CN104651292A - 一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用。所述重组大肠杆菌是同时具有羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌,所述羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示。本发明提供的重组大肠杆菌能够应用于高活性和高选择性地催化COBE生成(S)-CHBE,其酶活高达33.1U/mg,达到文献报导最高水平;并且通过使用大孔吸附树脂原位移除底物、产物抑制,使最终产物(S)-CHBE的积累量可达3000mM,最终底物转化率高达100%,产物光学纯度e.e%最高可达99.4%,相比现有技术均有了显著的提高。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域,更具体地涉及一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
光学纯的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxyrate,(S)-CHBE)是一种重要的有机中间体,其最主要的用途是作为合成降胆固醇药物阿托伐他汀的前体化合物。其手性单一对映体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)同样可用于其他很多活性药物的合成,如羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂等。
潜手性物质4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate,COBE)具有易于合成且价格低廉的优点,以其为反应底物进行不对称还原反应获取(S)-CHBE是非常经济有效的制备途径。
目前,以COBE不对称还原制备手性CHBE的研究已经有很多的报道。主要制备方法分为化学催化不对称还原法和微生物法两种。其中化学催化不对称还原法所用催化剂包括了价格昂贵的铑、钌等金属,并且最终产率低,耗能高,污染大。相比之下,微生物催化法有着反应条件温和,反应迅速,副产物产生少,产物的处理简单等优势,因此越来越受到关注。然而,由于微生物细胞内存在的酶系复杂,往往催化产物的光学纯度不高,同时需要辅酶的加入提供反应还原力。
以重组的还原酶直接进行催化反应,需要按照化学剂量添加大量昂贵的辅酶(NADH、NADPH)。因此,为了获得高产量、高纯度的(S)-CHBE,需要克隆脱氢酶基因实现辅酶的高效原位再生,以提供一种高效率的辅酶再生循环体系。Yasohara等人从400株酵母菌中筛选得到一株Candida magnoliae菌株,在水/乙酸正丁酯体系中,以添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脱氢酶用于辅酶循环,最终产物(S)-CHBE在有机相的积累量可达550mM,产物的光学纯度对映体过量值(enantiomeric excess e.e)达到96%。然而,该最终产物积累量和产物e.e值在本领域仍然并不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用,从而解决现有技术中的化学法催化产物的产率低,耗能高,污染大,微生物法催化产物的产量低,光学纯度不高,并且需要额外添加辅酶的缺陷。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
提供一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌,所述重组大肠杆菌是同时具有羰基还原酶基因(Carbonyl reductase fromSynechocystis sp.PCC 6803,SrCR)和葡萄糖脱氢酶基因(Glucosedehydrogenase from Bacillus subtilis,GDH)的大肠杆菌。
其中,羰基还原酶SsCR基因含有723bp碱基,其在Genbank中的收录号为CP003265(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/451779298?from=1437173&to=1437895&sat=4&sat_key=105780430&report=fasta),其基因序列如SEQ ID NO:1所示。由该基因编码的羰基还原酶,包含240个氨基酸,其在Genbank中的收录号为NP_441203(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/16330475?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=8AV63XPF01R),其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
葡萄糖脱氢酶GDH基因含有783bp碱基,其在Genbank中的收录号为M12276(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/142954?from=71&to=853&sat=4&sat_key=42714303&report=fasta),其基因序列如SEQ ID NO:3所示。由该基因编码的羰基还原酶,包含260个氨基酸,其在Genbank中的收录号为AAA22463(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/142955?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=8CKY4132015),其基因序列如SEQ ID NO:4所示。
所述重组大肠杆菌能够同时表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶。
本发明首先分别从pET-28a-SrCR和pET-28a-GDH载体中克隆出带有SD序列的基因片段SD-SrCR和SD-GDH,构建出双酶耦合表达系统pET-28a-SrCR-GDH,然后将所述双酶耦合表达系统转入大肠杆菌中,制得一种可不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌。
本发明还提供一种如上所述的重组大肠杆菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
本发明还提供一种制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。
该方法包括:采用如上所述的重组大肠杆菌,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,并以葡萄糖为辅助底物,以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)为辅因子,进行不对称还原反应将所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯转化成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
