CN103975069B

CN103975069B - 通过使用AlkB烷烃1-单加氧酶氧化烷烃的方法

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Publication number: CN103975069B
Application number: CN201280059816.0A
Authority: CN
Inventors: J.C.普费弗; T.哈斯; O.图姆; F.埃尔哈特; E.M.维特曼; C.格林; S.哈夫克迈尔; T.许勒
Original assignee: Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2032-11-22
Also published as: EP2788493B1; BR112014013481A2; CA2857713C; DK2788493T3; US20150044744A1; US10053713B2; WO2013083412A1; CN103975069A; JP6373190B2; BR112014013481B1; JP2015500642A; EP2602328A1; EP2788493A1; CA2857713A1

Abstract

本发明涉及氧化烷烃的方法，其包括使烷烃与AlkB型氧化还原酶接触，和使用AlkB型氧化还原酶制备烷烃的氧化产物的混合物，其中氧化产物中羧酸与醇的比例优选大于1:1。

Description

通过使用AlkB烷烃1-单加氧酶氧化烷烃的方法

烷烃是化学工业中最重要的基础材料。化石原材料通常是获得它们的起点，然而，同时，从可再生原材料获得烷烃的方法也是已知的。尽管烷烃对于公众是已知的，尤其是由于它们作为能源的有用性，例如，以气体形式的短链烷烃或液体的更长链烷烃，但它们在工业中尤其是在它们作为用于多种合成的反应物或溶剂的作用中是不可或缺的，所述合成产生日常生活中重要的产品，诸如塑料制品或药物制品。

使用烷烃用于此类目的的一个基本条件是氧化引入含杂原子的官能到烷烃碳链中，例如羟基、酮和羧基官能，这是由于烷烃本身由于它们的化学饱和性而可以表征为相对惰性的。然而，这必须不能导致烷烃向二氧化碳的完全氧化，除了当使用烷烃作为燃料之外，而是含杂原子的官能必须被选择性地且以可控的方式引入。

已知用于合成制备取代有含杂原子的官能的烷烃的许多反应，例如在UV光的影响下烷烃的卤化，其产物可以用作合成许多化合物的反应物。例如，醇可以通过卤素取代烷烃的亲核取代来获得。然而，此类反应常常需要使用有毒的和/或环境有害的物质，例如氯气，其由于它的工业价格低而常常用于卤化。

一系列用于将含杂原子尤其是含氧的官能引入烷烃的生物技术方法也是已知的。例如，通过嗜石油节杆菌（Arthrobacter petroleophagus）和其他野生型菌株转化丙烷为丙酮描述于Exxon的专利(EP 98137)中。Grant等 (2011)使用重组大肠杆菌细胞来氧化长链烷烃。

针对这一背景，本发明的目标是开发氧化烷烃的生物技术方法，其适合用于选择性氧化烷烃的末端碳原子，直至氧化为羧酸。

此外，本发明的目标是开发这样的方法，其适合于制备在末端碳原子处选择性氧化的烷烃的多种产物，其中可以改变产物的量和比例。

此外，本发明的目标是提供氧化还原酶系统，其能够催化末端碳原子的氧化至选自醇、醛和羧酸的所有氧化水平，其中仅单一的催化活性多肽与底物烷烃或其中间产物接触。

此外，本发明的目标是提供独立于脂肪酸代谢且通过单独的氧化系统的过表达而表征的系统，其用于烷烃的选择性末端氧化。

本发明的进一步的目标是提供用于氧化烷烃，优选气态烷烃的方法，其适合于主要地或以改进的产率氧化烷烃为羧酸，而非仅仅主要氧化为醇。

这些和其他目的通过本发明的主题和尤其还通过所附的独立权利要求的主题来实现，其中从属权利要求中产生具体实施方案。

在第一方面，本发明的目标通过氧化烷烃的方法来实现，所述方法包括使烷烃与AlkB型氧化还原酶在氧存在的情况下接触。

在第一方面的第一个实施方案中，所述烷烃是具有1-5个碳原子的烷烃。

在第一方面的第二个实施方案中，其还是第一方面的第一个实施方案的一个实施方案，所述烷烃是具有1-4个碳原子的烷烃，优选丁烷。

在第一方面的第三个实施方案中，其还是第一方面的第一个和第二个实施方案的一个实施方案，所述烷烃是支化的烷烃，优选具有4个或5个碳原子的烷烃，更优选异丁烷。

在第一方面的第四个实施方案中，其是第一方面的第一个至第三个实施方案的一个实施方案，所述AlkB型氧化还原酶是来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkB或其变体。

在第一方面的第五个实施方案中，其还是第一方面的第一个至第四个实施方案的一个实施方案，所述AlkB型氧化还原酶以全细胞催化剂的形式提供。

在第一方面的第六个实施方案中，其还是第一方面的第一个至第五个实施方案的一个实施方案，所述AlkB型氧化还原酶以纯化的多肽的形式提供。

在第二方面，本发明的目标通过使用AlkB型氧化还原酶在氧存在的情况下制备烷烃的氧化产物的混合物来实现，其中氧化产物中羧酸与醇的比例优选大于1:1。

在第二方面的第一个实施方案中，所述烷烃是具有1-5个碳原子的烷烃。

在第二方面的第二个实施方案中，其还是第二方面的第一个实施方案的一个实施方案，所述烷烃是具有1-4个碳原子的烷烃，优选丁烷。

在第二方面的第三个实施方案中，其还是第二方面的第一个和第二个实施方案的一个实施方案，所述烷烃是支化的烷烃，优选具有4个或5个碳原子的烷烃，更优选异丁烷。

在第二方面的第四个实施方案中，其是第二方面的第一个至第三个实施方案的一个实施方案，所述AlkB型氧化还原酶是来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkB或其变体。

在第二方面的第五个实施方案中，其还是第二方面的第一个至第四个实施方案的一个实施方案，所述AlkB型氧化还原酶以全细胞催化剂的形式提供。

在第二方面的第六个实施方案中，其还是第二方面的第一个至第四个实施方案的一个实施方案，所述AlkB型氧化还原酶以纯化的多肽的形式提供。

在第二方面的第七个实施方案中，其还是第二方面的第一个至第六个实施方案的一个实施方案，氧化产物中羧酸与醇的比例大于5:1，优选大于12:1，更优选大于20:1，最优选大于40:1。

本发明的发明人已确定AlkB型氧化还原酶（其在参考文献中也已知为用于制备主要氧化强度更低的产物的催化剂）可以令人惊奇地用于从烷烃制备主要更高氧化水平的产物，尤其从气态烷烃来制备，尤其是从烷烃开始产生羧酸。尤其是，产生的羧酸与产生的醇的比例令人惊奇地高。此外，本发明人已令人惊奇地发现此类氧化还原酶能够选择性氧化烷烃，并且产生可预期的副产物，尤其是在除末端碳原子之外的碳原子上氧化的烷烃仅仅以出人意料低的含量或以根本无法检测到的量存在。

