KR20210151928A - 호열성 단백질을 이용한 재조합 시험관내 전사 및 해독을 위한 시스템, 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 화합물, 단백질, 효소, 바이오시밀러의 시험관내 생합성 또는 소분자의 화학적 변형에 필수적인 무세포 반응 구성요소를 모두 함유하는 반응 혼합물인 재조합 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있다.
Description
본 출원은 2019년 4월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 62/833,555의 이익 및 우선권을 주장한다. 상기 참조된 출원의 전체 명세서 및 도면은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 생물학적 물질을 고수율로 시험관내 생산하기 위한 재조합 무세포 발현 시스템 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 2020년 4월 13일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 90125.00096-Sequence-Listing_ST25.txt이며 크기는 427 킬로바이트이다.
무세포 발현 시스템(시험관내 전사/해독, 무세포 단백질 발현, 무세포 해독, 또는 무세포 생합성이라고도 함)은 연구자가 시험관내에서 기능성 단백질 또는 기타 표적 분자를 발현할 수 있도록 하는 분자 생물학 기술을 나타낸다. 이러한 시스템은 생체내에서 생산하기 어려운 단백질 또는 기타 소분자의 시험관내 발현 뿐만 아니라 단백질 진화, 기능적 유전체학 및 구조 연구를 위한 단백질 라이브러리의 고처리량 생산을 가능하게 한다. 이러한 시스템의 또 다른 이점은 종종 발현될 표적 단백질이 숙주 세포에 독성일 수 있거나 일반적으로 세포 발현과 비화합성일 수 없어, 생체내 시스템을 단백질 발현에 완전히 비효과적인 비히클은 아니지만 비실용적이게 만든다. 박테리아 또는 조직 배양 세포를 기반으로 하는 생체내 기술과 비교하여, 시험관내 단백질 발현은 유전자 형질감염, 세포 배양 또는 광범위한 단백질 정제가 필요하지 않기 때문에 상당히 더 빠르다.
보다 구체적으로, 무세포 발현 시스템은 살아있는 세포를 사용함이 없이 RNA 종 및 단백질과 같은 표적 분자 및 복합체를 생성한다. 전형적인 무세포 발현 시스템은 하나 이상의 표적 유전자를 함유하는 DNA로부터 표적 분자를 생성하기 위해 세포 용해물에서 발견되는 생물학적 구성요소/기구를 활용할 수 있다. 전형적인 무세포 발현 시스템 반응의 공통 구성요소로는 일반적으로 세포 배양 용해물에서 유래된 세포 추출물, ATP와 같은 에너지원, 아미노산 공급, 마그네슘과 같은 보조인자, 전형적으로 플라스미드 합성 주형 또는 선형 발현(또는 합성) 주형(LET 또는 LST) 형태의 원하는 유전자를 갖는 핵산 합성 주형을 포함할 수 있다. 세포 추출물은 관심 세포를 용해하고 원심분리 또는 기타 침전 방법을 통해 세포벽, 게놈 DNA 및 기타 파편을 제거함으로써 수득할 수 있다. 용해물 또는 세포 추출물의 남은 부분은 표적 분자를 발현하는 데 필요한 필수적인 세포 기구를 함유할 수 있다.
일반 무세포 발현 시스템은 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis, CFPS)을 수반한다. 하나 이상의 관심 단백질을 생산하기 위해, 전형적인 CFPS 시스템은 미생물, 식물 또는 동물 세포의 미정제(crude) 용해물로부터 단백질 합성 및 에너지 생성에 필수적인 촉매 구성요소의 앙상블을 이용한다. 미정제 용해물은 DNA에서 RNA로의 전사, RNA에서 단백질로의 해독, 단백질 접힘(folding) 및 에너지 대사에 필수적인 요소를 함유한다(예를 들어, 리보솜, 아미노아실-tRNA 합성효소, 해독 개시 및 연장 인자, 리보솜 방출 인자, 뉴클레오타이드 재활용 효소, 대사 효소, 샤페론, 폴다아제(foldase) 등). 오늘날 사용되는 일반 세포 추출물은 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)(ECE), 토끼 망상적혈구(RRL), 밀 배아(WGE), 및 곤충 세포(ICE), 심지어 포유류 세포(MC)로부터 제조된다.
무세포 발현 시스템은 기존의 생체내 단백질 발현 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. 무세포 시스템은 세포의 대사 자원의 전부는 아니지만 대부분을 하나의 단백질의 독점적인 생산쪽으로 유도할 수 있다. 더욱이, 시험관내에 세포벽 및 막 성분의 결여는 합성 환경의 제어를 가능하게 하기 때문에 유리하다. 예를 들어, tRNA 수준은 발현 중인 유전자의 코돈 용법을 반영하도록 변화될 수 있다. 산화환원 전위, pH 또는 이온 강도는 또한 세포 성장 또는 생존력에 대한 우려가 적기 때문에 생체내보다 더 큰 유연성으로 변경될 수 있다. 또한, 적절하게 접힌 정제된 단백질 생성물의 직접 회수가 쉽게 달성될 수 있다.
무세포 발현 시스템의 많은 유리한 측면에도 불구하고 몇 가지 방해물은 이전에 단백질 생산 기술로서의 사용을 제한했다. 특히, 미국 특허 제7,118,883호에서 식별된 E.콜라이 추출물 기반의 무세포 시스템, 및 미국 특허 제9,528,137호에서 식별된 효모 추출물 기반의 무세포 시스템에 존재하는 이들 방해물로는 활성 단백질 합성의 짧은 반응 기간, 낮은 단백질 생산 속도, 작은 반응 규모, 다중 이황화 결합을 함유하는 단백질을 정확하게 접는 능력의 제한, 및 "블랙박스(black-box)" 과학으로서의 초기 개발을 포함한다. 결과적으로, 증가된 생성물 수율, 향상된 성분 안정성, 개선된 단백질 생산 속도 및 연장된 반응 시간을 나타내는 경제적으로 실행가능한 상업적인 무세포 발현 시스템에 대한 요구가 존재한다.
위에서 지적한 바와 같이, 무세포 시스템은 일관성, 수율 및 확장 가능성이 부족하기 때문에 생물학적 제제의 제조에 널리 사용되지 않는다. 본 발명자들은 E. 콜라이 기구를, 개선된 생산 속도 및 더 높은 수율을 야기하는 열안정성 단백질로 대체하지만, 신규 에너지 재생 시스템도 포함시켜, 이러한 시스템의 적용성을 개선하는, 예시적인 호열균을 활용한 추출물 기반의 무세포 시스템을 이전에 보고했다.(이러한 신규 에너지 재생 시스템은 PCT 출원 번호 PCT/US2018/012121에 일반적으로 기술되어 있으며, 그 상세한 설명, 도면, 실시예, 서열 및 청구범위는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨.)
하기에 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 일부 실시양태에서 다양한 예시적인 호열성 박테리아로부터의 펩타이드-기반 구성요소를 혼입시킨 완전 재조합 시험관내 전사/해독 시스템을 개발하였다. 위에서 언급한 바와 같이, 현재 상업적으로 이용가능한 무세포 시스템은 E. 콜라이 세포 추출물 유래의 필수적인 전사/해독 기구를 첨가하는 것을 기반으로 하거나, 재조합 E. 콜라이 효소를 기반으로 한다. 시험관내 단백질 생산을 개선하기 위해 호열균을 사용하는 것을 포함하는, 추출물에 대한 다양한 다른 출처가 보고되었지만, 호열성 단백질을 기반으로 하는 완전 재조합 발현 시스템을 포함하는 완전 재조합 발현 시스템은 지금까지 보고되지 않았다.
이하에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 현재의 본 발명의 기술은 더 긴 반응 지속 시간 및 더 높은 생성물 수율을 초래하는 진정으로 에너지 효율적이고 강건한 시험관내 무세포 발현 시스템의 목적을 충족시키면서 전통적인 무세포 발현 시스템의 한계를 극복한다. 구체적으로, 본 발명은 전사/해독에 필수적인 각 단백질을 재조합적으로 발현함으로써 호열균 기반의 무세포 시스템을 포함하고, 이에 따라 추출물 기반의 회분식(batch) 시스템에서 관찰되는 것과 같은 거대한 변수에 직면함이 없이 시스템의 더 나은 제어 및 미세 조정으로 연속적인 유동을 가능하게 한다. 이 시스템은 초기 연구 적용예에서의 소규모 단백질 생산, 뿐만 아니라 작은 동물 연구와 같은 중간 규모의 적용예에 유용할 수 있다. 본 발명은 본원에 기술된 신규 생물반응기에서 연속 유동 접근에 의해 대규모 제조를 가능하게 하고 훨씬 더 큰 설치 면적 및 인력 요구를 갖는 현행 제조 설비를 대체할 수 있다.
본 발명의 하나의 목적은 재조합 무세포 발현 시스템, 즉 시험관내 전사/해독 기전에 필수적인 무세포 반응 구성요소, 아미노산, 뉴클레오타이드, 에너지를 제공하고 단백질 합성에 필수적인 대사 구성요소를 전부 함유하는 반응 혼합물에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에서 식별된 효소는 E. 콜라이 또는 효모와 같은 다른 진핵생물 시스템의 구성요소를 공급받는 통상적인 무세포 시스템과 대조적으로, 상이한 호열성 박테리아로부터 공급될 수 있다. 이 호열균 공급(thermophilic sourcing) 전략은 시험관내 해독 중의 모든 단계(tRNA 로딩, 리보솜 펩타이드 생합성) 동안 더 높은 안정성을 제공할 뿐만 아니라 재조합 발현 시스템의 개선된 성능 및 더 긴 실행시간을 허용한다.
이러한 본 발명자의 호열균 공급 전략은 pH 및 염 농도의 변동에 대해 더 적은 민감성을 나타내고 ATP 가수분해로 인한 포스페이트 농도 증가에 의해 덜 영향을 받을 수 있는 재조합 무세포 발현 시스템의 생성을 가능하게 한다. 이 호열균 공급 전략의 또 다른 이점은 본 발명의 재조합 무세포 발현 시스템이 호열성 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 인식되는 상이한 세트의 tRNA를 이용할 수 있게 하여, 처음으로 무세포 시스템에서 전체 코돈에 적용할 수 있게 한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있으며, 이 반응 혼합물은 생물학적 화합물, 단백질, 효소, 바이오시밀러(biosimilar)의 시험관내 생합성, 또는 소분자의 화학적 변형에 필수적인 모든 무세포 반응 구성요소를 함유한다.
본 발명의 또 다른 목적은 백신, 생물학적 제제, 단백질, 효소, 바이오시밀러의 시험관내 전사, 시험관내 해독 및 시험관내 생합성, 및 연속 유동 작업에서 효소를 사용한 소분자의 생합성 또는 화학적 변형을 위한 연속 유동 생물반응기 시스템에 대한 방법, 시스템 및 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 무세포 발현 반응 혼합물의 일부를 형성할 수 있는 하나 이상의 단리된 뉴클레오타이드 암호 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 암호 서열은 호열균 또는 다른 박테리아로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 암호 서열은 개시 인자 뉴클레오타이드 암호 서열, 연장 인자 뉴클레오타이드 암호 서열, 방출 인자 뉴클레오타이드 암호 서열, 리보솜-재순환 인자 뉴클레오타이드 암호 서열, 아미노아실-tRNA 합성효소 뉴클레오타이드 암호 서열, 및 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제 뉴클레오타이드 암호 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적인 뉴클레오타이드 암호 서열은 RNA 중합효소 뉴클레오타이드 암호 서열, 뿐만 아니라 본원에 포함된 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 시스템과 관련된, 포함된 참고문헌인 PCT 출원 번호 PCT/US2018/012121(" '121 출원")에서 확인되는 뉴클레오타이드 암호 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 박테리아 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 프로모터 서열(들)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 단리된 뉴클레오타이드 암호 서열을 갖는 발현 벡터의 생성을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오타이드 암호 서열은 선택 박테리아에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이후에 단리되어 재조합 무세포 발현 반응 혼합물에 포함될 수 있는 단백질을 생성하는, 본원에서 식별된 뉴클레오타이드 암호 서열의 발현을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현된 단백질은 개시 인자 단백질, 연장 인자 단백질, 방출 인자 단백질, 리보솜-재순환 인자 단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소 단백질, 및 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제 단백질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가적인 뉴클레오타이드 암호 서열은 RNA 중합효소 단백질, 뿐만 아니라 본원에 포함된 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 시스템과 관련된 '121 출원에서 식별된 단백질 및 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 연속 유동 재조합 무세포 발현 장치를 포함할 수 있다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 이러한 연속 유동 재조합 무세포 발현 장치는 생물학적 제제, 단백질, 효소, 바이오시밀러의 시험관내 전사, 시험관내 해독 및 시험관내 생합성 및 연속 유동 작업에서 효소를 사용한 소분자의 생합성 또는 화학적 변형을 위한 교환 배지로서 중공 섬유 및 중공 섬유 기반 생물반응기의 적용을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 목적은 다음의 바람직한 실시양태 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
1. 다음을 포함하는 재조합 무세포 발현을 위한 시스템:
- 적어도 하기 구성요소를 갖는 핵심 재조합 단백질 혼합물:
- 다수의 개시 인자(initiation factor, IF);
- 다수의 연장 인자(elongation factor, EF);
- 다수의 펩타이드 방출 인자(release factor, RF);
- 적어도 하나의 리보솜 재순환 인자(ribosome recycling factor, RRF);
- 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS); 및
- 적어도 하나의 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF);
- 적어도 하나의 핵산 합성 주형;
- 시험관내 거대분자 합성에 필수적인 무세포 반응 구성요소를 갖는 반응 혼합물; 및
- 여기서, 상기 구성요소는 거대분자의 무세포 발현을 위해 구성된 생물반응기에 위치함.
