CN109837254A - 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 - Google Patents
一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109837254A CN109837254A CN201910247911.7A CN201910247911A CN109837254A CN 109837254 A CN109837254 A CN 109837254A CN 201910247911 A CN201910247911 A CN 201910247911A CN 109837254 A CN109837254 A CN 109837254A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- thermal stability
- enzyme
- ala
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 48
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 title claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title claims description 5
- 102220094206 rs876660300 Human genes 0.000 claims 1
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 abstract description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- ZEUITGRIYCTCEM-KRWDZBQOSA-N (S)-duloxetine Chemical compound C1([C@@H](OC=2C3=CC=CC=C3C=CC=2)CCNC)=CC=CS1 ZEUITGRIYCTCEM-KRWDZBQOSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229960002866 duloxetine Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 3
- 241000056141 Chryseobacterium sp. Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N Val-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N BZMIYHIJVVJPCK-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CFPQUJZTLUQUTJ-HTFCKZLJSA-N Ala-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](C)N CFPQUJZTLUQUTJ-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N Ala-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)NCC(O)=O SUHLZMHFRALVSY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-DCAQKATOSA-N Ala-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MDNAVFBZPROEHO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FFEUXEAKYRCACT-PEDHHIEDSA-N Arg-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(O)=O FFEUXEAKYRCACT-PEDHHIEDSA-N 0.000 description 1
- QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N Asn-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QEYJFBMTSMLPKZ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ZZXMOQIUIJJOKZ-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O ZZXMOQIUIJJOKZ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N Asn-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GFFRWIJAFFMQGM-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- PBFXCUOEGVJTMV-QXEWZRGKSA-N Asn-Met-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PBFXCUOEGVJTMV-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- FTNRWCPWDWRPAV-BZSNNMDCSA-N Asn-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FTNRWCPWDWRPAV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KTDWFWNZLLFEFU-KKUMJFAQSA-N Asn-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O KTDWFWNZLLFEFU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N Asn-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOQYDFCQPWAMSA-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- LKVKODXGSAFOFY-VEVYYDQMSA-N Asp-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LKVKODXGSAFOFY-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- LFIVHGMKWFGUGK-IHRRRGAJSA-N Gln-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LFIVHGMKWFGUGK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- UXXIVIQGOODKQC-NUMRIWBASA-N