述的方法中面包酵母干细胞的添加量高达120g/L，导致产物的分离比较困难(CN 101503714A)。

专一性不对称催化还原2-溴-2’,4’-二氯苯乙酮、2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮及2,2’,4’-三氯苯乙酮的还原酶越来越多地被报道。例如，Duming Zhu等人利用醇脱氢酶PFADH成功获得ee值高达99％的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(3’,4’-二氯苯基)乙醇以及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇，但酶的活性偏低，反应时空产率仅为20g L^-1d^-1(J.Mol.Catal.B:Enzym.2009,56,272-276)。Gotor等人筛选了多种醇脱氢酶(ADH-T,ADH-CP,ADH-A等)，但在众多酶中仅ADH-T具有较好的活性及对映选择性，但是酶的底物耐受性差，最高底物浓度仅为6.7g/L(J.Org.Chem.2011,76,2115-2122.)。

综上所述，在合成光学纯(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-溴-1-(2,4-二氯苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇等抗真菌类咪唑药物合成中间体的研究中存在许多的不足之处，已知的还原酶存在着催化活性低，底物耐受浓度低以及生产效率不高等问题。因此，需要更好的酶催化剂来满足催化反应效率高、对映选择性高、底物浓度高，操作简单、产物易分离的工业化需求。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术中羰基还原酶的不足，而提供一种木糖发酵酵母CBS 6054羰基还原酶，使用该酶及其突变体催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其结构类似物的不对称还原，具有反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等显著优点。

本发明提供了木糖发酵酵母菌CBS 6054所表达的羰基还原酶SsCR及羰基还原酶SsCR的突变体、其编码基因、表达该羰基还原酶及其突变体的重组表达载体和重组转化体，所述羰基还原酶在催化潜手性羰基化合物不对称还原制备手性仲醇，特别是(R)-2-氯-1-(3’,4’-二氯苯基)、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供了一种新羰基还原酶SsCR的氨基酸序列，如序列表SEQ IDNo.2所示。制备本发明所述羰基还原酶SsCR的方法包括但不限于：1)从木糖发酵酵母菌CBS6054的细胞中直接提取分离获得；2)按照本领域常规技术通过所述羰基还原酶编码基因的异源重组表达来获得。

本发明第二方面，提供了多种突变体，与母本相比，所述突变体均有活力提高，其中部分突变体热稳定性也有所提高。

这些突变体氨基酸序列如下：

(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；

(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第126位的缬氨酸替换为丙氨酸，第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；

(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸；

(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第215位的甲硫氨酸替换为亮氨酸；

(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第130位的丝氨酸替换为甘氨酸；

(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第130位丝氨酸突变为甘氨酸；

(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第165位的甘氨酸替换为酪氨酸，同时第169位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸；

(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸；

(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸；

(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第136位的甘氨酸突变为丝氨酸；

(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸；

(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第158位的组氨酸突变为天冬氨酸，第290位的赖氨酸突变为精氨酸；

(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第32位的丝氨酸突变为亮氨酸，第327位的赖氨酸突变为天冬酰胺；

(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第57位的缬氨酸替换为天冬氨酸，第132位的脯氨酸突变为谷氨酸；

(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第201位的赖氨酸突变为精氨酸；

(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第235位的苯丙氨酸突变为丝氨酸；

(17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为酪氨酸；

(18)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第243位的赖氨酸突变为精氨酸；

(19)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第160位的缬氨酸替换为天冬氨酸；

(20)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第126位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；

(21)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第158位的组氨酸替换为天冬氨酸；

(22)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位的缬氨酸替换为天冬氨酸，第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；

(23)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第165位的甘氨酸替换为酪氨酸；

(24)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第169位的苯丙氨酸替换为半胱氨酸；

(25)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第160位的缬氨酸替换为丙氨酸；

(26)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第57位的缬氨酸替换为丙氨酸，第182位的赖氨酸突变为谷氨酸；

