CN109897872A - 酶法制备(2s,3s)-n-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明通过基因工程技术分别构建了表达羰基还原酶SEQ ID NO:1、葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3和醇脱氢酶SEQ ID NO:5的大肠杆菌,表达该羰基还原酶的大肠杆菌和表达该葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌的组合、或者表达该羰基还原酶的大肠杆菌和表达该醇脱氢酶的大肠杆菌的组合能够对底物(S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑氨基‑1‑氯‑2‑酮‑4‑苯基丁烷进行联合催化,得到高光学纯度的(2S,3S)‑N‑叔丁氧羰基‑3‑氨基‑1‑氯‑2‑羟基‑4‑苯基丁烷,适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域,具体地说,涉及通过羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的联合催化、或者羰基还原酶与醇脱氢酶的联合催化来制备(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷的方法。
背景技术
HIV-1蛋白酶抑制剂是治疗AIDS的首先药物,FDA批准的几乎所有该类药物(除了替拉那韦(Tipranavir))都是拟肽类蛋白酶抑制剂,比如沙奎那韦(Saquinavir)、奈非那韦(Nelfinavir)、安普那韦(Amprenavir)、福沙那韦(Fosamprenavir)、地瑞那韦(Darunavir)。HIV-1蛋白酶是由HIV基因编码的天冬氨酸蛋白酶,通过水解多聚蛋白而得到成熟和有活性的酶以及结构蛋白,在HIV病毒复制过程中起到关键作用。蛋白酶抑制剂模拟多聚蛋白裂解部位构型,与多聚蛋白体竞争性结合蛋白酶,从而抑制HIV-1蛋白酶的活性,达到抑制HIV病毒复制的目的。这些拟肽类蛋白酶抑制剂的核心结构都是环氧化氨基苯丁烷,在其诸多合成路线中,由式I所示化合物(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷立体选择性还原为式II所示化合物(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷是关键的一步。
然而,化学法还原需要使用昂贵的手性催化剂,反应条件苛刻,并且反应步骤多,收率低,还存在产物的光学纯度低等缺点,近些年来,生物酶法催化还原逐渐成为有吸引力的方法并有一些文献报道。比如文献Emmanuelle,A.Highly stereoselectivebiocatalytic reduction of alpha-halo ketones.Tetrahedron:Asymmetry(2009)报道了采用CRED C1A来还原(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷,得到(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷,de可达到100%,但转化率最高只有58.3%。因此,开发催化性能更好的羰基还原酶和转化工艺,以获得更高的底物投料浓度、更高的转化率具有很必要。
发明内容
为了克服现有技术的不足,得到酶活性更高的催化体系,发明人对羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和醇脱氢酶进行了大量的筛选和构建,发现这些酶中一些特定氨基酸序列的酶之间的组合可以获得更高的底物化合物I投料浓度和更高的转化率。基于该发现,发明人还对于酶促转化条件进行了优化,从而创造出最优联合催化体系。
因此,本发明的第一个目的在于提供一种制备(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷的方法,包括如下步骤:
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的羰基还原酶或者其表达微生物、和氨基酸序列为SEQ ID NO:3的葡萄糖脱氢酶或者其表达微生物进行联合催化而得;或者
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的羰基还原酶或者其表达微生物、和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的醇脱氢酶或者其表达微生物进行联合催化而得。其中,
羰基还原酶SEQ ID NO:1为:
MTQDFSGKSAIVTGGASGIGAAIVRDLAARGARVVVADYNLEGAEKLAAEAGNGAVGFKVDTSDAAQVKAMVDFAVKQFGRLDLAVNNAGIAGSDKPVGEIDLDDWHRVIGVNLHGVFYGMRYQIPAMLETGGGAIVNMASILGSVGWRGAAAYVTAKHGVCGMTKSAALEYSAKGIRVNAVGPGFIETPLIENAMTDEARAALVGLHPIGRLGRPEEVAALTNFLLSDAASFVTGAYYPVDGAYLAQ;
葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3为:
MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTRTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG;
醇脱氢酶SEQ ID NO:5为:
MKAVQYTEIGSEPVVVDIPTPTPGPGEILLKVTAAGLCHSDIFVMDMPAAQYAYGLPLTLGHEGVGTVAELGEGVTGFGVGDAVAVYGPWGCGACHACARGRENYCTRAADLGITPPGLGSPGSMAEYMIVDSARHLVPIGDLDPVAAAPLTDAGLTPYHAISRVLPLLGPGSTAVVIGVGGLGHVGIQILRAVSAARVIAVDLDDDRLALAREVGADAAVKSGAGAADAIRELTGGQGATAVFDFVGAQSTIDTAQQVVAVDGHISVVGIHAGAHAKVGFFMIPFGASVVTPYWGTRSELMEVVALARAGRLDIHTETFTLDEGPAAYRRLREGSIRGRGVVVP。
