CN111944776A - 一种羰基还原酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其编码DNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述羰基还原酶可用于以乙酰丙酸酯为底物制备γ‑戊内脂，该羰基还原酶可还原乙酰丙酸酯，并经过pH调节发生酯交换反应合成γ‑戊内脂，转化率达90％以上。

Description

一种羰基还原酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种羰基还原酶及其编码基因和应用。

背景技术

由于羰基还原酶广泛存在于自然界动植物体内，具有易得、性质稳定的特点。大多是通过多重筛选、显色法、基于辅酶衍生物的筛选方法和基于辅酶荧光的筛选方法等进行筛选。因为以上方法成本较高且检测不易，不适应于做高通量筛选，因此不适用于获取耐受乙酰丙酸酯(特别是乙酰丙酸乙酯)的目标羰基还原酶。因此，我们通过提取土壤样品的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接到克隆载体pUC19上，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态，建立宏基因组文库，通过96孔板法高通量筛选得到阳性克隆子。对阳性克隆子进行测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

在反应过程中，过高浓度的产物会使反应向正向移动的速度变得缓慢，导致产物的产率较低。为了减少水相中产物对正向反应的抑制，采用有机相(例如乙酸乙酯)-水两相反应体系，底物缓慢释放到水中与酶反应，而生成的产物则被抽提到有机相，促使反应向内脂合成的方向进行。两相反应可以有效提高还原反应的得率。与单相水溶液中进行的酶催化反应相比，两相酶催化反应有如下优越性：①酶具有很好的稳定性；②酶可回收再利用；③有利于疏水性底物的反应以及促进反应正向进行；④可控制底物的专一性；⑤无微生物污染。

γ-戊内酯(GVL)具有无毒、可生物降解的特性，可以作为绿色反应溶剂运用在多种反应，如Pd催化偶联反应如Hiyama反应的溶剂，用以替代有毒的非质子性极性溶剂如二甲基甲酰胺等。GVL还可以作为起始原料合成其他碳基化学品、聚合材料及液体烃类燃料。GVL由于其的广泛应用，被认为是最具应用前景的生物质基平台化合物之一。目前GVL的工业化生产主要通过气相反应实现乙酰丙酸(LA)还原生成GVL，这种气相反应最早是由Quaker Oats公司发明。虽然这些气相固定床反应实现了高选择性地生产GVL，但是由于将LA气化需要消耗较高的能量，且对原料有着很高的纯度要求。除气相反应外，贵金属催化剂也是研究者的目光所在，虽催化条件相对比较温和但价格昂贵也限制了其在催化领域的规模化应用。因此从绿色化学和实用的角度看，GVL的合成仍然需要进一步研究。

因此，获得能够耐受乙酰丙酸酯和有机溶剂的羰基还原酶显得尤为重要。我们筛选得到了耐受高浓度乙酰丙酸酯的羰基还原酶，并测试了所述羰基还原酶的有机溶剂耐受性，发现该酶能够耐受甲基叔丁醚、异丙醚、二氯甲烷、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇，特别是水、乙酸乙酯和乙酸丁酯。因此，筛选的羰基还原酶非常适用于利用乙酰丙酸酯合成高浓度GVL的反应。接下来，本发明在20％(v/v)乙酸乙酯的溶剂体系中、常温常压条件下、异丙醇作为氢供体，利用羰基还原酶催化还原乙酰丙酸酯制备相应的内脂，摩尔转化率达到90％以上，转化浓度达到800mM，提供了一条γ-戊内脂的安全和绿色化的制备工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羰基还原酶、其编码基因及其应用，以安全、绿色化地制备γ-戊内脂。具体地，本发明提供了以下技术方案：

1.一种羰基还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.项目1所述的羰基还原酶的编码基因。

3.项目2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.项目1所述的羰基还原酶在制备γ-戊内脂中的应用。