根据本发明，烷烃优选气态烷烃，使用AlkB型氧化还原酶在氧存在的情况下氧化。AlkB代表最初从恶臭假单胞菌Gpo1的AlkBGT系统中已知的氧化还原酶，其依赖于另两种多肽AlkG和AlkT。将AlkT表征为FAD依赖性红素氧还蛋白还原酶，其从NADH向AlkG转移电子。AlkG是红素氧还蛋白，一种含铁的氧化还原蛋白，其功能为AlkB的直接电子供体。在一个优选的实施方案中，同一术语“AlkB型的氧化还原酶”为与具有氧化烷烃的能力的恶臭假单胞菌Gpo1的AlkB序列（数据库代码：CAB54050.1；该数据库代码如用于本申请中的现有技术的所有其他代码一样起源，即来自NCBI数据库，更准确地是在2011年11月15日在线可用地发布）具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%（递增优选地）的序列同源性的多肽。在一个尤其优选的实施方案中，AlkB型氧化还原酶是具有来自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkG(CAB54052.1)和AlkT (CAB54063.1)多肽的功能上相互作用的、氧化烷烃的氧化还原酶。在一个最优选的实施方案中，AlkB型氧化还原酶是来自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkBGT系统的AlkB或其变体。

本发明的教导不仅仅可以通过使用本文描述的生物大分子的准确的氨基酸或核酸序列来实现，还可以通过使用此类大分子的变体（其可以通过缺失、添加或取代一个或多于一个的氨基酸或核酸来获得）来实现。在一个优选的实施方案中，如本文所用的核酸序列或氨基酸序列的术语“变体”（下文中与术语“同源物”同义地且可互换使用）表示另一条核酸序列或氨基酸序列，其具有与对应的原始野生型核酸或氨基酸序列70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性（此处可同义使用同一性），其中优选除形成催化活性中心的或对于结构或折叠必需的氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代，或后者仅被保守取代，例如谷氨酸代替天冬氨酸，或亮氨酸代替缬氨酸。序列在其整个长度上具有相应的高同源性并不是必需的；根据本发明还可以使用融合蛋白或编码其的核酸，其具有部分相应的同源性和/或活性。现有技术描述了可用于计算两条序列同源性程度的算法，例如ArthurLesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版。在本发明进一步更优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体，优选除上述序列同源性之外，具有与野生型分子或原始分子基本上相同的酶活性。例如，有酶活性的多肽蛋白酶的变体具有与多肽酶相同或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个具体的实施方案中，术语“基本上相同的酶活性”表示这样的活性，其对于野生型多肽的底物而言，明确地在本底活性之上或/和在K_M和/或k_cat值上与野生型多肽对于相同底物展示出的不同，相差少于3个、优选2个、更优选1个数量级。在进一步优选的实施方案中，术语核酸或氨基酸序列的“变体”包括核酸或氨基酸序列的至少一个活性部分/或片段。在进一步优选的实施方案中，如本文所用的术语“活性部分”表示氨基酸序列或核酸序列，其具有少于氨基酸序列全长的序列和/或编码少于氨基酸序列全长的序列，其中比野生型氨基酸序列长度短的氨基酸序列或编码的氨基酸序列基本上具有与野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如醇脱氢酶、单加氧酶或氨基转移酶。在一个具体的实施方案中，术语核酸的“变体”包括这样的核酸，其互补链优选在严格条件下与野生型核酸结合。杂交反应的严格性可以由本领域技术人员容易地确定，并通常依赖于探针的长度、洗涤温度和盐浓度。通常，更长的探针需要更高的杂交温度，而更短的样品在更低的温度下操作。杂交是否发生通常依赖于变性DNA与其环境（即低于解链温度）中存在的互补链退火（annellieren）的能力。杂交反应的严格性和相应的条件更详细地描述于Ausubel等(1995)。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语核酸的“变体”包含编码与原始核酸相同的氨基酸序列的或在根据遗传密码简并性的情况下编码该氨基酸序列的变体的任何核酸序列。

对于许多应用，作为全细胞催化剂的部分所用的AlkB型氧化还原酶正在成为选择的实施方案，这是由于它不需要氧化还原酶或其活性的任何纯化，或者至少不需要完全纯化。在一个优选的实施方案中，将如本文所用的术语“全细胞催化剂”理解为表示具有目标酶活性的代谢活跃的细胞，优选具有AlkB型氧化还原酶，优选为相对于它的野生型升高的程度，其可以有利地通过过表达在质粒上的或整合入基因组中的重组的AlkB型氧化还原酶来实现。许多用于制备全细胞催化剂的系统对于本领域技术人员是已知的，例如来自DE60216245的。在一个优选的实施方案中，用作全细胞催化剂或用作表达系统的细胞是原核细胞，优选细菌细胞。在进一步优选的实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在进一步优选的实施方案中，它是低等真核细胞，优选酵母细胞。原核细胞的实例包括埃希氏菌属（Escherichia），尤其是大肠杆菌（Escherichia coli），和属假单胞菌属和棒杆菌属的菌株。低等真核细胞的实例包括属酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、耶罗维亚酵母属（Yarrowia）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），尤其是菌株热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和酿酒酵母（Saccharomyces cerivisiae）。细胞可以包含一个、或多于一个在质粒上的或整合入其基因组中的编码根据本发明使用的酶的核酸序列。用于制备此类质粒或细胞的方法可以由本领域技术人员常规实施。这些方面描述于分子生物学、生物化学、遗传学和微生物学的教科书和实验方案集合中，例如在Sambrook等(1989)。

在进一步优选的实施方案中，AlkB型氧化还原酶却是纯化的酶。在这种情况下，根据本发明使用的所有的有酶活性的多肽可以是包含有酶活性的多肽的细胞或其裂解产物或在所有纯化步骤中的多肽制备物（从粗裂解产物直至纯的多肽）。在一个优选的实施方案中，将如本文所用的术语“纯化的”酶理解为表示在一个优选的实施方案中，不将全细胞或其未处理的提取物用于催化，而是酶是部分或完全纯化的。在一个尤其优选的实施方案中，如本文所用的术语“纯化的”酶表示将酶纯化直到在制备物的SDS凝胶上它具有至少约80、85、95、98或优选99％（递增优选地）的可见蛋白。在一个更优选的实施方案中，将酶纯化直到它是对应制备物的SDS凝胶上唯一可识别的多肽。多种方法对于本领域技术人员是已知的，使用所述方法可以在合适细胞中过表达酶活性多肽并可以纯化或分离。因此，可以使用本领域技术人员可获的用于表达多肽的所有表达系统，例如pET型或pGEX型载体。层析方法适合于纯化，例如通过使用固定配体通过亲和层析纯化提供有标签的重组蛋白，例如，在组氨酸标签的情况下的镍离子，在与目的蛋白融合的谷胱甘肽S转移酶的情况下的固定的谷胱甘肽，或在含麦芽糖结合蛋白的标签的情况下的固定的麦芽糖。

纯化的酶活性的多肽可以以可溶形式或固定地来使用。合适的方法对于本领域技术人员是已知的，通过所述方法可以将多肽共价地或非共价地固定在有机或无机固相上，例如通过巯基偶联化学（例如来自Pierce的试剂盒）。