Gln-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O UXXIVIQGOODKQC-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N Glu-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LGYZYFFDELZWRS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N Glu-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O QXDXIXFSFHUYAX-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- KIEICAOUSNYOLM-NRPADANISA-N Glu-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KIEICAOUSNYOLM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N Gly-Ile-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SCWYHUQOOFRVHP-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- LPHQAFLNEHWKFF-QXEWZRGKSA-N Gly-Met-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LPHQAFLNEHWKFF-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAVQIQOOBXFKRC-BYULHYEWSA-N Ile-Asn-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UAVQIQOOBXFKRC-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- WTOAPTKSZJJWKK-HTFCKZLJSA-N Ile-Cys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N WTOAPTKSZJJWKK-HTFCKZLJSA-N 0.000 description 1
- LKACSKJPTFSBHR-MNXVOIDGSA-N Ile-Gln-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LKACSKJPTFSBHR-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- NHJKZMDIMMTVCK-QXEWZRGKSA-N Ile-Gly-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NHJKZMDIMMTVCK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N Ile-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N GAZGFPOZOLEYAJ-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- CKRFDMPBSWYOBT-PPCPHDFISA-N Ile-Lys-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N CKRFDMPBSWYOBT-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- QHUREMVLLMNUAX-OSUNSFLBSA-N Ile-Thr-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N QHUREMVLLMNUAX-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N Ile-Tyr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- MJOZZTKJZQFKDK-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O MJOZZTKJZQFKDK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HBJZFCIVFIBNSV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ALSRJRIWBNENFY-DCAQKATOSA-N Lys-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ALSRJRIWBNENFY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MYZMQWHPDAYKIE-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MYZMQWHPDAYKIE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RQILLQOQXLZTCK-KBPBESRZSA-N Lys-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O RQILLQOQXLZTCK-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- RATXDYWHIYNZLE-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N RATXDYWHIYNZLE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBALDZKOTNSBFM-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBALDZKOTNSBFM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XQSREVQDGCPFRJ-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XQSREVQDGCPFRJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N Ser-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HJEBZBMOTCQYDN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KCNSGAMPBPYUAI-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KCNSGAMPBPYUAI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UBTNVMGPMYDYIU-HJPIBITLSA-N