所述方法中不需要额外添加辅酶。
所述方法还包括向该反应体系中引入大孔吸附树脂以实现原位底物、产物移除,从而减弱反应体系中底物抑制和产物抑制。所述大孔吸附树脂可以是HZ814、HZ816、XAD4、XAD1180、XAD7HP中的一种,但是最优选为HZ814,经过多次实验验证该树脂的效果最好,得到的底物转化率最高。
所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为20mM~3000mM,葡萄糖的初始反应浓度为35mM~4500mM。
优选地,所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为400mM~1000mM,葡萄糖的初始反应浓度为600mM~1500mM。
所述不对称还原反应采用水相系统转化法。虽然现有技术中两相法和单水相催化都比较普遍,相比较而言单水相催化避免了大量有机试剂对催化剂的毒害作用,有助于提高反应效率,而本发明通过加入树脂可以有效地解决单水相反应中产物/底物浓度过高导致的产物/底物抑制原位移除产物抑制和底物抑制。
所述重组大肠杆菌以冻干菌体形式提供。
优选地,所述重组大肠杆菌悬浮于pH 6.5~7.5的磷酸缓冲溶液中进行所述不对称还原反应。
本发明人通过在微生物法生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯领域中进行大量的研究,通过基因组探矿技术从集胞藻细胞中获得了一条能够催化底物COBE的还原酶基因(SrCR),并结合从枯草芽孢杆菌中获得的葡萄糖脱氢酶基因(GDH),将这两段基因构建到同一载体质粒中,并成功在大肠杆菌中进行了高活性表达,经过发酵和催化反应研究,证实了该羰基还原酶能够应用于高活性和高选择性地催化COBE生成(S)-CHBE,其酶活高达33.1U/mg,达到文献报导最高水平。通过使用大孔吸附树脂,特别是HZ814,原位移除底物、产物抑制,使最终产物(S)-CHBE的积累量可达3000mM,最终底物转化率高达100%,产物光学纯度e.e%最高可达99.4%,相比现有技术均有了显著的提高。
附图说明
图1是本发明的重组共表达载体pET28a-SsCR-GDH的物理图谱。
图2是电泳图谱,其中,泳道1为蛋白质分子量标准,泳道2示出了本发明的纯化后羰基还原酶的SDS-PAGE电泳条带。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1:重组大肠杆菌的构建
1、羰基还原酶基因的获取:
蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803(购于Pasteur Culture Collection ofCyanobacteria),培养基Zobell 2216E(g·L-1):蛋白胨5g,酵母膏1g,磷酸高铁0.1g,陈海水1000mL,pH 7.6。
将蓝细菌Synechocystis sp.PCC 6803接种于4mL Zobell 2216E液体培养基中25℃至对数生长期,使用基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒)提取基因组。
构建表达载体所用的引物加设酶切位点,引物序列如下:
上游引物(SrCR-F含Bam HI)为:AACGCGGATCCATGTTAAGTCTTGGTTTGGAAG,下游引物(SrCR-R含HindⅢ)为:AACCCAAGCTTAGGTGTGGTGGGCCCCATTT,所有引物均由上海捷瑞公司合成。
东洋纺KOD酶PCR反应体系为:H2O 32.5ul、缓冲液5ul、2mm dNTP 5ul、MgCl22.5ul、模板2ul、20mM F/R引物1ul、KOD酶1ul。琼脂糖凝胶电泳确认条带大小正确后,使用天根公司胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的基因。随后,使用Fermentas公司内切酶BamHI和HindⅢ切割基因末端获得有悬挂末端的核酸序列。同时使用相同的内切酶切割获得相对应的具有悬挂末端的pET28a线性化载体。纯化后将两者在连接酶存在的体系中连接成环。将连接液转化入克隆宿主DH5α挑取转化子测序,确认重组质粒是否成功。提取测序正确的转化子的质粒,将其转入表达宿主BL21中。
2、葡萄糖脱氢酶基因的获取:
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilus CGMCC 1.1398(购于China GeneralMicrobiological Culture Collection Center),培养基LB(g·L-1):蛋白胨10g,NaCl 5g/L,酵母提取物5g,蒸馏水1000mL。
将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilus CGMCC 1.1398接种于4mL LB液体培养基中37℃至对数生长期,使用基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒)提取基因组。
构建表达载体所用的引物加设酶切位点,引物序列如下:
上游引物(GDH-F含Bam HI)为:AACGCGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAA,下游引物(GDH-R含HindⅢ)为:AACCCAAGCTTAACCGCGGCCTGCCTGGA。
东洋纺KOD酶PCR反应体系为:H2O 32.5ul、缓冲液5ul、2mm dNTP 5ul、MgCl22.5ul、模板2ul、20mM F/R引物1ul、KOD酶1ul。琼脂糖凝胶电泳确认条带大小正确后,使用天根公司胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的基因。随后,使用Fermentas公司内切酶BamHI和HindⅢ切割基因末端获得有悬挂末端的核酸序列。同时使用相同的内切酶切割获得相对应的具有悬挂末端的pET28a线性化载体。纯化后将两者在连接酶存在的体系中连接成环。将连接液转化入克隆宿主DH5α挑取转化子测序,确认重组质粒是否成功。提取测序正确的转化子的质粒,将其转入表达宿主BL21中。
3、羰基还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因的共表达:
PCR扩增带有酶切位点和SD序列的GDH基因SD-GDH,引物序列如下:
上游引物(SD-GDH-F含HindⅢ)为:CCCAAGCTTAAGGAGATATACATATGTATCCGGATTTA,下游引物(SD-GDH-R含Xho I)为:
CCGCTCGAGTTAACCGCGGCCTGCCTG。
