CN111118072A - 一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法 - Google Patents

一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法，以2,6‑二氯‑3‑氟苯基乙酮为底物，在羰基还原酶、辅因子及氢供体的存在下，发生不对称还原反应生成(R)‑2,6‑二氯‑3‑氟苯基乙醇，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明方法可以制备获得高手性ee值(ee＞99％)的恩沙替尼中间体(R)‑2,6‑二氯‑3‑氟苯基乙醇，以替代传统的化学合成方法，减少生产成本及对环境的污染。本发明提供的恩沙替尼中间体的合成方法，反应条件更温和，反应速度更快，反应收率和手性ee值高，且生产成本低，适合工业扩大化生产。

Description

一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法。
背景技术
恩沙替尼，是新一代间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂，商品名为贝美纳。临床结果显示恩沙替尼在疗效与进口药物相比更有优势，特别是颅内转移的患者中有更高的应答率，而且安全性方面更优。另外，研究进一步生物标志物分析显示，恩沙替尼具有针对广泛的继发性耐药突变的活性，包括对第二代ALK酪氨酸激酶抑制剂(TKI)出现耐药的突变，如C1156Y(ORR为71％)，F1174L/V(ORR为71％)、I1171T/S(ORR为50％)和G1202R(ORR为33％)。2例G1202R突变的患者经恩沙替尼治疗达到了部分缓解，持续缓解时间分别为7.6个月和4.0个月，研究提示恩沙替尼对G1202R点突变具有潜在的抑制作用。
恩沙替尼的结构式：
Figure BDA0002366255090000011
通过对恩沙替尼的结构分析可知，(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇是合成恩沙替尼的重要原料。因此，开发有效制备光学纯的(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的方法具有重要的应用前景。目前，(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇主要以化学合成法合成为主，但该方法需要使用价格昂贵的手性配体和金属试剂，产品收率低，手性ee值不高，同时化学生产成本大且对环境不优化，不适于规模化生产。(S)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的生物制备，目前已见报道，手性ee值大于99％，转化效率大于99％(US08852909)。但(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的生物制备方法目前尚未见报道。因此，开发生物制备光学纯的(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的方法具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法。本发明利用羰基还原酶催化法制备高手性ee值(ee＞99％)的恩沙替尼中间体(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇，可以大幅减少生产成本及对环境的污染。
一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法，其特征在于，所述方法以2,6-二氯-3-氟苯基乙酮为底物，在羰基还原酶、辅因子及氢供体的存在下，发生不对称还原反应生成(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
MGILDNKVALVTGAGSGIGLAVAHSYAKEGAKVIVSDIDEDHGNKAVEDIKAQGGEASFVKADTSNPEEVEALVKRTVEIYGRLDIACNNAGIGGEAALAGDYGLDSWRKVLSINLDGVFYGCKYELEQMEKNGGGVIVNMASIAGIVAAPLRSAYTSAKHAVVGLTKNIGAEYGQKNIRCNAVGPAYIETPLLESLTKEAKEALISKHPMGRLGKPEEVAELVLFLSSEKSSFMTGGYYLVDGGYTAV*。
进一步地，所述羰基还原酶的DNA序列如SEQ NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
ATGGGTATTTTAGACAACAAAGTAGCACTGGTTACAGGTGCAGGTTCCGGTATCGGTTTAGCTGTTGCTCATTCGTATGCAAAAGAAGGCGCCAAAGTTATTGTATCCGATATTGATGAAGATCACGGTAACAAAGCAGTCGAAGACATTAAAGCACAAGGCGGTGAAGCGTCTTTTGTAAAAGCAGATACTTCAAACCCAGAAGAAGTGGAAGCTTTAGTAAAACGTACAGTAGAAATCTACGGTCGTCTGGATATTGCATGTAATAATGCGGGTATCGGTGGCGAAGCGGCGCTGGCAGGCGATTACGGTCTGGACAGCTGGCGTAAAGTATTAAGCATTAATCTGGATGGCGTATTCTACGGCTGCAAATATGAGTTAGAACAAATGGAAAAAAACGGCGGTGGCGTTATTGTGAATATGGCCTCTATTGCGGGTATTGTTGCTGCACCGCTGCGTTCAGCCTACACTTCTGCAAAGCACGCAGTGGTAGGCCTGACTAAAAATATTGGTGCAGAATACGGTCAGAAAAATATCCGTTGCAATGCGGTGGGCCCAGCTTATATTGAAACCCCGCTGTTGGAAAGCCTGACAAAGGAAGCGAAGGAAGCACTGATTTCAAAACATCCGATGGGTCGTCTGGGTAAACCAGAAGAAGTAGCAGAACTGGTGTTGTTCCTGAGTTCAGAAAAATCATCTTTTATGACGGGTGGCTATTATCTGGTAGATGGTGGCTACACGGCAGTTTAG。