本发明的教导可以用于多种烷烃。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“烷烃”是选自以下的饱和的烃：分子式C_nH_2n+2的直链或支化的烃和分子式C_nH_2n的环化烃，其中n可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和更多的值，优选1-5，更优选1-4。具有1-4个碳原子的烷烃包括例如化合物甲烷、乙烷、丙烷、丁烷和异丁烷。烷烃包括直链烷烃，例如包含甲烷、乙烷、丙烷和丁烷的组。在一个优选的实施方案中，烷烃是支化的烷烃，优选选自异丁烷、2-甲基丁烷和新戊烷。在进一步尤其优选的实施方案中，烷烃是选自丁烷和异丁烷的烷烃。在进一步尤其优选的实施方案中，所述烷烃是甲基环丁烷。

为了进行本发明的方法，多种条件是合适的。作为氧化剂的分子氧的存在是必需的。氧可以以氧源的形式诸如过氧化氢或高锰酸钾存在，并且可以从这些中原位形成，但尤其优选的是引入氧气，更优选以空气的形式，进入含有氧化还原酶的液体反应培养基中。在这种情况下温度可以高于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃ 或高于80℃，优选直至100℃，只要在使用活细胞或合适的酶制剂的情况下，所选的细胞或所选的酶分别是活的或显示出活性。本领域技术人员已知哪些生物在哪些温度下是活的，例如从教科书诸如Fuchs/Schlegel, 2007中。在活酵母细胞的情况下，温度可以是5-45℃，优选15-42℃，更优选20-30℃。在革兰氏阴性细菌的情况下，优选来自肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的细菌，最优选大肠杆菌，温度可以是5-45℃，优选15-42℃，更优选20-30℃，最优选35-40℃。pH必须是这样的，从而使AlkB型氧化还原酶的活性至少保持足够长的时间。在使用全细胞催化剂的情况下，细胞必须足够长的时间保持完整。例如，pH可以是3-12，优选5-9，更优选6-8。

优选使烷烃以这样的方式与AlkB型氧化还原酶接触，从而使以纯化形式或以全细胞催化剂形式存在的AlkB型氧化还原酶以足够稳定形式存在于水溶液中，并且边轻柔搅拌边将烷烃（在固体或液体烷烃的情况下）与氧一起加入到溶液中，或者如果它是气态烷烃的话，则将它以气体形式引入到水溶液中。本领域技术人员具有在常规实验背景中提供酶或全细胞催化剂的稳定形式的能力。待观察的因素，诸如合适的缓冲系统的使用、合适的温度、pH和盐浓度的设定值，均描述于参考文献中，例如在Cornish-Bowden, 1995中。

对于培养本发明的细胞，多种培养基是合适的，在使用酵母细胞的情况下，例如YPD、YPN和YNB，其可以添加有氨基酸，例如具有0.01g/l的色氨酸、或添加有葡萄糖，例如以1% (w/v)的浓度。在使用来自肠杆菌科的细菌，优选大肠杆菌的情况下，培养可以在完全培养基中，诸如LB培养基或高细胞密度培养基(HCD培养基)，其每升由NH₄SO₄ 1.76 g、K₂HPO₄19.08 g、KH₂PO₄ 12.5 g、酵母提取物6.66 g、柠檬酸三钠1.96 g、柠檬酸NH₄Fe (1 %) 17ml、微量元素溶液US3 5 ml、给料溶液(葡萄糖50 % w/v, MgSO₄ [x 7 H₂O 0.5 % w/v,NH₄Cl 2.2 % w/v) 30 ml组成。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法中使用的细胞在用于烷烃氧化的培养基之外的另一种培养基中培养。在一个尤其优选的实施方案中，用于培养的培养基是完全培养基并且用于烷烃氧化的培养基是基本培养基。如果本发明的方法使用活细胞进行，则在细胞培养后优选在转化缓冲液中进行，其每升含有(NH₄)H₂PO₄ 8 g、NaCl 0.5 g, MgSO₄ x7 H₂O 0.48 g、微量元素溶液US3 15 ml。1升微量元素溶液US3由HCl 37 % 36.5 g、MnCl₂ x4H₂O 1.91 g、ZnSO₄ x 7H₂O 1.87 g、Na-EDTA x 2H₂O 0.8 g、H₃BO₃ 0.3 g、Na₂MoO₄ x 2H₂O0.25 g、CaCl₂ x 2H₂O 4.7 g、FeSO₄ x 7 H₂O 17.8 g、CuCl₂ x 2H₂O 0.15 g构成，并将它的pH调节至5.4。在进一步的实施方案中，烷烃氧化在M9培养基（在1000 ml摇瓶中15 g葡萄糖、6.79 g Na₂PO₄、3 g KH₂PO₄、0.5 g NaCl、2 g NH₄Cl、15 g酵母提取物、0.49 g MgSO₄*7H₂O、1 ml TE，并接有50 µg卡那霉素，其中微量元素溶液（TE）每升由以下构成：36.5 gHCl 37 %、1.91 g MnCl₂*4H₂O、1.87 g ZnSO₄*7H₂O、0.84 g Na-EDTA*2H₂O、0.3 g H₃BO₃、0.25 g Na₂MoO₄*2H₂O、4.7 g CaCl₂*2H₂O、17.3 g FeSO₄*7H₂O和0.15 g CuCl₂*2H₂O）中进行。

本发明的方法在大气压下进行。然而，在使用气态烷烃反应物的情况下，在气体混合物（主要包含烷烃和氧气的混合物，并且氧气以体积计多于50、60、70或80％（递增优选地））的存在的情况下，允许AlkB型氧化还原酶以更高的压力催化反应可能是有利的。在一个优选的实施方案中，压力大于1.5、2、3或4 bar。在进一步的实施方案中，压力为0.5-4，优选1-3，最优选1-1.5 bar。

本发明的方法的一个具体的优点在于可以获得用作反应物的烷烃的氧化产物的特定比例。原则上，烷烃可以由AlkB型氧化还原酶在末端碳原子（即最多直接共价连接仅一个另外的碳原子的碳原子）上被氧化至三个氧化水平，即醇、醛和羧酸。在一个优选的实施方案中，表述“氧化产物中羧酸与醇的比例优选大于1:1”表示羧酸与醇的物质的量的比，优选通过末端碳原子氧化形成的羧酸与通过末端碳原子氧化形成的醇的物质的量的比大于1:1，即比通过末端碳原子氧化形成的醇分子更多的通过末端碳原子氧化形成的羧酸分子存在于产物混合物中。

在一个优选的实施方案中，AlkB型氧化还原酶，优选来自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkB，可以用于在氧存在的情况下从烷烃制备氧化产物，所述烷烃为优选具有1-5个，更优选1-4个碳原子，最优选4个碳原子的烷烃，其中羧酸与醇的比例优选大于1:1、1.5:1、2:1、5:1、10:1、15:1或20:1（递增优选地）。

在进一步优选的实施方案中，本发明包含：氧化非环状烷烃的末端碳原子至相应的醛和/或相应的末端单羧酸的方法，所述方法包括在氧化剂存在的情况下，使烷烃与包含有催化活性的氧化还原酶的生物制剂接触，其中所述烷烃是丁烷或异丁烷，并且其中所述氧化还原酶是AlkB型氧化还原酶，更优选是来自恶臭假单胞菌GPO1的AlkB单加氧酶或其同源物，并且所述氧化剂是氧；和AlkB型氧化还原酶，优选来自恶臭假单胞菌GPO1的AlkB单加氧酶或其同源物用于氧化非环状烷烃的末端碳原子至相应的醛和/或相应的末端单羧酸的用途，其中所述烷烃是丁烷或异丁烷。