Ser-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O UBTNVMGPMYDYIU-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AQAMPXBRJJWPNI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N Trp-Asn-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N UKINEYBQXPMOJO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- OBWQLWYNNZPWGX-QEJZJMRPSA-N Trp-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OBWQLWYNNZPWGX-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- BOESUSAIMQGVJD-RYQLBKOJSA-N Trp-Met-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N BOESUSAIMQGVJD-RYQLBKOJSA-N 0.000 description 1
- VYQQQIRHIFALGE-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VYQQQIRHIFALGE-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- NXRAUQGGHPCJIB-RCOVLWMOSA-N Val-Gly-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NXRAUQGGHPCJIB-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- DJQIUOKSNRBTSV-CYDGBPFRSA-N Val-Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N DJQIUOKSNRBTSV-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N Val-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NLNCNKIVJPEFBC-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108010034507 methionyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- -1 propionyl ethyl Chemical group 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 108010072644 valyl-alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶ChKRED12耐热性突变体。羰基还原酶ChKRED12可以高效催化制备度洛西汀手性醇等中间体，但热稳定性较差。利用理性设计的方案对该酶进行分子进化，获得的突变体其耐热性大幅度提高，更利于工业应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶突变体。
背景技术
羰基还原酶(Carbonyl reductase，EC 1.1.1.x)是氧化还原酶(Oxidoreductases) 家族中的成员之一，是指能够催化还原羰基生成相应的醇或其逆反应的一类氧化还原酶，其反应的本质为底物和供氢体之间氢或电子的转移。手性醇是一类重要的有机合成砌块，在医药、农业、食品和化工等行业都有很高的应用价值，而羰基还原酶能够催化羰基的不对称还原生成相应的手性醇。
随着工业生物技术和蛋白质工程技术的发展，目前羰基还原酶在手性醇工业生产中的应用已十分广泛。为了适应工业环境下的应用范围，对羰基还原酶的酶学性能提出了更高的要求。其中热稳定性是评价工业生物催化剂的一个重要指标，提高反应温度，可以提高转化率、提升底物可溶性、增加操作弹性等。由于天然蛋白质通常不能承受恶劣的工业环境，大多数只能在温和条件下发挥作用，因此提高酶的热稳定性以使其适应工业应用具有重要意义。分子改造、化学修饰和物理修饰成为目前提高酶热稳定性的三个主要策略。
其中，分子改造是提高酶热稳定性的有效手段之一。在了解酶蛋白结构与功能关系的基础上，通过理性设计，利用定点突变或饱和突变等手段可以快速改造酶蛋白。目前应用比较成功的理性设计方法主要包括同源比对、脯氨酸效应设计、基于二硫键设计和表面电荷优化等。已有许多学者运用这些技术成功地改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展。
羰基还原酶ChKRED12能够催化度洛西汀手性醇中间体(中国专利，CN104830924A)，以及手性单羟基衍生化的1,2-醇类化合物(中国专利， CN108753851A)等，且能够耐受较高的底物浓度、具有较高的催化效率，是一个很有潜力的酶，然而其热稳定性较差，限制了工业应用。因此，通过分子改造提高该酶的耐热性，具有重要的实际应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：羰基还原酶ChKRED12热稳定性差的问题。为此，本发明公开了一种羰基还原酶ChKRED12热稳定性提高的突变体。
该突变体具有如下特征：
以SEQ ID NO.2为出发序列，将第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(S79P)，或者将第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(L128M)，或者将第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V162I)，或者将第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(G163A)，或者以上四个位点的任意组合得到的突变体。
根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。
本发明的技术方案为：
以理性设计的方法，识别羰基还原酶ChKRED12(氨基酸序列为SEQ ID NO.2) 热稳定性相关的氨基酸位点，利用定点突变技术进行单点突变和组合突变，从而得到热稳定性提高的突变体酶。
本发明的具体步骤为：
(1)羰基还原酶ChKRED12热稳定性相关位点的预测：该酶的基因序列和氨基酸序列已公开(基因序列NCBI登录号为KC342012；氨基酸序列NCBI 登录号为AHC30850.1，即SEQID NO.2)。