进一步地，所述羰基还原酶的制备方法为：将SEQ ID NO.1所示羰基还原酶基因连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-CS-ADH，将重组表达载体pET26b-CS-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，将单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中培养，37℃过夜培养，得菌种液，将菌种液加入含卡那霉素的TB培养基中，在37℃条件下振荡培养至OD600至2.5，然后添加IPTG至IPTG的终浓度为0.1mM，25℃下诱导培养8-10h，离心，收集菌体，超声破壁后即获得重组羰基还原酶。
进一步地，所述底物2,6-二氯-3-氟苯基乙酮的浓度为10-25g/L。
进一步地，所述重组羰基还原酶的使用量为10-50g/L。
进一步地，所述辅因子为NAD+，其浓度为0.05-0.1g/L。
进一步地，所述氢供体为葡萄糖，葡萄糖与底物的摩尔比是1.2∶1。
进一步地，所述不对称还原反应在缓冲液中进行，缓冲液为磷酸缓冲液，pH为7.0-7.5。
进一步地，所述不对称还原反应的温度为30-35℃；反应时间为8-12h。
进一步地，所述的产物(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的结构式如下：
Figure BDA0002366255090000031
本发明首先合成出羰基还原酶的原始基因，对其进行优化、重组，将重组的表达载体转移到菌株中进行表达，对表达菌株进行培养，然后破碎，得到含重组羰基还原酶菌体破碎液。
(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇生物催化的反应路线如下：
Figure BDA0002366255090000032
本发明的具体技术方案包括以下步骤：
(1)羰基还原酶原始基因的合成：按照大肠杆菌密码子分析用表对来源于Chryseobacterium sp.CA49羰基还原酶CS-ADH原始基因序列进行密码子优化，得到优化后的CS-ADH基因序列，对其进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-CS-ADH，优化后的CS-ADH基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)羰基还原酶的表达：将重组表达载体pET26b-CS-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，挑取单菌落，将单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中培养，得菌种液，将菌种液加入含卡那霉素的TB培养基中，然后添加IPTG，诱导培养8-10h；
(3)细胞破碎：将培养好的菌株离心，收集菌体，重悬菌体后对其进行超声破碎，所得液体即为含重组羰基还原酶菌体破碎液；
(4)酶催化：将2,6-二氯-3-氟苯基乙酮加入反应器中，随后，将NAD+、含重组羰基还原酶菌体破碎液、含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、葡萄糖、磷酸盐缓冲液的混合溶液加入反应器中，进行反应。
经过优化重组的的表达载体在菌株中表达出的酶对催化制备恩沙替尼前驱体的反应具有相当高的催化活性和选择性，制备恩沙替尼前驱体的反应中底物的转化率高，产物的手性ee值大于99％。与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明提供的酶法制备恩沙替尼中间体的方法，对环境友好，制备出了高手性ee值(ee＞99％)的恩沙替尼中间体(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。在本发明中所涉及的装置、连接结构和方法，若无特指，均为本领域公知的装置、连接结构和方法。
一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法，其中重组羰基还原酶的制备包括以下步骤：
(1)羰基还原酶原始基因的合成：按照大肠杆菌密码子分析用表对羰基还原酶CS-ADH原始基因序列进行密码子优化，得到优化后的CS-ADH基因序列，对其进行目的基因的全合成，优化后的CS-ADH基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。合成后的全基因两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-CS-ADH。
(2)羰基还原酶的表达：将重组表达载体pET26b-CS-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，挑取单菌落，将单菌落接入到5mL含浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在37℃条件下，振荡培养12h，得菌种液。每1mL菌种液加入到100mL含浓度为50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，在37℃条件下振荡培养至OD600至2.5，然后添加IPTG至IPTG的终浓度为0.1mM，在25℃条件下诱导培养10h。
(3)细胞破碎：将培养好的菌株用离心机离心，离心机的转速为10000r/min，离心时间为10min，收集菌体，用浓度为0.1M、pH为7.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，菌体与磷酸缓冲溶液的固液比为2g/1mL，超声破碎后所得液体即为含重组羰基还原酶菌体破碎液。
其中，LB培养液中含有以下成分的物质：每1L LB培养液中含有蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，余量为去离子水。
TB培养基中含有以下成分的物质：每1L TB培养液中含有蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4mL、KH2PO4 2.31g、K2HPO4 12.54g，余量为去离子水。其制备方法为：将蛋白胨、酵母提取物、甘油加入900mL去离子水中，制成溶液A；将KH2PO4、K2HPO4溶于100mL去离子水中，制成溶液B；将溶液A和溶液B分别灭菌后冷却至40℃混合均匀。