5.γ-戊内脂的制备方法，其特征在于，使用项目1所述的羰基还原酶，将乙酰丙酸酯的酮羰基进行还原反应，并添加10M盐酸溶液进行酯交换反应，从而获得γ-戊内脂；

优选地，在所述还原反应中，使用二级醇作为氢源。

6.根据项目5所述的制备方法，其中所述乙酰丙酸酯选自乙酰丙酸甲酯、乙酰丙酸乙酯、乙酰丙酸丁酯或乙酰丙酸异丙酯。

7.根据项目5所述的制备方法，其中，所述还原反应的温度为10℃-60℃，优选20℃-40℃。

8.根据项目5所述的制备方法，其中，在还原反应中，所述乙酰丙酸酯的浓度为0.001M-1M。

9.根据项目5所述的制备方法，其中，在所述还原反应中，使用有机溶剂-水两相反应体系进行反应，其中所述水和有机溶剂的体积比为10:1-10:5。

10.根据项目9所述的制备方法，其中，所述有机相溶剂包括有机醇、醚和酯；

优选地，所述有机醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇中的一种或二种以上；

优选地，所述酯为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、乳酸甲酯、丁二酸单乙酯、丁二酸单甲酯、丁二酸二甲酯、丁二酸二乙酯中的一种或二种以上；

优选地，所述醚为异丙醚或者甲基叔丁基醚、异丙醚或者甲基叔丁基醚的一种或二种以上。

在本发明的具体实施方案中，本发明人通过提取土壤样品的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接到克隆载体pUC19上，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态，建立宏基因组文库，通过96孔板法高通量筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段，获得羰基还原酶的编码基因SEQ ID NO.1。

随后，将含有目的基因片段SEQ ID NO.1的表达载体转化至宿主细胞中，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达的羰基还原酶。其中，IPTG诱导的浓度为0.6-1.8mM，诱导温度为18-37℃。

在本发明的具体实施方案中，使用本发明的羰基还原酶，以乙酰丙酸酯为底物，以二级醇作为氢源来制备γ-戊内酯，其中，所述二级醇为异丙醇、2-丁醇或环己醇。

总之，本发明从实验室附近的土样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的羰基还原酶的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，初步确定羰基还原酶的分子量约为59KDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明将SEQ ID NO.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：

(1)在大肠杆菌表达体系中，该羰基还原酶具有高效可溶性表达；

(2)以乙酰丙酸乙酯为底物，测得重组羰基还原酶的最适反应温度为40℃，升高或降低温度都会导致酶活性的减少。在30℃以下，该羰基还原酶具有良好的热稳定。但当温度为70℃时，酶完全失活。该酶的最适反应pH值为9.0，在pH 9.0-11.0的范围内保留活性80％以上的酶活性，酶的pH稳定性较好；

(3)本发明的重组羰基还原酶以乙酰丙酸酯(特别是乙酰丙酸乙酯)为底物，还原产物经pH调节生成γ-戊内脂，经GC内标法分析，转化率为90％以上。

本发明的有益效果是：

本发明的重组羰基还原酶能够耐受乙酰丙酸酯和有机溶剂，非常适用于利用乙酰丙酸酯合成高浓度GVL的反应。本发明在20％(v/v)乙酸乙酯的溶剂体系中、常温常压条件下、异丙醇作为氢供体，利用所述羰基还原酶催化还原乙酰丙酸酯制备相应的内脂，摩尔转化率可达到90％以上，转化浓度达到800mM，提供了一条γ-戊内脂的安全和绿色化的制备工艺。

附图说明

图1显示了pH值对重组羰基还原酶酶活性的影响；

图2显示了温度对重组羰基还原酶酶活性的影响；

图3为羰基还原酶以乙酰丙酸乙酯为底物生成γ-戊内酯的GC图；其中，乙酸乙酯的出峰时间为1.360min，γ-戊内酯的出峰时间为7.799min。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

定义

在本发明中所使用的术语“乙酰丙酸酯”是指乙酰丙酸和醇类缩合形成的酯，包括但不限于乙酰丙酸甲酯、乙酰丙酸乙酯、乙酰丙酸丁酯、乙酰丙酸叔丁酯、乙酰丙酸异丙酯、或其混合物、等等。其中所述的醇类包括甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、二乙二醇、等等。

在本发明中，术语“常温”具有化学领域中的通常含义，是指约25℃左右的温度。

在本发明的制备γ-戊内酯的方法中，所使用的“一锅法”也称为多相复式非连续生产法，是化工合成中常用的方法，其不需要进行中间处理纯化即可得到目标产物。

在本发明中，在还原反应体系中，底物乙酰丙酸酯的浓度为0.001-1M，优选为0.1-1M，0.2-1M，0.2-0.5M，0.3-1M，0.4-1M，0.5-1M，0.6-1M，0.7-1M或0.8-1M，更优选为0.8M。

