CN110713991B - 羰基还原酶及其突变体在茚达特罗药物中间体合成中的应用 - Google Patents

羰基还原酶及其突变体在茚达特罗药物中间体合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于Ralstonia sp.DSM 6428的羰基还原酶(RasADH)及其突变体作为生物催化剂，催化5－(α－卤代乙酰基)－8－取代氧基－(1H)－喹啉－2－酮合成茚达特罗手性中间体。RasADH在还原上述底物时酶活较低，转化时需要加入大量的菌体或者蛋白。通过蛋白质工程手段，本发明获得了七个突变体，RasADH E189A、RasADH Q191A、RasADH R202F、RasADH F205A、RasADH Q191A/F205A、RasADH Q191A/R202F/F205A、RasADH E189A/Q191A/R202F/F205A对上述底物的酶活有了显著提高，在转化底物时，能够高效转化，产物构型为R，立体选择性>99％。

Description

羰基还原酶及其突变体在茚达特罗药物中间体合成中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及来自Ralstonia sp.DSM 6428的羰基还原 酶RasADH及突变体、编码该酶的序列，以及羰基还原酶及突变体在茚达特罗药物中 间体不对称还原，制备高光学纯的手性醇中的应用。
背景技术
茚达特罗是具有有效的支气管扩张活性的β-选择性肾上腺素受体激动剂，可用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。2009年以来已在全球70多个国家和地区上市， 2012年6月经国家药监局批准在中国上市，是国内首个获批用于治疗COPD的长效β2 受体激动剂(Seth,H.D.；Sultan,S.；Gotfried,M.H.Role of Indacaterol,a Once-DailyBronchodilator,in Chronic Obstructive Pulmonary Disease J.Thorac.Dis.2013,5,806； Aparici,M.；Gómez-Angelats,M.；Vilella,D.；Otal,R.；Carcasona,C.；
Figure BDA0001729693350000011
M.；Ramos, I.；Gavaldà,A.；Alba,J.D.；Gras,J.；Cortijo,J.；Morcillo,E.；Puig,C.；Ryder,H.；Beleta,J.； Miralpeix,M.Pharmacological Characterization of Abediterol,aNovel Inhaled β(2)-Adrenoceptor Agonist with Long Duration of Action and aFavorable Safety Profile in Preclinical Models J.Pharmacol.Exp.Ther.2012,342,497)。
茚达特罗是对映异构纯的化合物，在制备过程中，通过脱去中间体(R)-5-[2-(5,6- 二乙基-茚满-2-氨基)-1-羟基-乙基]-8-取代氧基-1H-喹啉-2-酮(I)中的8-取代氧的保护基 团即可制得茚达特罗。茚达特罗中间体的制备通常有以下两条路线：
路线一：手性环氧化底物的加成。在加成反应中，除了获得目标产物I外，不可 避免的会生成两个副产物A和B，其中A是I的位置异构体，而B是I的双取代产物， 在反应后的体系中，目标产物I所占比例为60～80％，对于反应体系进行重结晶，往往 收率较低。普遍采取的纯化方法是苯甲酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸对上述 反应产物进行成盐处理，得到I的相应的盐来进行分离纯化(张席妮，熊志刚，资春 鹏，周涛，杨庆昆一种茚达特罗中间体的盐及其制备方法CN 107021921 A；王小宁， 刘飞，张喜全，顾红梅，陈智林，张洪英，江金凤，刘艳妮茚达特罗或其盐的制备方 法WO 2016161956)。
Figure BDA0001729693350000021
路线二：潜手性酮(II)的不对称还原。利用II为底物通过对羰基的不对称还原，获得手性中间体III，进一步取代反应生成目标产物I。在取代反应过程中，由于有X 基团的定位作用，所以位置易购产物都能够有效避免。目前报道较多的对III进行还原 的多为Corey-Bakshi-Shibata(CBS)反应(Corey,E.J.；Helal,C.J.Reduction of CarbonylCompounds with Chiral Oxazaborolidine Catalysts:A New Paradigm forEnantioselective Catalysis and a Powerful New Synthetic Method Angew.Chem.,Int.Ed.1998,37,1986)和 金属钌配合物催化(Fujii,A.；Hashiguchi,S.；Uematsu,N.；Ikariya,T.；Noyori,R. Asymmetric Transfer Hydrogenation of Imines Catalyzed byChiral Ru(II)Complexes J. Am.Chem.Soc.1996,118,2521.)的不对称氢化反应。
Figure BDA0001729693350000022
手性中间体III不仅可以通过化学不对称催化获得，同样也可以通过生物催化实现。随着生物信息学的发展，基因技术的完善，利用生物催化转化酮底物制备手性醇 已经成为了手性醇制备的重要方法之一。具有良好催化性能及对映选择性的化学催化 剂往往多步合成或者是金属离子参与配位，在催化剂的制备过程中，需要消耗大量的 有机试剂，在反应完成后，重金属离子的残留也需要解决。与之相对应的，利用生物 催化进行反应，可以避免使用大量的有机试剂，同时可以避免在重金属离子的使用， 对环境的影响明显降低。