(27)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第158位的组氨酸替换为脯氨酸；

(28)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第168位的谷氨酰胺替换为亮氨酸。

本发明中的羰基还原酶SsCR的突变体的获得方法为随机突变。

本发明第三方面，提供了羰基还原酶的编码基因，以及含有所述编码基因的重组表达载体。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种质粒载体，优选质粒pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的还原酶基因产物用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，然后与同样用EcoR I和Xho I双酶切的质粒pET28a混合，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明所述还原酶基因的重组表达载体。

本发明第四方面，提供一种包含本发明还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，要求是所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，更优选大肠杆菌(E.coli)DH5α用于高效复制重组表达载体，优选大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)用于重组表达载体高效表达目标蛋白。

本发明第五方面，提供一种重组羰基还原酶及其突变体的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组羰基还原酶。其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使转化体生长并能生产本发明所提到的还原酶。对于所述的宿主细胞，优选LB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，pH 6.5-7.0。培养条件没有明确的限制，前提是转化体能够生长并且产生所述的还原酶，优选的方法如下：将已经成功导入重组表达载体的大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))按常规接种量接种至含卡那霉素的LB培养基中，在37℃下培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6左右时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导后在16℃培养24h即可得到所需的重组还原酶蛋白。

本发明第六方面，还提供了利用所述相关重组表达转化体的培养物或所得羰基还原酶在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用，其中所述潜手性羰基化合物可选自如下通式：

其中，化合物1：R₁为-H，R₂为-Cl，R₃为-H，R₄为-H；

化合物2：R₁为-H，R₂为-H，R₃为-CH₃，R₄为-H；

化合物3：R₁为-CH₂CH₂Cl，R₂为-H，R₃为-H，R₄为-H；

化合物4：R₁为-CH₂Cl，R₂为-H，R₃为-Cl，R₄为-Cl；

化合物5：R₁为-CH₂Cl，R₂为-Cl，R₃为-H，R₄为-Cl；

化合物6：R₁为-CH₂Cl，R₂为-F，R₃为-H，R₄为-F。

具体的，所述化合物4为2,3’,4’-三氯苯乙酮,化合物5为2,2’,4’-三氯苯乙酮，化合物6为2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮。

在前述应用中，潜手性羰基化合物的浓度可为2～500mmol/L，所述羰基还原酶的用量可选为50～200U/mmol潜手性羰基化合物。反应中所需的NADPH或NADP⁺的用量为0～10mM。反应过程中可利用葡萄糖作为辅底物，通过葡萄糖脱氢酶催化实现宿主细胞内NADPH的辅酶循环，所述葡萄糖脱氢酶的用量可为50～200U/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量可为0.18～0.27g/mmol潜手性羰基化合物。不对称还原过程中所需的磷酸盐缓冲液为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸钠缓冲液，其浓度较佳为50～100mmol/L。所述的不对称还原反应是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度为20～40℃，优选30℃。所述的不对称还原反应的时间以底物完全反应完或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。

与现有技术相比，本发明的改善进步效果在于：本发明提供了一种新的羰基还原酶，高效催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其结构类似物的不对称还原，制备光学纯的(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及其结构类似物，将该羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶偶联实现辅酶原位再生，减少辅酶用量。所述的羰基还原酶能够在催化浓度高达500mM的疏水性芳香酮底物时，实现99％以上的转化率，产物的光学纯度高达99.9％。相对于其他的疏水性芳香酮底物不对称还原方法，本发明具有羰基还原酶催化活性高，耐受高浓度底物，反应产物光学纯度高，反应过程中可以无需额外添加辅酶等优势，本发明羰基还原酶易于获得，反应条件温和，环境友好，理论得率高达100％，反应过程简单高效，易于操作，产物易于提取，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为重组质粒pET28a-SsCR构建示意图。