本发明通过以下附图和非限定性实施例进一步说明，从中可以获得本发明的进一步的特征、实施方案、方面和优点。

图1a)、b)、c)和d)显示了通过恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT单加氧酶系统以500 –800或900 rpm的搅拌速度，在与氧转化丁烷的过程中，随时间过程的1-丁醇(a))、2-丁醇(b))、丁醛(c))和丁酸(d))的浓度。显示了在发酵罐(F)和在洗瓶（WB）中的浓度。

图2 a）和b）显示了生物量浓度对通过大肠杆菌由恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT单加氧酶系统氧化丁烷的影响，更准确地为随时间过程的1-丁醇(a))和丁酸(b))的浓度。

图3a)、b)、c)和d)显示了微量元素(TE)溶液的浓度对通过大肠杆菌由恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT单加氧酶系统氧化丁烷的影响，更准确地为随时间过程的1-丁醇(a))、2-丁醇(b))、丁醛(c))和丁酸(d))的浓度。

图4a)、b)、c)和d)显示了由恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT单加氧酶系统的菌株大肠杆菌BL21和大肠杆菌W3110的比较，以及其对通过大肠杆菌用恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶（AlkBGT）氧化丁烷的影响，更准确地为随时间过程的1-丁醇(a))、2-丁醇(b))、丁醛(c))和丁酸(d))的浓度。

图5a)、b)、c)显示了通过大肠杆菌由恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT单加氧酶系统氧化异丁烷，更准确地为随时间过程的2-甲基-1-丁醇(a))、异丁醛(b))和异丁酸(c))的浓度。

图6图示了实施例7的克隆的p-LL-30载体。

图7显示了通过大肠杆菌由Alcanivorax borkumensis的AlkBG单加氧酶系统氧化丁烷，如实施例7中进行的。

实施例1：通过大肠杆菌由恶臭假单胞菌GPO1的AlkBGT单加氧酶系统氧化丁烷

将100µl的大肠杆菌BL21 pCOM10 (空质粒)和大肠杆菌BL21 pBT10 (WO 2009/077461)的甘油冷冻培养物铺在含有50 µl卡那霉素的LB琼脂板上，并在37℃下孵育24小时。LB平板由酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 0.5 g、琼脂琼脂15 g和卡那霉素50 µg的1升溶液制备。高压灭菌前用5% NH₄OH将pH调节为7.4。

从这些平板（对于一个转化批次），用接种环满满一环（容量10 µl）接种在100 ml具有挡板（Schikanen）的摇瓶中含50 µl卡那霉素的2 x 25 ml的LB培养基（不具有琼脂琼脂的上述溶液）。将培养物在37℃和200rpm (振幅2.5 cm)下孵育24小时。

将每一25 ml的培养基随后用作在75 ml未改良的M9培养基（无菌过滤的）中的接种物，所述培养基每升有以下组成：在1000 ml摇瓶中15 g葡萄糖、6.79 g Na₂PO₄、3 gKH₂PO₄、0.5 g NaCl、2 g NH₄Cl、15 g酵母提取物、0.49 g MgSO₄*7H₂O、1 ml TE和50 μg卡那霉素。微量元素溶液(TE)每升如下构成：36.5 g HCl 37 %、1.91 g MnCl₂*4H₂O、1.87 gZnSO₄*7H₂O、0.84 g Na-EDTA*2H₂O、0.3 g H₃BO₃、0.25 g Na₂MoO₄*2H₂O、4.7 g CaCl₂*2H₂O、17.3 g FeSO₄*7H₂O和0.15 g CuCl₂*2H₂O。用5% NH₄OH将pH调节为7.4。此外，每瓶加入3滴高压灭菌的消泡剂(Delamex)。

将瓶在37℃和180rpm (振幅2.5 cm)下孵育2小时。随后将温度降低到25℃。在25℃下0.5小时后用0.4 mM DCPK诱导。将培养物在25℃和180 rpm下再振荡16小时。随后进行Monosepsis的显微镜检查。

将培养物组合，加入到50 ml Falcon管中并在25℃下以10 000 g离心10分钟。丢弃上清液。将来自200 ml的培养物的沉淀重悬于10 ml的转化缓冲液中。转化缓冲液由70mM Na⁺/K⁺ 磷酸盐缓冲液组成，其用1 M NaOH调节为pH 7，含有6.79 g Na₂PO₄、3 g KH₂PO₄、0.5 g NaCl、0.49 g MgSO₄*7H₂O、1 ml TE和50 µg卡那霉素，或由70 mM (NH₄)H₂PO₄缓冲液（pH 7）组成，其每升含有8 g (NH₄)H₂PO₄、0.5 g NaCl、0.49 g MgSO₄*7H₂O、1 ml TE和50 µg卡那霉素。在这种情况下用5% NH₄OH调节pH。

将170 ml加有约3滴高压灭菌的消泡剂(Delamex)的缓冲液置于300 ml发酵罐中。发酵罐用25％丁烷和75％合成空气的气体混合物充气，其来自贮气瓶以5 bar的初始压力经具有0.2 µm孔径的烧结玻璃充气器，并以25 升/小时的流速。将发酵罐在水浴中调温到25℃并且通过磁力搅拌器以500 rpm搅拌2小时，随后以800 rpm。将废气经过含有150 ml水的洗瓶导出。

用10 ml重悬的沉淀接种发酵罐。两种培养物的OD约为10。反应通过加入1体积％的葡萄糖来开始。在实验的时间过程中选择性地可以调节或不调节pH。在10、45、135和240分钟后从发酵罐和洗瓶中分别取出10 ml样品。用2 ml HCl终止来自发酵罐的样品中的反应。将发酵罐样品在室温下以10 000 g离心10分钟，并将上清液经0.2 µm注射器式滤器单元过滤。将样品装载到HPLC管中用于分析。层析分析在Agilent Technologies 1200装置上通过HPLC-RID进行。使用Aminex HPX-87H柱(300 mm x 7.8 mm)。使用10 mM H₂SO₄作为洗脱液以0.6 ml/min的流速和40℃的柱温操作装置。待分析的所有物质的标准品在超纯水中制备，并在相同条件下测量。通过比较保留时间进行评价。此外，在每次取样时间点从发酵罐中取出2 ml样品用于测定pH、OD和葡萄糖浓度。pH通过外部pH计测量，OD在600 nm处用分光光度计测量，并且葡萄糖含量用生物化学分析仪（来自Kreienbaum的YSI Select 2700）测定。

结果

结果显示于图1 a) – d)中。在用大肠杆菌BL21 pCOM10（空质粒）的实验中，没有发生丁烷或1-丁醇的氧化。相反，大肠杆菌BL21pBT10的更多应用被发现为正丁烷的氧化产物：1-丁醇、丁酸、2-丁醇、丁醛、1,4-丁二醇（不可定量的）和丁内酯（痕量的）。

所有氧化产物的浓度随总体实验时期而增加。消耗了约1 g/lh的葡萄糖，pH从7降低至约5。

实施例2：搅拌速度（物质运输限制）对通过大肠杆菌用恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶(AlkBGT)的正丁烷的氧化的影响

