CN105062986A - 羰基还原酶基因的应用、含该基因的工程菌及其催化还原反应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于解脂耶氏酵母的重组羰基还原酶其编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌以及该重组酶或重组工程菌作为催化剂在不对称还原羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。以重组酶作为催化剂可以不对称还原多种羰基化合物以制备光学活性手性醇，其催化效率高、立体选择性强。以重组工程菌作为催化剂不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)以高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，构建了底物耦联的反应体系。
Description
技术领域
本发明属于生物催化不对称转化技术领域，涉及一种羰基还原酶及其基因，以及通过基因工程手段构建重组菌株，及其在不对称还原羰基化合物中的应用。
背景技术
光学活性手性醇是医药和精细化学品合成的重要中间体。例如，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHBE)是一种重要的手性中间体，可用于很多活性药物的合成，如他汀类药物——羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和4-羟基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等。
目前，光学活性手性醇的制备方法主要包括化学催化的羰基不对称还原法、生物催化的羰基不对称还原法和生物催化的消旋醇手性拆分法。其中，化学催化羰基的不对称还原，通常需要铑、钌等昂贵的金属催化剂。这些催化剂回收困难、污染环境，且反应能耗高。生物催化的手性拆分不需添加辅酶，但该方法的缺点在于目标构型的产物最高收率不会超过50％。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。
羰基还原酶是普遍存在于自然界中的一类氧化还原酶，能使羰基化合物不对称还原生成手性醇。随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，利用基因挖掘技术克隆新型羰基还原酶已成为一种重要手段。筛选具有较宽底物谱的新型羰基还原酶，研究其可以高效选择性催化的手性药物中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。
解脂耶氏酵母可催化制备(R)-苯乙醇，在此基础上，利用基因组探矿的方式从已测序的解脂耶氏酵母菌株中克隆一种新型的羰基还原酶基因，构建了重组大肠杆菌，并将该羰基还原酶应用于不对称还原羰基化合中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的资源，即新型的羰基还原酶基因。
进一步的，包括提供了该羰基还原酶的氨基酸序列；表达该基因的载体；表达该羰基还原酶的重组工程菌；利用重组工程菌不对称还原羰基化合物制备手性醇的方法或者应用；以及利用该重组工程菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。
具体的，本发明的技术方案包括：
一种羰基还原酶，其核苷酸序列如SEQID：1所示。
该多核苷酸序列来自于解脂耶氏酵母，具体的制备方法为：根据Genebank中收录的预测为氧化还原酶的解脂耶氏酵母基因(Genebank登录号：XM_500963.1)序列设计合成引物；然后以的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的氧化还原酶全长基因序列。上述羰基还原酶YlCR2基因含有837bp碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
所述的多核苷酸编码的酶在羰基还原中的应用。其中，所述酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。多核苷酸序列无内含子，其编码的蛋白质包含278个氨基酸，其在Genebank中的登录号为XP_500963.1，氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。
含有上述的多核苷酸序列的重组载体以及将重组载体转化得到的基因工程菌。
本方案中的，重组菌为大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌BL21/pET-YlCR2(EscherichiacoliBL21/pET-YlCR2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2015339。
上述重组大肠杆菌的构建方法为：将羰基还原酶基因YlCR2插入载体pET28a构建重组质粒pETYlCR2，重组质粒pETYlCR2转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过含50ug/mL卡那霉素的LB平板筛选，获得重组菌株EscherichiacoliBL21/pETYlCR2。
采用现有技术，通过培养上述大肠杆菌，可以制备表达羰基还原酶，在本发明中，将重组基因工程菌进行诱导培养，将培养液分离，从而得到含重组羰基还原酶的菌体细胞。
本发明中的方法，其中，所述羰基化合物为如化学式ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ、ⅶ、ⅷ所示的前手性羰基化合物之一