在本发明中，在还原反应体系中，所述羰基还原酶的加入量为1-100μmol/L，优选为10-100μmol/L，20-100μmol/L，30-100μmol/L，40-100μmol/L，50-100μmol/L，60-100μmol/L，70-100μmol/L，80-100μmol/L，更优选为80μmol/L。

实施例1：宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达

1、总DNA的提取：

称取5g土壤样品，加入13.5ml DNA提取缓冲液(0.1M Tris，0.1M EDTA-Na，0.1MNa₃PO₄，1.5M NaCl，1％CTAB，pH值8.0)，剧烈振荡混匀，加入300μl溶菌酶(购于阿拉丁)(100mg/ml)，反复颠倒5-6次，37℃水浴30min，加入1.5ml 20％SDS，65℃水浴1h(期间每隔15min上下颠倒几次)，8000r/min离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，8000r/min离心10min，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2h，20000r/min离心20min，弃上清，沉淀加5mL预冷的70％乙醇，20000r/min离心10min，收集DNA沉淀，风干，用适量TE缓冲液溶解。

试剂盒法纯化DNA：按照OMEGA胶回收试剂盒说明书进行。

宏基因组电泳检测：用1％琼脂糖凝胶电泳检测总DNA量和纯度。

酶切总DNA：用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收2-8kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。

酶切片段及克隆载体的电泳检测：方法同宏基因组电泳检测。

酶切片段的连接：将回收得到的酶切片段和同样经BamHI和HindIII酶切后的pUC19质粒连接过夜，按照OMEGA MicroCycle-Pure Kit操作回收连接产物。

连接产物的转化：吸取3μl的连接产物加入到100μl的大肠杆菌DH5α高效感受态中，2500V/cm(Eppdoff 2510电击仪)电击1次，46℃热激6-10min，37℃，180-200rpm摇床培养45-60min，吸取20-50μl涂布于含AMP抗生素(100μg/ml)LB琼脂平板，37℃培养过夜。由此构建了一个库容量达20000个转化子、高多样性的宏基因组文库。

文库筛选和阳性克隆子的鉴定：将涂布后的平板置于37℃培养箱培养72h，挑取平板上的菌落移至含有LB培养基和AMP(100μg/ml)抗生素的96孔板，在37℃培养过夜。将培养液移至含有LB培养基和AMP(100μg/ml)抗生素的另一块96孔板，在37℃培养3h，加入0.5mM的IPTG继续培养过夜，8000g离心10min，加入1mg/ml溶菌酶裂解1h，随后利用如下反应体系检测裂解液的还原性：反应体系共300μl，包括：10mM乙酰丙酸乙酯、0.1mM NADH、50μL稀释酶液、pH9.0磷酸钾缓冲液。还原性检测是在酶标仪中，通过分析340nm处的光吸收值减少进行的。检测原理是反应中NADH氧化生成NAD⁺，而NADH在340nm处有最大特征吸收峰，在一定光吸收值范围内，340nm处光吸收值与NADH浓度呈正比。通过筛选，得到一株阳性克隆子。将阳性克隆子挑出并接种至10ml含AMP抗生素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，取2ml菌体进行质粒提取，对插入片段测序，并命名为质粒pUC19-KRED。将测定的序列经过NCBI的BLAST软件分析比较，发现该DNA由1146个碱基对组成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA编码的多肽，含381个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基因片段的克隆：根据测序结果设计一对引物：F'和R'，引物两端引入能插入pET-32a⁽⁺⁾载体的BamHI和HindIII酶切位点，引物序列如下：

F'-CG GGATCC ATGAACATCTGTAAACAGAGC(SEQ ID NO.3)

R'-CCC AAGCTT TTACGGCTGAAAAACTGCAC(SEQ ID NO.4)

利用两条引物，以质粒pUC19-KRED为模板进行PCR扩增反应，PCR体系如下：条件为：94℃，5min，94℃，30sec，66℃，30sec，72℃，2min，30个循环，72℃，10min。

用胶回收试剂盒将PCR产物纯化并用BamHI、HindIII于37℃双酶切24h，与用BamHI、HindIII双酶切的pET-32a⁽⁺⁾(Novagen)表达载体进行连接，得到重组质粒。取5μl重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE₃)，转化液涂布含AMP抗生素(100μg/ml)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取10株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序。