FirePort预测热稳定性位点：将羰基还原酶ChKRED12的氨基酸序列提交至在线网站SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org)进行同源建模，获得羰基还原酶ChKRED12的三维模型，再将三维模型提交至FirePort (https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprot/)进行热稳定性相关氨基酸位点预测。从预测的众多突变子中经过各参数的比较分析，最终选择了最有潜力的4个突变子(S79P，L128M，V162I和G163A，见说明书附图1)，构建热稳定性突变体。
(2)突变体构建和热稳定性验证：利用定点突变技术，以pET-28a- ChKRED12基因为模板，构建单点突变质粒。本发明也可以根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的基因序列为模板(基因序列见SEQ ID NO.1，氨基酸序列不变)，实施例中以优化后的序列SEQ IDNO.1为模板来详细说明本发明的具体方案。
将突变体质粒以化学法转入大肠杆菌DH5α，送于上海生工生物工程股份有限公司测序，将测序正确的质粒转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，并挑取单克隆诱导表达蛋白，而后冷冻离心收集菌体，加入磷酸钾缓冲液(0.1M、pH 8.0)重悬菌体，混匀后超声波破碎细胞。冷冻离心，取适量上清粗酶液用于生物催化反应，以3-氧-3-(2-噻吩)丙酰乙酯为底物，反应适当时间测定酶活。同时，另取等量的上清液于不同温度热处理一定时间，以相同的方法测定残余活性。再以未经过高温处理的粗酶液的酶活为参比，得到残余酶活百分比。详细方案见实施例1和2。
经上述理性设计获得了4个热稳定性提高的突变体，分别为S79P，L128M， V162I和G163A，其特征如下：
S79P：第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由AGC变为CCG)；
L128M：第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)；
V162I：第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(DNA序列由GTG变为ATT)；
G163A：第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由GGG变为GCA)。
以上4个突变体(S79P，L128M，V162I和G163A)热稳定性相比母本均有不同程度的提高。其中，S79P和L128M热稳定性提高最大，在50℃热处理1.5h，S79P和L128M仍保留80％以上的相对酶活性，而野生型在相同温度下热处理1.5h，仅保留37％的相对酶活性。S79P在50℃热处理3h，仍保留68％的相对酶活性，在4个突变体中热稳定性最好。
(3)4个位点的整合：
通过上述(1)突变获得的4个有益突变位点，分别为S79P，L128M，V162I 和G163A，以热稳定性最好的S79P为模板，利用定点突变技术，构建多位点组合突变体。优选构建以下组合突变体：M722、M723、M7234，其特征如下：
M722：第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由AGC变为CCG)、第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(DNA序列由GTG变为ATT)。
M723：第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由AGC变为CCG)、第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由GGG变为GCA)。
M7234:第79位的丝氨酸突变为脯氨酸(DNA序列由AGC变为CCG)、第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(DNA序列由GTG变为ATT)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由GGG变为GCA)。
这3种组合突变体的热稳定性与单点突变体相比又有进一步提高。55℃热处理1.5h，M722的相对酶活为85％、M723的相对酶活为75％、M7234的相对酶活力保持在90％以上，而野生型在55℃热处理1.5h基本失活。M7234在55 ℃热处理3h，仍可保持高达90％的相对酶活性。
本发明有益效果：上述所有突变体与母本相比，热稳定性均有大幅度提高，且酶的活性基本未受到影响，这些突变体能够在较高温度下进行工业生产，利于生产工艺的灵活性，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1 FirePort热稳定性突变子预测结果。
图2 50℃条件下，单点突变体与野生型热稳定性比较。“◇”表示 ChKRED12的热稳定性曲线，“■”表示S79P的热稳定性曲线，“▲”表示 L128M的热稳定性曲线，“◆”表示V162I的热稳定性曲线，“●”表示G163A 的热稳定性曲线。
图3 55℃条件下，多位点突变体热稳定性比较。“●”表示M722的热稳定性曲线，“■”表示M723的热稳定性曲线，“▲”表示M7234的热稳定性曲线，“◇”表示ChKRED12的热稳定性曲线。
具体实施方法
以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
实施例1 4个单点突变体的构建
理性设计方法对潜在耐热性位点预测的结果见说明书附图1。单点突变体 S79P，L128M，V162I和G163A均以羰基还原酶ChKRED12密码子优化后的基因SEQ ID NO.1为模板进行构建，所用引物：
S79P-F:5′–GGATGCGAATCCGAGCGCCGTGG–3′
S79P-R:5′–CCACGGCGCTC GATTCGCATCC–3′
L128M-F:5′–CTTTATCCAGAAAATGCTGCGTAA C–3′
L128M-R:5′–GTTACGCAGCATTTTCTGGATAAA G–3′
V162I-F:5′–GGCGCGCTGATTGGGGCGACC–3′
V162I-R:5′–GGTCGCCCCAATCAGCGCGCC–3′
G163A-F:5′–GGCGCGCTGGTGGCAGCGACCAAAGC–3′
G163A-R:5′–GCTTTGGTCGCTGCCACCAGCGCGCC–3′
PCR条件为：5×HF Buffer 10μL，MgCl2(1mM)1μL，引物(50ng/μL) 各1.5μL，dNTP(2.5mM)4μL，Phu(1U)1μL，质粒50ng，超纯水补足50μL，条件：98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共 25个循环，再72℃延伸10min。PCR产物用1μL DpnI，37℃处理1h。取DpnI 消化的PCR产物10μL，化学法转入大肠杆菌DH5α。送于上海生工生物工程股份有限公司测序，测序正确后，提取质粒转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例2粗酶液制备及酶活力的测定
2.1粗酶液的制备