2. 실시양태 1에 있어서, 상기 핵심 재조합 단백질 혼합물의 구성요소는 박테리아로부터 유래된 핵심 재조합 단백질 혼합물을 포함하는 시스템.
3. 실시양태 2에 있어서, 박테리아로부터 유래된 상기 핵심 재조합 단백질 혼합물은 핵심 재조합 단백질 혼합물을 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 구성요소는 호열성 박테리아로부터 유래되는 것인 시스템.
4. 실시양태 2 및 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 호열성 박테리아는 호열성 바실러스과(Bacillaceae) 박테리아, 또는 지오바실러스(Geobacillus) 호열성 박테리아를 포함하는 시스템.
5. 실시양태 4에 있어서, 상기 지오바실러스 호열성 박테리아는 지오바실러스 서브테라뉴스(Geobacillus subterraneus) 및 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시스템.
6. 실시양태 1에 있어서, 박테리아로부터 유래된 상기 핵심 재조합 단백질 혼합물이 핵심 재조합 단백질 혼합물을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 구성요소는 비호열성 박테리아, 또는 비호열성 및 호열성 박테리아의 조합으로부터 유래되는 것인 시스템.
7. 실시양태 6에 있어서, 상기 비호열성 박테리아가 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)를 포함하는 시스템.
8. 실시양태 1에 있어서, 상기 다수의 개시 인자(IF)는 호열성 박테리아로부터 유래된 다수의 개시 인자를 포함하는 시스템.
9. 실시양태 1 및 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 개시 인자가 IF1, IF2, IF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
10. 실시양태 1, 8 및 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 개시 인자가 서열번호 2, 4, 6, 70, 72 및 74로 이루어진 아미노산 서열의 그룹 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
11. 실시양태 1에 있어서, 상기 다수의 연장 인자(EF)는 호열성 박테리아로부터 유래된 다수의 연장 인자를 포함하는 시스템.
12. 실시양태 1 및 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 연장 인자가 EF-G; EF-Tu; EF-Ts; EF-4; EF-P, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
13. 실시양태 1, 11, 및 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 연장 인자가 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
14. 실시양태 1에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자(RF)는 호열성 박테리아, 또는 바실러스 박테리아로부터 유래되는 다수의 펩타이드 방출 인자를 포함하는 시스템.
15. 실시양태 1 및 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 펩타이드 방출 인자가 RF1, RF2 및 RF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
16. 실시양태 1, 14, 및 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 펩타이드 방출 인자가 서열번호 18, 20, 22, 86, 88로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 것인 시스템.
17. 실시양태 1에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자(RRF)는 호열성 박테리아로부터 유래된 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
18. 실시양태 1 및 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
19. 실시양태 1, 17, 및 18 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리보솜 재순환 인자가 아미노산 서열인 서열번호 14 및 90, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
20. 실시양태 1에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS)는 호열성 박테리아, 또는 E. 콜라이로부터 유래되는 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소를 포함하는 시스템.
21. 실시양태 1 및 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 AlaRS; ArgRS; AsnRS; AspRS; CysRS; GlnRS; GluRS; GlyRS; HisRS; IleRS; LeuRS; LysRS; MetRS; PheRS (a); PheRS (b); ProRS; SerRS; ThrRS; TrpRS; TyrRS; 및 ValRS, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
22. 실시양태 1, 20, 및 21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 서열번호 26, 28, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
23. 실시양태 1에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF)가 호열성 박테리아로부터 유래된 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
24. 실시양태 1 및 23에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
25. 실시양태 1, 23 및 24 중 어느 한 실시양태에 있어서, 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 아미노산 서열인 서열번호 68 및 132, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
26. 실시양태 1에 있어서, 상기 핵산 합성 주형이 DNA 주형을 포함하는 시스템.
27. 실시양태 26에 있어서, 상기 DNA 주형이 다음을 갖는 선형 DNA 주형을 포함하는 시스템:
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 표적 서열, 여기서 상기 표적 서열은 선택적으로 코돈 최적화될 수 있음;
- 적어도 하나의 리보솜 결합 부위(RBS);
- 적어도 하나의 발현 생성물 절단 부위; 및
- 적어도 하나의 태그.
28. 실시양태 1에 있어서, 상기 핵산 합성 주형이 RNA 주형을 포함하는 시스템.
29. 실시양태 1에 있어서, 상기 반응 혼합물이 하기 구성요소 중 하나 이상을 포함하는 시스템:
- 다량의 리보솜, 선택적으로 호열성 박테리아에서 유래되는 다량의 리보솜;
- 다량의 RNase 억제제;
- 다량의 RNA 중합효소;
- 다량의 tRNA, 및 선택적으로 호열성 박테리아에서 유래되는 다량의 tRNA;
- 완충액; 및
- 다량의 아미노산.
30. 실시양태 29에 있어서, 상기 반응 혼합물이 하기 구성요소 중 하나 이상을 추가로 포함하는 시스템:
- 트리스-아세테이트;
- Mg(OAc)2;
- K+-글루타메이트;
- 아미노-아세테이트;
- NaCl;
- KC1;
- MgCk;
- DTT;
- 옥틸-b-글리코사이드;
- NAD;
- NADP;
- 소르비톨;
- FADH;
- CoA;
- PLP; 및
- SAM.
31. 실시양태 1 및 29 중 어느 한 실시양태에 있어서, 에너지원을 추가로 포함하는 시스템.
32. 실시양태 32에 있어서, 상기 에너지원이 다량의 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP)를 포함하는 시스템.
33. 실시양태 32에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 트리포스페이트가 아데닌 트리포스페이트(ATP); 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 트리포스페이트 UTP 및 시티딘 트리포스페이트(CTP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 포함하는 시스템.
34. 실시양태 31, 32, 및 33 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 에너지원이 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 포함하는 시스템.
35. 실시양태 34에 있어서, 상기 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템이 다음을 포함하는 시스템:
- 다음을 포함하는 세포의 아데노신 트리포스페이트(ATP) 에너지 재생 시스템:
- 다량의 아데노실 키나제(Gst AdK) 효소;
- 다량의 폴리포스페이트 키나제(TaqPPK) 효소;
- 다량의 무기 폴리포스페이트(PPi); 및
- 다량의 아데노신 모노포스페이트(AMP);
- 여기서, 상기 AdK 및 PPK 효소는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생함.
36. 실시양태 1에 있어서, 상기 생물반응기가 연속 유동 생물반응기를 포함하는 시스템.
37. 다음을 포함하는 재조합 무세포 발현 반응 혼합물:
- 다수의 개시 인자(IF);
- 다수의 연장 인자(EF);
- 다수의 방출 인자(RF)
- 적어도 하나의 리보솜 재순환 인자(RRF);
- 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS); 및
- 적어도 하나의 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF).
38. 실시양태 37에 있어서, 상기 다수의 개시 인자(IF)는 호열성 박테리아로부터 유래되는 다수의 개시 인자를 포함하는 시스템.
39. 실시양태 37 및 38 중 어느 한 실시양태에 있어서, 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 개시 인자가 IF1, IF2, IF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
40. 실시양태 37, 38, 및 39 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 개시 인자가 서열번호 2, 4, 6, 70, 72 및 74로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
41. 실시양태 37에 있어서, 상기 다수의 연장 인자(EF)는 호열성 박테리아로부터 유래되는 다수의 연장 인자를 포함하는 시스템.
42. 실시양태 37 및 41 중 어느 한 실시양태에 있어서, 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 연장 인자가 EF-G, EF-Tu, EF-Ts, EF-4, EF-P, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
43. 실시양태 37, 41, 및 42 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다수의 연장 인자가 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
44. 실시양태 37에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자(RF)는 호열성 박테리아, 또는 바실러스 종 박테리아로부터 유래되는 다수의 방출 인자를 포함하는 시스템.
45. 실시양태 37 및 44 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 펩타이드 방출 인자가 RF1, RF2 및 RF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
46. 실시양태 37, 44, 및 45 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 펩타이드 방출 인자가 서열번호 18, 20, 22, 86, 88로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
47. 실시양태 37에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자(RRF)가 호열성 박테리아로부터 유래된 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
48. 실시양태 37 및 47 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
49. 실시양태 37, 47, 및 48 중 어느 한 실시양태에 있어서, 리보솜 재순환 인자가 아미노산 서열인 서열번호 14 및 90, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
50. 실시양태 37에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS)는 적어도 하나가 호열성 박테리아에서 유래되는 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소를 포함하는 시스템.
51. 실시양태 37 및 50 중 어느 한 실시양태에 있어서, 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 AlaRS; ArgRS; AsnRS; AspRS; CysRS; GlnRS; GluRS; GlyRS; HisRS; IleRS; LeuRS; LysRS; MetRS; PheRS (a); PheRS (b); ProRS; SerRS; ThrRS; TrpRS; TyrRS; 및 ValRS, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
52. 실시양태 37, 50, 및 51 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 서열번호 26, 28, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어지는 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
53. 실시양태 37에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF)가 호열성 박테리아로부터 유래된 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
54. 실시양태 37 및 53 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
55. 실시양태 37, 53 및 54 중 어느 한 실시양태에 있어서, 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 아미노산 서열인 서열번호 68 및 132, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
56. 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 뉴클레오타이드:
- 서열번호 1, 3, 5 69, 71, 73;
- 서열번호 7, 9, 11, 13, 15, 75, 77, 79, 81 및 83;
- 서열번호 17, 19, 21, 85 및 87;
- 서열번호 23, 및 89; 및
- 서열번호 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129 및 131.
57. 프로모터에 작동가능하게 연결된, 실시양태 56의 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 발현 벡터.
58. 실시양태 57의 발현 벡터 중 하나에 의해 형질전환된 박테리아.
59. 실시양태 58에 있어서, 상기 박테리아가 E. 콜라이를 포함하는 형질전환된 박테리아.
60. 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드:
- 서열번호 2, 4, 6, 70, 72 및 74;
- 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84;
- 서열번호 18, 20, 22, 86, 88;
- 서열번호 14, 및 90;
- 서열번호 26, 28, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 94, 96, 서열번호 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130; 및
- 서열번호 68 및 132, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체.
61. 실시양태 60의 펩타이드 중 적어도 하나를 사용하는 무세포 발현 시스템.
본 발명의 기술의 추가적인 목적은 이하에 제시된 상세한 개시내용, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 수 있다.
본 명세서에 혼입되고 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술의 특정 측면을 설명하는 역할을 한다. 도면은 단지 본 발명의 하나 이상의 바람직한 실시양태를 예시하기 위한 것일 뿐이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1: 다음 합성효소: AlaRS, ArgRS, AsnRS, AspRS, CysRS, GlnRS(Ec), GluRS, GlyRS, HisRS, IleRS 및 tRNA 무첨가 대조군에 대한 아미노아실-tRNA-합성효소 동역학 활성 검정(Kinetic Activity Assay)의 결과를 입증한다.
도 2: 다음 합성효소: LeuRS, LysRS, MetRS, PheRS, ProRS, SerRS, ThrRS, TrpRS, TyrRS 및 ValRS와 tRNA 무첨가 대조군에 대한 아미노아실-tRNA-합성효소 동역학 활성 검정의 결과를 입증한다.
도 3a: E. 콜라이의 예시적인 tRNA를 활용한 아미노아실-tRNA-합성효소 활성 검정의 결과를 입증한다.
도 3b: 예시적인 호열성 박테리아 지오바실러스 스테아로써모필러스로부터의 tRNA를 활용한 아미노아실-tRNA-합성효소 활성 검정의 결과를 입증한다.
도 4: 본원에 기재된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용하여 녹색 형광 단백질(muGFP, 서열번호 134)) 무세포 발현 생성물의 생산을 입증한다.
도 5: 일 실시양태에서 무세포 생산 및 연속 교환에 대한 중공 섬유 반응기의 다이어그램.
도 6a-6b: 일 실시양태에서 무세포 생산 및 연속 교환에 대한 중공 섬유 반응기의 이미지.
도 7: pET151/D-TOPO 벡터는 발현된 단백질에 N-말단 태그를 추가하여 선택 합성 유전자를 위해 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E.콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. N-말단 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 8: pET24a(+) 벡터는 발현된 단백질에 C-말단 6x His-태그를 추가하여 선택 합성 유전자를 위해 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E.콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. C-말단 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 9: pNAT 벡터는 선택 클로닝 및/또는 합성 유전자를 위해, 발현된 단백질에 N-말단 FLAG 태그 및/또는 C-말단 6X His 태그를 추가하여 설계 및 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 10: pNAT 2.0 벡터는 선택 클로닝 및/또는 합성 유전자를 위해, 발현된 단백질에 N-말단 또는 C-말단 6X His 태그를 추가하여 설계 및 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 11: 다음과 같은 정제된 아미노아실-tRNA-합성효소(aaRS) 효소: AlaRS, ArgRS, AsnRS, AspRS, CysRS, GlnRS(Ec), GluRS, GlyRS, HisRS, IleRS 및 LeuRS에 대한 SDS-PAGE 결과를 입증한다.