实验与实施例1类似地进行。将搅拌速度在第二批中从开始设定为恒定的900rpm。相比于实施例1，OD为两倍。TE浓度为15倍。最终取样在200分钟后。

结果

在恒定的更高搅拌速度下，1-丁醇在发酵罐（F）中更迅速地形成，并且更快地达到最大值。在洗瓶（WF）中的1-丁醇的浓度处于大概同样低的水平。发酵罐（F）中2-丁醇的浓度在整个实验时间过程中在任意搅拌速度下增加，但保持是低的。直至实验时间结束，2-丁醇在洗瓶中才可检测到。丁醛浓度随更高的搅拌速度更迅速地增加，但由于蒸气压为113 hPa(20℃)，也更迅速地排出。丁醛仅仅是可以定性地而非可定量地检测到。

在更低的搅拌速度下，直至实验时期结束时，正丁酸才形成。在高的搅拌速度下，浓度持续增加。在洗瓶中不能检测到正丁酸。

实施例3：生物量浓度对通过大肠杆菌用恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶(AlkBGT)的正丁烷的氧化的影响

实验与实施例1类似地进行。搅拌速度为恒定900 rpm，TE浓度分别为15倍。1x表示约10的OD，2x对应于20。

结果

结果显示于图2 a)和b)中。最大浓度在两倍OD时在更早的实验时刻达到。1-丁醇也更迅速地转化。

丁酸仅可以在发酵罐（F）中检测到，而非在洗瓶中。在两倍OD时，丁酸的形成已经在转化开始时开始了。在一倍OD时，丁酸在这些条件下直至240分钟后才能被检测到。在两倍OD时，浓度大约是最大浓度的18％。

实施例4：TE浓度对通过大肠杆菌用恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶(AlkBGT)的正丁烷的氧化的影响

实验与实施例1类似地进行。搅拌速度恒定为900 rpm。所用的菌株为大肠杆菌W3110 pBT10。TE浓度为1 ml/l的缓冲液(1x)或15 ml/l的缓冲液(15x)。在用15倍浓度的实验中，加入额外的30 mg/l MOPS。

结果

结果显示于图3 a) – d)。在15倍TE浓度下，所有氧化产物更迅速地且以更高浓度形成。

实施例5：具有恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶(AlkBGT)的菌株大肠杆菌BL21和大肠杆菌W3110的比较

实验与实施例1类似地用固定搅拌速度900 rpm进行。TE浓度为15 ml/l的转化缓冲液。

结果

结果显示于图4 a) – d)。大肠杆菌W3110 pBT10菌株比大肠杆菌BL21 pBT10菌株更迅速地且以更高浓度形成所有氧化产物。

实施例6：通过具有恶臭假单胞菌GPO1的单加氧酶（AlkBGT）的大肠杆菌氧化异丁烷

工作流程与实施例1类似地进行。仅使用大肠杆菌W3110 pBT10菌株。转化缓冲液由70 mM Na⁺/K⁺ 磷酸盐缓冲液组成，其用5% NH₄OH调节为pH7，每升含有6.79 g Na₂PO₄、3 gKH₂PO₄、0.5 g NaCl、0.49 g MgSO₄*7H₂O、15 ml TE和50 µg卡那霉素。

充气如实施例1中进行，仅用25％异丁烷和75％合成空气的混合物。

结果

结果显示于图5 a) – c)中。发现的异丁烷的氧化产物为异丁醇、异丁酸、叔丁醇和异丁醛。

实施例7：用具有Alcanivorax borkumensis的AlkBG单加氧酶系统的大肠杆菌氧化丁烷

用于氧化的菌株包含具有来自Alcanivorax borkumensis SK2 (数据库代码CAL18155.1和CAL18156.1)的AlkBG单加氧酶的遗传信息的质粒。AlkST、AlkL以及AlkS和AlkB启动子的遗传信息来源于恶臭假单胞菌GPo1。

靶载体的克隆

对于倍增，根据制造商说明书使用来自New England Biolabs (NEB, M0531S)的2x Phusion HF Master Mix。根据纯度的程度，载体和PCR产物直接在柱(QiaQuick PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden)上纯化，或在琼脂糖凝胶上纯化并提取(QiaQuick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden)。PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙啶染色和PCR片段大小的确定均以本领域技术人员已知的方式进行。在两种情况下还可以提供期望大小的PCR片段。对于PCR，使用具有所述序列SEQ ID NO1、2、3和4的引物。

在凝胶纯化后，将纯化的PCR产物使用In-Fusion HD Cloning Kit按照制造商说明书(Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA)通过重组克隆入EcoRI-HF + AclI切割的载体pBT10_AlkL中。以本领域技术人员已知的方式转化化学感受态大肠杆菌DH10β(New England Biolabs, Frankfurt)。通过限制性分析检验目标序列的正确插入，并通过DNA测序确定引入序列的可靠性。所获的载体称为p-LL-30 (图7)。载体序列示于SEQ ID NO 5下的序列方案中。

供体生物和提供的基因：

·恶臭假单胞菌GPo1

检索号 AJ245436

AlkB 基因

完整的膜无血红素铁单加氧酶

蛋白_id="CAB54050.1

AlkF 基因

红素氧还蛋白1

蛋白_id="CAB54051.1

AlkG 基因

红素氧还蛋白2

蛋白_id="CAB54052.1

AlkH 基因

醛脱氢酶

检索号 AJ245436

AlkT 基因

红素氧还蛋白还原酶

蛋白_id="CAB54063.1

AlkL 基因

外膜蛋白

蛋白_id="CAB54056.1

AlkS 基因

表达调节子

蛋白_id="CAB54064.1"

·Alcanivorax borkumensis 1

AlkB_Ab 基因

烷烃1-单加氧酶

CAL18155.1

AlkG_Ab 基因

红素氧还蛋白

CAL18156.1

将靶载体以本领域技术人员已知的方式克隆入大肠杆菌W3110中。所获的菌株称为大肠杆菌W3110 AN-S-LL-16。

细胞培养和生物转化

将100µl的大肠杆菌W3110 EN-S-LL-16的甘油冷冻培养物铺在含有50 µl卡那霉素的LB琼脂板上，并在37℃下孵育24小时。LB平板由酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 0.5g、琼脂琼脂15 g和卡那霉素50 µg的1升溶液制备。

从这些平板，用来自平板的单一菌落接种在100 ml具有挡板的摇瓶中含50 µl卡那霉素的3 x 25 ml的LB培养基（不具有琼脂琼脂的上述溶液）。将培养物在37℃和200rpm(振幅2.5 cm)下孵育24小时。

将每一25 ml的培养基随后用作在175 ml未改良的M9培养基中的接种物，所述培养基每升有以下组成：在1000 ml摇瓶中15 g葡萄糖、6.79 g Na₂PO₄、3 g KH₂PO₄、0.5 gNaCl、2 g NH₄Cl、15 g酵母提取物、0.49 g MgSO₄*7H₂O、1 ml TE和50 μg卡那霉素。微量元素溶液(TE)每升如下构成：36.5 g HCl 37 %、1.91 g MnCl₂*4H₂O、1.87 g ZnSO₄*7H₂O、0.84 g Na-EDTA*2H₂O、0.3 g H₃BO₃、0.25 g Na₂MoO₄*2H₂O、4.7 g CaCl₂*2H₂O、17.3 gFeSO₄*7H₂O和0.15 g CuCl₂*2H₂O。用5% NH₄OH将pH调节为7.4。此外，每瓶加入3滴高压灭菌的消泡剂(Delamex)。