将实施例1中各个突变体质粒，化学法转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆于10mL 含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，180rpm，过夜培养。以1％的接种量接种于200mL含有卡那霉素(50μg/mL)的TB培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，30℃诱导18h后，5000rpm、4℃离心10min，弃上清，菌体用生理盐水清洗两次，再加入15mL浓度为0.1M的磷酸钾缓冲液 (pH 8.0)重悬菌体，以超声波破碎细胞(工作条件：工作时间3s，间歇时间3s，工作次数99，功率200W)，细胞破碎液12000rpm，4℃离心20min，取上清粗酶液用于反应。
2.2粗酶活力的测定
粗酶活力测定反应条件见表1，以葡萄糖脱氢酶GDH进行辅酶循环。反应体系于40℃温浴5min，最后加入终浓度为10mg/mL(总蛋白浓度)的粗酶液， 40℃、150rpm反应3h。
反应结束后，加入1mL的乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，GC检测。检测方法为：程序升温，柱温初始温度为110℃，保持5min，再以35℃/min升温速度至180℃，保持5min。底物保留时间5.719min，产物(S)-HEES保留时间为11.152min。
表1粗酶反应体系
2.3热稳定性的测定
将总蛋白浓度50mg/mL的粗酶液100μL置于容量250μL的PCR管，在50℃条件下热处理1.5h，间隔一定时间取样，迅速放置冰上冷却，取热处理后的粗酶液测定残余活性，参照实施例2.2粗酶活力测定。再以未经过高温处理的粗酶液为参比，得到残余相对酶活性。
本轮突变获得4个突变体S79P，L128M，V162I和G163A。野生型与突变体对底物的转化率以及相对酶活性见表2和说明书附图2。50℃热处理1.5h，野生型仅保留37％的相对酶活性，而突变体S79P，L128M，V162I和G163A保留80％以上的相对酶活性。
表2野生型和突变体的转化率及相对酶活力
a所有数值均由粗酶液测定
实施例3构建多位点组合突变体
3.1突变体M722的构建
定点突变方法将突变体S79P的第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(DNA序列由GTG变为 ATT)，构建突变体M722，所用的引物如下：
L128M-F:5′–CTTTATCCAGAAAATGCTGCGTAA C–3′
L128M-R:5′–GTTACGCAGCATTTTCTGGATAAA G–3′
V162I-F:5′–GGCGCGCTGATTGGGGCGACC–3′
V162I-R:5′–GGTCGCCCCAATCAGCGCGCC–3′
PCR条件以及操作同实施例1，得到新突变体M722。
3.2突变体M723的构建
定点突变方法将突变体S79P的第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由GGG变为GCA), 构建突变体M723，所用的引物如下：
L128M-F:5′–CTTTATCCAGAAAATGCTGCGTAA C–3′
L128M-R:5′–GTTACGCAGCATTTTCTGGATAAA G–3′
G163A-F:5′–GGCGCGCTGGTGGCAGCGACCAAAGC–3′
G163A-R:5′–GCTTTGGTCGCTGCCACCAGCGCGCC–3′
PCR条件以及操作同实施例1，得到新突变体M723。
3.3突变体M7234的构建
定点突变方法将突变体S79P的第128位的亮氨酸突变为甲硫氨酸(DNA序列由TTA变为ATG)、第162位的缬氨酸突变为异亮氨酸(DNA序列由GTG变为 ATT)、第163位的甘氨酸突变为丙氨酸(DNA序列由GGG变为GCA)，所用的引物如下：
L128M-F:5′–CTTTATCCAGAAAATGCTGCGTAA C–3′
L128M-R:5′–GTTACGCAGCATTTTCTGGATAAA G–3′
V162I-G163A-F:5′–GCGAAAGGCGCGCTG ATTGCAGCGACCAAAGCTCTGG–3′
V162I-G163A-R:5′–CCAGAGCTTTGGTCGCTGCAATCAGCGCGCCTTTCGC–3′
PCR条件以及操作同实施例1，得到新突变体M7234。
3.4组合突变体热稳定性测定
将总蛋白浓度50mg/mL的粗酶液100μL置于容量250μL的PCR管，在55℃水浴处理1.5h，然后将样品管放置于冰上冷却，测定方法见2.2。以未经过高温处理的酶液为参比，得到酶相对活力。
与热稳定性最高的单点突变体S79P相比，组合突变体M722、M723和M7234 热稳定性均有不同程度提高。其中，突变体M7234的热稳定性提高幅度最大。组合突变体对底物的转化率以及相对酶活性见表3和说明书附图-3。55℃热处理1.5h，M722的相对酶活为85％、M723的相对酶活为75％、M7234的相对酶活为90％)，而野生型在55℃热处理1.5h基本失活。
表3组合突变体和母本的相对酶活力及转化率
a所有数值均由粗酶液测定。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 732
<212> DNA
<213> Chryseobacterium sp.
<400> 1
atgaaatgcg cgataattac cggcggaagc cgtggcattg gccgtgcgat ttgcattaag 60
ctggcggagg aaaagaatta tcatattctg attaactata cctcaaatga gactgccgct 120
cgtgaaaccc tggcgaaggt ggaagagtta ggcgcaacag gcgaaattct gaaatttgat 180
gtgggtaacg cggaagagac gaaagcggtg ctgaccgaat ggcaggatgc gaatagcagc 240
gccgtggtgg aggtgatcgt gaataatgcg ggcattacac gtgatggcct gtttatgtgg 300
atgccgagcg aagattggaa tagcgtcatt aataccagcc tgaatggctt cttcaacgtg 360
acgaacttct ttatccagaa attactgcgt aacaaatatg gccgtattat caatatggtg 420
agcgtgagcg gtgtaaaggg cactgcgggt caaaccaatt atagcgcagc gaaaggcgcg 480
ctggtggggg cgaccaaagc tctggcgcag gaagtcgcga aacgtaatat cactgtgaat 540
gcggtggctc cgggttttat caaaacggat atgacccagg agtttaatga agatgaactg 600
aaaggcatga ttccggcgaa ccgtttcggg gaagctgagg aggtggcgga tttagtggcg 660
tttctggcga gcaagaaagc gagctacata acgggcgaag tgatcaacat aaatgggggc 720
atttattctt aa 732
<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> Chryseobacterium sp.
