CN110904068A - 一种ck-mb型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用 - Google Patents

一种ck-mb型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶工程技术领域，尤其是涉及一种CK‑MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用。通过本发明所提供的制备方法所得到的CK‑MB型肌酸激酶同工酶的产率较高，M亚基蛋白和B亚基蛋白等比例复性后的得率为35 mg/L；通过本发明的制备方法所得到的CK‑MB型肌酸激酶同工酶用罗氏肌酸激酶同工酶检测试剂盒（电化学发光法）进行定量检测，其活性率大于41%。本发明所提供的CK‑MB型肌酸激酶同工酶的制备方法操作简单、成本低、产率高，所制备得到的CK‑MB型肌酸激酶同工酶的生物活性高，稳定性好，可以用于体外诊断中质控品或者校准品，也可以用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。

Description

一种CK-MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其是涉及一种CK-MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用。
背景技术
肌酸激酶同工酶为二聚体酶，广泛存在于各种组织中，分子量大小为81-82KDa，由两个相同或相似的亚基组成，包括肌肉型(CK-MM)、脑型(CK-BB)、杂化型(CK-MB)、线粒体型(MiMi)四种。其中，CK-MB型肌酸激酶同工酶诊断特异性最高，在急性心肌梗死(AMI)发生6h后，含量升至正常浓度的2倍，24h后达峰值，36h后降至基线水平，心梗发生时，血清CK-MB的浓度可增高至正常水平的10-25倍，超过CK总活力的10-12倍，临床上CK-MB被视为检测AMI的“金标准”。
CK-MB型肌酸激酶同工酶的空间结构极其复杂，体外重组表达困难。目前市面上高品质的CK-MB型肌酸激酶同工酶均为血源型。但因来源受限价格昂贵，严重阻碍CK-MB型肌酸激酶同工酶诊断产品的研究与开发。
发明内容
本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法包括如下步骤：
(1)以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQ ID NO.1，以基因序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的基因为引物进行PCR扩增，得到M亚基基因片段；
以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQ ID NO.2，以基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的基因为引物进行PCR扩增，得到B亚基基因片段；
上述所用基因的基因序列如下所示：
SEQ ID NO.1：
Figure BDA0001801492610000021
SEQ ID NO.2：
Figure BDA0001801492610000022
SEQ ID NO.3：
cagcaaatgggtcgcggatccATGCCGTTCGGTAACACCC
SEQ ID NO.4：
gtggtggtggtggtgctcgagTTTCTGAGCCGGGATCATGT
SEQ ID NO.5：
cagcaaatgggtcgcggatccATGCCGTTCTCTAACTCTCACAACG
SEQ ID NO.6：
gtggtggtggtggtgctcgagTTTCTGAGCCGGCATCAGG
(2)将M亚基基因片段、B亚基基因片段分别插入至表达载体pET28a(+)，形成pET28a-CKM与pET28a-CKB；
(3)将pET28a-CKM与pET28a-CKB分别热激法转化表达宿主菌，并用IPTG诱导表达，然后离心分离菌体，超声破碎，并过Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白，分别得到高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白；
(4)将高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白稀释后等比例混合，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：
优选地，步骤(2)中：分别以限制性内切酶BamHI和HindIII对表达载体pET28a(+)进行双酶切，将M亚基基因片段和B亚基基因片段分别与pET28a(+)酶切载体相连接。
优选地，表达宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)或者Rosetta(DE3)。
优选地，步骤(2)中应用DH5α感受态细胞进行载体构建，其目的在于增加筛选成功连接载体的概率。
优选地，步骤(4)中：高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白分别稀释至0.5mg/L，且以等比例混合，并在25℃下静置24h，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。
本发明的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种CK-MB型肌酸激酶同工酶，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶由前面所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法制备得到。
本发明的第三个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用基于前文所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：
优选地，以小牛血清作为稀释液将CK-MB型肌酸激酶稀释，并在真空条件下-45℃预冻，再真空冻干，形成冻干粉。
优选地，稀释液的配方为：4％乳糖、1％BSA、2mM EDTA、50mM NaCl、0.02％叠氮钠。
