CN107254454A - 一种羰基还原酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其用途。本发明利用基于晶体结构的半理性设计对羰基还原酶ChKRED20进行分子改造，将一个或者多个氨基酸进行替换，获得一系列底物谱更广的突变体，显示了在生物催化中的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其在不对称还原羰基化合物中的应用。
背景技术
手性醇是合成手性药物的重要中间体，生物催化不对称还原羰基化合物生产手性醇是制备手性醇的重要方法之一。生物催化通常以产羰基还原酶(或酮还原酶)的微生物或偶联有辅酶再生系统的重组酶为生物催化剂。由于重组酶在反应中几乎无副反应生成，因此目前大规模的工业生产中绝大部分都采用重组酶。然而，随着生物催化剂定制需求的快速增长，现有的基础酶库在数量和质量上都远不能满足需要。以蛋白质工程技术对酶进行分子改造是公认的解决天然酶局限的有力工具，可目标导向性地快速获得酶学性能改良的突变体，以达到工业生产中工艺的要求。
近年来，随着X射线晶体衍射技术和核磁共振对生物大分子的解析手段不断发展，蛋白质的理性/半理性设计越来越成为体外改良蛋白质性质的重要手段，过去十年间人们成功地利用该技术改造了上百种蛋白质的性质(J.D.Bloom，F.H.Arnold.In the light ofdirected evolution:Pathways of adaptive protein evolution.PNAS，2009，106：9995-10000)。野生型羰基还原酶ChKRED20能够催化多种苯乙酮衍生物而生成光学纯度较高的手性醇(T.-X.Tang，Y.Liu，Z.-L.Wu.Characterization of a robust anti-Prelog short-chain dehydrogenase/reductase ChKRED20from Chryseobacterium sp.CA49.J MolCatal B-Enzym.2014，105：82-88；专利ZL 201310399109.2，ZL 201410103481.9)，但是对于邻位取代的苯乙酮衍生物如1-(3-氯-2,6-二氟苯基)乙酮，1-(2-(三氟甲基)苯基)乙酮和1-(2,4-二甲基苯基)乙酮等却难以转化，这可能由于该酶在催化口袋的某些部位存在较大的位阻。应用现有技术，进一步改良ChKRED20的催化口袋，扩展其底物谱，将推动该酶在相关领域的更广泛应用。
发明内容
本发明利用基于结构的半理性设计对来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)的羰基还原酶ChKRED20进行分子改造，将一个或者多个氨基酸进行替换，从而获得底物谱更广的突变体。
根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。
为了达到以上目的，本发明基于母本羰基还原酶ChKRED20的晶体结构确定活性口袋，通过首轮丙氨酸扫描，筛选获得2个有益突变子H145A和M201A。通过对145和201两个位点同时进行饱和突变，筛选到催化活力大幅提高的突变体H145A/M201A。然后，将与His145和Met201距离较近的位点进行饱和突变，应用高通量筛选方法筛选得到底物特异性改变较大的H145A/M201A/S153R和H145A/M201A/Y188L。其中，H145A/M201A/Y188L的立体选择性也发生了反转。在第三轮中，通过将底物口袋外部边缘的氨基酸残基进行饱和突变，高通量筛选到底物特异性进一步改变的突变子H145A/M201A/S153R/N39D/Q97A。
本发明的具体实施方法为：
(1)第一轮筛选：对催化口袋进行丙氨酸扫描
我们已经公开了从金黄杆菌CA49中(Chryseobacterium sp.CA49，2012年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为NO：CCTCC M 2012484)克隆羰基还原酶ChKRED20的方法(吴中柳，刘艳等，一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产，中国专利，CN 103497911B)。羰基还原酶ChKRED20基因大小为750bp，编码249个氨基酸，在NCBI的登录号为KC342020。
基于对羰基还原酶ChKRED20晶体结构分析(PDB ID：5X8H)，我们尝试对催化口袋中的9个氨基酸残基(I144、H145、K160、P186、Y188、I189、L194、L197、M201)进行丙氨酸扫描，即将这些位点分别突变成丙氨酸，测定这些单点突变体对底物1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮的催化活性，结果表明H145A和M201A比野生型的活力高。通过对145位点和201位点进行双位点饱和突变，所获得突变体H145A/M201A具有比单点突变体H145A和M201A更高的活力。
经上述对催化口袋的丙氨酸扫描，我们获得了3个对底物1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮催化提高的突变体，分别为H145A、M201A、H145A/M201A，其特征如下：
H145A：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)。
M201A：第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)。
H145A/M201A：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)。
(2)第二轮筛选：基于靶点的饱和突变文库