在本发明中，还提供了利用上述重组大肠杆菌不对称还原羰基化合物制备手性醇中的方法。具体的，包括如下步骤：
(1)重组菌EscherichiacoliBL21/pETYlCR2的培养
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0；需要时使用前加入卡那霉素50ug/mL，固体培养基再添加2％琼脂粉；
培养条件：挑取重组菌EscherichiacoliBL21/pETYlCR2的单菌落接种于50mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD6000.8，在培养基中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mmol/L，于30℃诱导培养10h；5000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤，收集得到重组菌全细胞；
(2)以重组羰基还原酶粗酶和葡萄糖脱氢酶(GDH)为催化剂，以20mM羰基化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(氧化型辅酶Ⅱ，NADP+)为辅因子，进行不对称合成手性醇。
其中，加入的NADP+即由葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖生成NADPH，使反应循环进行。
其中，所述的反应温度为30℃，反应时间为12h
在本发明中，还提供了利用重组大肠杆菌，高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
包括以重组菌全细胞为催化剂，以COBE为底物，以甘露醇为辅助底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(氧化型辅酶Ⅱ，NADP+)为辅因子，进行不对称还原制备(S)-CHBE。
其中，加入的NADP+即由羰基还原酶YlCR2氧化甘露醇生成NADPH，使反应循环进行，既避免额外添加葡萄糖脱氢酶，又避免连续投加NADPH，从而降低了生产成本。
其中，COBE的反应浓度为3000mM，甘露醇的初始反应浓度为0.6-1.5mmol甘露醇/mmolCOBE，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(氧化型辅酶Ⅱ，NADP+)的初始反应浓度为0-0.4mM，重组大肠杆菌的用量(湿重)为80-160g/L。
其中，所述的反应温度为30℃，反应时间为11h
其中，所述的转化反应采用有机试剂/水双相体系转化法。所述的有机试剂/水双相体系转化法为在含有pH7.0的磷酸缓冲/乙酸丁酯的双相体系进行生物转化。
在优选的一个实施方案中，以重组菌全细胞为催化剂，以COBE为底物，以山梨醇为辅助底物，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸为辅因子，进行不对称还原制备(S)-CHBE。
其中，COBE的反应浓度为3000mM，山梨醇的初始反应浓度为1.1-1.5mmol山梨醇/mmolCOBE，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸的初始反应浓度为0-0.6mM，重组大肠杆菌的用量(湿重)为80-160g/L，反应温度为30℃，反应时间为14h，反应体系为磷酸缓冲/乙酸丁酯的双相体系进行生物转化。其中，湿重指在8000转/分钟的离心条件下将菌体与发酵液固液分离后的带水分的湿菌体重量。
在另一个优选的实施方案中，以重组菌全细胞为催化剂，以COBE为底物，不添加NADP+，分别以甘露醇和山梨醇为辅助底物，进行不对称还原制备(S)-CHBE。
本发明的有益效果在于：
(1)成功从解脂耶氏酵母基因组中克隆出一种新型羰基还原酶YlCR2，该基因全长837bp，Genbank序列号为XM_500963.1。将羰基还原酶基因YlCR2插入载体pET28a中，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得带有目的基因的重组菌株E.coliBL21/pETYlCR2。该重组羰基还原酶YlCR2可以催化多种羰基化合物，尤其对COBE有很好的催化效果。
因此，本发现了一种基因，该基因表达的酶具有羰基还原的作用，本发明还提供了重组表达该酶的载体以及工程菌，从而提供了新型的羰基还原酶。
(2)提供了新的还原羰基制备手性醇的方法。
(3)在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法中，引入了新的体系，包括新型的酶，包括甘露醇或者山梨醇在内的新型催化反应体系，从而降低了传统催化体系对酶的毒性；在优选的方案中采用了全细胞合成的方法，从而省去传统反应体系中辅酶的利用，大大降低了反应的成本，并大大提高了底物的反应浓度，从而提高了效率并降低了成本。具体的，通过生物转化反应条件优化，在pH7.0的磷酸缓冲/乙酸丁酯的双相体系中，构建了两种底物耦联的催化体系。其一，利用120g/L重组细胞(湿重)，在添加0.2mM的NADP+和1.2mmol甘露醇/mmolCOBE，对3000mM的底物COBE催化转化11h，生成产物(S)-CHBE的光学纯度为99％，转化率99％；其二，利用140g/L重组细胞(湿重)，在添加0.4mM的NADP+和1.3mmol山梨醇/mmolCOBE，对3000mM的底物COBE催化转化14h，生成产物(S)-CHBE的光学纯度为99％，转化率99％。避免添加额外的氧化还原酶和辅酶NADPH，只需添加辅酶NADP+和便宜的甘露醇和山梨醇便可使得辅酶NADPH高效再生，当添加1.3mmol甘露醇/mmolCOBE的甘露醇，无需添加辅酶NADP+，即可将3000mM的底物COBE完全转化，大大的节约了成本。
附图说明
图1为羰基还原酶基因的构建图。