<400> 2
Met Lys Cys Ala Ile Ile Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile Gly Arg Ala
1 5 10 15
Ile Cys Ile Lys Leu Ala Glu Glu Lys Asn Tyr His Ile Leu Ile Asn
20 25 30
Tyr Thr Ser Asn Glu Thr Ala Ala Arg Glu Thr Leu Ala Lys Val Glu
35 40 45
Glu Leu Gly Ala Thr Gly Glu Ile Leu Lys Phe Asp Val Gly Asn Ala
50 55 60
Glu Glu Thr Lys Ala Val Leu Thr Glu Trp Gln Asp Ala Asn Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Val Glu Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Gly
85 90 95
Leu Phe Met Trp Met Pro Ser Glu Asp Trp Asn Ser Val Ile Asn Thr
100 105 110
Ser Leu Asn Gly Phe Phe Asn Val Thr Asn Phe Phe Ile Gln Lys Leu
115 120 125
Leu Arg Asn Lys Tyr Gly Arg Ile Ile Asn Met Val Ser Val Ser Gly
130 135 140
Val Lys Gly Thr Ala Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Ala Ala Lys Gly Ala
145 150 155 160
Leu Val Gly Ala Thr Lys Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Lys Arg Asn
165 170 175
Ile Thr Val Asn Ala Val Ala Pro Gly Phe Ile Lys Thr Asp Met Thr
180 185 190
Gln Glu Phe Asn Glu Asp Glu Leu Lys Gly Met Ile Pro Ala Asn Arg
195 200 205
Phe Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Asp Leu Val Ala Phe Leu Ala Ser
210 215 220
Lys Lys Ala Ser Tyr Ile Thr Gly Glu Val Ile Asn Ile Asn Gly Gly
225 230 235 240
Ile Tyr Ser
Claims (1)
1.一种羰基还原酶突变体，其特征是以SEQ ID NO.2所示的序列为出发序列，将突变位点S79P、L128M、V162I或G163A一个或者多个组合得到的突变体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910247911.7A CN109837254B (zh) | 2019-03-28 | 2019-03-28 | 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910247911.7A CN109837254B (zh) | 2019-03-28 | 2019-03-28 | 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109837254A true CN109837254A (zh) | 2019-06-04 |
| CN109837254B CN109837254B (zh) | 2022-05-31 |
Family
ID=66886394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910247911.7A Expired - Fee Related CN109837254B (zh) | 2019-03-28 | 2019-03-28 | 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109837254B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109852592A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-06-07 | 中国科学院成都生物研究所 | 耐热性提高的羰基还原酶突变体 |
| CN110592035A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-12-20 | 浙江大学 | 一种羰基还原酶的突变体、重组表达载体及其在生产手性醇中的应用 |
| CN117887679A (zh) * | 2024-03-14 | 2024-04-16 | 山东金城生物药业有限公司 | 羰基还原酶突变体及其在制备(s)-玻色因中的应用 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120227131A1 (en) * | 2002-10-02 | 2012-09-06 | Abad Mark S | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| US20130344551A1 (en) * | 2007-12-20 | 2013-12-26 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Ketol-acid reductoisomerase using nadh |
| CN103834694A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-06-04 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途 |
| CN105062985A (zh) * | 2015-08-11 | 2015-11-18 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种羰基还原酶突变体及其用途 |
| US20160040138A1 (en) * | 2013-03-28 | 2016-02-11 | Kaneka Corporation | Modified carbonyl reducing enzyme and gene |
| CN106047828A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-10-26 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途 |
| CN107254454A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-10-17 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种羰基还原酶突变体及其应用 |
| CN108728421A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-02 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种羰基还原酶突变体及其用途 |
| CN108753851A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-11-06 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物 |
| CN109355265A (zh) * | 2018-11-25 | 2019-02-19 | 华南理工大学 | 一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)及其应用与编码基因 |
| CN109468291A (zh) * | 2018-06-01 | 2019-03-15 | 杭州馨海生物科技有限公司 | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 |
| CN109852592A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-06-07 | 中国科学院成都生物研究所 | 耐热性提高的羰基还原酶突变体 |
-
2019
- 2019-03-28 CN CN201910247911.7A patent/CN109837254B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120227131A1 (en) * | 2002-10-02 | 2012-09-06 | Abad Mark S | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
| US20130344551A1 (en) * | 2007-12-20 | 2013-12-26 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Ketol-acid reductoisomerase using nadh |
| US20160040138A1 (en) * | 2013-03-28 | 2016-02-11 | Kaneka Corporation | Modified carbonyl reducing enzyme and gene |
| CN103834694A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-06-04 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途 |