도 12: 다음과 같은 정제된 아미노아실-tRNA-합성효소(aaRS) 효소: LysRS, MetRS, PheBRS, ProRS, SerRS, ThrRS, TrpRS, TyrRS, ValRS 및 정제된 메티오닐-tRNA-트랜스포밀라제 MTF에 대한 SDS-PAGE 결과.
도 13: 다음과 같은 정제된 해독 인자: IF-1, IF-2, IF-3, EF-G, EF-Ts, EF-Tu, EF-P, RF-1, RF-2, RF-3 및 RRF에 대한 SDS-PAGE 결과를 입증한다.
도 14: 정제된 해독 인자 EF-4에 대한 SDS-PAGE 결과를 입증한다.
도 15: 본원에 기재된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용한 형광 단백질(muGFP; 서열번호 134) 생성물의 실시간 생산을 입증한다.
도 16: 역 정제 후 리보솜 여과제거 없이 무세포 단백질 발현 반응물에 대한 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 본원에 기술된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용한 단백질 무세포 발현 생성물, 특히 de-녹색 형광 단백질(de-Green Fluorescent Protein, deGFP, 서열번호 135)의 특이적 검출을 입증한다.
도 17: (A) E. 콜라이로부터의 예시적인 tRNA를 사용한 3가지 독립적인 아미노아실-tRNA-합성효소 AMP-생산 활성 검정의 결과를 입증한다. (B) AMP 표준 곡선을 나타낸다.
도 1: 다음 합성효소: AlaRS, ArgRS, AsnRS, AspRS, CysRS, GlnRS(Ec), GluRS, GlyRS, HisRS, IleRS 및 tRNA 무첨가 대조군에 대한 아미노아실-tRNA-합성효소 동역학 활성 검정(Kinetic Activity Assay)의 결과를 입증한다.
도 2: 다음 합성효소: LeuRS, LysRS, MetRS, PheRS, ProRS, SerRS, ThrRS, TrpRS, TyrRS 및 ValRS와 tRNA 무첨가 대조군에 대한 아미노아실-tRNA-합성효소 동역학 활성 검정의 결과를 입증한다.
도 3a: E. 콜라이의 예시적인 tRNA를 활용한 아미노아실-tRNA-합성효소 활성 검정의 결과를 입증한다.
도 3b: 예시적인 호열성 박테리아 지오바실러스 스테아로써모필러스로부터의 tRNA를 활용한 아미노아실-tRNA-합성효소 활성 검정의 결과를 입증한다.
도 4: 본원에 기재된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용하여 녹색 형광 단백질(muGFP, 서열번호 134)) 무세포 발현 생성물의 생산을 입증한다.
도 5: 일 실시양태에서 무세포 생산 및 연속 교환에 대한 중공 섬유 반응기의 다이어그램.
도 6a-6b: 일 실시양태에서 무세포 생산 및 연속 교환에 대한 중공 섬유 반응기의 이미지.
도 7: pET151/D-TOPO 벡터는 발현된 단백질에 N-말단 태그를 추가하여 선택 합성 유전자를 위해 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E.콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. N-말단 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 8: pET24a(+) 벡터는 발현된 단백질에 C-말단 6x His-태그를 추가하여 선택 합성 유전자를 위해 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E.콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. C-말단 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 9: pNAT 벡터는 선택 클로닝 및/또는 합성 유전자를 위해, 발현된 단백질에 N-말단 FLAG 태그 및/또는 C-말단 6X His 태그를 추가하여 설계 및 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 10: pNAT 2.0 벡터는 선택 클로닝 및/또는 합성 유전자를 위해, 발현된 단백질에 N-말단 또는 C-말단 6X His 태그를 추가하여 설계 및 사용했다. 이 벡터에서 발현된 모든 유전자는 단백질 서열로부터 DNA로 역해독했고 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화했다. 태그는 아래에서 식별되는 특정 서열로부터 생략될 수 있다.
도 11: 다음과 같은 정제된 아미노아실-tRNA-합성효소(aaRS) 효소: AlaRS, ArgRS, AsnRS, AspRS, CysRS, GlnRS(Ec), GluRS, GlyRS, HisRS, IleRS 및 LeuRS에 대한 SDS-PAGE 결과를 입증한다.
도 12: 다음과 같은 정제된 아미노아실-tRNA-합성효소(aaRS) 효소: LysRS, MetRS, PheBRS, ProRS, SerRS, ThrRS, TrpRS, TyrRS, ValRS 및 정제된 메티오닐-tRNA-트랜스포밀라제 MTF에 대한 SDS-PAGE 결과.
도 13: 다음과 같은 정제된 해독 인자: IF-1, IF-2, IF-3, EF-G, EF-Ts, EF-Tu, EF-P, RF-1, RF-2, RF-3 및 RRF에 대한 SDS-PAGE 결과를 입증한다.
도 14: 정제된 해독 인자 EF-4에 대한 SDS-PAGE 결과를 입증한다.
도 15: 본원에 기재된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용한 형광 단백질(muGFP; 서열번호 134) 생성물의 실시간 생산을 입증한다.
도 16: 역 정제 후 리보솜 여과제거 없이 무세포 단백질 발현 반응물에 대한 항-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 본원에 기술된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용한 단백질 무세포 발현 생성물, 특히 de-녹색 형광 단백질(de-Green Fluorescent Protein, deGFP, 서열번호 135)의 특이적 검출을 입증한다.
도 17: (A) E. 콜라이로부터의 예시적인 tRNA를 사용한 3가지 독립적인 아미노아실-tRNA-합성효소 AMP-생산 활성 검정의 결과를 입증한다. (B) AMP 표준 곡선을 나타낸다.
본 발명은 환자에게 직접 전달하기에 적합한 무세포 환경에서 폴리펩타이드와 같은 치료 거대분자의 주문형(on-demand) 제조에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 주로 치료용 단백질의 제조와 관련하여 기술되고 예시될 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 독성 단백질, 방사성 표지된 아미노산, 비천연 아미노산 등을 갖는 단백질을 포함하는 임의의 유형의 단백질을 제조하는 데에도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 특히 무세포 발현을 사용한 단백질의 주문형 제조에 적합하며, 따라서 본 발명은 주로 무세포 단백질 발현의 정황에서 설명될 것이다.
본 발명은 상이한 방식으로 조합될 수 있는 다양한 측면을 포함한다. 다음 설명은 본 발명의 일부 실시양태를 설명하고 요소를 나열하기 위해 제공된다. 이러한 요소는 초기 실시형태와 함께 나열되지만, 추가 실시형태를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 설명된 실시예 및 바람직한 실시양태는 본 발명을 명시된 시스템, 기술 및 적용예만으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 이 상세한 설명은 임의의 수의 개시된 요소, 각각의 요소 단독 및 또한 본 출원 또는 임의의 후속 출원에서 모든 요소의 임의의 및 모든 다양한 순열 및 조합을 갖는 다양한 실시양태, 시스템, 기술, 방법, 장치 및 적용예 전부의 상세한 설명 및 청구범위를 지원하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 기재된 본 발명의 기술은 신규한 재조합 무세포 발현 시스템을 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명은 시험관내 발현 활성에 기여할 수 있는 다수의 핵심 부분을 포함하는 반응 혼합물의 생성을 포함할 수 있다. 예시적인 핵심 단백질은 다음을 포함할 수 있다:
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 하나 이상의 개시 인자(IF)를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 개시 인자는 펩타이드 합성 과정에서 개시 복합체의 형성을 허용할 수 있다. 예를 들어, IF1, IF2 및 IF3은 특정 실시양태에서 반응 혼합물 중 개시 인자로서 사용될 수 있다. 예를 들어, IF3는 30S 및 50S 서브유닛으로 리보솜의 해리를 촉진하고(즉, 일반적으로 해독을 개시하기 위해 필요한 단계), 개시 복합체를 형성하는 단계에서 포르밀메티오닐-tRNA 외에 다른 tRNA가 P 위치로 삽입되는 것을 방해한다. IF2는 포르밀메티오닐-tRNA에 결합하고 포르밀메티오닐-tRNA를 30s 서브유닛의 P-위치로 전달하여 개시 복합체를 형성한다. IF1은 IF2 및 IF3의 기능을 강화시킬 수 있다. 본 발명에서, 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 호열성 박테리아에서 유래되는 개시 인자, 예를 들어, 박테리아과인 바실러스과, 및/또는 지오바실러스, 예컨대 지오바실러스 서브테라뉴스, 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스에서 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 IF에 대한 예시적인 아미노산 서열은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
IF1(서열번호 2 및 70)
IF2(서열번호 4 및 72)
IF3(서열번호 6 및 74)
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 1-2, 4, 6 69-70, 72 및 74에 따른 아미노산 서열, 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 IF를 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 IF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 1-2, 4, 6, 69-70, 72 및 74에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. 콜라이와 같이 높은 수준의 단백질을 발현하도록 구성된 박테리아에서 발현 및/또는 단리된 개시 인자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 IF에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
IF1(서열번호 1 및 69)
IF2(서열번호 3 및 71)
IF3(서열번호 5 및 73)
특히, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 박테리아, 또는 효모 등과 같은 다른 단백질 발현 시스템에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 이 실시양태에서, 예시적인 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 1, 3 및 5는 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 1, 3, 5, 69, 71, 및 73에 따른 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 IF를 암호화하는 적어도 하나의 암호 영역을 포함한다. 이 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 IF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 1, 3, 5, 69, 81, 및 73에 따른 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 하나 이상의 연장 인자를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. EF-Tu와 같은 연장 인자는 2가지 유형, 즉 GTP 유형과 GDP 유형으로 분류될 수 있다. GTP 유형의 EF-Tu는 아미노아실-tRNA에 결합하여 이를 리보솜의 A 위치로 전달한다. 리보솜에서 EF-Tu가 방출되면 GTP는 GDP로 가수분해된다. 또 다른 연장 인자 EF-Ts는 GDP 유형의 EF-Tu에 결합하여 GTP 유형으로의 변환을 촉진한다. 또 다른 연장 인자 EF-G는 펩타이드 사슬 신장 과정에서 펩타이드 결합 형성 후 전위를 촉진한다. 본 발명에서, 박테리아 유래의 EF, 보다 바람직하게는 호열성 박테리아 유래의 EF, 예를 들어 박테리아과인 바실러스과 및/또는 지오바실러스 서브테라뉴스 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스와 같은 지오바실러스에서 수득되는 EF를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나 이상의 EF에 대한 예시적인 아미노산 서열은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다:
EF-G(서열번호 8 및 76)
EF-Tu(서열번호 10 및 78)
EF-Ts(서열번호 12 및 80)
EF-4(서열번호 14 및 82)
EF-P(서열번호 16 및 84)
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84에 따른 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 적어도 하나의 EF를 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 EF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. 콜라이와 같은 높은 수준의 단백질을 발현하도록 구성된 박테리아에서 발현 및/또는 단리된 EF를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 EF에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
EF-G(서열번호 7 및 75)
EF-Tu(서열번호 9 및 77)
EF-Ts(서열번호 11 및 79)
EF-4(서열번호 13 및 81)
EF-P(서열번호 15 및 83)
특히, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 박테리아, 또는 효모 등과 같은 다른 단백질 발현 시스템에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 이 실시양태에서, 예시적인 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 7, 9, 11, 13 및 15는 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 7, 9, 11, 13, 15, 75, 77, 79 및 83에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 암호화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 적어도 하나의 EF를 암호화하는 적어도 하나의 암호 영역을 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 EF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화되는 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 7, 9, 11, 13, 15, 75, 77, 79 및 83에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 하나 이상의 펩타이드 방출 인자(RF)를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. RF는 단백질 합성을 종결시키고, 해독된 펩타이드 사슬을 방출하고, 후속 mRNA 해독의 개시를 위해 리보솜을 재순환시키는 데 역할을 할 수 있다. 방출인자 없는 반응 시스템에서 단백질이 합성되는 경우, 종결 코돈 이전에 반응이 정지하여, 리보솜, 펩타이드, mRNA로 구성된 안정적인 3원 복합체(폴리솜 디스플레이)가 쉽게 형성될 수 있다. 종결 코돈(UAA, UAG 또는 UGA)이 리보솜의 A-위치에 위치하는 경우, 방출 인자 RF1 및 RF2는 A-위치로 들어가고 P-위치의 펩타이딜-tRNA로부터 펩타이드 사슬의 해리를 촉진할 수 있다. RF1은 종결 코돈 중 UAA 및 UAG를 인식하는 반면, RF2는 UAA 및 UGA를 인식한다. 또 다른 종결 인자 RF3은 RF1 및 RF2에 의한 펩타이드 사슬의 해리 후 리보솜으로부터 RF1 및 RF2의 해리를 촉진한다.