图2为羰基还原酶YlCR2基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图：泳道1为DL2000DNAMarker，泳道2和3为利用引物扩增得到的羰基还原酶基因片段。
图3为阳性重组质粒pET28a-YlCR2琼脂糖凝胶电泳图：泳道1为DL5000DNAMarker，泳道2为质粒pET28a，泳道2为阳性重组质粒pET28a-YlCR2。
图4为重组大肠杆菌E.coliBL21/pETYlCR2的菌液PCR扩增电泳图：泳道1为DL2000DNAMarker，泳道2和3重组大肠杆菌E.coliBL21/pETYlCR2的菌液PCR扩增电泳图。
图5为羰基还原酶纯化后的SDS-PAGE图：泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为不加诱导剂的粗酶，泳道3为粗酶，泳道4为纯化后的羰基还原酶YlCR2。
图6为手性醇合成方程式。
图7为(S)-CHBE合成方程式。
本发明所述的生物材料，涉及一株大肠杆菌菌株，其分类命名为大肠杆菌BL21/pET-YlCR2(EscherichiacoliBL21/pET-YlCR2)，于2015年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为：CCTCCNO：M2015339。
具体实施方式
实施例1：YlCR2基因的获得
图1为羰基还原酶基因YlCR2的构建图。根据Genbank收录的预测为解脂耶氏酵母(yarrowialiplytic)还原酶的基因序列(Genbank登录号：)为依据，设计PCR引物如下：
上游引物：CGGGATCCATGCCTGCACCAGCAAC
下游引物：CCGCTCGAGTCAAGGACAACAGTAGCCGC
其中，上游引物下划线部分为BamHⅠ酶切位点，下游引物下划线部分为XhoⅠ酶切位点。
以解脂耶氏酵母(yarrowialiplytic)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系(总体积50μL)为：ddH2O19μL，2×TaqPlusMasterMix(DyePlus)25μL，基因组DNA2μL，上游引物和下游引物各2μL。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用DNA胶回收试剂盒回收800bp左右的目标条带，见图2。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pMD19-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD19-T-YlCR2，将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含有终浓度50ug/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆测序，全长837bp(其核苷酸序列如所示)，该序列编码一个完整的阅读框(氨基酸序列为)。
实施例2：重组菌株E.coliBL21/pETYlCR2的获得
利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒pMD19-T-YlCR2和商业化载体pET28a分别进行双酶切处理，处理后DNA片段通过粘性末端连接，获得重组表达载体pET28a-YlCR2。将重组表达载体pET28a-YlCR2转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有终浓度50ug/mL卡那霉素抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆，重组质粒见图3，菌落PCR见图4，测序验证，利用软件分析测序结果，序列与YlCR2基因的核苷酸序列相同。该结果说明获得了重组大肠杆菌E.coliBL21/pETYlCR2
实施例3：重组菌的培养
将实施例2中获得的重组大肠杆菌E.coliBL21/pETYlCR2菌体接种于50mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD6000.8，在培养基中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.1mmol/L，于30℃诱导培养10h；5000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤，收集得到重组菌全细胞。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。
实施例4：羰基还原酶YlCR2的分离纯化
将实施例3中获得的重组菌重悬于100mMpH7.0的磷酸缓冲液中，用高压匀浆机破碎细胞。将破碎后的菌液于8000rpm4℃离心30min。将上清在AKTA蛋白纯化仪系统中进行蛋白纯化。
缓冲液配制：镍柱BindingbufferA:100mM磷酸缓冲液,0.5MNaCl,20mM咪唑,pH7.4；镍柱ElutionbufferB:100mM磷酸缓冲液,0.5MNaCl,300mM咪唑,pH7.4)；透析缓冲液：100mM磷酸缓冲液,pH7.0。
纯化步骤：第一步将Ni柱安装于蛋白纯化仪上，设定流速为1.0ml/min，用5倍柱体积的BindingbufferA进行柱平衡；第二步将过膜后的上清进行蛋白挂柱，流速为1.0ml/min；第三步用5倍柱体积的BindingbufferA冲洗镍柱；第四步用流速为1.5ml/min的ElutionbufferB洗脱并收集目的蛋白；第五步将收集的目的蛋白置于透析液中进行透析，透析24h，每6h换一次透析液。