| CN105062985A (zh) * | 2015-08-11 | 2015-11-18 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种羰基还原酶突变体及其用途 |
| CN106047828A (zh) * | 2016-07-18 | 2016-10-26 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途 |
| CN107254454A (zh) * | 2017-05-16 | 2017-10-17 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种羰基还原酶突变体及其应用 |
| CN108753851A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-11-06 | 中国科学院成都生物研究所 | 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物 |
| CN109468291A (zh) * | 2018-06-01 | 2019-03-15 | 杭州馨海生物科技有限公司 | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 |
| CN108728421A (zh) * | 2018-06-19 | 2018-11-02 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种羰基还原酶突变体及其用途 |
| CN109355265A (zh) * | 2018-11-25 | 2019-02-19 | 华南理工大学 | 一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)及其应用与编码基因 |
| CN109852592A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-06-07 | 中国科学院成都生物研究所 | 耐热性提高的羰基还原酶突变体 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| DENG, J等: "Towards the computational design and engineering of enzyme enantioselectivity: A case study by a carbonyl reductase from Gluconobacter oxydans", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| LEE, JK等: "Purification and characterization of a novel erythrose reductase from Candida magnoliae", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| LIU,Y等: "short-chain dehydrogenase reductase, partial [Chryseobacterium sp. CA49]", 《NCBI GENBANK》 * |
| LUO, X等: "Activity improvement of a Kluyveromyces lactis aldo-keto reductase KlAKR via rational design", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| WU,Z.L等: "Identification of ketone reductase ChKRED20 from the genome of Chryseobacterium sp. CA49 for highly efficient anti-Prelog reduction of 3,5-bis(trifluoromethyl)acetophenone", 《J. MOL. CATAL. B ENZYM》 * |
| 宫緖敏等: "羰基还原酶辅酶结合域位点突变对其不对称催化性能的影响", 《催化学报》 * |
| 梁晨等: "羰基还原酶突变体高选择性催化不对称还原大位阻羰基化合物", 《高等学校化学学报》 * |
| 王华: "迭代酮还原酶SiaM三维结构和酶学性质的研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109852592A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-06-07 | 中国科学院成都生物研究所 | 耐热性提高的羰基还原酶突变体 |
| CN109852592B (zh) * | 2019-01-14 | 2022-05-31 | 中国科学院成都生物研究所 | 耐热性提高的羰基还原酶突变体 |
| CN110592035A (zh) * | 2019-08-29 | 2019-12-20 | 浙江大学 | 一种羰基还原酶的突变体、重组表达载体及其在生产手性醇中的应用 |
| CN110592035B (zh) * | 2019-08-29 | 2022-07-15 | 浙江大学 | 一种羰基还原酶的突变体、重组表达载体及其在生产手性醇中的应用 |
| CN117887679A (zh) * | 2024-03-14 | 2024-04-16 | 山东金城生物药业有限公司 | 羰基还原酶突变体及其在制备(s)-玻色因中的应用 |
| CN117887679B (zh) * | 2024-03-14 | 2024-06-11 | 山东金城生物药业有限公司 | 羰基还原酶突变体及其在制备(s)-玻色因中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109837254B (zh) | 2022-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109837254A (zh) | 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 | |
| CN106591271A (zh) | 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用 | |
| CN109609474A (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其在合成l-草铵膦中的应用 | |
| CN110066777B (zh) | 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用 | |
| CN112980814B (zh) | 低温适应性提高的外切菊粉酶突变体MutV268Δ13 | |
| CN113444714B (zh) | 一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用 | |
| CN117625581B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| CN117737037B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体De266LΔ6及其制备与应用 | |
| CN113308449B (zh) | 热稳定性提高的玉米赤霉烯酮内酯水解酶的突变体s162p及其应用 | |
| CN110592059A (zh) | 麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体 | |
| CN104152505A (zh) | 一种利用重组菌株转化制备4-羟基-l-异亮氨酸的方法 | |
| CN106754776B (zh) | 一种催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脱氢酶突变体 | |
| CN108118036A (zh) | 新型葡萄糖氧化酶突变体 | |
| CN109852592A (zh) | 耐热性提高的羰基还原酶突变体 | |
| CN103421734A (zh) | 一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用 | |
| CN103103234A (zh) | 利用固定化酶合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的方法 | |
| CN110184258B (zh) | 一种普鲁兰酶突变体 | |
| CN108823186B (zh) | 一种玉米淀粉降解能力提高的嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用 | |
| Lee et al. | One-pot enzymatic synthesis of UDP-D-glucose from UMP and glucose-1-phosphate using an ATP regeneration system | |
| CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN115232799B (zh) | 一种苯乙烯单加氧酶突变体及其应用 | |
| CN105985935B (zh) | 一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用 | |
| CN109182319A (zh) | 一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN114350630A (zh) | L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用 | |
| CN113355312B (zh) | 大肠杆菌l-谷氨酸脱羧酶突变体的制备及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220531 |