本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在肌酸激酶同工酶抗体开发中的应用。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在肌酸激酶同工酶抗体开发中的应用，将前面所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。
本发明提供一种CK-MB型肌酸激酶同工酶、制备方法及应用，通过本发明所提供的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法所得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶的产率较高，M亚基蛋白和B亚基蛋白等比例复性后的得率为35mg/L；通过CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法所得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶用罗氏肌酸激酶同工酶检测试剂盒(电化学发光法)进行定量检测，其活性率大于41％；将所制备得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶溶于牛血清并经真空干燥的得到的冻干粉可用作质控品或者校准品，该冻干粉在37℃可稳定保存11天以上，在4℃可稳定保存1年，复溶后4℃可稳定保存12天。本发明所提供的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法操作简单、成本低、产率高，所制备得到的CK-MB型肌酸激酶同工酶的生物活性高，稳定性好，可以用于体外诊断中质控品或者校准品，也可以用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。
附图说明
图1为用BamH I和Xho I双酶切构建的pET28-CKM与pET28-CKB；
其中，M：DNA marker DL2000；1：为pET28a-CKM双酶切；2：为pET28a-CKB双酶切。
图2为纯化后的M亚基蛋白、B亚基蛋白及复性后的CK-MB产品蛋白的SDS-PAGE电泳图，非还原；
其中，MW：蛋白分子量标准(分别为20kD、34kD、50kD、80kD、110kD)；M：纯化后的M亚基蛋白(约43KD)；B：纯化后的B亚基蛋白(约43KD)；MB：复性后的CK-MB蛋白(约86KD)。
具体实施方式
参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。
1.肌酸激酶M亚基与B亚基表达载体的构建
利用OptimumGeneTM基因设计软件优化人源化肌酸激酶同工酶两亚基编码基因序列，替换大肠杆菌稀有密码子、平衡GC含量、减少mRNA起始密码子附近稳定的二级结构，优化后的基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)；
以SEQ ID NO.1为模板，以SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为引物进行PCR扩增，胶纯化回收得M亚基基因片段；以SEQ ID NO.2为模板，以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6为引物进行PCR扩增，胶纯化回收得B亚基基因片段；表达载体pET28a(+)分别经限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，将M亚基基因片段与B亚基基因片段分别与pET28a(+)酶切载体连接，将连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞，涂布于含50ug/ml卡那抗生素的LB琼脂培养基，37℃培养过夜，筛选得阳性克隆，挑选阳性克隆培养并抽取质粒进行测序及酶切鉴定，测序结果与预期一致，无任何碱基突变；参照图1所示，双酶切鉴定可见1240bp左右的目的条带，表明目的基因成功插入表达载体pET28a(+)，命名为pET28a-CKM与pET28a-CKB。
2.肌酸激酶M亚基与B亚基的诱导表达及纯化：
将测序正确阳性克隆重组质粒pET28a-CKM与pET28a-CKB分别用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50ug/ml卡那抗生素的LB琼脂培养基，37℃培养过夜，各挑选2个单菌落接种至含50ug/ml卡那抗生素的5ml LB液体培养基中，37℃，250r/min培养至OD600≈0.6，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，37℃诱导培养4h，SDS-PAGE显示肌酸激酶M亚基与B亚基均实现高效表达。
肌酸激酶M亚基与B亚基纯化按上述条件进行1L LB培养基发酵培养，8000rpm/min离心5min收集菌体，用50mM Tris、0.5M NaCl pH 8.0的缓冲液重悬，加入终浓度1mM PMSF后进行冰浴超声破碎，超声破碎条件为：超声4s，间隔6s，超声总时间30min，超声功率150W；12000rpm/min，4℃离心30min，取上清过Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白，上样缓冲液为50mMTris、0.5M NaCL pH 8.0，平衡缓冲液为50mM Tris、0.5M NaCl、50mM咪唑pH 8.0，洗脱缓冲液为50mM Tris、0.5M NaCL、500mM咪唑pH 8.0，将洗脱的目的蛋白在透析缓冲液中透析24h，12h换液一次，透析缓冲液为50mM Tris、0.2M NaCl、2mM EDTApH 8.0。参照图1，透析后SDS-PAGE显示：肌酸激酶M亚基与B亚基蛋白纯度均大于85％。
3.肌酸激酶同工酶CK-MB折叠条件探索
参照表1所示，将肌酸激酶M亚基蛋白与肌酸激酶B亚基蛋白稀释至不同浓度，1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml，相同浓度条件下分别以1:1、1:2、1:3、3:1、2:1体积比例混合，放置于4℃静置、4℃搅拌、25℃静置、25℃搅拌条件下处理24h，稀释10000倍后用罗氏肌酸激酶同工酶检测试剂盒(电化学发光法)进行活性检测，确定最佳折叠条件为肌酸激酶M亚基蛋白与肌酸激酶B亚基蛋白稀释至0.5mg/L 1:1比例混合，25℃静置24h，活性率达41％。