본 발명에서는 박테리아로부터의 RF를 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 호열성 박테리아 유래, 더 바람직하게는 호열성 박테리아, 예를 들어 박테리아과인 바실러스과 및/또는 지오바실러스 서브테라뉴스 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스와 같은 지오바실러스에서 수득된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나 이상의 RF에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
RF1(서열번호 18 및 86)
RF2(서열번호 20 및 88)
RF3(서열번호 22)
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 18, 20, 22, 86, 및 88에 따른 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 RF를 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 RF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 18, 20, 22, 86, 및 88에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. 콜라이와 같은 높은 수준의 단백질을 발현하도록 구성된 박테리아에서 발현 및/또는 단리된 RF를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 RF에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
RF1(서열번호 17 및 85)
RF2(서열번호 19 및 87)
RF3(서열번호 21)
특히, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 박테리아, 또는 효모 등과 같은 다른 단백질 발현 시스템에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 이 실시양태에서, 예시적인 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 17, 19 및 21은 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 17, 19, 21, 85, 및 87에 따른 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 적어도 하나의 RF를 암호화하는 적어도 하나의 암호 영역을 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 RF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 17, 19, 21, 85, 및 87에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 단백질 합성 후 P-위치에 남아 있는 tRNA의 해리 및 후속 단백질 합성을 위한 리보솜의 재순환을 촉진하는 하나 이상의 리보솜 재순환 인자(RRF)를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 박테리아로부터의 RRF, 보다 바람직하게는 호열성 박테리아로부터, 더욱 바람직하게는 호열성 박테리아, 예를 들어 박테리아 과인 바실러스과 및/또는 지오바실러스 서브테라뉴스(Geobacillus subterraneus) 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)와 같은 지오바실러스에서 수득되는 RRF를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나 이상의 RRF에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
RRF(서열번호 24 및 90)
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 23 및 90에 따른 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 RRF를 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 RRF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 23 및 90에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. 콜라이와 같은 높은 수준의 단백질을 발현하도록 구성된 박테리아에서 발현 및/또는 단리된 RRF를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 RRF에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
RRF(서열번호 23 및 89)
특히, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 박테리아, 또는 효모 등과 같은 다른 단백질 발현 시스템에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 이 실시양태에서 예시적인 뉴클레오타이드 서열인 서열번호 23은 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 23 및 89에 따른 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 암호화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 적어도 하나의 RF를 암호화하는 적어도 하나의 암호 영역을 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 RF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 23 및 89에 따르는, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 아미노아실-tRNA 합성효소는 ATP 존재하에 아미노산을 tRNA에 공유결합시켜 아미노아실-tRNA를 합성하는 효소이다. 본 발명에서, 호열균-기원의 아미노아실-tRNA 합성효소, 예를 들어 박테리아 그룹 바실러스과 및/또는 지오바실러스, 또는 보다 구체적으로 G. 스테아로써모필러스 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스 종으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 추가 실시양태는 비호열균, 예컨대 E. 콜라이로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소의 사용을 포함할 수 있으며, 이러한 사용은 호열균 기원의 아미노아실-tRNA 합성효소와 함께 사용된다. 아미노아실-tRNA 합성효소에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
AlaRS(서열번호 26 및 서열번호 92)
ArgRS(서열번호 28 및 서열번호 94)
AsnRS(서열번호 30 및 서열번호 96)
AspRS(서열번호 32 및 서열번호 98)
CysRS(서열번호 34 및 서열번호 100)
GlnRS(Ec)(서열번호 36)
GluRS(서열번호 38 및 서열번호 102)
GlyRS(서열번호 40 및 서열번호 104)
HisRS(서열번호 42 및 서열번호 106)
IleRS(서열번호 44 및 서열번호 108)
LeuRS(서열번호 46 및 서열번호 110)
LysRS(서열번호 48 및 서열번호 112)
MetRS(서열번호 50 및 서열번호 114)
PheRS(a)(서열번호 52 및 서열번호 116)
PheRS(b)(서열번호 54 및 서열번호 118)
ProRS(서열번호 56 및 서열번호 120)
SerRS(서열번호 58 및 서열번호 122)
ThrRS(서열번호 60 및 서열번호 124)
TrpRS(서열번호 62 및 서열번호 126)
TyrRS(서열번호 64 및 서열번호 128)
ValRS(서열번호 66 및 서열번호 130)
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 134, 126, 128, 및 130에 따른 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 하나의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 RS를 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 RS의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 134, 126, 128, 및 130에 따른, 각각 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 아미노산 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. 콜라이와 같은 높은 수준의 단백질을 발현하도록 구성된 박테리아에서 발현 및/또는 분리된 RS를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 RS에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
AlaRS(서열번호 25 및 서열번호 91)
ArgRS(서열번호 27 및 서열번호 93)
AsnRS(서열번호 29 및 서열번호 95)
AspRS(서열번호 31 및 서열번호 97)
CysRS(서열번호 33 및 서열번호 99)
GlnRS(Ec)(서열번호 35)
GluRS(서열번호 37 및 서열번호 101)
GlyRS(서열번호 39 및 서열번호 103)
HisRS(서열번호 41 및 서열번호 105)
IleRS(서열번호 43 및 서열번호 107)
LeuRS(서열번호 45 및 서열번호 109)
LysRS(서열번호 47 및 서열번호 111)
MetRS(서열번호 49 및 서열번호 113)
PheRS(a)(서열번호 51 및 서열번호 115)
PheRS(b)(서열번호 53, 및 서열번호 117)
ProRS(서열번호 55 및 서열번호 119)
SerRS(서열번호 57 및 서열번호 121)
ThrRS(서열번호 59 및 서열번호 123)
TrpRS(서열번호 61 및 서열번호 125)
TyrRS(서열번호 63 및 서열번호 127)
ValRS(서열번호 65 및 서열번호 129)
특히, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 박테리아, 또는 효모 등과 같은 다른 단백질 발현 시스템에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 이 실시양태에서, 예시적인 뉴클레오타이드 서열인, 서열번호 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65는 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 및 129에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 RS를 암호화하는 적어도 하나의 암호 영역을 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 RS의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 및 129에 따른 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF)를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 메티오닌의 단부에 있는 아미노기에 부착된 포르밀기를 운반하는 N-포르밀메티오닌은 원핵생물 단백질 합성 시스템에서 개시 아미노산으로서 작용한다. 이 포르밀기는 MTF에 의해 메티오닐-tRNA의 메티오닌에 부착된다. 즉, MTF는 Nlυ-포르밀테트라하이드로폴레이트의 포르밀기를 개시 코돈에 해당하는 메티오닐-tRNA의 N-말단으로 전달하여 포르밀메티오닐-tRNA를 제공한다. 이렇게 부착된 포르밀기는 IF2에 의해 인식되어 단백질 합성의 개시 신호로서 작용한다. 본 발명에서, 박테리아로부터의 MTF, 보다 바람직하게는 호열성 박테리아로부터, 보다 바람직하게는 호열성 박테리아, 예를 들어 박테리아과인 바실러스과, 및/또는 지오바실러스 서브테라뉴스 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스와 같은 지오바실러스로부터 수득된 MTF를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나 이상의 MTF에 대한 예시적인 아미노산 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
MTF(서열번호 68 및 132)
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 아미노산 서열 중 하나 이상은 이에 따라 서열번호 68 및 132에 따른 아미노산 서열 또는 이들 아미노산 서열 중 어느 한 서열의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 MTF를 포함한다. 이러한 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 MTF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 68 및 132에 따른, 각각의 자연 발생의 전체 길이의 단백질 또는 이의 변이체의 아미노산 서열과 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 하나 이상의 박테리아, 보다 바람직하게는 E. 콜라이에서와 같이 높은 수준의 단백질을 발현하도록 구성된 박테리아에서 발현 및/또는 단리된 MTF를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 MTF에 대한 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다:
MTF(서열번호 67 및 131)
특히, 이 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 박테리아, 또는 효모 등과 같은 다른 단백질 발현 시스템에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 예를 들어, 이 실시양태에서 예시적인 뉴클레오타이드 서열인, 서열번호 67은 E. 콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 뉴클레오타이드 서열 67 및 131에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편 또는 변이체에 의해 암호화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어지는 적어도 하나의 MTF를 암호화하는 적어도 하나의 암호 영역을 포함한다. 이 문맥에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 MTF의 적어도 하나의 암호 영역에 의해 암호화된 단백질의 단편 또는 이의 변이체는 전형적으로, 바람직하게는 본원에 개시된 서열번호 67 및 131에 따른, 각각 자연 발생의 전체 길이의 단백질의 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 변이체와 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 또는 심지어 97%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 다량의 리보솜을 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 리보솜은 입자이며, 여기서 펩타이드가 합성된다. 이것은 mRNA에 결합하고 아미노아실-tRNA를 A-위치에, 포르밀메티오닐-tRNA 또는 펩타이딜-tRNA를 P-위치에 배위시켜 펩타이드 결합을 형성한다. 본 발명에서, 임의의 리보솜은 기원에 관계없이 사용될 수 있지만, 바람직한 실시양태에서, 리보솜은 재조합 무세포 발현 시스템에 사용하기 위해 호열성 박테리아로부터 단리될 수 있으며, 바람직하게는 박테리아과인 바실러스과, 및/또는 지오바실러스 서브테라뉴스 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스와 같은 지오바실러스와 같은 호열성 박테리아의 세포 용해물로부터 단리될 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 DNA 서열을 RNA로 전사시키는 효소이며 다양한 유기체에서 발생하는 다량의 RNA 중합효소 또는 이의 단편 또는 변이체를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 일 예로서, 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명은 T7 RNA 중합효소, 예를 들어 아미노산 서열, 서열번호 136에 따른 T7 RNA 중합효소를 포함할 수 있다. T7 RNA 중합효소는 T7 프로모터라고 하는 특정 DNA 서열에 결합한 다음, 하류 DNA 서열을 RNA로 전사시키는 효소로서, T7 파지에서 유래한다. 본 발명에는 T7 RNA 중합효소 외에도 다양한 RNA 중합효소가 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 다량의 RNase 억제제를 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. RNase 효소는 올리고뉴클레오타이드로의 RNA의 붕괴를 촉진했다. RNase 억제제는 본 기술분야에 공지되어 있으며; 이와 같이, 재조합 무세포 발현 시스템에 포함될 RNase 억제제의 유형 및 양은 본 기술분야의 기술자의 기술 범위 내에 있다. RNase 억제제의 비제한적인 예는 포유류 리보뉴클레아제 억제제 단백질 [예를 들어, 돼지 리보뉴클레아제 억제제 및 인간 리보뉴클레아제 억제제 (예를 들어, 인간 태반 리보뉴클레아제 억제제 및 재조합 인간 리보뉴클레아제 억제제)], 아우린트리카복실산(ATA) 및 이의 염 [예를 들어, 트리암모늄 아우린트리카복실레이트(알루미논)], 아데노신 5'-피로포스페이트, 2'-시티딘 모노포스페이트 유리산(2'-CMP), 5'-디포스포아데노신 3'-포스페이트(ppA-3'-p), 5'-디포스포아데노신 2'-포스페이트(ppA-2'-p), 류신, 올리고비닐술폰산, 폴리(아스파르트산), 티로신-글루탐산 중합체, 5'-포스포-2'-데옥시우리딘 3'-피로포스페이트 P'→아데노신 3'-포스페이트와의 5'-에스테르(pdUppAp), 및 이의 유사체, 유도체 및 염을 포함한다.
일 실시양태에서, 재조합 무세포 발현 시스템은 다량의 아미노산, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 전형적으로 플라스미드 합성 주형 또는 선형 발현(또는 합성) 주형(LET 또는 LST)의 형태로 표적 서열을 암호화하는 mRNA 또는 DNA 주형, 및 무기 폴리포스페이트 에너지-재생 시스템에 관한 '121 출원에서 식별된 다른 화합물 및 서열, 및 바람직하게는 시험관내 발현 반응을 효과적으로 유도하는데 필수적일 수 있는 커플링된 AdK/PPK 에너지 재생 시스템을 갖는 반응 혼합물을 포함할 수 있다.
'121 출원(본원에 참고로 포함됨)의 도 8에 일반적으로 도시된 바와 같이, 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 단리 및 정제된 Gst AdK(본원에 참고로 포함된 '121 출원의 서열번호 8) 및/또는 TaqPPK(본원에 참고로 포함되는 '121 출원의 서열번호 11)는 다량의 무기 폴리포스페이트와 함께 이 무세포 발현 시스템에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 이러한 양의 무기 폴리포스페이트는 최적의 폴리포스페이트 농도 범위를 포함할 수 있다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 이러한 최적의 폴리포스페이트 농도 범위는 일반적으로 반응의 평형을 안정하게 유지하는 무기 폴리포스페이트(PPi)의 농도로서 정의된다. 이러한 바람직한 실시양태에서, 최적의 폴리포스페이트 농도 범위는 약 0.2 내지 2 mg/ml PPi일 수 있다.