实施例1
将1.0g底物2,6-二氯-3-氟苯基乙酮加入到250mL反应器中，随后，将100mL含有0.1g/L NAD+、30g/L含重组羰基还原酶菌体破碎液、10g/L含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、10.5g/L葡萄糖、0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)加入该反应器中，(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇与混合溶液的固液比为10g/L，利用pH自动控制系统和1M Na2CO3溶液控制酶反应的pH值为7.0左右。35℃反应12h。底物转化率大于98％，产物浓度为9.8g/L，产物手性ee值大于99％。
实施例2
将2.5g底物2,6-二氯-3-氟苯基乙酮加入到250mL反应器中，随后，将100mL含有0.1g/L NAD+、30g/L含重组羰基还原酶菌体破碎液、10g/L含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、26g/L葡萄糖、0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)加入该反应器中，(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇与混合溶液的固液比为25g/L，利用pH自动控制系统和1M Na2CO3溶液控制酶反应的pH值为7.0左右。35℃反应12h。底物转化率大于98％，产物浓度为24.5g/L，产物手性ee值大于99％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 长兴制药股份有限公司
<120> 一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> 羰基还原酶(carbonyl reductase)
<400> 1
atgggtattt tagacaacaa agtagcactg gttacaggtg caggttccgg tatcggttta 60
gctgttgctc attcgtatgc aaaagaaggc gccaaagtta ttgtatccga tattgatgaa 120
gatcacggta acaaagcagt cgaagacatt aaagcacaag gcggtgaagc gtcttttgta 180
aaagcagata cttcaaaccc agaagaagtg gaagctttag taaaacgtac agtagaaatc 240
tacggtcgtc tggatattgc atgtaataat gcgggtatcg gtggcgaagc ggcgctggca 300
ggcgattacg gtctggacag ctggcgtaaa gtattaagca ttaatctgga tggcgtattc 360
tacggctgca aatatgagtt agaacaaatg gaaaaaaacg gcggtggcgt tattgtgaat 420
atggcctcta ttgcgggtat tgttgctgca ccgctgcgtt cagcctacac ttctgcaaag 480
cacgcagtgg taggcctgac taaaaatatt ggtgcagaat acggtcagaa aaatatccgt 540
tgcaatgcgg tgggcccagc ttatattgaa accccgctgt tggaaagcct gacaaaggaa 600
gcgaaggaag cactgatttc aaaacatccg atgggtcgtc tgggtaaacc agaagaagta 660
gcagaactgg tgttgttcct gagttcagaa aaatcatctt ttatgacggg tggctattat 720
ctggtagatg gtggctacac ggcagtttag 750
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> 羰基还原酶(carbonyl reductase)
<400> 2
Met Gly Ile Leu Asp Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ile Gly Leu Ala Val Ala His Ser Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Ile Val Ser Asp Ile Asp Glu Asp His Gly Asn Lys Ala Val Glu
35 40 45
Asp Ile Lys Ala Gln Gly Gly Glu Ala Ser Phe Val Lys Ala Asp Thr
50 55 60
Ser Asn Pro Glu Glu Val Glu Ala Leu Val Lys Arg Thr Val Glu Ile
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Cys Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Glu
85 90 95
Ala Ala Leu Ala Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Arg Lys Val Leu
100 105 110
Ser Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Tyr Gly Cys Lys Tyr Glu Leu Glu
115 120 125
Gln Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Val Ile Val Asn Met Ala Ser Ile
130 135 140
Ala Gly Ile Val Ala Ala Pro Leu Arg Ser Ala Tyr Thr Ser Ala Lys
145 150 155 160