目前已知的报道中，并未发现有利用底物II或者是类似物进行生物催化制备手性醇的报道，原因主要为底物II的位阻较大，大部分羰基还原酶对其没有转化活力，并 且作为药物茚达特罗的中间体，产物的构型应该为R构型，并且光学纯度>99％。筛选 生物催化剂或者对其进行改造，提高对底物II的催化活性，从而实现茚达特罗手性中 间体的绿色生物催化合成是非常必要的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明利用来源于Ralstonia sp.DSM 6428的羰基还原酶(RasADH)或突变体实现底物II的绿色还原，RasADH的突变体催化活性较野生型 提高了4-28倍。本发明包括的是利用整细胞、破菌液催化底物II合成茚达特罗手性中 间体醇的新方法。
本发明是通过利用如下技术方案实现的，Ralstonia sp.DSM 6428的羰基还原酶(RasADH)，其优化后核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
对具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质进行突变，将189位谷氨酸替换为丙氨酸(RasADH E189A，如SEQ ID No.3所示)或191位谷氨酰胺替换为丙氨酸 (RasADHQ191A，如SEQ ID No.4所示)或202位精氨酸替换为苯丙氨酸(RasADH R202F，如SEQ IDNo.5所示)或205位苯丙氨酸替换为丙氨酸(RasADH F205A， 如SEQ ID No.6所示)或在RasADH Q191A基础上将205位苯丙氨酸突变为丙氨酸 (RasADH Q191A/F205A，如SEQ IDNo.7所示)或在RasADH Q191A基础上将202 位精氨酸替换为苯丙氨酸，205位苯丙氨酸替换为丙氨酸(RasADH Q191A/R202F/F205A，如SEQ ID No.8所示)或在RasADH E189A基础上将191位谷 氨酰胺替换为丙氨酸，202位精氨酸替换为苯丙氨酸，205位苯丙氨酸替换为丙氨酸 (RasADH E189A/Q191A/R202F/F205A，如SEQ ID No.9所示)。
本发明提供了制备RasADH的方法。
该制备方法包括以下步骤：(1)合成RasADH基因并构建到pET21a表达载体上， 获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌 BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(3)将上述的RasADH基因突变体构建到pET21a 表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒(4)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选 大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的突变体工程菌株(5)将工程菌株接种至L-B培 养基中，25℃培养16小时。(5)离心收集菌体，破菌留取上清液。
本发明还提供了利用RasADH及突变体重组菌作为生物催化剂转化底物II的方法。具体地，将底物II与重组菌构建反应体系，利用葡萄糖脱氢酶、葡萄糖实现辅因 子NADPH的再生，底物II终浓度为10～60g/L，葡萄糖20-80g/L，30～35℃，转化8～12 h可完成反应。
本发明的有益效果：本发明利用基因突变技术在基因组数据库中获得的羰基还原酶RasADH及其突变体能够实现大位阻底物II的催化合成，突变后的羰基还原酶对底 物II的转化活性明显提高，使其具备了工业转化制备手性醇的潜力。利用RasADH重 组菌作为生物催化剂，能以较高底物II投料浓度，获得高收率的目标产物产率不低于 95％，对映选择性大于98％，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：RasADH及突变体的基因获得的
1.1 RasADH基因的合成及其突变体基因的获得
RasADH基因来源于青枯菌(Ralstonia sp.DSM 6428)，并且已有晶体结构(PDB：4BMS)，根据大肠杆菌密码子偏好性对该基因优化后送公司合成，密码子优化后的 基因，分别在5’端添加NdeⅠ(CATATG)酶切位点、在3’端添加XhoI(CTCGAG)酶切 位点，克隆至PET21a载体上。因已知RasADH的晶体结构，利用Discovery Studio 4.1 软件将底物II与其三维结构对接获得底物和蛋白相互作用的关系。根据对接结果，选 定活性中心附近的氨基酸189位，191位，202位，205位进行定点突变，以连有RasADH 基因的PET21a质粒为模板并根据RasADH基因序列设计引物进行滚环扩增，PCR的 扩增反应体系为：
Figure RE-GDA0001815145070000061
PCR的扩增条件为：
Figure RE-GDA0001815145070000062
对PCR扩增产物采用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。对经过DNA纯化试剂盒纯化的PCR 产物采用Dpn I限制性内切酶进行酶切消化，于37℃消化1h。消化后的产物同样用DNA纯 化试剂盒进行纯化回收，回收后的产物进行下步的转化。