위에서 언급했듯이, PPK는 폴리포스페이트와 AMP로부터 ADP를 합성할 수 있다. 이 바람직한 실시양태에서 Gst AdK와 PPK의 커플링된 작용은 2개의 ADP를 1개의 ATP와 1개의 아데노신 모노포스페이트(AMP)로 전환시킴으로써 시스템으로부터 아데노신 디포스페이트(ADP)를 제거할 수 있다:
이 반응은 ADP 생성쪽으로 PPK의 평형 반응을 유도하기에 충분히 빠를 수 있다:
이 시스템에서 더 높은 농도의 AMP의 존재는 ADP쪽으로 TaqPPK 반응을 더욱 유도할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 무세포 시스템을 사용한 거대분자의 생산은 생물반응기 시스템에서 달성될 수 있다. 본원에 사용된 "생물반응기"는 시험관내에서 거대분자의 생산에 도움이 되는 환경을 유지하도록 구성된 밀폐된 장치의 임의의 형태일 수 있다. 생물반응기는, 예를 들어 주입기 반응 용액에 의해, 회분식, 연속식 또는 반연속식 기반으로 실행되도록 구성될 수 있다. '121 출원(본원에 참고로 포함됨)의 도 14를 참조하면, 본 실시양태에서 본 발명은 무세포 배양 장치를 추가로 포함할 수 있다. 이 세포 배양 장치는, 특정 바람직한 실시양태에서 호열성 박테리아를 배양하도록 구성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서 발효 용기는 제거가능하고 별도로 오토클레이브 가능하다. 또한, 이 무세포 배양 장치는 혐기성은 물론 호기성인 유기체의 성장을 제공하도록 구성될 수 있다. 또한, 무세포 발현 생물반응기 및 무세포 배양 장치는 모두 미세조류, 식물 세포 등과 같은 다양한 세포 배양물을 수용할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명은 연속 교환 또는 유동 생물반응기(1)를 이용한 작업에 특히 적합할 수 있다. 이 바람직한 실시양태에서, 이 연속 교환 생산 장치는 생물학적 제제, 백신, 단백질, 효소, 바이오시밀러의 시험관내 전사, 시험관내 해독 및 시험관내 생합성, 및 연속 유동 작업에서 효소를 사용한 소분자의 생합성 또는 화학적 변형을 위한 교환 배지로서 다수의 섬유 및 중공 섬유 기반의 생물반응기를 포함할 수 있다.
일반적으로 도 5를 참조하면, 연속 유동 생물반응기 장치는 생물학적 제제, 단백질, 효소, 바이오시밀러의 시험관내 전사, 시험관내 해독 및 시험관내 생합성 및 연속 유동 작업에서 효소를 사용한 소분자의 생합성 또는 화학적 변형을 위한 교환 배지로서 하나 이상의 중공 섬유(2) 및 중공 섬유 기반의 생물반응기(2)를 포함할 수 있다. 이 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 기질의 연속 공급은 장치에 도입될 수 있고, 또한 중공 섬유 반응기(2)의 내부 및 외부 구획 사이의 농도 구배를 통해 반응 생성물의 제거와 동반될 수 있는 것이며, 내부 구획의 "통과(flow-through)" 용액으로부터 단리될 수 있는, 생물학적 물질 또는 생물학적 변형 물질의 회분 독립적 생산 및 작업 시간의 연장을 허용한다.
도 5a 및 5b에 도시된 바와 같이, 예시적인 중공 섬유 반응기(2)의 작업이 설명된다. 이 실시양태에서, 주입 용액은 반응기(3)의 내부 구획을 통해 전진하는 동안, 섬유의 투과성은 mRNA 합성을 위한 기질(뉴클레오타이드), 일반 단백질(아미노산), 기질(화합물의 시험관내 생합성 또는 화학적 변형을 위한 것) 및 '121 출원으로부터 본원에 포함되는 것으로서 리보솜의 작동을 위해 ATP 및 GTP(뉴클레오타이드 키나제, 예를 들어 NDPK를 통해)를 제공하기 위한 ATP 재생 시스템의 연속 공급을 허용하고, 외부 구획(4)은 연속 교환에서 시험관내 전사, 시험관내 해독, 및 시험관내 생합성 반응을 유도하는 효소 및 인자를 함유한다. 생산된 단백질, 효소 및 큰 생물학적 제제는 도 5b에 도시된 바와 같은 밀폐 루프 시스템에서 단리 및 정제된다. 이 밀폐 루프 시스템은 생성물의 잠재적 오염의 위험, 유출 또는 노출을 예방 및/또는 감소시키며, 처리되어야 할 부피를 감소시키고, 임의의 종류의 생물학적 제제에 대한 생산 공간의 점유면적을 감소시킨다. 반응 용기의 부피에 대한 간단한 증가는 연구 규모의 생합성에서부터 산업적 규모의 생산까지 적용을 가능하게 한다. 따라서, 공정 확장 및 개발 일정에 대한 개발 노력과 비용을 줄일 수 있다.
본원에 사용된 시험관내 재조합 무세포 발현은 생물학적 추출물 및/또는 정해진 무세포 반응 구성요소를 포함하는 반응 혼합물 또는 용액에서 폴리펩타이드의 무세포 합성을 지칭한다. 반응 혼합물은 거대분자의 생산을 위한 주형 또는 유전자 주형, 예를 들어, DNA, mRNA 등; 합성될 거대분자를 위한 단량체, 예를 들어, 아미노산, 뉴클레오타이드 등; 및 합성에 필수적인 보조 인자, 효소 및 기타 시약, 예를 들어 리보솜, tRNA, 중합효소, 전사 인자 등을 포함할 수 있다. 재조합 무세포 합성 반응 및/또는 본 명세서에 참고로 포함된 세포의 아데노신 트리포스페이트(ATP) 에너지 재생 시스템 구성요소는 회분식, 연속 유동 또는 반연속 유동으로서 수행/첨가될 수 있다.
본 발명에 의해 발현될 수 있는 일부 표적 단백질은 백신, 진핵생물 펩타이드, 원핵생물 펩타이드, 박테리아 관련 펩타이드, 진균 관련 펩타이드, 효모 관련, 인간 관련 펩타이드, 식물 관련 펩타이드, 독소 펩타이드, 혈관활성 장 펩타이드, 바소프레신 펩타이드, 신규 또는 인공적으로 조작된 펩타이드, 바이러스 관련 펩타이드, 박테리오파지 관련 단백질, 호르몬, 항체, 세포 수용체, 세포 조절 단백질 및 위에 열거한 임의의 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 유전자 변경된 유기체의 생산을 수반하고 재조합 DNA 기술을 수반하기 때문에, 본 발명을 설명하는 데 도움을 주기 위해 다음 정의가 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태에서 또는 물질이 생산될 때 물질에 보통 동반되는 구성요소가 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, 순도 및 균질성은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정한다. 제제에 존재하는 주요 종인 핵산 또는 특정 박테리아는 실질적으로 정제된다. 예시적인 실시양태에서, 용어 "정제된"은 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 발생시키는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 전형적으로, 단리된 핵산 또는 단백질은 범위로 표현된 순도 수준을 갖는다. 구성요소에 대한 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 초과이다.
바람직한 실시양태에서, 무세포 발현 시스템의 산출물은 단리 또는 정제될 수 있는 펩타이드 또는 이의 단편과 같은 생성물일 수 있다. 실시양태에서, 표적 단백질의 단리 또는 정제에서, 표적 단백질은 반응 혼합물 중 적어도 하나의 다른 구성요소로부터, 예를 들어 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 침전과 같은 유기 용매 침전, 트리클로로아세트산(TCA) 또는 황산암모늄 침전과 같은 유기 또는 무기 염 침전, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전과 같은 비이온성 중합체 침전, pH 침전, 온도 침전, 면역침전, 크로마토그래피 분리, 예컨대 흡착, 이온 교환, 친화도 및 겔 배제 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 등전점 포커싱, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 겔 전기영동, 투석, 정밀여과 등에 의해 적어도 부분적으로 분리된다.
본원에 사용된 용어 "활성"은 전체 길이(완전) 단백질과 관련된 펩타이드 또는 이의 일부의 기능적 활성 또는 활성들을 지칭한다. 기능적 활성으로는 촉매 또는 효소 활성, 항원성(항-폴리펩타이드 항체에 결합하기 위해 폴리펩타이드와 결합하거나 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력, 및 폴리펩타이드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 생성된 단백질의 활성은 약 0℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 3일 동안 초기 활성의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상을 유지한다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. 전형적으로 "핵산" 중합체는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 발생하지만, 3개 이상의 가닥을 포함하는 구조를 형성하는 것도 알려져 있다. 용어 "핵산"은 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 참조 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 합성, 자연 발생, 및 비-자연 발생인 공지된 뉴클레오타이드 유사체, 변형된 백본 잔기 또는 결합을 포함하는 핵산 뿐만 아니라 자연 발생의 핵산 중합체를 포함한다. 예시적인 유사체는 제한 없이 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 및 펩타이드-핵산(PNA)을 포함한다. "DNA", "RNA", "폴리뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 서열", "올리고뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", "핵산 단편" 및 " 단리된 핵산 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 핵산의 경우, 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)으로 제공된다. 추정치는 전형적으로 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 서열결정된 핵산, 또는 공개된 DNA 서열에서 유래된다. 단백질의 경우, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기 수로 제공된다. 단백질 크기는 겔 전기영동, 서열결정된 단백질, 유도된 아미노산 서열 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.
본원에 사용된 용어 "표적 단백질"은 일반적으로 약 5개 초과의 아미노산을 갖는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 폴리펩타이드는 상동성일 수 있거나, 바람직하게는 외인성일 수 있으며, 이는 이들이 생산될 수 있는 박테리아 세포의 박테리아에 대해 이종성, 즉 외래인 것을 의미하며, 예컨대, E. 콜라이와 같은 숙주 박테리아에서 생산된 인간 단백질 또는 효모 단백질이다. 바람직하게는, 포유류 폴리펩타이드, 바이러스, 박테리아, 진균 및 인공 조작된 폴리펩타이드가 사용된다.
본 기술분야에 공지된 바와 같이, 상이한 유기체는 폴리펩타이드를 생성하기 위해 상이한 코돈을 우선적으로 사용한다. 이러한 "코돈 용법" 선호도는 특정 숙주 세포계에서 발현을 최적화하기 위해 본 발명의 단백질 및 키메라를 암호화하는 핵산 분자의 설계에 사용될 수 있다.
본 발명에 기술된 모든 뉴클레오타이드 서열은 특정 유기체에서의 발현 또는 생산 수율의 증가를 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 일반적으로 관심 유전자의 해독 효율을 증가시켜 단백질 발현을 개선시킨다. 유전자의 기능은 또한 맞춤 설계된 유전자 내에서 코돈 용법을 최적화함으로써 증가시킬 수 있다. 코돈 최적화 실시양태에 따르면, 종에서 빈도가 낮은 코돈은 빈도가 높은 코돈으로 대체될 수 있으며, 예를 들어 빈도가 낮은 코돈 UUA는 류신용으로 빈도가 높은 코돈 CUG로 대체될 수 있다. 코돈 최적화는 mRNA 안정성을 증가시켜 단백질 해독 또는 단백질 접힘 속도를 조정할 수 있다. 또한, 코돈 최적화는 전사 및 해독 제어를 맞춤화하고, 리보솜 결합 부위를 변형시키거나, mRNA 분해 부위를 안정화할 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 상보적(또는 보체) 서열, 및 역보체 서열, 뿐만 아니라 명시된 서열을 내포한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다(예를 들어, Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260:2605-2608(1985) 및 Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)). 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 코돈의 축퇴 성질 외에도, 주어진 부위에서 화학적으로 동등한 아미노산을 생성하지만 암호화된 폴리펩타이드의 기능적 특성에는 영향을 미치지 않는 폴리뉴클레오타이드의 변경은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. "보존적 아미노산 치환"은 참조 폴리펩타이드의 특성을 최소한으로 방해할 것으로 예측되는 치환이다. 즉, 보존적 아미노산 치환은 참조 단백질의 구조와 기능을 실질적으로 보존한다. 따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 글리신과 같은 또 다른 덜 소수성인 잔기, 또는 발린, 류신 또는 이소류신과 같은 더 소수성인 잔기를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있다. 유사하게, 하나의 음하전 잔기를 또 다른 것으로 치환시키는 변화, 예컨대 글루탐산 대신 아스파르트산으로 치환, 또는 하나의 양하전 잔기를 다른 것으로 치환시키는 변화, 예컨대, 아르기닌 또는 히스티딘 대신 리신으로의 변화는 기능적으로 등가의 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산할 것으로 예측할 수도 있다. 예시적인 보존적 아미노산 치환은 본 기술분야의 기술자에게 알려져 있다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환 영역 중 폴리펩타이드 백본의 구조, 예를 들어, 베타 시트 또는 알파 나선 입체구조, (b) 치환 부위에 있는 분자의 전하 또는 소수성, 및/또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지한다.