His Ala Val Val Gly Leu Thr Lys Asn Ile Gly Ala Glu Tyr Gly Gln
165 170 175
Lys Asn Ile Arg Cys Asn Ala Val Gly Pro Ala Tyr Ile Glu Thr Pro
180 185 190
Leu Leu Glu Ser Leu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Ala Leu Ile Ser Lys
195 200 205
His Pro Met Gly Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Val Ala Glu Leu Val
210 215 220
Leu Phe Leu Ser Ser Glu Lys Ser Ser Phe Met Thr Gly Gly Tyr Tyr
225 230 235 240
Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Val
245

Claims (10)

1.一种酶法制备恩沙替尼中间体的方法，其特征在于，所述方法以2,6-二氯-3-氟苯基乙酮为底物，在羰基还原酶、辅因子及氢供体的存在下，发生不对称还原反应生成(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇，所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的DNA序列如SEQ NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶的制备方法为：将SEQ IDNO.1所示羰基还原酶基因连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-CS-ADH，将重组表达载体pET26b-CS-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，将单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中培养，37℃过夜培养，得菌种液，将菌种液加入含卡那霉素的TB培养基中，在37℃条件下振荡培养至OD600至2.5，然后添加IPTG至IPTG的终浓度为0.1mM，25℃下诱导培养8-10h，离心，收集菌体，超声破壁后即获得重组羰基还原酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物2,6-二氯-3-氟苯基乙酮的浓度为10-25g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组羰基还原酶的使用量为10-50g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅因子为NAD+，其浓度为0.05-0.1g/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氢供体为葡萄糖，葡萄糖与底物的摩尔比是1.2∶1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不对称还原反应在缓冲液中进行，缓冲液为磷酸缓冲液，pH为7.0-7.5。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述不对称还原反应的温度为30-35℃；反应时间为8-12h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的产物(R)-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的结构式如下：
Figure FDA0002366255080000011
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497911A (zh) * 2013-09-05 2014-01-08 中国科学院成都生物研究所 金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产
CN103664896A (zh) * 2013-11-25 2014-03-26 济南精合医药科技有限公司 一种新的抗肿瘤分子靶向药物克里唑替尼的合成工艺方法
CN106701698A (zh) * 2016-11-15 2017-05-24 华东理工大学 羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103497911A (zh) * 2013-09-05 2014-01-08 中国科学院成都生物研究所 金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产
CN103664896A (zh) * 2013-11-25 2014-03-26 济南精合医药科技有限公司 一种新的抗肿瘤分子靶向药物克里唑替尼的合成工艺方法
CN106701698A (zh) * 2016-11-15 2017-05-24 华东理工大学 羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONIOTRINCONE著；刘伟志等译: "《海洋生物酶 海洋生态科学与资源管理译丛》", 30 June 2018, 北京：海洋出版社 *
ZHAO, FENG-JIAO; JIN, YUN; LIU, ZHONGCHUAN; 等: "Crystal structure and iterative saturation mutagenesis of ChKRED20 for expanded catalytic scope", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOG》 *
张惠展编著: "《基因工程 第4版》", 31 January 2017, 华东理工大学出版社 *
李校堃，袁辉主编: "《基因工程药物的制备原理与应用》", 31 August 2003, 暨南大学出版社 *

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