蛋白液经SDS-PAGE检测为单一条带(羰基还原酶YlCR2蛋白电泳图见附图5)，经BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量为0.907mg/ml。
实施例5：酶活测定
用实施例4中所获得的纯蛋白进行酶活的测定。通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定羰基还原酶YlCR2的氧化和还原活力。
YlCR2的还原活力测定体系为总体积为200μL，5mM的羰基化合物，0.4mM的NADPH，10μL的纯酶，100mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。30℃，340nm处吸光值的下降。酶活定义为每分钟内氧化1umolNADPH所需要的酶量为一个酶活单位。
YlCR2的氧化活力测定体系为总体积为200μL，400mM的山梨醇，0.4mM的NADP+，10μL的纯酶，100mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。30℃，340nm处吸光值的上升。酶活定义为每分钟内还原1umolNADP+所需要的酶量为一个酶活单位。
表1YlCR2对羰基化合物和山梨醇的酶活测定结果
实施例6：粗酶YlCR2催化羰基化合物的不对称还原
催化体系组成和催化条件如下：1ml的反应体系，20mM羰基化合物，60mM的葡萄糖，0.5mM的NADP+，2U的葡萄糖脱氢酶，2U的实施例4中高压破碎得到的YlCR2的粗酶液，100mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)；在30℃，200rpm振荡反应12h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯进行萃取，加无水硫酸钠干燥后分析底物转化率和产物的ee值。手性醇合成方程式见图6，结果见表2。
表2YlCR2催化羰基化合物不对称还原反应的结果
实施例7以甘露醇为辅助底物，重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
以实施例3方法获得的重组菌株E.coliBL21/pETYlCR2湿菌体作为生物催化剂，以COBE为底物，以甘露醇为辅助底物。(S)-CHBE合成方程式见图7。
(1)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯体系中辅助底物的选择
催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，1.3mmol辅助底物浓度/mmolCOBE，静息细胞140g/L(湿重)，3000mMCOBE，0.5mMNADP+浓度。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应11h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表1。
表1重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中辅助底物的研究
| 辅助底物 | 转化率(％) | ee(％) |
| 甘露醇 | 99 | 99(S) |
| 山梨醇 | 96.3 | 99(S) |
| 丙三醇 | 3.1 | 99(S) |
| 异丙醇 | 4.1 | 99(S) |
| 葡萄糖 | 9.2 | 99(S) |
结果表明，以甘露醇和山梨醇为辅助底物，转化率较高。
(2)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯体系中有机试剂的选择
水/有机相双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml有机相(甲苯，邻苯二甲酯二丁酸，苯，正己烷和乙酸丁酯)，0.5mMNADP+,1.3mmol甘露醇浓度/mmolCOBE，静息细胞140g/L(湿重)，COBE的上载量分别为3000mM。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应11h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表2。
表2重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中有机相的研究
结果表明，以乙酸丁酯为有机相，转化率最高。
(3)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中甘露醇浓度的优化
水/丁酸乙酯双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，甘露醇/COBE摩尔比分别为0.6，0.8，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5。静息细胞140g/L(湿重)，3000mMCOBE，0.5mMNADP+浓度。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应11h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表3。
表3重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中山梨醇浓度的优化
结果表明，当山梨醇(山梨醇浓度/COBE浓度)为1.2时，辅酶循环再生体系体系已经基本上能够满足催化反应所需的NADPH了。
(4)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中NADP+浓度的优化