上述酶可以呈游离酶或固定化酶的酶形式,也可以呈微生物菌体形式。
相应地,就催化体系而言,羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的组合、或者羰基还原酶与醇脱氢酶的组合可以是酶+酶的形式、酶+菌体的形式、或者菌体+菌体的形式。
上述微生物是任何可以表达羰基还原酶SEQ ID NO:1、葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3、或者醇脱氢酶SEQ ID NO:5的微生物,包括细菌和真菌,优选是大肠杆菌,最优选是大肠杆菌BL21(DE3)。
当采用菌体+菌体形式的催化体系时、尤其采用大肠杆菌作为酶的表达宿主时,上述化合物II的制备步骤即为:
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用表达羰基还原酶SEQ IDNO:1的大肠杆菌和表达葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的大肠杆菌进行联合催化而得;或者
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达醇脱氢酶SEQ ID NO:5的大肠杆菌进行联合催化而得。
优选地,羰基还原酶SEQ ID NO:1的编码基因是SEQ ID NO:2:
atgacacaggatttctcgggcaaatcggccatcgttaccggcggcgcatcgggcatcggggcggccatcgtgcgcgatctggcggcgcggggtgcgagagtggtcgtggcggattacaatctggagggggcggagaaactcgctgccgaagcgggcaacggcgcagtgggtttcaaggtcgatacgtctgacgcggcacaagtgaaggcaatggtcgatttcgcggtgaagcagttcggccggctcgatctggcagtgaacaatgccgggatcgcgggttcggacaagccggtgggcgagatcgatctggacgattggcaccgggtgatcggcgtgaacctgcacggggtgttctacggcatgcgctatcagataccggccatgctggagacgggcggaggcgcgatcgtcaatatggcctccattctcggctcggtcggctggcgcggggcggcggcctatgtcacggccaagcacggcgtttgcggcatgaccaaatcggcggcgctcgaatattcggcgaagggcatccgcgtgaatgcggtggggccgggcttcattgaaacgccgctgatcgagaatgccatgaccgacgaggcgcgcgccgccctggtcgggctgcatcccatcgggcggttgggccggccagaggaagtggccgcgttgaccaatttcctgctcagcgatgcggccagtttcgtgaccggcgcctattatccggtggacggcgcctatctggcccagtga(SEQ ID NO:2)。
葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的编码基因是SEQ ID NO:4:
atgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacaggagctgcttcagggctcggaaaggcgatggccattcgcttcggcaaggagcaggcaaaagtggttatcaactattatagtaataaacaagatccgaacgaggtaaaagaagaggtcatcaaggcgggcggtgaagctgttgtcgtccaaggagatgtcacgaaagaggaagatgtaaaaaatatcgtgcaaacggcaattaaggagttcggcacactcgatattatgattaataatgccggtcttgaaaatcctgtgccatctcacgaaatgccgctcaaggattgggataaagtcatcggcacgaacttaacgggtgcctttttaggaagccgtgaagcgattaaatatttcgtagaaaacgatatcaagggaaatgtcattaacatgtccagtgtgcacgaagtgattccttggccgttatttgtccactatgcggcaagtaaaggcgggataaagctgatgacacgaacattagcgttggaatacgcgccgaagggcattcgcgtcaataatattgggccaggtgcgatcaacacgccaatcaatgctgaaaaattcgctgaccctaaacagaaagctgatgtagaaagcatgattccaatgggatatatcggcgaaccggaggagatcgccgcagtagcagcctggcttgcttcgaaggaagccagctacgtcacaggcatcacgttattcgcggacggcggtatgacactatatccttcattccaggcaggccgcggttaa(SEQ ID NO:4)。
醇脱氢酶SEQ ID NO:5的编码基因是SEQ ID NO:6:
atgaaagcagtccagtacaccgaaattggtagtgaaccggttgttgttgacattccgacgccgacgccgggtccgggtgaaatcctgctgaaagtcaccgcggccggtctgtgtcatagcgacatttttgttatggatatgccggcagctcagtatgcatacggtctgccgctgacgctgggtcacgagggtgtgggtaccgttgccgaactgggcgaaggtgtgaccggcttcggtgttggcgatgctgttgcagtctatggtccgtggggttgcggtgcatgtcatgcatgcgcacgtggtcgcgaaaactactgcacgcgtgcagcagatctgggtatcaccccgccgggtctgggtagcccgggttctatggctgaatatatgattgtggactccgcgcgccatctggttccgatcggtgacctggatccggtggcagctgcgccgctgacggatgcaggtctgaccccgtaccacgcaattagtcgtgttctgccgctgctgggtccgggttccaccgcagtggttatcggtgtcggcggtctgggtcacgtgggcattcaaatcctgcgtgccgtgagtgccgcacgcgtcattgcagtggatctggatgacgatcgtctggctctggcgcgcgaagttggcgcagatgctgcggtcaaatcaggtgccggcgccgcagacgcaattcgtgaactgacgggcggtcagggtgccaccgcagtttttgacttcgtcggcgcgcaaagcacgatcgataccgctcagcaagtcgtggcggtggacggtcatatttctgttgtcggtatccatgctggcgcgcacgccaaggttggctttttcatgattccgtttggcgcctcagtggttacgccgtattggggcacccgctcggaactgatggaagtcgtggcactggctcgtgcaggtcgtctggatatccacaccgaaacgttcaccctggacgaaggcccggcggcgtatcgtcgtctgcgtgaaggtagcattcgtggtcgtggtgtcgtggttccgtaa(SEQ ID NO:6)。
优选地,基因SEQ ID NO:2、基因SEQ ID NO:4和基因SEQ ID NO:6的表达宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
在一种优选的实施方式中,当采用表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的大肠杆菌进行联合催化时,反应体系中加入有葡萄糖。
在一种优选的实施方式中,当采用表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达醇脱氢酶SEQ ID NO:5的大肠杆菌进行联合催化时,反应体系中加入有异丙醇。
优选地,当采用上述大肠杆菌进行联合催化时,反应体系中可以加入有NAD+。
本发明的方法用于生产化合物II时,相比现有技术,可以有效地克服化合物I转化率较低、底物化合物I的浓度较低等不足,有利于实现酶法生产化合物II的工业化。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。
在本文中,术语“式I所示化合物”、“化合物I”和“底物化合物I”表示相同的意义,都是指作为酶促反应底物的(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷。类似地,术语“式II所示化合物”和“化合物II”表示相同的意义,都是指作为酶促反应产物的(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷。
在本文中,术语“(联合)催化体系”是指羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的组合、或者羰基还原酶与醇脱氢酶的组合,包括但不限于酶表达菌株的组合。
本发明中使用的羰基还原酶SEQ ID NO:1、葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3、或者醇脱氢酶SEQ ID NO:5结构明确,因此本领域技术人员能够容易地获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
当作为生物催化剂用于生产化合物II时,本发明的羰基还原酶SEQ ID NO:1、葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3、或者醇脱氢酶SEQ ID NO:5可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶,包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等。而且这些酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
为表述方便起见,在本发明中有时将羰基还原酶SEQ ID NO:1简写为羰基还原酶RSB或者RSB;将葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3简写为葡萄糖脱氢酶GDH或者GDH;将醇脱氢酶SEQ ID NO:5简写为醇脱氢酶ADH-A或者ADH-A。
类似地,为表述方便起见,在实施例中有时将表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的菌体简称为RSB菌体;将表达葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的菌体简称为GDH菌体;将表达醇脱氢酶SEQ ID NO:5的菌体简称为ADH-A菌体。
当采用表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的大肠杆菌进行联合催化时,反应体系中可以加入有葡萄糖,作为葡萄糖脱氢酶的底物。反应时,葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化,同时将NAD+还原为NADH,而羰基还原酶和NADH将化合物I还原为化合物II。葡萄糖加入量取决于化合物I和两种菌体的加入量,可通过简单的实验予以确定。
当采用表达羰基还原酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达醇脱氢酶SEQ ID NO:5的大肠杆菌进行联合催化时,反应体系中可以加入有异丙醇,作为醇脱氢酶的底物。反应时,醇脱氢酶催化异丙醇氧化,同时将NAD+还原为NADH,而羰基还原酶和NADH将化合物I还原为化合物II。异丙醇加入量取决于化合物I和两种菌体的加入量,可通过简单的实验予以确定。
在上述大肠杆菌联合催化时,反应体系中还可以加入有NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,即辅酶I),用于辅助葡萄糖脱氢酶和/或醇脱氢酶的催化产生充足的NADH,从而促进羰基还原酶对化合物I的选择性还原反应。由于NAD+比较昂贵,其加入量是有限的,根据化合物I投料浓度和两种菌体的加入量进行调整,可通过简单的实验予以确定。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版),J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译,科学出版社,北京,2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