상동성(예를 들어, 상동성 퍼센트, 서열 동일성 + 서열 유사성)은 쌍을 이룬 서열 정렬을 계산하는 임의의 상동성 비교 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 두 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 정황에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 정렬했을 때 동일한 두 서열 내의 잔기에 대한 언급을 포함한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 서로 다른 것으로 인식되어야 하며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되어, 분자의 기능성 성질을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환으로 상이한 경우, 서열 동일성 퍼센트는 치환의 보존 본성을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것이라 한다. 이 조정을 제조하는 수단은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 이것은 보존적 치환을 완전 불일치보다는 오히려 부분 불일치로서 채점하여, 서열 동일성 백분율을 증가시키는 것을 수반한다. 즉, 예를 들어, 동일한 아미노산이 1점으로 채점되고 비보존적 치환이 0점으로 채점되는 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이로 채점된다. 보존적 치환의 채점은 예를 들어, Henikoff S and Henikoff JG. [Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915-9]의 알고리즘에 따라 계산한다.
특정 실시양태에 따르면, 상동성 서열은 본원에 제공된 서열(핵산 또는 아미노산 서열)에 적어도 60, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 심지어 동일한 것이다. 50% 내지 99% 사이의 서열번호 1 내지 22의 상동성 서열은 본 발명의 특정 실시양태에 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "프라이머"는 적합한 조건 하에 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 이러한 조건으로는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 확장 생성물의 합성이 적절한 완충액 및 적합한 온도에서 4가지 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 확장 작용제(예를 들어, DNA 중합효소 또는 역전사효소)의 존재 하에 유도되는 것을 포함한다.
프라이머는 바람직하게는 단일 가닥 DNA이다. 프라이머의 적절한 길이는 프라이머의 의도된 용도에 따라 달라지지만, 전형적으로 약 6 내지 약 225개의 뉴클레오타이드 범위이고, 이는 예컨대 15 내지 35개 뉴클레오타이드, 18 내지 75개 뉴클레오타이드 및 25 내지 150개 뉴클레오타이드와 같은 중간 범위를 포함한다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 혼성 복합체를 형성하기 위해 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머는 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만 주형과 혼성화하기에 충분히 상보적이어야 한다. 주어진 표적 서열의 증폭에 적합한 프라이머의 디자인은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 본원에 인용된 문헌에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "중합효소"는 뉴클레오타이드의 중합을 촉매하는 효소를 지칭한다. "DNA 중합효소"는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합을 촉매한다. 공지된 DNA 중합효소는, 예를 들어, 특히 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus, Pfu) DNA 중합효소, E. 콜라이 DNA 중합효소 I, T7 DNA 중합효소 및 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq) DNA 중합효소를 포함한다. "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오타이드의 중합을 촉매한다. DNA 중합효소의 전술한 예는 DNA 의존성 DNA 중합효소로도 알려져 있다. RNA 의존성 DNA 중합효소는 또한 DNA 중합효소의 범위에 속한다. 레트로바이러스에 의해 암호화된 바이러스 중합효소를 포함하는 역전사효소는 RNA 의존성 DNA 중합효소의 일 예이다. RNA 중합효소("RNAP")의 공지된 예는, 예를 들어, 특히 T3 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소 및 E. 콜라이 RNA 중합효소를 포함한다. RNA 중합효소의 전술한 예는 또한 DNA 의존성 RNA 중합효소로도 알려져 있다. 임의의 상기 효소의 중합효소 활성은 본 기술분야에 잘 알려진 수단에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "반응 혼합물" 또는 "무세포 반응 혼합물" 또는 "재조합 무세포 반응 혼합물"은 주어진 반응을 수행하는 데 필수적인 시약을 함유하는 용액을 지칭한다. 무세포 발현 시스템 "반응 혼합물" 또는 "반응 용액"은 전형적으로 미정제 또는 부분적으로 정제된 추출물(예컨대, 박테리아, 식물 세포, 미세조류, 진균 또는 포유류 세포 유래) 뉴클레오타이드 해독 주형, 및 해독 주형으로부터 무세포 단백질 합성을 촉진하기에 적합한 반응 완충액을 함유한다. 일 측면에서, CF 반응 혼합물은 외인성 RNA 해독 주형을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, CF 반응 혼합물은 DNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 DNA 발현 주형을 포함할 수 있다. 이들 다른 측면에서, CF 반응 혼합물은 또한 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 RNA 해독 주형의 전사를 유도하기 위해 DNA-의존성 RNA 중합효소를 포함할 수 있다. 이들 다른 측면에서, 추가의 NTP 및 2가 양이온 보조인자가 CF 반응 혼합물에 포함될 수 있다. 반응 혼합물은 반응을 가능하게 하는 데 필수적인 모든 시약을 함유한다면 완전한 것으로 지칭되며, 필수 시약의 부분세트만을 함유한다면, 불완전한 것으로 지칭된다. 본 기술분야의 통상의 기술을 가진 자라면, 반응 구성요소는 편의, 저장 안정성의 이유로 또는 구성요소 농도의 적용예-의존적 조정을 허용하기 위해, 각각 전체 구성요소의 부분세트를 함유하는 별도의 용액으로서 관례적으로 저장되고, 반응 구성요소들은 반응 전에 조합되어 완전한 반응 혼합물을 생성한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 반응 구성요소는 상업화를 위해 별도로 포장되고, 본 발명의 반응 구성요소의 임의의 부분세트를 유용한 상업적 키트가 함유할 수 있다는 것을 본 기술분야의 통상의 기술을 가진 자라면 이해할 것이다. 더욱이, 통상의 기술을 가진 자는 반응 혼합물 중 일부 구성요소가 특정 실시양태에서는 활용되지만, 무세포 발현 생성물을 생성하는 데 필수적인 것은 아님을 이해할 것이다. "무세포 발현 생성물"이라는 용어는 무세포 발현 시스템을 통해 생성된 임의의 생물학적 생성물일 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 시간 프레임, 온도, 압력 또는 부피와 같은 값 또는 값들의 통계적으로 의미있는 범위 내를 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 더욱 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. "약" 또는 "대략"에 포함된 허용가능한 변동은 연구 중인 특정 시스템에 따라 달라질 것이다. "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것이며, 본원에서 달리 표시되지 않는 한, 그 범위를 한정하는 종말점 경계를 포함하며, 각각 별도의 값은 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
용어 "재조합" 또는 "유전자 변형된"은, 예를 들어, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우, 세포, 유기체, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었음을 나타내거나, 이와 같이 변형된 세포로부터 세포가 유래되는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비재조합 또는 야생형) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현할 수 있거나, 또는 달리 비정상적으로 발현되거나, 과발현되거나, 과소발현되거나, 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "유전자 변형된"은 세포 내로 하나 이상의 핵산 분자(들)의 전달을 지칭한다. 미생물은 핵산 분자가 안정적으로 복제되는 경우 박테리아 또는 세포 또는 유기체로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환"되거나 "유전자 변형"된다. 본원에 사용된 용어 "형질전환" 또는 "유전자 변형된"은 핵산 분자가 박테리아와 같은 세포 또는 유기체 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 전사 개시로부터 상류에 있을 수 있는 DNA 영역을 지칭하는 것으로서, RNA 중합효소 및 기타 단백질의 인식 및 결합에 관여하여 전사를 개시할 수 있다. 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 암호 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 프로모터는 세포에서 발현시키기 위한 암호 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
조절 서열 및 암호 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 연결된 암호 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 연관된 암호 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 해독의 타이밍 및 수준/양에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 해독 리더 서열; 인트론; 인핸서; 줄기-루프 구조; 억제인자 또는 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열; 등을 포함할 수 있다. 특정 조절 서열은 이에 작동가능하게 연결된 암호 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 암호 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절 서열은 이중 가닥 핵산 분자의 연관된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "게놈(genome)"은 세포의 핵 내에서 발견되는 염색체 DNA를 지칭하며, 또한 세포의 하위세포 구성요소 내에서 발견되는 소기관 DNA를 지칭한다. 박테리아에 적용되는 경우 용어 "게놈"은 박테리아 세포 내의 염색체 및 플라스미드를 모두 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, DNA 분자는 이 DNA 분자가 박테리아의 게놈 내로 통합되도록 박테리아 내로 도입될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, DNA 분자는 염색체로 통합되거나, 또는 안정한 플라스미드로서 또는 안정한 플라스미드 내에 위치할 수 있다.
용어 "유전자" 또는 "서열"은 유전자 생성물(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA)의 발현을 몇몇 방식으로 조절할 수 있는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 결합된 암호 영역을 지칭한다. 유전자는 암호화 영역(오픈 리딩 프레임, ORF)의 앞(상류) 및 뒤(하류)에 DNA의 미해독 조절 영역(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 억제인자 등) 뿐만 아니라 적용 가능한 경우, 개별 암호 영역(즉, 엑손) 사이의 개재 서열(즉, 인트론)을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "구조 유전자"는 mRNA로 전사된 후 특정 폴리펩타이드의 특징적인 아미노산 서열로 해독되는 DNA 서열을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "발현" 또는 "암호 서열의 발현"(예를 들어, 유전자 또는 전이유전자)은 핵산 전사 단위(예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA 포함)의 암호화된 정보가 세포의 작동성, 비작동성 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정을 지칭하며, 종종 단백질 합성을 포함한다. 유전자 발현은 외부 신호에 의해 영향을 받을 수 있다; 예를 들어, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 대한 세포, 조직 또는 유기체의 노출. 유전자의 발현은 또한 DNA에서 RNA로, 그리고 단백질에 이르는 경로 중 임의의 곳에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 예를 들어 전사, 해독, RNA 수송 및 프로세싱, mRNA와 같은 중간 분자의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 만들어진 후 그의 활성화, 비활성화, 구획화 또는 분해를 통해, 또는 이의 조합에 의해 발생한다. 유전자 발현은 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯 또는 시험관내, 동일계내 또는 생체내 단백질 활성 검정(들)을 포함하나 이에 제한되지 않는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
"벡터"라는 용어는 DNA, RNA, 단백질 또는 폴리펩타이드를 숙주에 도입시킬 수 있는 일부 수단을 지칭한다. 숙주 내로 도입될 폴리뉴클레오타이드, 단백질 및 폴리펩타이드는 본질적으로 치료적 또는 예방적일 수 있고; 항원을 암호화하거나 항원일 수 있으며; 본래 조절성 등일 수 있다. 벡터에는 바이러스, 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 및 박테리아를 비롯한 다양한 유형이 있다.
"발현 벡터"는 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 복제할 수 있는 핵산이다. 발현 벡터는 자율적 구조로 복제할 수 있거나, 또는 대안적으로 전체 또는 부분이 숙주 세포 염색체 또는 세포 소기관의 핵산에 통합될 수 있거나, 외래 DNA를 세포로 전달하기 위한 셔틀로 사용되어, 숙주 세포 게놈과 함께 복제된다. 따라서, 발현 벡터는 선택된 숙주 세포, 소기관 또는 유기체, 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, 핵산 단편에서 복제할 수 있는 폴리뉴클레오타이드이며, 이로 인해 발현 벡터 상의 특정 유전자(관심 유전자 포함)는 세포, 소기관 또는 유기체; 또는 "발현 카세트"를 포함하는 본 기술분야에 공지된 임의의 적합한 작제물 내에서 폴리펩타이드 또는 단백질로 전사 및 해독된다. 대조적으로, 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, "카세트"는 본 발명의 발현 벡터의 섹션을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 카세트의 사용은 발현 벡터의 어셈블리를 돕는다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스, 키메라 바이러스 또는 코스미드와 같은 레플리콘이며, 발현 제어 서열(들)에 작동가능하게 연결된 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다.
본원에 일반적으로 기재된 바와 같이 무세포 발현 시스템에서 발현되는 단백질에 관한 용어 "발현 생성물"은 상호교환가능하게 사용되며, 일반적으로 약 5개 초과의 아미노산을 갖는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 이 폴리펩타이드는 무세포 추출물에서 생성되는 인간 단백질, 식물 단백질, 바이러스 단백질, 효모 단백질 등과 같이, 무세포 추출물이 유래되는 유기체에 대해 이종성, 즉 외래인 것을 의미하는 외인성일 수 있거나, 또는 상동성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "유래된"은 박테리아로부터 추출되거나, 또는 발현되어 단리되는 것을 의미한다. 예를 들어, 일 실시양태에서 호열성 박테리아로부터 유래될 수 있는 단백질은 호열성 박테리아에 내인성이고 상기 박테리아로부터 단리되거나 상이한 박테리아에서 이종으로 발현되고 개별 단백질 또는 세포 추출물로서 단리된 단백질을 의미할 수 있다.