将瓶在37℃和180rpm (振幅2.5 cm)下孵育2小时。随后将温度降低到25℃。在25℃下0.5小时后，用0.4 mM DCPK进行诱导。将培养物在25℃和180 rpm下再振荡16小时。

将培养物组合，加入到50 ml Falcon管中并在25℃下以10 000 g离心10分钟。丢弃上清液。将来自600 ml的培养物的沉淀重悬于30 ml的转化缓冲液中。转化缓冲液由70mM磷酸铵缓冲液（pH 7）组成，其每升含有8 g (NH₄)H₂PO₄、0.5 g NaCl、0.49 g MgSO₄*7H₂O、1 ml TE和50 µg卡那霉素。用25％的氨溶液调节pH。

将150 ml加有约3滴高压灭菌的消泡剂(Delamex)的缓冲液置于300 ml发酵罐中。发酵罐用25％丁烷和75％合成空气的气体混合物充气，其经具有0.2 µm孔径的烧结玻璃充气器并以6.5 l_N/小时的流速。将发酵罐在水浴中调温到30℃并且通过磁力搅拌器以900rpm搅拌。将废气经过含有150 ml水的洗瓶导出。

用重悬的预培养物沉淀接种发酵罐。OD600约为15。用5%氨溶液将pH调节为7.0。葡萄糖补料速率为1 g/lh。在不同时间点从发酵罐和洗瓶中分别取出5 ml样品。将发酵罐样品在室温下以10 000 g离心10分钟，并将上清液经0.2 µm注射器式滤器单元过滤。将样品装载到HPLC管中用于分析。层析分析在Agilent Technologies 1200装置上通过HPLC-RID进行。使用Aminex HPX-87H柱(300 mm x 7.8mm)。使用10 mM H₂SO₄作为洗脱液以0.6 ml/min的流速和40℃的柱温操作装置。待分析的所有物质的标准品在超纯水中制备，并在相同条件下测量。通过比较保留时间进行评价。此外，在每次取样时间点从发酵罐中取出2 ml样品用于测定pH、OD和葡萄糖浓度。pH通过外部pH计测量，OD在600 nm处用分光光度计测量，并且葡萄糖含量用生物化学分析仪（来自Kreienbaum的YSI Select 2700）测定。结果概述于图7中。

序列表

<110> Evonik Industries AG

<120> 生物烷烃氧化

<130> 201100451

<160> 5

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 1

aaaaattgga gaattatgtc agagaacatt ttaaccgag 39

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

ctaatcttca tggaggacat agtc 24

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 3

ctccatgaag attagtcgac ctgtaacgac aacaaaacg 39

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 4

cgttgcttcg caacgttaga aaacatatga cgcaccaag 39

<210> 5

<211> 11353

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 载体

<400> 5

gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa 60

ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta tttttctaaa 120

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatgca 180

gcctgaaagg caggccgggc cgtggtggcc acggcctcta ggccagatcc agcggcatct 240

gggttagtcg agcgcgggcc gcttcccatg tctcaccagg gcgagcctgt ttcgcgatct 300

cagcatctga aatcttcccg gccttgcgct tcgctggggc cttacccacc gccttggcgg 360

gcttcttcgg tccaaaactg aacaacagat gtgtgacctt gcgcccggtc tttcgctgcg 420

cccactccac ctgtagcggg ctgtgctcgt tgatctgcgt cacggctgga tcaagcactc 480

gcaacttgaa gtccttgatc gagggatacc ggccttccag ttgaaaccac tttcgcagct 540

ggtcaatttc tatttcgcgc tggccgatgc tgtcccattg catgagcagc tcgtaaagcc 600

tgatcgcgtg ggtgctgtcc atcttggcca cgtcagccaa ggcgtatttg gtgaactgtt 660

tggtgagttc cgtcaggtac ggcagcatgt ctttggtgaa cctgagttct acacggccct 720

caccctcccg gtagatgatt gtttgcaccc agccggtaat catcacactc ggtcttttcc 780

ccttgccatt gggctcttgg gttaaccgga cttcccgccg tttcaggcgc agggccgctt 840

ctttgagctg gttgtaggaa gattcgatag ggacacccgc catcgtcgct atgtcctccg 900

ccgtcactga atacatcact tcatcggtga caggctcgct cctcttcacc tggctaatac 960

aggccagaac gatccgctgt tcctgaacac tgaggcgata cgcggcctcg accagggcat 1020

tgcttttgta aaccattggg ggtgaggcca cgttcgacat tccttgtgta taaggggaca 1080

ctgtatctgc gtcccacaat acaacaaatc cgtcccttta caacaacaaa tccgtccctt 1140

cttaacaaca aatccgtccc ttaatggcaa caaatccgtc cctttttaaa ctctacaggc 1200

cacggattac gtggcctgta gacgtcctaa aaggtttaaa agggaaaagg aagaaaaggg 1260

tggaaacgca aaaaacgcac cactacgtgg ccccgttggg gccgcatttg tgcccctgaa 1320

ggggcggggg aggcgtctgg gcaatccccg ttttaccagt cccctatcgc cgcctgagag 1380

ggcgcaggaa gcgagtaatc agggtatcga ggcggattca cccttggcgt ccaaccagcg 1440

gcaccagcgg cgcctgagag gcgaattgac ataagcctgt tcggttcgta aactgtaatg 1500

caagtagcgt atgcgctcac gcaactggtc cagaaccttg accgaacgca gcggtggtaa 1560

cggcgcagtg gcggttttca tggcttgtta tgactgtttt tttgtacagt ctatgcctcg 1620

ggcatccaat cgatgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga 1680

tctgatggcg caggggatca agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 1740

ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 1800

atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 1860

aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg 1920

acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 1980

acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 2040

tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 2100

ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 2160

agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 2220

atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg 2280

aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 2340

gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 2400

cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 2460

tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 2520

agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caatcgattg gtaactgtca 2580

gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 2640

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 2700

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 2760

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 2820

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 2880

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 2940

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 3000

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3060

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgatctacac cgaactgaga 3120

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3180

tatccggtaa gcggcagagt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3240

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 3300

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 3360

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 3420

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 3480

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt 3540

acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata ggggatctcc aatcgtgcct tggcgcagcg 3600