具体实施方式

本发明通过分析生物信息学的方法，分析预测可能对2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮具有明显还原活性的羰基还原酶的基因，并将其分选出来进行克隆表达，验证其功能。采用这种方法，从木糖发酵酵母菌中克隆获得一个高效催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮不对称还原，制备获得抗真菌类咪唑药物合成中间体(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇和(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇的羰基还原酶基因，重组表达的羰基还原酶催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮和2,2’,4’-三氯苯乙酮的还原，产物的ee值高达99.9％，该羰基还原酶命名为SsCR，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码本发明所述羰基还原酶SsCR的核酸分子的较佳来源有：以木糖发酵酵母菌(Scheffersomyces stipitis)CBS 6054的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链反应PCR)，获得编码所述羰基还原酶SsCR的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，优选的如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示：

正向引物SEQ ID No.3：CCG GAATTC ATGACTACCTCAGTTTTCGT

反向引物SEQ ID No.4：CCG CTCGAG TTAACCTTGTACCTTCAAAA

其中，正向引物中以下划线标出的碱基序列为EcoR I酶切位点，反向引物中以下划线标出的碱基序列为Xho I酶切位点。然后以木糖发酵酵母菌CBS 6054的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得羰基还原酶SsCR全长基因的PCR产物，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，全长1005bp，其起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，序列中无内含子，编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1005个碱基，所编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

采用易错PCR的方法对重组酶SsCR进行了随机突变改造，通过一个氨基酸的改变获得的突变体SsCR_M1的活力是SEQ ID No.2活力的2倍，其氨基酸序列为：将如序列表中SEQID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸。在此基础上，进一步通过大规模易错PCR突变以及高通量筛选，获得一批酶活性显著提高的突变体。这些突变体与母本相比，其活力提高了2～8倍。

本发明所述的羰基还原酶SsCR及其突变体可由相应的核酸序列编码。包含所述编码基因的核酸分子包括但不限于：从生物体内提取天然存在的编码羰基还原酶SsCR的核酸分子，或通过基因克隆技术对已有核酸片段进行基因工程操作制得的编码羰基还原酶SsCR及其突变体的核酸分子，或通过人工合成方法得到的编码所述羰基还原酶SsCR及其突变体的核酸分子。术语“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。

本发明的重组表达载体可通过下述示例性方法制得：将通过PCR扩增所得的包含羰基还原酶SsCR基因(如SEQ ID No.1所示)的PCR产物用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，形成互补的粘性末端，同时将表达载体pET28a用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，经T4 DNA连接酶连接经过酶切的基因片段和表达载体生成含有本发明的羰基还原酶基因的重组表达质粒pET28a-SsCR，如图1所示。将所述重组表达质粒pET28a-SsCR转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的重组表达羰基还原酶SsCR的基因工程菌株，即大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28a-SsCR。采用类似的方法，可以很方便地获得表达本发明所述的羰基还原酶SsCR的各种突变体的基因工程菌株。

当所述重组表达转化体是大肠杆菌时，优选LB培养基进行重组表达转化体的培养以及诱导产酶，该培养基含有蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并高效产生本发明所述羰基还原酶即可。重组表达转化体的培养和羰基还原酶的产生，可优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组羰基还原酶。

本发明中，羰基还原酶的收集与储存方法如下：将重组大肠杆菌的发酵液(包括摇瓶培养以及发酵罐培养发酵液)，在高速离心机以15,000rpm离心10min，收集重组大肠杆菌细胞。细胞可以用pH 6.5的PBS缓冲液(100mM)重悬，在冰水浴的条件下进行超声破碎(超声破碎仪的设定功率为400W，工作4s，间歇6s，共循环99次)。破碎液在4℃低温离心机里15000rpm离心40min，取上清液进行活力测定以及蛋白纯化。另外所收集的细胞在-80℃下冷冻12h后，用真空冷冻干燥机低温干燥20h，即可得到冻干细胞，储存在4℃冰箱内。冻干细胞保留了胞内羰基还原酶和辅酶的活性，在进行酶促反应时易于定量和添加。

本发明中所述羰基还原酶的活力可用如下方法测定：将含2mmol/L 2,2’,4’-三氯苯乙酮和0.1mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mmol/L PBS缓冲液，pH 6.5)预热至30℃，然后加入适量的羰基还原酶，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