以H145A/M201A为模板，选择羰基还原酶ChKRED20的晶体结构中距离145His和205Met在之内的9个氨基酸残基(S143、I147、P151、S153、K160、P186、Y188、S196、L205)作为突变位点，分别建立单点饱和突变文库，并以1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮为底物进行高通量筛选。在筛选过程中，2个突变体被筛选出来。其中，突变体H145A/M201A/S153R对1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮活力均有提高，尤其对底物1-(2-氯苯基)乙酮的活力是母本H145A/M201A的5.5倍(见实施例4.2中表6)。使我们意外的是，突变体H145A/M201A/Y188L不仅对底物1-(2-氯苯基)乙酮的催化活力比H145A/M201A高，而且生成了相反构型产物(见实施例4.2中表6)。
经上述基于靶点的饱和突变文库筛选，我们获得了2个对底物1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮催化活力进一步提高的突变体，分别为H145A/M201A/S153R和H145A/M201A/Y188L，其特征如下：
H145A/M201A/S153R：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)、第153位的丝氨酸突变为精氨酸(DNA序列由TCC变为CGG)。
H145A/M201A/Y188L：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)、第188位的络氨酸突变为亮氨酸(DNA序列由TAT变为CTG)。
(3)第三轮筛选：底物口袋出入口相关位点的饱和突变
通过上述(1)和(2)轮的半理性设计，野生型ChKRED20对于邻位取代的苯乙酮衍生物的底物限制已经打破，由于底物催化口袋的出入口是控制底物进出的第一道屏障，我们尝试随机化排列在口袋口的氨基酸残基I38、N39、H42、Q97、L152、L193、L194。由于H145A/M201A/S153R符合“anti-Prelog”法则，我们将此作为第三轮饱和突变文库构建模板，并以1-(2，4-二甲基苯基)乙酮为底物进行高通量筛选。有3个突变体被筛选出来：突变体H145A/M201A/S153R/Q97A，H145A/M201A/S153R/L152M和H145A/M201A/S153R/N39D，它们对浓度15mM的1-(2，4-二甲基苯基)乙酮转化率分别为96.4％、91.6％和92.0％，而对照H145A/M201A/S153R的转化率为69.8％。在对这三个突变体随机整合中，突变体H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D对1-(2，4-二甲基苯基)乙酮的转化活力最高，可在18小时转化93.9％的340mM(50g/L)的该底物，并且对2a-6a、15a、16a、17a、19a的催化活力也大幅度提高(如实例4.2中表7所示)。
经上述对底物口袋出入口相关位点的饱和突变文库进行筛选，我们获得了4个对底物催化活力进一步提高的突变体，分别为H145A/M201A/S153R/Q97A，H145A/M201A/S153R/L152M，H145A/M201A/S153R/N39D和H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D，其特征如下：
H145A/M201A/S153R/Q97A：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA：序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)、第153位的丝氨酸突变为精氨酸(DNA序列由TCC变为CGG)、第97位的谷氨酰胺突变为丙氨酸(DNA序列由CAG变为GCG)。
H145A/M201A/S153R/L152M：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)、第153位的丝氨酸突变为精氨酸(DNA序列由TCC变为CGG)、第152位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由GAA变为AAA)。
H145A/M201A/S153R/N39D：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)、第153位的丝氨酸突变为精氨酸(DNA序列由CTT变为ATG)、第39位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(DNA序列由AAT变为GAT)。
H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D：第145位的组氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由CAT变为GCT)、第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由ATG变为GCG)、第153位的丝氨酸突变为精氨酸(DNA序列由TCC变为CGG)、第97位的谷氨酰胺突变为丙氨酸(DNA序列由CAG变为GCG)、第39位的天冬酰胺突变为天冬氨酸(DNA序列由AAT变为GAT)。
通过对野生型ChKRED20的底物特异性和催化选择性进行改造，我们获得了底物谱更广且活力更高的突变体H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D，以及选择性反转的突变体H145A/M201A/Y188L。