"무세포 추출물" 또는 "용해물"은 박테리아, 호열성 박테리아, 내열성 박테리아, 고세균, 후벽균, 진균, 조류, 미세조류, 식물 세포 배양물 및 식물 현탁 배양물을 비롯한 다양한 유기체 및/또는 세포로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에 사용된 단수 형태 "일"("a"), "및", 및 "상기"("the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"란 언급은 다수의 이러한 세포를 포함하고 "배양물"이란 언급은 본 기술분야의 기술자에게 공지된 하나 이상의 배양물 및 이의 등가물 등에 대한 언급을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 달리 명시되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이제 일반적으로 설명되는 본 발명은 단지 본 발명의 실시양태의 특정 측면을 예시하기 위한 목적으로 포함된 하기 실시예를 참조함으로써 더 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 본 기술분야의 기술자가 상기 교시 및 다른 기술과 방법이 청구범위를 만족시킬 수 있고 청구된 발명의 범위를 벗어남이 없이 사용될 수 있는 이하 실시예로부터 인식할 수 있는 것으로서 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본 발명이 이의 바람직한 실시양태를 참조하여 구체적으로 나타내고 설명되었지만, 본 기술분야의 기술자라면 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 본원에서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이제 일반적으로 설명되는 본 발명은 단지 본 발명의 실시양태의 특정 측면을 예시하기 위한 목적으로 포함된 하기 실시예를 참조함으로써 더 쉽게 이해될 것이다. 실시예는 본 기술분야의 기술자가 상기 교시 및 다른 기술 및 방법이 청구범위를 만족시킬 수 있고 청구된 발명의 범위를 벗어남이 없이 사용될 수 있는 이하 실시예로부터 인식할 수 있는 것으로서 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 실제로, 본 발명은 이의 바람직한 실시양태를 참조하여 구체적으로 나타내고 설명되었지만, 본 기술분야의 기술자라면 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 본원에서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1: 재조합 무세포 발현 시스템을 위한 단백질 합성 및 클로닝
본 발명자들은 재조합 무세포 발현 시스템에서 사용하기 위해, 다수의 핵심 재조합 단백질, 바람직하게는 선택된 호열성 박테리아 유래인 것을 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다. 이 실시양태에서, 본 발명자들은 다수의 핵심 재조합 호열성 개시 인자(IF)를 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다. 이 실시양태에서, 본 발명자들은 다수의 핵심 재조합 호열성 연장 인자(EF)를 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다. 이 실시양태에서, 본 발명자들은 다수의 핵심 재조합 방출 인자(RF)를 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다. 이 실시양태에서, 본 발명자들은 적어도 하나의 핵심 재조합 리보솜 재순환 인자(RRF)를 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다. 이 실시양태에서, 본 발명자들은 다수의 핵심 재조합 아미노아실-tRNA-합성효소(RS)를 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다. 이 실시양태에서, 본 발명자들은 적어도 하나의 핵심 재조합 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF)를 합성하고 선택 발현 벡터에 클로닝했다.
표 1에 일반적으로 나타낸 바와 같이, 바람직한 일 실시양태에서, 본 발명자들은 E.콜라이에서 합성, 클로닝, 발현시키고, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 12개(12)의 상이한 재조합 인자, 및 본 발명의 재조합 무세포 발현 시스템에 적용될 수 있는 적어도 34개(34) 단백질의 예시적인 핵심 재조합 단백질 혼합물을 형성하는 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열(서열번호 1 내지 132)을 포함하는 적어도 22개(22)의 재조합 합성효소를 정제했다. 이들 핵심 단백질은 발현 벡터, 예를 들어, 도 7-8 및 9에 도시된 바와 같은, pET151/D-TOPO(pET151), pET24a(+) 또는 pNAT로 클로닝했다.
본 발명자들은 식별된 34개 단백질 중 하나 이상, 뿐만 아니라 예시적인 호열성 박테리아로부터 단리된 선택 리보솜 및 tRNA를 혼입시킨 재조합 무세포 반응 혼합물을 추가로 생성하였다. 다음으로, 본 발명자들은 재조합 무세포 반응 혼합물에 다량의 RNA 중합효소, 특히 T7 RNA 중합효소, 뿐만 아니라 예시적인 아미노산 및 완충액를 포함시켰다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 PCT 출원 번호 PCT/US2018/012121('121 출원)의 청구범위에서 확인되는 무기 폴리포스페이트 에너지 재생 시스템의 구성요소 중 하나 이상을 혼입시킨 재조합 무세포 반응 혼합물을 추가로 생성하였다.
실시예 2: 예시적인 재조합 무세포 반응 혼합물의 생성.
일 실시양태에서, 본 발명자들은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시험관내 전사 및 해독을 할 수 있는 재조합 무세포 반응 혼합물을 생성했다:
- 반응 혼합물, 표 1에서 식별되는 적어도 33개(33)의 호열성 핵심 단백질;
- 표 1에서 식별되는 E. 콜라이로부터의 하나(1)의 핵심 단백질;
- 호열균 유래의 tRNA;
- 선택 호열균으로부터 단리된 다량의 리보솜;
- 다량의 아미노산;
- ATP, CTP, GTP, TTP와 같은 다량의 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP);
- 다량의 반응 완충액; 및
- 본원에 포함된 '121 출원의 청구범위, 도면, 서열 및 명세서에서 식별되는 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 또는 에너지 재생 시스템의 하나 이상의 구성요소.
실시예 3: 재조합 아미노아실-tRNA-합성효소의 활성.
본 발명자들은 각각의 정제된 아미노아실-tRNA-합성효소(RS)의 활성을 확인하였다. 일반적으로, 아미노아실-tRNA-합성효소 반응은 2단계 과정이다:
단계 1: 활성화
아미노산 + ATP => 아미노아실-AMP + PPi
단계 2: 전달
아미노아실-AMP + tRNA => 아미노아실-tRNA + AMP
결과적으로 수득되는 PPi는 EnzCheck 피로포스페이트 키트를 사용하여 측정할 수 있다. 이 개요를 이용하여, 본 발명자들은 시판 피로포스페이트 검정 키트(EnzCheck Pyrophosphate Assay Kit, Molecular Probes, E-6654, 본원에 참고로 포함됨)를 사용하여 동역학 검정을 수행했다. 이러한 상업적으로 이용가능한 검정은 피로포스페이트의 효소적 생산을 분광광도측정법으로 간접적으로 측정한다. 각 RS 반응은 표 2에 제시된 다음과 같은 최종 농도로 총 30μl로 준비했다. 12.5μl의 RS 반응 혼합물을 사용하여 표 3에 입증된 바와 같은 피로포스페이트 검정을 위한 50μl 반응액을 준비했다. 피로포스페이트 검정은 96웰 평판에서 준비하고 평판 판독기 세트에서 2분 간격으로 자동으로 판독하여 360nm에서의 흡광도를 판독하게 했다. 이 동역학 측정은 모든 RS 단백질의 활성 및 기능성을 정성측정하는 1차 테스트로서 사용했다.
검정은 제조업체의 설명서에 따라 수행하고 시간 경과에 따른 흡광도 변화를 각 RS에 대하여 시간 경과에 따라 플로팅했다. 도 1 및 2에서 나타나듯이, 각 RS는 양호한 활성을 입증했고(대조군으로서 tRNA 무첨가), ATP가 ADP+Pi로 가수분해되어 무기 피로포스페이트가 생성되며, Pi는 EnzCheck 검정 키트를 사용하여 간접적으로 검출할 수 있다. 낮은 흡광도 변화에도 불구하고 도 1 및 2의 데이터는 제조업체의 안내서에서 제공하는 ATP 사용법에 대한 다른 효소 동역학에 대해 제시된 RS 및 그래프에 대한 공개된 보고서와 비슷하다. 명확성을 위해 도 1 및 2 모두에는 동일한 실험에서 기원하는 10개의 RS만을 각 그래프에 플로팅했다.
아미노아실-tRNA-합성효소 반응으로부터 생성된 AMP는 AMP-Glo™ 키트를 이용하여 측정할 수 있다. 본 발명자들은 상용 AMP 검출 키트(AMP-Glo™ 검정, Promega V5012, 본 명세서에 참고로 포함됨)를 사용하여 검정을 수행했다. 이 상업적으로 이용가능한 검정은 발광 반응을 통해 AMP의 효소적 생산을 간접적으로 측정한다. 포함된 표준물질은 보정 및 생산된 AMP의 양을 계산하는 데 사용될 수 있다. 이 검정은 정량적 종말점 측정 검정이다. 각 RS 반응은 표 4에 제시된 최종 농도로 총 100μL로 준비했으며 37℃에서 1시간 동안 실행했다. 후속 AMP 검출 검정은 제조업체의 설명서에 따라 이반복으로 수행했으며 생성된 AMP는 표준 곡선을 사용하여 계산했다(도 17b). 도 17a는 E. 콜라이로부터의 예시적인 tRNA를 사용한 3개의 독립적인 아미노아실-tRNA-합성효소 AMP-생산 활성 검정의 결과를 입증한다. 표준 AMP 곡선은 도 17b에 제공된다.
실시예 4: 재조합 아미노아실-tRNA-합성효소의 활성 확인.
각각 클로닝된 RS 활성의 추가적인 확인으로서, 본 발명자들은 이용가능한 상용 키트(Cayman, Malachite Green Phosphate Assay Kit, #10009325, 본원에 참고로 포함됨)를 사용하여 말라카이트 그린 포스페이트(malachite green phosphate) 검정을 수행했다. 생성된 피로포스페이트는 말라카이트 그린과 복합체를 형성하고 흡광도로서 측정될 수 있는 색상 변화를 초래할 것이다. 포함된 표준물질은 생산된 PPi의 양을 보정하고 계산하는 데 사용될 수 있다. 이 검정은 정량적 종말점 측정 검정이다. 모든 반응은 제조업체의 설명서에 따라 수행했으며 생산된 PPi는 표준 곡선(그래프에 작은 삽입도로서 표시됨)을 사용하여 계산했다.
이하의 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 RS 반응에 대한 최종 농도는 150 μl의 총 부피를 포함하였다. E. 콜라이로부터의 예시적인 tRNA가 이 검정에서 이용되었다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 그래프는 반응 완충액이 없는 대조군(ATP 무첨가) 및 RS 중 하나의 아미노산 오류(AsnRS + Arg)와 비교하여 모든 RS에서 양호한 활성을 입증하였다. 각 RS는 동일한 몰 농도로 사용했고 키트를 사용하여 PPi 농도를 측정하기 전에 60분 동안 항온처리하였다. 각 막대는 배경/블랭크 측정에 대해 교정되었으며 이반복 측정의 평균값을 나타낸다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 지오바실러스 서브테라뉴스 또는 지오바실러스 스테아로써모필러스와 같은 지오바실러스 호열균 유래의 tRNA를 사용하여 앞서 일반적으로 설명한 바와 같이 동일한 검정을 반복하였다.
실시예 5: 예시적인 단백질의 재조합 무세포 발현.
본 발명자들은 본 발명의 재조합 무세포 발현 시스템에서 2개의 예시적인 GFP 펩타이드(서열번호 134-135)의 생산을 입증했다. 표 6에서 확인되는 바와 같이, 대조군 및 주형 재조합 무세포 발현 혼합물이 생성되었다. 이하의 표 6에서 확인된 핵심 재조합 단백질의 단리는 도 11 내지 14에서 입증되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 재조합 무세포 발현 시스템은 추가된 주형 DNA를 전사시켰고 생성된 mRNA를 도 4의 밴드로 표시된 바와 같은 단백질로 해독된다. 도 15에서 추가로 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 본원에 기술된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용하여 형광 단백질(muGFP; 서열번호 134)의 실시간 생산을 보여주었다. 도 16에 추가로 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 본원에 기재된 재조합 무세포 발현 시스템을 이용한 형광 단백질(deGFP; 서열 번호 135) 생성물의 생산을 보여주었다. 또한, 본 발명자들은 생성된 GFP 펩타이드로부터 재조합 무세포 발현 시스템 해독 구성요소의 제거를 역정제를 통해 입증했다. 도 16에 구체적으로 나타낸 바와 같이, 역정제 후 무세포 단백질 발현 반응의 항-FLAG 항체로 웨스턴 블롯을 수행했다.
표
참고문헌
이하 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다:
[1] Carlson, Erik D. 등 "Cell-Free Protein Synthesis: Applications Come of Age." Biotechnology advances 30.5 (2012): 1185-1194. PMC. Web. 1 Jan. 2018.