所述葡萄糖脱氢酶的活力可用如下方法测定：将含10mmol/L葡萄糖、1mmol/LNADP⁺的1mL反应体系(100mmol/L PBS缓冲液，pH 6.5)预热至30℃，然后加入适量葡萄糖脱氢酶。30℃条件下，在分光光度计比色皿中保温反应，并原位检测340nm处NADPH吸光度的变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

按上述方法测定所述羰基还原酶的活力时，可用下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×1)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为ml；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；1为光程距离，单位为cm。对于羰基还原酶而言，1个活性单位对应于上述条件下每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。

本发明还公开了所述羰基还原酶SsCR及其突变体在催化潜手性羰基化合物不对称还原生成抗真菌类咪唑药物合成中间体及其他光学纯手性仲醇中的应用。所述的应用包括以所述羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂，在pH 6.0～7.5(例如pH 6.5)的缓冲液中，加入待转化的潜手性羰基化合物、葡萄糖以及葡萄糖脱氢酶，经过适当时间的生物转化，即可生成光学纯的手性羟基化合物，例如，(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇、(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇及其结构类似物。

本发明中所用的缓冲液为本领域常规缓冲液。在一种实施方式中，所述缓冲液为pH 6.5的PBS缓冲液，其他可用的缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、磷酸钾缓冲液，只要其能满足pH 6.0～7.5的缓冲范围即可。缓冲液的浓度范围可为10～200mM，优选为50～100mM。

提及化合物时，术语“化学纯”是指与不需要的杂质相比，化合物占总量的85％或更高(例如，90％、95％或更高)的纯化物。本发明中，光学纯度一般以术语“对映体过量”或符号“ee”表示，该术语是指混合物中一种对映体相对于另一种的过量。除非另有说明，说明书中涉及纯度或ee值时，“>99％”表示残余底物或某异构体含量低于检测下限而无法准确测定。本文中，ee值的分析可通过将提取后的产物进行手性气相色谱分析来实现，示例性的气相色谱条件为：采用手性气相柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温为梯度升温：150℃保持6min，20℃/min升至200℃，保持10min。

所述的不对称还原反应较佳地在适度振荡或搅拌条件下进行。反应温度可选20～40℃，底物浓度可选为2～500mmol/L，羰基还原酶用量可选地为50～200U酶/mmol底物；葡萄糖脱氢酶用量可选地为50～200U酶/mmol底物；葡萄糖用量可选为0.18～0.27g/mmol底物；过程中NADPH或NADP⁺的添加量为0～10mmol/L。反应中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以转化率达到99％以上为准，一般为1～24小时。转化率可采用气相色谱法来分析，例如，利用手性气相柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温为梯度升温：150℃保持6min，20℃/min升至200℃，保持10min。

待不对称还原反应结束后，反应液用等量水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚，进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物的粗提物。粗提物通过常规方法如减压蒸馏、重结晶等进一步纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。

本发明提供的木糖发酵酵母CBS 6054羰基还原酶SsCR及突变体，可用于高效催化2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮、2,2’,4’-三氯苯乙酮及其结构类似物的不对称还原，生成光学纯(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇。利用该酶法催化技术，底物浓度达500mmol/L，转化率可超过99％，产物ee值高于99.9％。相对于其他(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇的不对称还原制备方法，本发明具有产物浓度高和光学纯度高的优势，有利于实现(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氟苯基)乙醇及(R)-2-氯-1-(2’,4’-二氯苯基)乙醇等抗真菌类咪唑药物合成中间体的高效、低成本生产，具有工业化应用前景。

前述各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可用通过实验得到验证。以下实施例举例说明了本发明示例性的实施方式，来帮助本领域技术人员理解本申请的其它目标、特征、优点和各方面。应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述和具体实施例仅是为了说明而给出，而不对本发明的范围构成限制。本发明的范围根据所附权利要求书确定。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。