重组羰基还原酶粗酶液的获得、纯化及分子量检测：将重组工程菌划线至含AMP抗生素(100μg/ml)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取1株重组菌接种至含AMP抗生素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，按1:100的接种量转接至50mL的含AMP抗生素(100μg/ml)的LB液体培养基中，当生长至OD₆₀₀＝0.6-0.8时加入IPTG进行诱导，30℃、200r/min摇床培养8-9小时(OD₆₀₀＝3)，取诱导表达后菌液1ml加入到2ml EP管中，12000rpm离心1min，收集湿细胞，用1ml 50mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤菌体两次，再重悬于1ml 50mMTris-HCl(pH8.0)中。超声波破碎2min，破碎5s间隔5s，4℃、12000rpm离心1min，上清即为粗酶液。之后进行酶液的纯化，具体纯化方法参见Purification Kit(Novagen)试剂盒，具体步骤如下：

(1)用10ml预冷的1×Binding Buffer悬浮从100ml培养液中收集的菌体；

(2)采用超声波破碎细胞至澄清(4℃)、14000rpm离心20min收集上清即得到粗酶液；

(3)加入4ml His·Bind resin至滤柱中，形成2ml的纯化柱；

(4)依次6ml无菌水洗涤，10ml 1×Charge Buffer洗涤，6ml 1×Binding Buffer洗涤；

(5)将上述粗酶液置于纯化柱上，除去滤液；

(6)依次用20ml 1×Binding Buffer洗涤，12ml 1×Wash Buffer洗涤纯化柱；

(7)最后用12ml 1×Elute Buffer洗脱纯化柱中的蛋白质，即得纯化的羰基还原酶。

利用SDS-PAGE凝胶电泳对获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白各个组分分开，用考马斯亮蓝R-250染色，酶蛋白的大小利用Protein Maker进行预估。通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，SEQ IDNO.1所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌BL21(DE₃)中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白羰基还原酶的分子量约为59kDa。

实施例2

酶活的测定

①以乙酰丙酸乙酯为底物的羰基还原酶活性的定义：1个单位羰基还原酶的活性定义为在pH9.0，30℃，每分钟还原1μmol乙酰丙酸乙酯所需的酶量。

②测定原理：例如以乙酰丙酸乙酯为底物进行酶活性测定，羰基还原酶催化1mol乙酰丙酸乙酯还原生成1mol 4-羟基戊酸乙酯，与此同时1mol NADH氧化生成1mol NAD⁺，NADH在340nm处有最大特征吸收峰，在一定光吸收值范围内，340nm处光吸收值与NADH浓度呈正比。

③测定方法如下：

反应体系共300μl，包括：10mM乙酰丙酸乙酯、0.1mM NADH、50μL稀释酶液、pH9.0磷酸钾缓冲液。在酶标仪中，检测340nm处的光吸收值。

实施例3重组羰基还原酶酶学性质研究

重组羰基还原酶的最适pH测定

分别取用不同pH的50mM的缓冲液，pH范围6.0-11.0，体系同上，平行试验三次，测定35℃下各pH值条件下的酶活。以酶活力最高者定为100％，以相对酶活力对pH作图。具体如下：

将酶液在不同pH的缓冲液(pH范围6.0-11.0)中37℃放置1h，平行试验三次，按上述标准方法测定不同pH下保存的羰基还原酶活性，以未处理酶液的酶活力为100％，以相对酶活力对pH作图，如图1所示，重组羰基还原酶的最适反应pH为9.0，在pH 9-11.0的范围内活性比较稳定，仍保留大于80％的酶活。

重组羰基还原酶最适反应温度测定

分别测定pH 9.0下不同温度条件的稀释酶液的酶活力，温度范围20-70℃，体系同上，平行试验三次，测定pH9.0值条件下各温度酶活。以酶活力最高者定为100％，以相对酶活力对pH作图。具体如下：

将酶液分别放入不同温度的水浴中保温2h，取出酶液后置于冰上，平行试验三次，同时用未经处理的样品作正对照，按照上述标准方法测定不同温度下样品的酶活力。以未处理酶液的酶活力为100％，以相对酶活力对温度作图，如图2所示，重组羰基还原酶最适反应温度为40℃，升高或降低温度都会导致酶活性的减少。在30-50℃的半衰期为35h，在70℃条件下，几乎完全失活。