acagccctcg gtcccccaga tagccattga tcttctctcg cctgtcccct cagttcagta 3660

atttcctgca tttgcctgtt tccagtcggt agatattcca caaaacagca gggaagcagc 3720

gcttttccgc tgcataaccc tgcttcgggg tcattatagc gattttttcg gtatatccat 3780

cctttttcgc acgatataca ggattttgcc aaagggttcg tgtagacttt ccttggtgta 3840

tccaacggcg tcagccgggc aggataggtg aagtaggccc acccgcgagc gggtgttcct 3900

tcttcactgt cccttattcg cacctggcgg tgctcaacgg gaatcctgct ctgcgaggct 3960

ggccggctac cgccggcgta acagatgagg gcaagcggat ggctgatgaa accaagccaa 4020

ccaggaaggg cagcccacct atcaaggtgt actgccttcc agacgaacga agagcgattg 4080

aggaaaaggc ggcggcggcc ggcatgagcc tgtcggccta cctgctggcc gtcggccagg 4140

gctacaaaat cacgggcgtc gtggactatg agctcgagaa cgcttaccgc caacacagca 4200

gtgtatttga ataagagctc gaacatgatc ggatctccca tttcagcaag ggaaatccca 4260

ccatagccac caccgattta tgtggcgtag aaaacggtca tcaccaaata tggcaatact 4320

tccccgccca agcgccacat aacagcctgg gccacatttt acgcggtagt tccgcacgta 4380

cggagtgcgg ggggcggcag gtaactgccg tccctatcgc gaccgttggt tcgagtggct 4440

gagcatcatt gctaatcagg taattttata ctccctgcaa gcgcaccttg acgtttaggc 4500

aaatttattg tctcagttgc aatcagtcgc tcctgcttgt acgcaaggac ttctagttca 4560

agagtttcgt tattaattgc aacaacgagt ttatcgtagt cctttagagc accaagtcct 4620

tgcagcgcca tccctttaag atcagaccag aaccgtggtg gggttggtgc tggtgttgat 4680

gtgccacaga tgctacttgc gacaatttga gcgtgtgtaa ccgcattatg aattgtctct 4740

aaacgtacca tcgttcccca aaaaggattt ctagccattg cgcagtcgcc gattgcatat 4800

atacttgtat ccgatgtaca catctgatca tcgaccacaa caccattact cacttcaagg 4860

gccgcctcag ttgccagctc tagctctggg atagcaccga ttccaactac aatcagatcc 4920

gcctgaattt cttctccact ttcaagtacg cattgttcaa catggccatt cctgcccttt 4980

atagacgtta atttcgcatt cagcttgaac tcaattcctt cagcctccag gcgggctctg 5040

actaagtttg ctgctgccgg cgtaaccacg cgcgccatta cacgcggggc ggcttctatc 5100

actgtgaccc tcttccctaa gcccaccgca gctgaggcga cttcaagccc gattactccg 5160

ccgcccaaca caacaacaga cgcactctcc acaagtttcc tacgtaaatt tttggcgtct 5220

tccatactgc gtaaatagca gaccccagac agttcagacc cctcgcaggt taacctacgt 5280

gcgctagcac ctgttgcaag aatcaatttt tcatacgcgt attcttttcc atctttagaa 5340

gaaactatct tacgccccac gtcgattgat acaatcggtg tatttaacga aatggtaata 5400

ttgttattcg tataaaaacc ttctggcttt aatggcactg cggattctgc aatctcactt 5460

gtcagaaaag ccttggatag aggaggccgc tgataaggcg ccacagactc cctgctaaaa 5520

atcctaattt cccctttata accatattga cgaagccaga acgcagcatt tactccagct 5580

gtaccagcgc caacaacaac gattgccata attctctctc cggtatactt ttcactatat 5640

cacttaatgc cgattatttt agataattcc ttgacgctca gcttcaattg ttgcttgcgt 5700

gcgattcact acattcaagg tggcaaatat tttcctcata tgccacttta tagcatcttc 5760

ggtgacatgc atatttgttg ctatttgttt gtttgagcac ccctctttta caagcctcaa 5820

gacagcaatc tgcttccgtg tcaataaagc gtcagcttta ttctctgcgg actttccaat 5880

ctcaactatt cgcggaagac taaaagcccc aatcgcttga tctaaattaa ctgctgtgaa 5940

ggcttcacat gaagccggta ttattcgctc aattaaacat acttcatcaa gaactgtttg 6000

aaagcattga agctgttttg ctatctccac tgcataaaca atgttaagct gagccttttt 6060

taaatcaccg gcacctgcct gcgctccggc caaacacaat aatccacgga cttccagctg 6120

gcccgcgtta attttacggg cttgctgaat agccaataac gctctgtgcg cggcactatg 6180

aaagttccga tctcgggaaa gcactagtga ttgaacaagc agcaggcgtg cttttagggg 6240

ggctgagtgc tgtccggaga aaatcttatg atcttcaaga gtttttaaat tatttatgcc 6300

cgttatgcct tgacagacta agcgctgata gatctcaatt tggctcataa cttccaatct 6360

tggtagattt ttttcaaccg catgcgcctt cgcccactcc aatatctcaa tggagccatt 6420

taggtcactc cttccaagcc gccaagctga cacagcacgg catacggaaa aaaacacgtc 6480

tgtcaccccg tgattggaaa tgaactctaa aattttggag agcttttctt ctgaggtgtc 6540

caagcagcgc aattcataat gtaactcaag ctctagagcg tcaaacattt tcgaagtaaa 6600

ctcggattcc atcatctgcg cgcgactgtc tgtgcgtgct tgagttataa tctgcctcgc 6660

ccagcccatt tttccgcttg ctagggcttg ttgaaacctc gcgacataca gccaaccaaa 6720

agcaaaattt tgttttgcaa atttattcac ggcttgggcc tgagccagca ccttctccaa 6780

ctctgcaaat ctatactcac tggcaaaaat aaaagccaaa caggttagcg cggccccttt 6840

tccaactgcg tttgaatccc caaataaact aatccactta ttacagagct cctcactcga 6900

aagcatttca tctttcgttg ctttacctat tgcaagcaca agctgcagcc attccttttc 6960

ttgccattta ttttttttat cggattgtga agataggtct ttaattaact tctctgctcg 7020

cgcgccttgc tgactgaaat acaataccca cgcgtaacta ataagcacta tgggtttttt 7080

gtgccaggcc tgcttcggca gctctaacag ccactgtctc agcgcatcta tttcgccctg 7140

acgaaatgac aaatctaaaa ttattctctc agacatgctg actgcccagc gacagtcatt 7200

cgcccgtagg gatattcgta ttgcatactg gtattcacct ctacgccaat gccagaaagc 7260

tgcacgctta agcaggtagg atcttttagc aggattttca gtccaagtaa tttctcgtag 7320

aaaattacgc agtactggat gcagtgtaaa ctgcgctggc tcaccgctca catggcgaag 7380

caacatgtaa ttagtgctta aatacttaat acatgagacc ccattgacgc atttgaatac 7440

ataattgtat tgatcaggcg tcacgaaatc gagcaatgaa gaatttgcaa gaaaaacacg 7500

atagcgctcg ggaatcgcct caaatatttc atccctaaag taattgtcta cttcaactac 7560

tgctgaaata tgcttggccg gcaactcacg ctttaacaaa aaaactacaa gagcaggcca 7620

cccctcaact tcttgcacca aggtctctat ctgttcttca ggaactccaa gaacagactc 7680

tgcctccgct aacgccaccg cctcttctgc gctaaaggcc aagtctttct cggtgtactc 7740

ccgcatagcg cctgcaagtt taagctgcga gaaccctttt attgtattgc ctgcaactgc 7800

aaacctgata ttttttggtg tatttaacat aaactccata agtgcgtgca acaacggcaa 7860

gtctaagtca tgattaatat tatccaaaca aactagcgtt tctatctcgt tattcgaggt 7920

gctctgccaa agactagatg caaggtctcg caagagcgca ggcttgctca caccctctct 7980

cacacggctg aattttacca tttcgaaagt ttcaagctgc tcaataatct ctgcgcagat 8040

atcaaattca ctgtaagaac tggctcttaa agaaagccac actgcaggac gtccggctgt 8100

tctgtggcgt agccactcga acgcaagagc aacggttttc ccatatccag gtggggctct 8160

gtaaaggcat actctgggag cggctccatc cgcgatactc aatcttggcc gatatatgca 8220

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gaaatcatta tttattatta ttttcattat gctattctcg cgccagctga ctggaaattt 8340