参照图2，图2为纯化后的M亚基蛋白、B亚基蛋白及复性后的CK-MB产品蛋白的SDS-PAGE电泳图，非还原；
其中，MW：蛋白分子量标准(分别为20kD、34kD、50kD、80kD、110kD)；M：纯化后的M亚基蛋白(约43KD)；B：纯化后的B亚基蛋白(约43KD)；MB：复性后的CK-MB蛋白(约86KD)。
表1
Figure BDA0001801492610000071
4.肌酸激酶同工酶CK-MB冻干条件优化及稳定性研究
用小牛血清做稀释液，加入赋形剂和保护剂后将肌酸激酶同工酶CK-MB稀释成三个浓度(H、M、L分别形成三水平)进行真空冷冻干燥，通过冻干粉外观、活性收率和37℃加速破坏试验筛选稀释液配方及真空冷冻干燥工艺条件，并在4℃条件下评估冻干粉的真实稳定性及开瓶稳定性。确定稀释液配方为4％乳糖、1％BSA、2mM EDTA、50mM NaCl、0.02％叠氮钠，真空冷冻干燥条件为-45℃预冻3h、真空冻干18h，-20℃2h、-10℃2h、0℃2h、10℃2h、20℃10h，在此方案下制备的肌酸激酶同工酶冻干制品在37℃可稳定保存11天以上，在4℃条件下可稳定保存1年以上，在4℃条件下开瓶稳定性可稳定保存13天以上。该冻干制品可用做体外诊断中质控品与校准品，也可用作免疫原用于肌酸激酶同工酶抗体开发及筛选。表2-4分别为CK-MB型肌酸激酶同工酶冻干样在37℃、4℃下的保存稳定性以及4℃下的开瓶稳定性的实验表。
表2
Figure BDA0001801492610000081
表3
Figure BDA0001801492610000082
表4
Figure BDA0001801492610000083
Figure BDA0001801492610000091
结果表明，通过本发明方法制备的CK-MB型肌酸激酶同工酶操作简单、产率高、生物活性高、稳定性好，CK-MB型肌酸激酶还可用于肌酸激酶同工酶抗体的开发与体外诊断中肌酸激酶同工酶质控品与校准品的制备。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法包括如下步骤：
（1）以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQ ID NO.1，以基因序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4的基因为引物进行PCR扩增，得到M亚基基因片段；
以优化后的人源化肌酸激酶同工酶基因为模板，基因序列为SEQ ID NO.2，以基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的基因为引物进行PCR扩增，得到B亚基基因片段；
（2）将M亚基基因片段、B亚基基因片段分别插入至表达载体pET28a (+)，形成pET28a-CKM与pET28a-CKB；
（3）将pET28a-CKM与pET28a-CKB分别热激法转化表达宿主菌，并用IPTG诱导表达，然后离心分离菌体，超声破碎，并过Ni2+-NTA柱纯化目的蛋白，分别得到高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白；
（4）将高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白稀释后等比例混合，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。
2. 根据权利要求1所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中：分别以限制性内切酶BamHI和HindIII对表达载体pET28a (+)进行双酶切，将M亚基基因片段和B亚基基因片段分别与pET28a (+)酶切载体相连接。
3. 根据权利要求1所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，表达宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)或者Rosetta (DE3)。
4.根据权利要求1所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中应用DH5α感受态细胞进行载体构建。
5. 根据权利要求1所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中：高纯度的M亚基蛋白和B亚基蛋白分别稀释至0.5 mg/L，且以等比例混合，并在25℃下静置24 h，形成CK-MB型肌酸激酶同工酶二聚体蛋白。
6.一种CK-MB型肌酸激酶同工酶，其特征在于，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶由权利要求1-5中任意一项所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶的制备方法制备得到。
7.一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用，其特征在于，所述CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用基于权利要求5所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶。
8.根据权利要求7所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用，其特征在于，以小牛血清作为稀释液将CK-MB型肌酸激酶稀释，并在真空条件下-45℃预冻，再真空冻干，形成冻干粉。
9. 根据权利要求7所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶在质控品或校准品中的应用，其特征在于，稀释液的配方为：4%乳糖、1%BSA、2 mM EDTA、50 mM NaCl、0.02%叠氮钠。
10.一种CK-MB型肌酸激酶同工酶在肌酸激酶同工酶抗体开发中的应用，其特征在于，将权利要求6所述的CK-MB型肌酸激酶同工酶用作免疫原或者筛选原用于肌酸激酶同工酶抗体开发。
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