实施例4重组羰基还原酶以乙酰丙酸乙酯为底物的还原反应

在常温常压条件下，采用异丙醇作为氢源，使用乙酸乙酯-水两相反应体系，在“一锅法”中协同催化还原乙酰丙酸乙酯制备γ-戊内酯，实现γ-戊内酯的绿色制备过程。

在10mL体系中，首先加入1M的异丙醇、200mM乙酰丙酸乙酯和0.1mM NAD⁺，获得溶液1；将羰基还原酶酶液用pH9.0 Tris-HCl缓冲液中进行悬浮，获得溶液2；之后按2:8的体积比，将乙酸乙酯与溶液1和溶液2的混合液进行混合(其中羰基还原酶的浓度为80μmol/L)，在30℃、转速为120rpm的条件下反应。分别在4h、8h、12h、20h各补200mM乙酰丙酸乙酯、每隔8h补一次酶液。反应完毕，加入10M HCl 0.2mL，使还原产物发生酯交换成环。放置24h后，10000rpm离心2分钟，反应体系分层，将下层反应产物12000rpm离心5min，利用气相色谱法(GC)进行分析(GC-2010型气相色谱仪)，FFAP柱(5μm，4.6x250mm)，初始温度为60℃，保留1min，10℃/min程序升温，升到240℃，保留3min。经过GC内标法分析，γ-戊内酯的转化率为90.1％。

实施例5重组羰基还原酶以乙酰丙酸丁酯为底物的还原反应

在常温常压条件下，采用异丙醇来供氢，使用乙酸乙酯-水两相反应体系，在“一锅法”中协同催化还原乙酰丙酸丁酯制备γ-戊内酯，实现γ-戊内酯的绿色制备过程。

首先加入1M的异丙醇、250mM乙酰丙酸丁酯和0.1mM NAD+，获得溶液1；将羰基还原酶酶液用pH9.0 Tris-HCl缓冲液中进行悬浮，获得溶液2；之后按2:8的体积比，将乙酸乙酯与溶液1和溶液2的混合液进行混合(其中羰基还原酶的浓度为80μmol/L)，在30℃、转速为120rpm的条件下反应。分别在4h、7.5h、12h、18h补200mM乙酰丙酸丁酯、每隔8h补一次酶液。反应完毕，加入10M HCl 0.15mL，使还原产物发生酯交换成环。放置24h后，10000rpm离心2min，反应体系分层，将下层反应产物12000rpm离心5min，利用气相色谱法(GC)进行分析(GC-2010型气相色谱仪)，FFAP柱(5μm，4.6x250mm)，初始温度为60℃，保留1min，10℃/min程序升温，升到240℃，保留3min。经过GC内标法分析，γ-戊内酯的转化率为90.5％。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种羰基还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的羰基还原酶的编码基因。

3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述的羰基还原酶在制备γ-戊内脂中的应用。

5.γ-戊内脂的制备方法，其特征在于，使用权利要求1所述的羰基还原酶，将乙酰丙酸酯的酮羰基进行还原反应，并添加10M盐酸溶液进行酯交换反应，从而获得γ-戊内脂；

优选地，在所述还原反应中，使用二级醇作为氢源。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中所述乙酰丙酸酯选自乙酰丙酸甲酯、乙酰丙酸乙酯、乙酰丙酸丁酯或乙酰丙酸异丙酯。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述还原反应的温度为10℃-60℃，优选20℃-40℃。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其中，在还原反应中，所述乙酰丙酸酯的浓度为0.001M-1M。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其中，在所述还原反应中，使用有机溶剂-水两相反应体系进行反应，其中所述水和有机溶剂的体积比为10:1-10:5。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，所述有机相溶剂包括有机醇、醚和酯；

优选地，所述有机醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1，3-丙二醇、1，2-丙二醇中的一种或二种以上；

优选地，所述酯为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、乳酸甲酯、丁二酸单乙酯、丁二酸单甲酯、丁二酸二甲酯、丁二酸二乙酯中的一种或二种以上；

优选地，所述醚为异丙醚或者甲基叔丁基醚、异丙醚或者甲基叔丁基醚的一种或二种以上。

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