下列实施例中的材料来源为：

木糖发酵酵母CBS 6054购自荷兰微生物菌种保藏中心；

表达质粒pET28a购自Novagen公司；

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I和Xho I均为Takara公司的市售产品。

实施例1 羰基还原酶SsCR的基因克隆

根据羰基还原酶SsCR的开放阅读框，设计上、下游引物如下：

上游引物SEQ ID No.3：

CCG GAATTC ATGACTACCTCAGTTTTCGT

下游引物SEQ ID No.4：

CCG CTCGAG TTAACCTTGTACCTTCAAAA

其中，上游引物下划线部分为EcoR I酶切位点，下游引物下划线部分为Xho I酶切位点。

以木糖发酵酵母CBS 6054的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×TaqPCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH₂O 19μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行32次如下循环：94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟；最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列中编码的开放阅读框全长1005bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2 羰基还原酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备

如图1所示，将实施例1中PCR扩增所得的羰基还原酶目的片段以及pET 28a空质粒同时用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的经酶切目的片段和空质粒载体在T4 DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pET28a-SsCR。

将所得重组质粒转化至E.coli DH 5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8小时，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取菌落PCR扩增出长度约1000bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，提取相应的质粒，进一步转化至E.coliBL21，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsCR。

实施例3 羰基还原酶SsCR突变体构建

采用易错PCR技术构建羰基还原酶SsCR的随机突变库：以pET28a_SsCR作为模板，以For_EcoR I和Rev_Xho I为引物，用Taq DNA聚合酶进行易错PCR。为了获得合适的突变率，选择一系列不同的MnCl₂浓度梯度(100μM～300μM的MnCl₂)构建突变库。PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入模板0.5～20ng，5μL 10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)，5μL dNTP(各2.0mM)，5μL MnCl₂(1mM)，一对突变引物各2μL(10μM)，0.5μL Taq DNApolymerase，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)95℃变性3min；(2)94℃变性10sec，(3)60℃退火30sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收之后的目的基因及pET 28a用限制性内切酶EcoRI和XhoI在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET 28a质粒与目的基因片段置于16℃进行连接。将连接产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有Kan抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。

表1提供本发明公开的具有相关活性的特定序列的羰基还原酶SsCR突变体的列表。在下表中，序列标号分别指表1后面的一系列序列，在活性列中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了0.1～2倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了2～4倍。三个加号“+++“表示突变体蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了4～9倍。在热稳定性列中，一个加号“+”对应于突变体蛋白的T₅₀ ¹⁵值提高0℃～3℃；两个加号“++”表示突变体蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的T₅₀ ¹⁵值提高3℃～6℃；三个加号“+++“表示突变体蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的T₅₀ ¹⁵值提高6℃～9℃。

表1：羰基还原酶SsCR突变体序列和相应的活性改进列表

其氨基酸序列分别如下：

实施例4 羰基还原酶SsCR的诱导表达及活力测定

将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsCR，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，放入37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以15000rpm转速离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将所得细胞用10ml的PBS缓冲液(100mM,pH 6.5)重悬，冰水浴中进行如下超声处理：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下15000rpm离心40分钟，收集上清液，按前文发明详述所述方法进行活力测定。

采用镍柱进行蛋白纯化。以下为缓冲液配方：A液：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH7.4)，含有0.5M NaCl、10mM咪唑；B液：Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 7.4)，含有0.5M NaCl、0.5M咪唑；C液：Tris-HCl缓冲液(25mM,pH 7.4),150mM NaCl,1mM DTT。将表达的羰基还原酶的粗酶液上样到镍柱上，首先用A液洗脱杂蛋白，随后用B液洗脱目标蛋白，超滤浓缩到一定体积后用C液进行置换，降低蛋白溶液内的咪唑浓度。根据SDS-PAGE检测的结果收集纯化的蛋白质，加入终浓度为20％(w/v)的甘油，于-80℃保存备用。

用磷酸钠缓冲液(100mM,pH 6.5)将经过镍柱纯化的纯酶稀释至0.02mg mL^-1，吸取10μL酶液加到1mL测活体系中(970μL磷酸钠缓冲液，0.1mM NADPH，2mM 2,2’,4’-三氯苯乙酮)，30℃下测定1min内340nm处的吸光值变化，计算所得的酶活为30U/mg纯酶。

实施例5 SsCR催化还原2,2’,4’-三氯苯乙酮

在含50mmol/L底物2,2’,4’-三氯苯乙酮(11.2g/L)和75mmol/L葡萄糖的10mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入10kU/L的实施例2所述重组表达转化体(E.coliBL21/pET28a-SsCR)的冻干细胞，加入10kU/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入1.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应4小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测得：底物转化率为99.9％，产物ee值为99.9％(R)。

实施例6 SsCR_M1催化还原2,2’,4’-三氯苯乙酮

在含50mmol/L底物2,2’,4’-三氯苯乙酮(11.2g/L)和75mmol/L葡萄糖的10mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入10kU/L的实施例3所述重组表达转化体(E.coliBL21/pET28a-SsCR_M1)的冻干细胞，加入10kU/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入1.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应2小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测得：底物转化率为99.9％，产物ee值为99.9％(R)。

实施例7～12 SsCR_M1催化的不对称还原

在2mL离心管中进行反应，1mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中加有20mmol/L的底物，5.4g/L葡萄糖，1U葡萄糖脱氢酶和终浓度为1.0mM的NADPH，2.12U如实施例3所述的重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-SsCR_M1)的静息细胞。反应在振荡器上1000rpm，30℃下进行。转化12小时，终止反应，用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，测定底物转化率和还原产物的ee值。转化率与ee值的分析条件见实施例13～18，结果见表2。

表2 SsCR_M1催化潜手性底物不对称还原反应的结果

实施例7-12中的底物转化率及产物对映体过量值的分析条件，如表3所示。

表3 SsCR_M1不对称催化潜手性底物的转化率及产物ee值的分析条件

实施例13 SsCR_M1催化还原2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮

在含100mmol/L底物2-氯-2’,4’-二氟苯乙酮(19.1g/L)和150mmol/L葡萄糖的10mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入20kU/L如实施例3所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-SsCR_M1)的冻干细胞，加入20kU/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入3.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应2小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测得：底物转化率为99.9％，产物ee值为99.9％(R)。

实施例14 SsCR_M1催化还原2,3’,4’-三氯苯乙酮

在含100mmol/L底物2,3’,4’-三氯苯乙酮(23.5g/L)和150mmol/L葡萄糖的10mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入20kU/L如实施例3所述重组表达转化体(E.coliBL21/pET28a-SsCR_M1)的冻干细胞，加入20kU/L葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入3.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应2小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测得：底物转化率为99.9％，产物ee值为86.1％(R)。

实施例15 SsCR_M1催化还原2,2’,4’-三氯苯乙酮

在含500mmol/L底物2,2’,4’-三氯苯乙酮和450mmol/L葡萄糖的10mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入以60kU/L如实施例3所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-SsCR_M1)的冻干细胞，以60kU/L葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入10.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。反应在磁力搅拌下于30℃水浴中进行，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应12小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测定得：底物转化率为99.9％，产物ee值为99.9％。

实施例16 SsCR_M15催化还原2,2’,4’-三氯苯乙酮

在含500mmol/L底物2,2’,4’-三氯苯乙酮和450mmol/L葡萄糖的10mL的磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入60kU/L如实施例3所述突变体重组表达转化体(E.coliBL21/pET28a-SsCR_M15)的冻干细胞，以60kU/L的葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入10.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生。反应在磁力搅拌下于30℃水浴中进行，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应6小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测定得：底物转化率为99.9％，产物ee值为99.9％。