根据突变体菌株的转化结果，将189，191,202,205这几个位点进行组合突变，其中突变 体RasADH Q191A/F205A的获得是以连有RasADH Q191A基因的质粒为模板，设计含有205 位突变的引物进行滚环扩增，RasADH Q191A/R202F/F205A基因的获得则是以连有RasADH Q191A/F205A基因的质粒为模板，设计含有202位突变的引物进行滚环扩增，RasADHE189A/Q191A/R202F/F205A基因的获得则是以连有RasADH Q191A/R202F/F205A基因的质粒为模板，设计含有189位突变的引物进行滚环扩增所得，扩增体系，方法及模板消化方法同上所述。
1.2重组质粒的转化
氯化钙法制备感受态大肠杆菌细胞。
将消化纯化后的PCR产物用化学转化的方法转入大肠杆菌中，转化过程为：
(1)取10μL重组质粒于50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上1～2min。
(3)加入新鲜LB液体培养基600μL，于37℃振荡培养45～60min。
(4)取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(10mg/mL)的LB固体培养基表面，
37℃培养12～16h至单菌落出现。
实施例2：RasADH及其突变体表达菌的构建
将消化纯化后的PCR产物用化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态 细胞中后，挑取单克隆至4mL含氨苄青霉素(10mg/mL)的LB培养基中，取新鲜 菌液送测序公司测序，测序结果显示正确的突变体即为RasADH突变体表达菌。
实施例3：RasADH及其突变体的诱导表达
配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10 g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过 夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基，25℃，200rpm培养20h。取发酵 液5mL浓缩超声破菌后，检测RasADH及其突变体活力。RasADH及其突变体酶活 定义：每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量为1个酶活单位(U)。
实施例4：RasADH及其突变体的纯化及活力检测
诱导表达后的发酵液6500rpm离心十分钟收集菌体，收集菌体用缓冲液(0.1mol/LPH7.0磷酸钠缓冲液+0.5mol/L NaCl)重悬洗涤一遍，采用同样方法离心缓冲液重悬， 重悬液采用高压匀浆均质机进行破碎，破碎液10000rpm，4℃离心20min获得粗酶液， 将获得的粗酶液采用His-Trap TM/FF亲和层析柱进行分离纯化，采用含咪唑的洗脱液 (0.1mol/L磷酸钠+0.5mol/L NaCl+250mmol/L咪唑，pH 7.0)，进行梯度洗脱，收集 活性部分，采用SDS-PAGE检测酶蛋白纯度。
实施例5：RasADH及其突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达
RasADH及其突变体采用实施例3中所述培养方法进行培养后提取质粒作为模板，设 计合适的RasADH上下游引物，通过一步克隆方法连接至共表达载体pRSFDuet1的第 二个读码框，连接后转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有卡那抗生素的平 板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。挑取所得到的单克隆菌落进行菌落PCR验 证，验证结果显示RasADH已连接至共表达载体中。葡萄糖脱氢酶(GDH)也采用此方 法连接至共表达载体pRSFDuet1的第一个读码框。
表1：羰基还原酶RasADH突变体序列和相应的活性改进列表
Figure BDA0001729693350000071
Figure BDA0001729693350000081
实施例6：RasADH-9突变体重组菌制备手性醇III的方法
按照实施例3的方法获得发酵液1L，离心后菌体加入200mL磷酸缓冲(pH 7.0，100mM)，在改缓冲中加入10g葡萄糖，0.1g NADP+，随后将底物(X＝Cl)5g溶解 在100mL DMF中加入到上述反应体系中，薄层层析检测反应进程。10小时后检测， 底物反应完全后乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，获得手性醇III 4.2g。
实施例7：RasADH-9突变体重组菌制备手性醇III的方法
按照实施例3的方法获得发酵液1L，离心后菌体加入200mL磷酸缓冲(pH 7.0，100mM)，在改缓冲中加入10g葡萄糖，0.1g NADP+，随后将底物(X＝Br)4g溶解 在100mL DMF中加入到上述反应体系中，薄层层析检测反应进程。10小时后检测， 底物反应完全后乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，获得手性醇III 4.2g。
实施例8：RasADH-9突变体重组菌制备手性醇III的方法
按照实施例3的方法获得发酵液3L，加入20g葡萄糖，0.3g NADP+，将底物 (X＝Cl)10g溶解在100mL DMSO中加入到上述反应体系中，薄层层析检测反应进 程。12小时后检测，底物反应完全后乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，获得手性醇III 8.5g。
实施例9：RasADH-9突变体重组菌制备手性醇III的方法