东洋纺KOD酶PCR反应体系为:H2O 32.5ul、缓冲液5ul、2mm dNTP 5ul、MgCl22.5ul、模板2ul、20mM F/R引物1ul、KOD酶1ul。琼脂糖凝胶电泳确认条带大小正确后,使用天根公司胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的基因。随后,使用Fermentas公司内切酶HindⅢ和Xho I切割基因末端获得有悬挂末端的核酸序列。同时使用相同的内切酶切割获得相对应的具有悬挂末端的pET28a-SrCR线性化载体。纯化后将两者在连接酶存在的体系中连接成环。将连接液转化入克隆宿主DH5α挑取转化子测序,确认重组质粒是否成功。提取测序正确的转化子的质粒,将其转入表达宿主BL21中。构建图谱见附图1。
实施例2:重组大肠杆菌E.coli(pET28a-SrCR-GDH)整细胞的获得
将实施例1中获得的转化子接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基,在37℃培养12h,再以1%的接种量(v/v)接种到新鲜的含有50ug/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中,37℃培养至菌体浓度OD600约0.5左右,再向LB液体培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG,20℃诱导培养20h后,将培养液在4℃、5000rpm离心6min,弃去上清液,收集沉淀,即为含有胞内表达重组质粒(pET28a-SrCR-GDH)的重组大肠杆菌E.coli(pET28a-SrCR-GDH)湿菌体。将湿菌体冷冻干燥4h后即得到冻干菌体。将湿菌体破碎后离心弃沉淀,取上清使用镍柱纯化,在20mM咪唑下洗脱杂蛋白,200mM咪唑下洗脱目的蛋白可以得到单一条带的羰基还原酶纯酶,如图2所示,再次可确认重组质粒构建成功。纯酶酶活为33U/mg。
实施例3:该重组大肠杆菌在制备(S)-CHBE中的应用
以实施例2得到的冻干菌体作为催化剂。称取0.5g冻干菌体悬浮于25mLTrish-Hcl(100mM)中,加入葡萄糖35mM,COBE 20mM,NADP 0.2mM,30℃,反应10min后,最终底物转化率达到100%,产物光学纯度e.e%为99.4%。
以实施例2得到的冻干菌体作为催化剂。称取0.5g冻干菌体悬浮于25mLTrish-Hcl(100mM)中,加入葡萄糖600mM,COBE 400mM,NADP 0.2mM,30℃,反应30min后,最终底物转化率达到100%,产物光学纯度e.e%为99.3%。
以实施例2得到的冻干菌体作为催化剂。称取0.5g冻干菌体悬浮于25mLTrish-Hcl(100mM)中,加入葡萄糖900mM,COBE 600mM,NADP0.2mM,,30℃,反应1h后,最终底物转化率仅达到69.8%,产物光学纯度e.e%为99.1%。
以实施例2得到的冻干菌体作为催化剂。称取0.5g冻干菌体悬浮于25mLTrish-Hcl(100mM)中,加入葡萄糖1500mM,COBE1000mM,NADP 0.2mM,树脂HZ814100g/L,30℃,反应1.5h后,最终底物转化率达到100%,产物光学纯度e.e%为99.3%。
以实施例2得到的冻干菌体作为催化剂。称取0.5g冻干菌体悬浮于25mLTrish-Hcl(100mM)中,加入葡萄糖4500mM,COBE 3000mM,NADP 0.2mM,树脂HZ814200g/L,30℃,反应8h后,最终底物转化率达>99%,产物光学纯度e.e%为99.3%。
检测手段如下:反应结束后,加入等体积的乙酸乙酯萃取,取上层乙酸乙酯层,保存测样。
DB-5毛细管柱,内标物为2-羟基苯乙酮。程序为:检测器FID,载气为氮气,流速1mL/min,柱温先90℃保持3min,以10℃/min的速度程序升温至160摄氏度,保持0.5min,检测器和进样口温度均为250℃。用HPLC对(S)-CHBE的旋光性进行分析(大赛璐OB-H手性色谱柱,Agilent 1100型液相色谱),检测条件:流动相为正己烷:异丙醇=90:10,流速0.8mL/min,波长214nm。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
Claims (10)
1.一种不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌是同时具有羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌,所述羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,其特征在于,所述重组大肠杆菌能够同时表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶。
3.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,首先分别克隆出羰基还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因,构建出双酶耦合表达系统,然后将所述双酶耦合表达系统转入大肠杆菌中,制得一种可不对称转化制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌。
4.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
5.一种制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法,其特征在于,该方法包括:采用根据权利要求1所述的重组大肠杆菌,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,并以葡萄糖为辅助底物,以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸为辅因子,进行不对称还原反应将所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯转化成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述方法中不需要额外添加辅酶。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于,所述方法还包括向该反应体系中引入大孔吸附树脂HZ814以实现原位底物、产物移除。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为20~3000mM,葡萄糖的初始反应浓度为35mM~4500mM。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述不对称还原反应采用水相系统转化法。
10.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述重组大肠杆菌以冻干菌体形式提供。
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