LB培养基:10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠,pH7.2,121℃高温高压灭菌20min。
TB培养基:24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油,pH 7.0-7.5,121℃高温高压灭菌20min。
反应底物及产物的HPLC测定条件:
流动相组分A:称取2.3g磷酸二氢氨溶于1L水中,用磷酸调pH=2.5
流动相组分B:乙腈
流动相:A:B=50:60(v/v)
进样量:5uL
流速:1.0mL/min
采集时间:15min
色谱柱:ZORBAX SB-C18反相柱
柱温:30°
检测波长:215nm
保留时间:(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷7.2min
(2R,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷8.69min
(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮基-4-苯基丁烷12.0min
de计算方法:(S-R)/(S+R)×100%
其中,S代表(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷
R代表(2R,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷。
实施例1羰基还原酶RSB表达菌种的构建
从NCBI登录号MKUB01000068中提供的全基因组鸟枪序列中的碱基24474至25220的747bp区获得编码Sphingomonadales bacterium 63-6来源的氧化还原酶的多核苷酸序列。全基因合成该基因序列,两端设计酶切位点NdeI和BamHI,亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点,获得重组质粒pET24a-RSB。将构建好的重组质粒pET24a-RSB用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),得到菌株BL21(DE3)/pET24a-RSB。
RSB基因序列为SEQ ID NO:2;RSB蛋白序列为SEQ ID NO:1。
实施例2葡萄糖脱氢酶GDH表达菌种的构建
将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168接种于LB液体培养基中,30℃、220rpm培养24小时。总DNA的提取参照基因组提取试剂盒说明书(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
根据已报道的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的葡萄糖脱氢酶GDH的基因序列(NCBI登录号:AL009126.3),设计引物如下:
正向GDH-F:5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAG-3’(BamHI),
反向GDH-R:5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(HindIII)。
PCR反应体系包括:GDH-F和GDH-R各50pmol,总DNA 100ng,1X KOD plus buffer,0.2mM dNTP,25mM MgSO4,KOD plus 2U,补水至总体系50μL。PCR扩增条件为:95℃5min,94℃45s,55℃45s,68℃1min,重复30个循环,68℃10min。PCR反应结束后,用琼脂糖凝胶电泳进行分析,检测到一条大约800bp的特异条带,为所需条带。使用小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物,用BamHI和HindIII于37℃双酶切3-6小时,过柱纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pET24a用T4DNA连接酶于16℃连接过夜,转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取转化子进行测序验证,获得重组质粒pET24a-GDH。
对GDH氨基酸序列的第170位和第252位两个位点做定点突变,将第170位的谷氨酸(E)突变为精氨酸(R),将第252位的谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L)。根据待突变的氨基酸及突变位点设计引物,采用MEGA WHOP方法(Arnold and Georgiou 2003)进行突变。设计引物如下:
正向GDHE170R-F:AAGCTGATGACACGAACATTAGCGTT,
反向GDHQ252L-R:AATGAAGGATATAGTGTCATACCGC。
用这对引物扩增出含有突变位点Q252L/E170R的序列。
PCR反应体系包括:GDHE170R-F和GDHQ252L-R各50pmol,质粒模板pET24a-GDH50ng,1X KOD plus buffer,0.2mM dNTP,25mM MgSO4,KOD plus 2U,补水至总体系50μL。PCR扩增条件为:95℃5min,94℃45s,55℃45s,68℃30s,重复30个循环,68℃10min。PCR反应结束后,用琼脂糖凝胶电泳进行分析,检测到一条大约250bp的特异条带,为所需条带。小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。将此PCR产物作为大引物,以pET24a-GDH为模板,采用高保真DNA聚合酶KOD plus做全质粒线性扩增,PCR反应体系包括:大引物片段50-100pmol,质粒模板pET24a-GDH 50ng,1X KOD plus buffer,0.2mM dNTP,25mM MgSO4,KOD plus 2U,补水至总体系50μL。PCR扩增条件为:95℃5min,94℃45s,55℃45s,68℃6min,重复25个循环,68℃10min。扩增完成后,在体系中加入DpnI于37℃消化去除质粒模板,然后将消化产物直接转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取克隆进行测序验证,测序正确的菌种命名为BL21(DE3)/pET24a-GDH。