本发明有益效果：上述所有酶活力提高的突变子与母本相比，酶的催化范围更广，能催化更多的药物中间体，催化底物的时空效率均有提高。其中突变子H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D能够高效转化底物1-(2,4-二甲基苯基)乙酮，1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮，1-(2-溴苯基)乙酮，2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮等底物，具有良好的工业应用前景。
具体实施方式
以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施例1野生型及突变子粗酶液酶活力的测定
1.1粗酶液的制备
挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/mL)培养基中，37℃培养3h，加入0.5mM IPTG诱导后，30℃继续培养至18h。菌液4℃、8000rpm离心收集菌，细胞均质机破碎，离心取上清为粗酶液。
1.2粗酶活力的测定
粗酶活力测定反应条件：该反应体系由两相组成，水相为磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)中包含3g/L的粗酶液(总蛋白浓度))，0.2g/L的NAD+；有机相为异丙醇和底物(底物溶解于异丙醇中)，占总反应体积的45％。40℃、150rpm反应。反应结束后，等体积乙酸乙酯萃取，测定产物的生成量。
实施例2羰基还原酶ChKRED20催化口袋的丙氨酸扫描
2.1丙氨酸扫描突变体的构建方法
基于对羰基还原酶ChKRED20晶体结构的分析，我们尝试对催化口袋中的9个氨基酸残基(I144、H145、K160、P186、Y188、I189、L194、L197、M201)进行丙氨酸扫描，将这些位点定点突变为丙氨酸，全部突变均以羰基还原酶ChKRED20基因为模板，所用引物见表1。
表1丙氨酸扫描的引物序列
PCR条件为：10×Buffer 5μL，引物(10mM)各6μL，dNTP(2.5mM)4μL，pfu酶(2.5U/mL)1μL，质粒10ng，超纯水补足50μL。条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16个循环。PCR产物用1μL DpnI酶于37℃处理1h。PCR产物10μL化学法转入E.coli DH5α。送于上海英骏生物技术有限公司测序。测序正确后，提取质粒转入表达菌株E.coli BL21-DE3。
所获得的丙氨酸扫描突变体酶活测定方法见实例1.2。测定结果显示，在40℃反应3小时后，母本ChKRED20转化35g/L底物15a的转化率为6.8％，而这些突变子中H145A和M201A转化率高于母本，分别为21.7％和24.4％；在转化16a的实验中，H145A的转化率为27.4％，而M201A与母本均不能转化该底物。然后，我们以母本ChKRED20基因为模板，对所获得的两个突变位点进行整合，将第145位和第201位氨基酸残基同时进行双位点饱和突变。
2.2双位点饱和突变文库的构建方法
我们对羰基还原酶ChKRED20的第145位和第205位氨基酸位点进行饱和突变，该文库构建以羰基还原酶ChKRED20基因为模板，所用引物见表2。
表2双位点饱和突变的兼并引物序列
PCR条件为：10×HF Buffer 10μL，MgCl2 1μL，引物(50ng/μL)各1.5μL，(145和201位点随机化引物VHG:NRT:WTT:TGG＝9：8：2：1)，dNTP(2.5mM)4μL，pfusion(2.5U/mL)1μL，质粒10ng，超纯水补足50μL。PCR程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16个循环。PCR产物用1μL DpnI酶于37℃处理1h。PCR产物10μL化学法转入E.coliDH5α，所建突变库容应大于1200。送于上海英骏生物技术有限公司测序。测序正确后，提取质粒转入表达菌株E.coli BL21-DE3，挑取1200个克隆进行培养。
2.3双位点饱和突变文库的高通量筛选方法
饱和突变文库的高通量筛选方法：挑取单克隆于96孔板，每孔含有200μL TB培养基(含有50μg/mL卡那霉素，0.5mM IPTG)，30℃，180rpm，震荡培养18h。用96孔板复制器复制各单克隆于LB固体培养基平板，37℃培养12h后，4℃冰箱保存。将菌体诱导表达后的96孔板在4℃、4000rpm下离心10min，弃去上清，各孔加入200μL的溶菌缓冲液重悬细胞(溶菌缓冲液的配置：0.1M、pH 8.0的磷酸钾缓冲液，10mg/mL溶菌酶，1μg/mL DNase I，10mM MgCl2)。将加有溶菌液的96孔板在37℃放置60min后，在4℃、4000rpm下离心10min，取上清。用排枪轻轻吸出96孔板各孔中的上清液到新的96孔板上(50μL)，在其各孔中加入150μL反应液(1mM的NADH，0.1M、pH 8.0的磷酸钾缓冲液和0.02倍体积的含有1mM 16a的二甲基亚砜溶液)；30℃反应1h后，在340nm下测定NADH的吸光度。
表3丙氨酸扫描突变体对底物15a及16a的转化情况
如表3所示，以底物16a筛选到的突变体H145A/M201A具有比单点突变体H145A和M201A更高的活力，该突变子对254mM的15a和227mM的16a的转化活力分别为43.7％及40.3％，ee值均>99％。
实施例3距离第145位组氨酸之内的位点随机化
3.1距离第145组氨酸之内的饱和突变文库构建方法
分别对突变体H145A/M201A上的第143、144、151、153、160、186、188、196、205位点进行饱和突变。以突变体H145A/M201A为模板，利用NNS兼并性引物(N代表A，T，C，G；S代表G，C)，所用的兼并引物见表4。
表4第一轮单位点饱和突变兼并引物