tcaccatagg ttacggtgtt aaatattaaa actacactta agtgtagtcg gcatgatcgg 8400

tggtgcaaaa tatttactag ggaaggtctg aagtaggccg ctatttctgg ccgacttcgg 8460

ccttcgccga ttttgaagac gggcaccggg tcaaaatcga ccagatagct cgctcatttc 8520

ggtgctttca gccgtcgcga gtagctcgcg gtacctggca tgcttgcggc cagctcgtgt 8580

ttttccagca gacgacggag caaaaactac ccgtaggtgt agttggcgca agcgtccgat 8640

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aaaattacgt cttaaatctc gtagcgacta atttaataaa aattggagaa ttatgtcaga 8760

gaacatttta accgagcccc cacgaagtga tgctgataat gagggttatg tggaccgaaa 8820

gcgccacttg tggattcttt ctgtactgtg gccagcaaca ccaataattg gcctatatct 8880

cgtatcccaa acagggtgga gtatatggta cggattagta ttaatcctat ggtacggcct 8940

agtccctttg atcgacacca tgcttggcga ggattattcc aaccctcctg aatccgttgt 9000

tcctaagctt gaacaagacc gttactacaa agttttaacg tacttaaccg ttcctattca 9060

ttatgcagcg ttgattataa gtgcctggtg ggtatctacc caaccaatag gggtattcga 9120

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tgaactcggg cataaaaaag aaacctttga ccgctggatg gccaagcttg tactggccgt 9240

ggtcggatat ggtcacttct tcattgaaca caataaaggg catcatcgtg acgtagcaac 9300

accgatggac ccggctacat cccgcatggg cgaatctatt tatacgtttt cactgcgtga 9360

aattcctggt gcctttaaac gggcatgggg cttggaagag cagcgcctca gccgttgcgg 9420

caaaagcgta tggagcctag ataatgaagt cttacagcct atgattttga cggtagtgct 9480

ttatgccgca ttgctggcat ttttcggtcc tttaatgctc atctttttgc ccattcaaat 9540

ggccttcggc tggtggcagc tgaccagtgc caattatatt gagcactacg gactgctgcg 9600

tgaaaagctg ccgaacgggc gttacgagca tcaaaaaccc catcattcat ggaattcaaa 9660

ccatgtaatg tcgaacctca tcctgtttca tctgcaacgt cattcagatc accatgcgca 9720

tcctacaaga tcttatcaat cacttaggga cttcagcgac cttcccaccc tgcctacggg 9780

ctaccctggg atgttcttcg tcgcattctt tccctcctgg tttcgttcac taatggatga 9840

tcgggtgatg gagtgggcgc acggagacat taataagatc cagattcagc cgggaatgcg 9900

tgaattctat gagcaaaaat ttggagtaaa gggttcggag tcacccgata caaccgttgc 9960

caaataatcg ccaacagaaa tccatctatt aaagctcgtg ctttcacact ttgaggaaca 10020

gcgcccggcg tgtacgtcgg gcgccattaa ctaaagacaa taatattggt tcaaaggtgc 10080

tttaaatggc taaatatcaa tgccccgatt gcgaatatat atacgatgaa gtcgctggcc 10140

acccacacga aggcttcccc ccaggaacgt cttgggaaac gattcctgaa gagtgggcct 10200

gcccagactg tgcagtaagg gataaagctg acttcgtagt aatagaatcc ggttccgcgt 10260

ccccggcgtc tggcgcggcc accccagaag tgcgcactgc taccacccca cctaaggcag 10320

aggcttcacc tcaaaaatca acgggggcct cgactccttc agctaacaat aaagccaaag 10380

caaaggctaa agccaaaccc gcacgggcaa aatcgtctaa agactccacc ggcaaagaga 10440

ccacctttcg taaatggatc tgtatcactt gcggtcacat ttatgatgaa gctcttggcg 10500

atgaaactga agggttcgcg ccaggcactc tttttgaaga tatcccggac gattggtgct 10560

gtcccgactg tggtgccaca aaagaggact atgtcctcca tgaagattag tcgacctgta 10620

acgacaacaa aacgagggta gcacaatgag tttttctaat tataaagtaa tcgcgatgcc 10680

ggtgttggtt gctaattttg ttttgggggc ggccactgca tgggcgaatg aaaattatcc 10740

ggcgaaatct gctggctata atcagggtga ctgggtcgct agcttcaatt tttctaaggt 10800

ctatgtgggt gaggagcttg gcgatctaaa tgttggaggg ggggctttgc caaatgctga 10860

tgtaagtatt ggtaatgata caacacttac gtttgatatc gcctattttg ttagctcaaa 10920

tatagcggtg gatttttttg ttggggtgcc agctagggct aaatttcaag gtgagaaatc 10980

aatctcctcg ctgggaagag tcagtgaagt tgattacggc cctgcaattc tttcgcttca 11040

atatcattac gatagctttg agcgacttta tccatatgtt ggggttggtg ttggtcgggt 11100

gctatttttt gataaaaccg acggtgcttt gagttcgttt gatattaagg ataaatgggc 11160

gcctgctttt caggttggcc ttagatatga ccttggtaac tcatggatgc taaattcaga 11220

tgtgcgttat attcctttca aaacggacgt cacaggtact cttggcccgg ttcctgtttc 11280

tactaaaatt gaggttgatc ctttcattct cagtcttggt gcgtcatatg ttttctaacg 11340

ttgcgaagca acg 11353

Claims

1.AlkB型氧化还原酶在氧存在的情况下用于制备烷烃的氧化产物的混合物的用途，其中所述氧化产物中羧酸与醇的比例大于1:1，其中所述烷烃是1-4个碳原子的烷烃，其中所述AlkB型氧化还原酶是来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkB。

2.权利要求1的用途，其中所述烷烃是丁烷。

3.权利要求1或2的用途，其中所述烷烃是支化的烷烃。

4.权利要求3的用途，其中所述支化的烷烃的碳原子数为4。

5.权利要求3的用途，其中所述支化的烷烃为异丁烷。

6.权利要求1或2的用途，其中所述AlkB型氧化还原酶以全细胞催化剂的形式提供。

7.权利要求1或2的用途，其中所述AlkB型氧化还原酶以纯化的多肽的形式提供。

8.权利要求1或2的用途，其中所述氧化产物中羧酸与醇的比例大于5:1。

9.权利要求1或2的用途，其中所述氧化产物中羧酸与醇的比例大于12:1。

10.权利要求1或2的用途，其中所述氧化产物中羧酸与醇的比例大于20:1。

11.权利要求1或2的用途，其中所述氧化产物中羧酸与醇的比例大于40:1。