按照实施例3的方法获得发酵液3L，加入20g葡萄糖，0.3g NADP+，将底物 (X＝Br)8g溶解在100mL DMSO中加入到上述反应体系中，薄层层析检测反应进 程。12小时后检测，底物反应完全后乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，获得手性醇III 8.5g。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 羰基还原酶及其突变体在茚达特罗药物中间体合成中的应用
<130> 1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Ralstonia sp. DSM 6428
<400> 1
atgtaccgtc tgctgaacaa aaccgctgtt atcaccggtg gtaactctgg tatcggtctg 60
gctaccgcta aacgtttcgt tgctgaaggt gcttacgttt tcatcgttgg tcgtcgtcgt 120
aaagaactgg aacaggctgc tgctgaaatc ggtcgtaacg ttaccgctgt taaagctgac 180
gttaccaaac tggaagacct ggaccgtctg tacgctatcg ttcgtgaaca gcgtggttct 240
atcgacgttc tgttcgctaa ctctggtgct atcgaacaga aaaccctgga agaaatcacc 300
ccggaacact acgaccgtac cttcgacgtt aacgttcgtg gtctgatctt caccgttcag 360
aaagctctgc cgctgctgcg tgacggtggt tctgttatcc tgacctcttc tgttgctggt 420
gttctgggtc tgcaggctca cgacacctac tctgctgcta aagctgctgt tcgttctctg 480
gctcgtacct ggaccaccga actgaaaggt cgttctatcc gtgttaacgc tgtttctccg 540
ggtgctatcg acaccccgat catcgaaaac caggtttcta cccaggaaga agctgacgaa 600
ctgcgtgcta aattcgctgc tgctaccccg ctgggtcgtg ttggtcgtcc ggaagaactg 660
gctgctgctg ttctgttcct ggcttctgac gactcttctt acgttgctgg tatcgaactg 720
ttcgttgacg gtggtctgac ccaggtttaa 750
<210> 2
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Val Phe Ile Val Gly Arg Arg Arg Lys Glu Leu Glu Gln Ala Ala Ala
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Glu Ile Gly Arg Asn Val Thr Ala Val Lys Ala Asp Val Thr Lys Leu
50 55 60
Glu Asp Leu Asp Arg Leu Tyr Ala Ile Val Arg Glu Gln Arg Gly Ser
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Arg Gly Leu Ile Phe Thr Val Gln Lys Ala Leu Pro Leu Leu Arg Asp
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Gly Gly Ser Val Ile Leu Thr Ser Ser Val Ala Gly Val Leu Gly Leu
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Gln Ala His Asp Thr Tyr Ser Ala Ala Lys Ala Ala Val Arg Ser Leu
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Ala Arg Thr Trp Thr Thr Glu Leu Lys Gly Arg Ser Ile Arg Val Asn
165 170 175
Ala Val Ser Pro Gly Ala Ile Asp Thr Pro Ile Ile Glu Asn Gln Val
180 185 190
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Thr Pro Leu Gly Arg Val Gly Arg Pro Glu Glu Leu Ala Ala Ala Val
210 215 220
Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ser Ser Tyr Val Ala Gly Ile Glu Leu
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<212> PRT
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Claims (1)

1. 一种羰基还原酶突变体在催化大位阻药物茚达特罗中间体不对称还原制备光学纯的(R)-手性醇中的应用，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述大位阻药物茚达特罗中间体作为底物II的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，其中X为Cl或Br。
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