实施例17 1-L规模SsCR_M1整细胞还原2,2’,4’-三氯苯乙酮

在含500mmol/L的底物2,2’,4’-三氯苯乙酮和450mmol/L葡萄糖的1L磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.5)中，加入60kU/L如实施例3所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-SsCR_M1)的冻干细胞，并加入以60kU/L葡萄糖脱氢酶的冻干酶粉，最后加入10.0mM的NADP⁺用于辅酶的循环再生，体系中含有10％v/v的二甲基亚砜用于增加底物的溶解度。反应在30℃水浴下进行，机械搅拌，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的氢氧化钠溶液使pH控制在6.5。反应24小时后，测得转化率99.9％，产物ee值99.9％，加入等量乙酸乙酯萃取两次,合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，获得产品60g，分离收率为88.2％。测得产物比旋光度为：

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

<130>

<160>4

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 木糖发酵酵母(Scheffersomyces stipites CBS 6054)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1005)

<400> 1

atgactacct cagttttcgt ttcaggtgca accggttacc ttgcccaaca aattattgca 60

cttgttctct ccaagggcta caaggtcgtt ggttcggtca gatctgaaga aaagggtgca 120

aacttaaaaa aattgtatgg tgacgatttc tcctatgaag ttgtcaaggt cttggaacag 180

aagggtgctt tcgatgaagc cttgaagaag cacccagaag ttacaatttt cttacacact 240

gcctctccag ttaccttcga agttgaagat accgaaaagg aaatcttgat tcctgccatt 300

aatggaacaa agtacgtctt gcaatctatc aaggacgttg ctcctcaaat caccagagtt 360

gtttacacca gttctgtctg tgctatgtct gtcccagagg aattaggtag cccagatgtg 420

gtcctctctg aagcttcttg gagtagtctc tcttacgagc aatccaagac tcatggagtt 480

ttggcttact tcggttcgaa gcaatttgct gaaagggctg catgggagtt tgttgaacag 540

gaaaagccaa actttgctct ctcgaccgta aaccctgtct acatttttgg tcctcaagct 600

aaggacgagg aagttaaggg taccttgaac ctttctgccg aaatggttaa ttccgtattg 660

aagttgaata aggacgacga tgttccagca actactggta ctttcattga tgttagagat 720

gtggctaaag ctcaccttgc agccttcgaa aaggacgaag caaagggtga aagacttctc 780

ctctctaaca ccagattcaa tggtcaaact cttttggacg ttgttagaaa gaacttccca 840

caacttgctg acaagcttcc agttggaaag ccacattctg acgatttctc tgcttttaag 900

gaatggaacg acaagaagac caagaagatt cttggatttg aatacttcga ctttgaaact 960

tctgttgttg actcaatcaa gcaagttttg aaggtacaag gttaa 1005

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 木糖发酵酵母(Scheffersomyces stipites CBS 6054)

<400> 2

Met Thr Thr Ser Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Tyr Leu Ala

5 10 15

Gln Gln Ile Ile Ala Leu Val Leu Ser Lys Gly Tyr Lys Val Val

20 25 30

Gly Ser Val Arg Ser Glu Glu Lys Gly Ala Asn Leu Lys Lys Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Asp Phe Ser Tyr Glu Val Val Lys Val Leu Glu Gln

50 55 60

Lys Gly Ala Phe Asp Glu Ala Leu Lys Lys His Pro Glu Val Thr

65 70 75

Ile Phe Leu His Thr Ala Ser Pro Val Thr Phe Glu Val Glu Asp

80 85 90

Thr Glu Lys Glu Ile Leu Ile Pro Ala Ile Asn Gly Thr Lys Tyr

95 100 105

Val Leu Gln Ser Ile Lys Asp Val Ala Pro Gln Ile Thr Arg Val

110 115 120

Val Tyr Thr Ser Ser Val Cys Ala Met Ser Val Pro Glu Glu Leu

125 130 135

Gly Ser Pro Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Ser Trp Ser Ser Leu