GDH基因序列为SEQ ID NO:4;GDH蛋白序列为SEQ ID NO:3。
实施例3醇脱氢酶ADH-A表达菌种的构建
根据已报道的Rhodococcus Ruber来源醇脱氢酶ADH-A的蛋白序列(NCBI登录号:3JV7),进行适于大肠杆菌表达的密码子优化并全基因合成该基因序列,两端设计酶切位点NdeI和HindIII,亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点,获得重组质粒pET24a-ADH-A。
将构建好的重组质粒pET24a-ADH-A用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),得到BL21(DE3)/pET24a-ADH-A。
ADH-A基因序列为SEQ ID NO:6;ADH-A蛋白序列为SEQ ID NO:5。
实施例4用RSB和GDH联合催化法制备化合物II
将BL21(DE3)/pET24a-RSB菌种接种入装有4mL LB培养基的试管,37℃培养过夜,得种子培养液。将种子培养液接种于装有1L TB培养基的三角瓶,37℃振荡培养至OD600=3.0时,加入0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并降温至25℃继续培养过夜。3500转/分离心20分钟收集沉淀,得到RSB菌体。
使用BL21(DE3)/pET24a-GDH菌种,按照同样的方法得到GDH菌体。
向总体积3L的发酵罐中加入100g化合物I,100g一水葡萄糖,加入800mL自来水,400rpm搅拌10分钟,用氢氧化钠调到pH=7.0±0.2,加入1g RSB菌体,1g GDH菌体,0.01gNAD+(购自罗氏),加自来水定容到总反应体积为1L。维持温度为30℃,反应过程中用氢氧化钠溶液控制pH=7.0±0.2.反应18小时。向反应液中加入50倍的异丙醇,加热到40℃,充分搅拌,通过HPLC测定,用流动相稀释5倍进样。
根据HPLC结果计算,产物de=100%,化合物I的转化率为98.3%。
实施例5用RSB和ADH-A联合催化法制备化合物II
使用BL21(DE3)/pET24a-ADH-A菌种,采用和实施例4中相同的方法制备RSB菌体。并采用同样的方法制备ADH-A菌体。
向总体积3L的发酵罐中加入100g化合物I,100mL异丙醇,加入700mL自来水,400rpm搅拌10分钟,用氢氧化钠调到pH=8.0±0.2,加入2gRSB菌体,10gADH-A菌体,0.04gNAD+(购自罗氏),加自来水定容到总反应体积为1L。维持温度为30℃,反应18小时。向反应液中加入50倍的异丙醇,加热到40℃,充分搅拌,通过HPLC测定,用流动相稀释5倍进样。
根据HPLC结果计算,产物de=100%,化合物I的转化率为98.0%。
实验结果表明,本发明所构建的表达该羰基还原酶的大肠杆菌和表达该葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌的组合、或者表达该羰基还原酶的大肠杆菌和表达醇脱氢酶的大肠杆菌的组合能够对底物(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷进行联合催化,底物浓度高,达到100g/L;转化率高,达到98.0%以上;得到的(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷具有高光学纯度,de=100%,因而具有工业化前景。
Claims (10)
1.一种制备(2S,3S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷的方法,包括如下步骤:
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用氨基酸序列为SEQ IDNO:1的羰基还原酶或者其表达微生物、和氨基酸序列为SEQ ID NO:3的葡萄糖脱氢酶或者其表达微生物进行联合催化而得;或者
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用氨基酸序列为SEQ IDNO:1的羰基还原酶或者其表达微生物、和氨基酸序列为SEQ ID NO:5的醇脱氢酶或者其表达微生物进行联合催化而得。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物是大肠杆菌。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤为:
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用表达羰基还原酶SEQID NO:1的大肠杆菌和表达葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的大肠杆菌进行联合催化而得;或者
以(S)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-酮-4-苯基丁烷为底物,用表达羰基还原酶SEQID NO:1的大肠杆菌和表达醇脱氢酶SEQ ID NO:5的大肠杆菌进行联合催化而得。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,羰基还原酶SEQ ID NO:1的编码基因是SEQID NO:2。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:3的编码基因是SEQID NO:4。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,醇脱氢酶SEQ ID NO:5的编码基因是SEQ IDNO:6。
7.如权利要求4至5中任一项所述的方法,其特征在于,基因SEQ ID NO:2、基因SEQ IDNO:4和基因SEQ ID NO:6的表达宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。
8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶联合催化的反应体系中加入有葡萄糖。
9.如权利要求3所述的方法,其特征在于,羰基还原酶和醇脱氢酶联合催化的反应体系中加入有异丙醇。
10.如权利要求8或9所述的方法,其特征在于,反应体系中还加入有NAD+。
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