水/丁酸乙酯双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，1.2mmol甘露醇浓度/mmolCOBE，静息细胞140g/L(湿重)，3000mMCOBE，NADP+浓度分别为0mM，0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应11h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表4。
表4重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中NADP+浓度的优化
| NADP+(mM) | 转化率(％) | ee(％) |
| 0 | 83 | 99(S) |
| 0.05 | 86.8 | 99(S) |
| 0.1 | 89.1 | 99(S) |
| 0.2 | 99 | 99(S) |
| 0.3 | 99 | 99(S) |
| 0.4 | 99 | 99(S) |
结果表明，重组菌催化COBE的转化率随NADP+的浓度增加而增加，当NADP+浓度大于0.2mM时，转化率趋于稳定。
(5)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中菌体量的优化
水/丁酸乙酯双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，,1.2mmol甘露醇浓度/mmolCOBE，静息细胞(湿重)分别为80，100，120，140和160g/mL，3000mMCOBE，0.2mMNADP+浓度。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应11h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表5。
表5重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中菌体量的优化
结果表明，当重组细胞的菌体量为120g/L时，已经能够完全催化3M的底物了。
(6)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中不添加NADP+的研究
催化体系：1.2mmol甘露醇浓度/mmolCOBE，140g/L的菌体；1.3mmol甘露醇浓度/mmolCOBE,140g/L的菌体；1.3mmol甘露醇浓度/mmolCOBE，120g/L的菌体，30℃,磁力减拌器上搅拌，反应20h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表6。
表6重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中不添加NADP+的研究
结果表明，即使在不添加NADP+的情况下，1.3mmol甘露醇浓度/mmolCOBE，140g/L的菌体，也能将底物完全转化，节约成本。
实施例8以山梨醇为辅助底物，重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
以实施例3方法获得的重组菌株E.coliBL21/pETYlCR2湿菌体作为生物催化剂，以COBE为底物，以山梨醇为辅助底物。
(1)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中山梨醇浓度的优化
水/丁酸乙酯双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，山梨醇/COBE摩尔比分别为1.1，1.2，1.3，1.4，1.5。静息细胞140g/L(湿重)，3000mMCOBE，0.5mMNADP+浓度。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应14h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表7。
表7重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中山梨醇浓度的优化
结果表明，当山梨醇(山梨醇浓度/COBE浓度)为1.3时，辅酶循环再生体系体系已经基本上能够满足催化反应所需的NADPH了。
(2)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中NADP+浓度的优化
水/丁酸乙酯双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，1.3mmol山梨醇浓度/mmolCOBE，静息细胞140g/L(湿重)，3000mMCOBE，NADP+浓度分别为0mM，0.05mM，0.1mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应14h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表8。
表8重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中NADP+浓度的优化
| NADP+(mM) | 转化率(％) | ee(％) |
| 0 | 55.1 | 99(S) |
| 0.05 | 65 | 99(S) |
| 0.1 | 84.5 | 99(S) |
| 0.3 | 96.2 | 99(S) |
| 0.4 | 99 | 99(S) |
| 0.5 | 99 | 99(S) |
| 0.6 | 99 | 99(S) |
结果表明，重组菌催化COBE的转化率随NADP+的浓度增加而增加，当NADP+浓度大于0.4mM时，转化率趋于稳定。