140 145 150

Ser Tyr Glu Gln Ser Lys Thr His Gly Val Leu Ala Tyr Phe Gly

155 160 165

Ser Lys Gln Phe Ala Glu Arg Ala Ala Trp Glu Phe Val Glu Gln

170 175 180

Glu Lys Pro Asn Phe Ala Leu Ser Thr Val Asn Pro Val Tyr Ile

185 190 195

Phe Gly Pro Gln Ala Lys Asp Glu Glu Val Lys Gly Thr Leu Asn

200 205 210

Leu Ser Ala Glu Met Val Asn Ser Val Leu Lys Leu Asn Lys Asp

215 220 225

Asp Asp Val Pro Ala Thr Thr Gly Thr Phe Ile Asp Val Arg Asp

230 235 240

Val Ala Lys Ala His Leu Ala Ala Phe Glu Lys Asp Glu Ala Lys

245 250 255

Gly Glu Arg Leu Leu Leu Ser Asn Thr Arg Phe Asn Gly Gln Thr

260 265 270

Leu Leu Asp Val Val Arg Lys Asn Phe Pro Gln Leu Ala Asp Lys

275 280 285

Leu Pro Val Gly Lys Pro His Ser Asp Asp Phe Ser Ala Phe Lys

290 295 300

Glu Trp Asn Asp Lys Lys Thr Lys Lys Ile Leu Gly Phe Glu Tyr

305 310 315

Phe Asp Phe Glu Thr Ser Val Val Asp Ser Ile Lys Gln Val Leu

320 325 330

Lys Val Gln Gly

334

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

CCGGAATTCA TGACTACCTC AGTTTTCGT 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

CCGCTCGAGT TAACCTTGTA CCTTCAAAA 29

Claims

1.一种羰基还原酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代一个或几个氨基酸且催化活性提高的由(a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种羰基还原酶，其特征在于，所述蛋白质(b)为由SEQ IDNo.2所示氨基酸序列的第32位的亮氨酸、第57位的缬氨酸、第64位的苯丙氨酸、第126位的缬氨酸、第127位的半胱氨酸、第130位的丝氨酸、第132位的脯氨酸、第136位的甘氨酸、第158位的组氨酸、第160位的缬氨酸、第164位的苯丙氨酸、第165位的甘氨酸、第168位的谷氨酰胺、第169位的苯丙氨酸、第182位的赖氨酸、第201位的赖氨酸、第210位的天冬酰胺、第215位的甲硫氨酸、第235位的苯丙氨酸、第243位的赖氨酸、第290位的赖氨酸、第308位的赖氨酸、第327位的赖氨酸经过一个或几个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述的一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶有如下序列：

4.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1-3中任一项所述羰基还原酶的核酸分子。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求4所述的基因。

6.一种重组表达转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求5所述的重组表达载体。

7.一种羰基还原酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括培养如权利要求6所述的重组表达转化体，然后从中分离提取所述羰基还原酶的步骤。

8.如权利要求1-3中任一项所述的羰基还原酶作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述潜手性羰基化合物的浓度为2～500mmol/L，所述羰基还原酶的用量为50～200U/mmol潜手性羰基化合物。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，不对称还原反应中额外添加葡萄糖脱氢酶，葡萄糖，辅酶NADP⁺或NADPH。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的用量为50～200U/mmol潜手性羰基化合物，

所述葡萄糖的用量为0.18～0.27g/mmol潜手性羰基化合物，

所述辅酶NADPH或NADP⁺的用量选为0～10mM。

12.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的潜手性羰基化合物的通式为：

其中，化合物1：R₁为-H，R₂为-Cl，R₃为-H，R₄为-H；

化合物2：R₁为-H，R₂为-H，R₃为-CH₃，R₄为-H；

化合物3：R₁为-CH₂CH₂Cl，R₂为-H，R₃为-H，R₄为-H；

化合物4：R₁为-CH₂Cl，R₂为-H，R₃为-Cl，R₄为-Cl；

化合物5：R₁为-CH₂Cl，R₂为-Cl，R₃为-H，R₄为-Cl；

化合物6：R₁为-CH₂Cl，R₂为-F，R₃为-H，R₄为-F。

13.如权利要求6所述重组表达转化体作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用。