PCR条件为：10×Buffer 5μL，引物(10mM)各6μL，dNTP(2.5mM)4μL，pfu酶(2.5U/mL)1μL，质粒10ng，超纯水补足50μL。条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16个循环。PCR产物用1μL DpnI酶于37℃处理1h。PCR产物10μL化学法转入E.coli DH5α，所建突变库容应大于100。送于上海英骏生物技术有限公司测序。测序正确后，提取质粒转入表达菌株E.coli BL21-DE3，挑取100个克隆进行培养。
3.2第一轮饱和突变文库的高通量筛选方法
高通量筛选方法同实施例2.3。
在底物16a的高通量筛选中，获得活力比对照H145A/M201A高出50％的菌株H145A/M201A/S153R、H145A/M201A/Y188L，通过进一步粗酶液复筛(方法同实施例1.2)，测得其对底物15a以及16a的活力相对于突变体H145A/M201A有不同程度的提高。另外，H145A/M201A/Y188L所生成的相应醇的构型与突变体H145A/M201A/S153R为互补构型。在进一步实验中，我们尝试利用野生型ChKRED20及突变体H145A/M201A、H145A/M201A/S153R、H145A/M201A/Y188L对底物1a-20a的转化活力进行测定，如表6所示。
实施例4 ChKRED20催化口袋进出口的位点随机化
4.1ChKRED20催化口袋进出口的位点饱和突变文库构建方法
分别对突变体H145A/M201A/S153R上的第38、39、42、97、152、193、194位点进行饱和突变。以突变体H145A/M201A/S153R为模板，利用NNS兼并性引物(N代表A，T，C，G；S代表G，C)，PCR条件及建库方法同实例3，所用的兼并引物见表5。
表5第二轮单位点饱和突变兼并引物序列
4.2第二轮饱和突变文库的高通量筛选方法
高通量筛选方法同实施例2.3，底物为5a。
由于H145A/M201A/S153R符合“anti-Prelog”法则，我们将此突变体作为饱和突变文库构建模板，并以5a为底物进行高通量筛选，获得活力比对照H145A/M201A/S153R高出50％的菌株有H145A/M201A/S153R/Q97A，H145A/M201A/S153R/L152M和H145A/M201A/S153R/N39D。在进一步粗酶液复筛中，其对浓度为15mM的底物5a转化率分别为96.4％、91.6％和92％，而对照H145A/M201A/S153R的转化率为62.8％。我们通过定点突变对新筛选出的三个突变体进行随机组合，最终得到对底物5a活力最高的突变子H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D，该突变子对底物2a-6a、15a、16a、17a、19a的催化活力也大幅度提高(如表6所示)。
突变体H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D对1-(2，4-二甲基苯基)乙酮的转化活力最高，可在18小时转化93.9％的340mM(50g/L)该底物，并且对2a-6a、15a、16a、17a、19a的催化活力也大幅度提高。突变体H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D不对称还原多个底物均具有很高的立体选择性(表7)，但是对6a和19a所生成的相应产物醇ee值不高。然而，我们前面几轮突变所获得其他突变体对6a和19a却有较高的选择性。例如，突变体H145A/M201A/Y188L对催化底物6a和19a生成的产物(S)-6b、(S)-17b，ee值都>99％。
表6野生型ChKRED20和突变子对底物1a-20a的催化情况
注：Con表示转化率；nd表示未检测到。
表7野生型ChKRED20和突变子H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D对多种酮的催化情况
Claims (9)
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于以羰基还原酶ChKRED20的氨基酸序列为出发序列，经突变后具有以下特征的氨基酸序列：将其第201位的甲硫氨酸突变为丙氨酸。
2.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求1所述的突变体的第145位的组氨酸突变为丙氨酸。
3.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求2所述的突变体的第153位的丝氨酸突变为精氨酸。
4.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求2所述的突变体的第188位的络氨酸突变为亮氨酸。
5.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求3所述的突变体的第97位的谷氨酰胺突变为丙氨酸。
6.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求3所述的突变体的第152位的亮氨酸突变为甲硫氨酸。
7.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求3所述的突变体的第39位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。
8.一种羰基还原酶突变体，其特征在于：将权利要求5所述的突变体的第39位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。
9.权利要求1～8所述的羰基还原酶突变体在催化羰基化合物中的应用。
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