(3)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中菌体量的优化
水/丁酸乙酯双相催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，,1.3mmol山梨醇浓度/mmolCOBE，静息细胞(湿重)分别为80，100，120，140和160g/mL，3000mMCOBE，0.4mMNADP+浓度。在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应14h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表9。
表9重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中菌体量的优化
结果表明，当重组细胞的菌体量为140g/L时，已经能够完全催化3M的底物了。
(4)重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中不添加NADP+的研究
催化体系：5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，5ml乙酸丁酯，山梨醇/COBE摩尔比为1.3，1.5，2，静息细胞140g/L(湿重)，3MCOBE，不添加NADP+，在30℃,磁力减拌器上搅拌，反应20h。反应结束后，离心取上层有机相测定底物的转化率和ee。
同样的条件下，以空载的大肠杆菌作为对照。结果见表9。
表9重组菌高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯双相体系中不添加NADP+的研究
结果表明，即使在不添加NADP+的情况下，当山梨醇的摩尔浓度是COBE的摩尔浓度两倍时，也能将底物完全转化，节约的成本。
序列表
<110>南京工业大学
<120>羰基还原酶基因的应用、含该基因的工程菌及其催化还原反应的方法
<130>xb15081903
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>837
<212>DNA
<213>羰基还原酶
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(837)
<400>1
atgcctgcaccagcaacctacgctactggcttgacgccccttcccacc48
MetProAlaProAlaThrTyrAlaThrGlyLeuThrProLeuProThr
151015
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202530
ggaaaggttgcctctatcaccggttcttcttctggaatcggattcgct144
GlyLysValAlaSerIleThrGlySerSerSerGlyIleGlyPheAla
354045
gttgctgaggcatttgcccaggctggtgccgatgtcgcgatctggtac192
ValAlaGluAlaPheAlaGlnAlaGlyAlaAspValAlaIleTrpTyr
505560
aactccaagccttccgatgagaaggctgagtatctgtccaagacatac240
AsnSerLysProSerAspGluLysAlaGluTyrLeuSerLysThrTyr
65707580
ggagtccgatctaaggcttacaaatgtgctgtgaccaacgccaagcag288
GlyValArgSerLysAlaTyrLysCysAlaValThrAsnAlaLysGln
859095
gtcgagaccactatccaaaccatcgaaaaggactttggaaagattgac336
ValGluThrThrIleGlnThrIleGluLysAspPheGlyLysIleAsp
100105110
atcttcatcgccaacgcgggtatcccatggactgctggtccaatgatc384
IlePheIleAlaAsnAlaGlyIleProTrpThrAlaGlyProMetIle
115120125
gatgtccctaacaacgaggagtgggacaaggttgttgacctggatctc432
AspValProAsnAsnGluGluTrpAspLysValValAspLeuAspLeu
130135140
aacggtgcctattattgcgccaagtacgccggccagatcttcaagaag480
AsnGlyAlaTyrTyrCysAlaLysTyrAlaGlyGlnIlePheLysLys
145150155160
cagggctacggctccttcatcttcaccgcctccatgtctggccatatt528
GlnGlyTyrGlySerPheIlePheThrAlaSerMetSerGlyHisIle
165170175
gtcaatatcccccagatgcaggcctgctacaacgcagctaagtgtgct576
ValAsnIleProGlnMetGlnAlaCysTyrAsnAlaAlaLysCysAla
180185190
gtcctccatctgtcccgatctctggccgtggagtgggctggattcgct624
ValLeuHisLeuSerArgSerLeuAlaValGluTrpAlaGlyPheAla
195200205
cgatgtaatacagtgtcccctggttacatggctaccgagatttctgac672
ArgCysAsnThrValSerProGlyTyrMetAlaThrGluIleSerAsp
210215220
ttcatcccacgagacacaaaggagaagtggtggcagctcatccccatg720
PheIleProArgAspThrLysGluLysTrpTrpGlnLeuIleProMet
225230235240
ggccgagagggagatccttctgagcttgctggagcctatatttacctg768
GlyArgGluGlyAspProSerGluLeuAlaGlyAlaTyrIleTyrLeu
245250255
gcttcggatgcctcaacttataccactggtgcagacattctggttgat816
AlaSerAspAlaSerThrTyrThrThrGlyAlaAspIleLeuValAsp
260265270
ggcggctactgttgtccttga837
GlyGlyTyrCysCysPro
275
<210>2
<211>278
<212>PRT
<213>羰基还原酶
<400>2
MetProAlaProAlaThrTyrAlaThrGlyLeuThrProLeuProThr
151015
ProValProLysValSerLysAsnIleMetGluArgPheSerLeuLys
202530
GlyLysValAlaSerIleThrGlySerSerSerGlyIleGlyPheAla
354045
ValAlaGluAlaPheAlaGlnAlaGlyAlaAspValAlaIleTrpTyr
505560
AsnSerLysProSerAspGluLysAlaGluTyrLeuSerLysThrTyr
65707580
GlyValArgSerLysAlaTyrLysCysAlaValThrAsnAlaLysGln
859095
ValGluThrThrIleGlnThrIleGluLysAspPheGlyLysIleAsp
100105110
IlePheIleAlaAsnAlaGlyIleProTrpThrAlaGlyProMetIle
115120125
AspValProAsnAsnGluGluTrpAspLysValValAspLeuAspLeu
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AsnGlyAlaTyrTyrCysAlaLysTyrAlaGlyGlnIlePheLysLys
145150155160
GlnGlyTyrGlySerPheIlePheThrAlaSerMetSerGlyHisIle
165170175
ValAsnIleProGlnMetGlnAlaCysTyrAsnAlaAlaLysCysAla
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ValLeuHisLeuSerArgSerLeuAlaValGluTrpAlaGlyPheAla
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210215220
PheIleProArgAspThrLysGluLysTrpTrpGlnLeuIleProMet
225230235240
GlyArgGluGlyAspProSerGluLeuAlaGlyAlaTyrIleTyrLeu
245250255
AlaSerAspAlaSerThrTyrThrThrGlyAlaAspIleLeuValAsp
260265270
GlyGlyTyrCysCysPro
275
Claims (10)
1.一种羰基还原酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.含有如权利要求1所述的羰基还原酶基因的重组载体
3.将如权利要求2所述的重组载体转化得到的基因工程菌，其特征在于，其分类命名为大肠杆菌BL21/pET-YlCR2(EscherichiacoliBL21/pET-YlCR2)保藏编号为：CCTCCNO：M2015339。
4.一种重组羰基还原酶的制备方法，其特征在于，包括将权利要求3所述的重组基因工程菌进行诱导培养，将培养液分离，从而得到含重组羰基还原酶的菌体细胞的步骤。
5.一种不对称还原羰基化合物制备手性醇的方法，其特征在于，以权利要求3所述的基因工程菌破碎后的粗酶液为催化剂，在磷酸钠缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，将浓度为20mM的羰基化合物进行不对称还原，制备光学活性手性醇。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羰基化合物为如化学式ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ、ⅶ、ⅷ所示的前手性羰基化合物之一：
7.一种高效制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，反应体系包括辅助底物，将底物4-氯乙酰乙酸乙酯与如权利要求4所述的菌体接触，在不添加辅酶的情况下，反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于，反应体系中，所述4-氯乙酰乙酸乙酯的反应浓度不大于3000mM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述辅底物为山梨醇、甘露醇中的一种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述菌体的用量为湿重80-160g/L。
10.上述任一权利要求所述的基因、酶、载体、基因工程菌在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用。
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