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서열목록
SEQUENCE LISTING
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<120> Systems, Methods And Compositions For Recombinant in Vitro
Transcription And Translation Utilizing Thermophilic Proteins
<130> 90125.00096
<150> 62/833,555
<151> 2019-04-12
<160> 136
<170> PatentIn version 3.5
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Leu Ala His Val Ser Gly Lys Ile Arg Met His Phe Ile Arg Ile Leu
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Pro Gly Asp Arg Val Thr Val Glu Leu Ser Pro Tyr Asp Leu Thr Arg
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Gly Arg Ile Thr Tyr Arg Tyr Lys
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Thr Phe Glu Gly Ser Leu Thr Val Ala Glu Leu Ala Lys Lys Leu Gly
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Gly Arg Arg Val Lys Glu Ala Thr Pro Ser Met Pro Val Glu Ile Thr
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Lys Ala Asp Val Gln Gly Ser Val Glu Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln
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565 570 575
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595 600 605
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aaaatgagcc aggcactgca gaaactgcaa gaagaggatc cgacctttcg tgcacatacc 1320
gatccggaaa ccggtcagac cattattagt ggtatgggtg aactgcatct ggatatcatt 1380
gttgatcgta tgcgtcgcga atttaaagtt gaagcaaatg ttggtgcacc gcaggttgca 1440
tatcgtgaaa cctttcgtaa aagcgcacag gttgaaggca aatttatccg tcagagtggt 1500
ggtcgtggtc agtatggtca tgtttggatt gaattttcac cgaacgaacg cggtaaaggc 1560
tttgaatttg aaaatgcaat tgttggtggt gtggtgccga aagaatatgt tccggcagtt 1620
caggcaggtc tggaagaggc aatgcagaat ggtgttctgg caggttatcc ggttgttgat 1680
attaaagcca aactgttcga tggcagctat cacgatgttg atagcagcga aatggcattc 1740
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gaaccgatta tgaaagtgga agttgttatc cctgaggaat atctgggtga tattatgggc 1860
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gttcgtgcaa tggttccgct ggcagaaatg tttggttatg caaccagcct gcgtagcaat 1980
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<211> 692
<212> PRT
<213> Geobacillus
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50 55 60
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65 70 75 80
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Arg Val Leu Asp Gly Ala Ile Thr Val Leu Asp Ala Gln Ser Gly Val
100 105 110
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115 120 125
Pro Arg Ile Val Phe Val Asn Lys Met Asp Lys Ile Gly Ala Asp Phe
130 135 140
Leu Tyr Ser Val Lys Thr Leu His Asp Arg Leu Gln Ala Asn Ala His
145 150 155 160
Pro Val Gln Leu Pro Ile Gly Ala Glu Asp Gln Phe Ser Gly Ile Ile
165 170 175
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180 185 190
Asn Ile Glu Arg Ile Asp Ile Pro Glu Glu Tyr Arg Asp Met Ala Glu
195 200 205
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210 215 220
Leu Met Met Lys Tyr Leu Glu Gly Glu Glu Ile Thr Ala Glu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Ala Ala Ile Arg Lys Ala Thr Ile Ser Val Glu Phe Phe Pro Val
245 250 255
Phe Cys Gly Ser Ala Phe Lys Asn Lys Gly Val Gln Leu Leu Leu Asp
260 265 270
Gly Val Val Asp Tyr Leu Pro Ser Pro Val Asp Ile Pro Ala Ile Arg
275 280 285
Gly Val Val Pro Asp Thr Glu Glu Glu Val Thr Arg Glu Ala Ser Asp
290 295 300
Asp Ala Pro Phe Ala Ala Leu Ala Phe Lys Ile Met Thr Asp Pro Tyr
305 310 315 320
Val Gly Lys Leu Thr Phe Ile Arg Val Tyr Ser Gly Thr Leu Asp Ser
325 330 335
Gly Ser Tyr Val Met Asn Thr Thr Lys Gly Lys Arg Glu Arg Ile Gly
340 345 350
Arg Leu Leu Gln Met His Ala Asn His Arg Gln Glu Ile Ser Lys Val
355 360 365
Tyr Ala Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Gly Leu Lys Asp Thr Thr Thr
370 375 380
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435 440 445
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595 600 605
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Val Arg Ala Met Val Pro Leu Ala Glu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Ser
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<212> DNA
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<212> DNA
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Met Asn Arg Glu Glu Arg Leu Lys Arg Gln Glu Arg Ile Arg Asn Phe
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Ile Asp Asn Asn Leu Glu Ile Leu Pro Val Ile Asn Lys Ile Asp Leu
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Gly Leu Asp Ala Ser Glu Ala Val Leu Ala Ser Ala Lys Val Gly Ile
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Gly Ile Glu Glu Ile Leu Glu Gln Ile Val Glu Lys Ile Pro Ala Pro
180 185 190
Ser Gly Asp Pro Asp Ala Pro Leu Lys Ala Leu Ile Phe Asp Ser Leu
195 200 205
Tyr Asp Pro Tyr Arg Gly Val Val Ala Tyr Val Arg Ile Val Asp Gly
210 215 220
Thr Val Lys Pro Gly Gln Arg Ile Lys Met Met Ser Thr Gly Lys Glu
225 230 235 240
Phe Glu Val Thr Glu Val Gly Val Phe Thr Pro Lys Gln Lys Ile Val
245 250 255
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260 265 270
Asn Val Lys Asp Thr Arg Val Gly Asp Thr Ile Thr Asp Ala Glu Arg
275 280 285
Pro Ala Ala Glu Pro Leu Pro Gly Tyr Arg Lys Leu Asn Pro Met Val
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Glu Ala Leu Glu Lys Leu Gln Leu Asn Asp Ala Ala Leu His Phe Glu
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Pro Glu Thr Ser Gln Ala Leu Gly Phe Gly Phe Arg Cys Gly Phe Leu
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Gly Leu Leu His Met Glu Ile Ile Gln Glu Arg Ile Glu Arg Glu Phe
355 360 365
His Ile Asp Leu Ile Thr Thr Ala Pro Ser Val Val Tyr Lys Val His
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Asp Pro Gln Lys Ile Asp Arg Ile Glu Glu Pro Tyr Val Lys Ala Thr
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Gly Lys Arg Gly Thr Phe Val Asp Met Gln Tyr Leu Asp Glu Lys Arg
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485 490 495
Leu Asn Gly Glu Lys Ile Asp Ala Leu Ser Phe Ile Val His Arg Glu
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Lys
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<213> Geobacillus
<400> 16
Met Ile Ser Val Asn Asp Phe Arg Thr Gly Leu Thr Ile Glu Val Asp
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<210> 17
<211> 1077
<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 17
atgtttgatc gtctggaagc agttgaacag cgttatgaaa aactgaatga actgctgatg 60
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attggcgaac tggaagaacg tgaagaagca ctggttgaga aactgaaagt tctgctgctg 300
ccgaaagatc cgaatgatga aaaaaacgtg atcatggaaa ttcgtgcagc agccggtggc 360
gaagaagcag cactgtttgc cggtgatctg tatcgtatgt atacccgtta tgcagaaagc 420
caaggttgga aaaccgaagt tattgaagca agcccgaccg gtttaggtgg ttataaagaa 480
atcatcttca tgatcaatgg caagggtgca tacagcaaac tgaaatttga aaatggtgca 540
catcgtgttc agcgtgttcc ggaaaccgaa agcggtggtc gtattcatac cagcaccgca 600
accgttgcat gtctgccgga aatggaagaa atcgaagtgg aaatcaacga gaaagatatt 660
cgcgttgata cctttgcaag cagcggtcct ggtggtcaga gcgttaatac caccatgagc 720
gcagttcgtc tgacccatat tccgaccggt attgttgtta cctgtcagga tgaaaaatcc 780
cagatcaaaa acaaagaaaa agccatgaaa gtgctgcgtg cccgtatcta tgataaatat 840
cagcaagagg cacgtgcgga atatgatcag acccgtaaac aggcagttgg caccggtgat 900
cgtagcgaac gtattcgtac ctataacttt ccgcagaatc gtgttaccga tcatcgtatt 960
ggtctgacca ttcaaaaact ggatcaggtt ctggatggtc atctggatga aattatcgaa 1020
gcactgattc tggatgacca ggcaaaaaag ctggaacagg caaatgatgc aagctaa 1077
<210> 18
<211> 358
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 18
Met Phe Asp Arg Leu Glu Ala Val Glu Gln Arg Tyr Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Glu Leu Leu Met Glu Pro Asp Val Ile Asn Asp Pro Lys Lys Leu Arg
20 25 30
Asp Tyr Ser Lys Glu Gln Ala Asp Leu Glu Glu Thr Val Gln Thr Tyr
35 40 45
Arg Glu Tyr Lys Ser Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Lys Ala Met
50 55 60
Leu Glu Glu Lys Leu Glu Pro Glu Leu Arg Glu Met Val Lys Glu Glu
65 70 75 80
Ile Gly Glu Leu Glu Glu Arg Glu Glu Ala Leu Val Glu Lys Leu Lys
85 90 95
Val Leu Leu Leu Pro Lys Asp Pro Asn Asp Glu Lys Asn Val Ile Met
100 105 110
Glu Ile Arg Ala Ala Ala Gly Gly Glu Glu Ala Ala Leu Phe Ala Gly
115 120 125
Asp Leu Tyr Arg Met Tyr Thr Arg Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Trp Lys
130 135 140
Thr Glu Val Ile Glu Ala Ser Pro Thr Gly Leu Gly Gly Tyr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Ile Phe Met Ile Asn Gly Lys Gly Ala Tyr Ser Lys Leu Lys Phe
165 170 175
Glu Asn Gly Ala His Arg Val Gln Arg Val Pro Glu Thr Glu Ser Gly
180 185 190
Gly Arg Ile His Thr Ser Thr Ala Thr Val Ala Cys Leu Pro Glu Met
195 200 205
Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile Asn Glu Lys Asp Ile Arg Val Asp Thr
210 215 220
Phe Ala Ser Ser Gly Pro Gly Gly Gln Ser Val Asn Thr Thr Met Ser
225 230 235 240
Ala Val Arg Leu Thr His Ile Pro Thr Gly Ile Val Val Thr Cys Gln
245 250 255
Asp Glu Lys Ser Gln Ile Lys Asn Lys Glu Lys Ala Met Lys Val Leu
260 265 270
Arg Ala Arg Ile Tyr Asp Lys Tyr Gln Gln Glu Ala Arg Ala Glu Tyr
275 280 285
Asp Gln Thr Arg Lys Gln Ala Val Gly Thr Gly Asp Arg Ser Glu Arg
290 295 300
Ile Arg Thr Tyr Asn Phe Pro Gln Asn Arg Val Thr Asp His Arg Ile
305 310 315 320
Gly Leu Thr Ile Gln Lys Leu Asp Gln Val Leu Asp Gly His Leu Asp
325 330 335
Glu Ile Ile Glu Ala Leu Ile Leu Asp Asp Gln Ala Lys Lys Leu Glu
340 345 350
Gln Ala Asn Asp Ala Ser
355
<210> 19
<211> 984
<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 19
atggcagcac cgaatttttg ggatgatcag aaagcagcac aggcagttat tagcgaagca 60
aatgcactga aagatctggt ggaagaattt agcagcctgg aagaacgttt tgataatctg 120
gaagttacct acgaactgct gaaagaagaa ccggacgacg aactgcaggc agaactggtt 180
gaagaggcaa aaaaactgat gaaagatttt agcgaatttg aactgcagct gctgctgaat 240
gaaccgtatg atcaaaataa tgccatcctg gaactgcatc ctggtgccgg tggcaccgaa 300
agccaggatt gggcaagcat gctgctgcgt atgtataccc gttgggcaga aaaaaaaggc 360
tttaaagttg aaaccctgga ttatctgcct ggtgaagaag caggtattaa aagcgttacc 420
ctgctgatta aaggccataa tgcatatggt tatctgaaag ccgaaaaagg tgttcatcgt 480
ctggttcgta ttagcccgtt tgatgcaagc ggtcgtcgtc ataccagctt tgttagctgt 540
gaagttgtgc cggaactgga tgataacatt gaaattgaaa ttcgccctga agaactgaag 600
attgatacct atcgtagcag cggtgcaggc ggtcagcatg ttaataccac cgatagcgca 660
gtgcgtatta cccatctgcc gaccggtatt gttgttacct gtcagagcga acgtagccag 720
attaaaaacc gtgaaaaagc catgaatatg ctgaaagcca aactgtacca gaagaaatta 780
gaagaacagc aggccgagct ggccgaactg cgtggtgaac agaaagaaat tggttggggt 840
aatcagattc gcagctatgt ttttcatccg tacagcctgg ttaaagatca tcgtaccaat 900
gttgaagttg gtaatgttca ggccgttatg gatggtgaaa ttgatgtttt tatcgatgca 960
tacctgcgtg ccaaactgaa ataa 984
<210> 20
<211> 327
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 20
Met Ala Ala Pro Asn Phe Trp Asp Asp Gln Lys Ala Ala Gln Ala Val
1 5 10 15
Ile Ser Glu Ala Asn Ala Leu Lys Asp Leu Val Glu Glu Phe Ser Ser
20 25 30
Leu Glu Glu Arg Phe Asp Asn Leu Glu Val Thr Tyr Glu Leu Leu Lys
35 40 45
Glu Glu Pro Asp Asp Glu Leu Gln Ala Glu Leu Val Glu Glu Ala Lys
50 55 60
Lys Leu Met Lys Asp Phe Ser Glu Phe Glu Leu Gln Leu Leu Leu Asn
65 70 75 80
Glu Pro Tyr Asp Gln Asn Asn Ala Ile Leu Glu Leu His Pro Gly Ala
85 90 95
Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Trp Ala Ser Met Leu Leu Arg Met Tyr
100 105 110
Thr Arg Trp Ala Glu Lys Lys Gly Phe Lys Val Glu Thr Leu Asp Tyr
115 120 125
Leu Pro Gly Glu Glu Ala Gly Ile Lys Ser Val Thr Leu Leu Ile Lys
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Gly His Asn Ala Tyr Gly Tyr Leu Lys Ala Glu Lys Gly Val His Arg
145 150 155 160
Leu Val Arg Ile Ser Pro Phe Asp Ala Ser Gly Arg Arg His Thr Ser
165 170 175
Phe Val Ser Cys Glu Val Val Pro Glu Leu Asp Asp Asn Ile Glu Ile
180 185 190
Glu Ile Arg Pro Glu Glu Leu Lys Ile Asp Thr Tyr Arg Ser Ser Gly
195 200 205
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210 215 220
His Leu Pro Thr Gly Ile Val Val Thr Cys Gln Ser Glu Arg Ser Gln
225 230 235 240
Ile Lys Asn Arg Glu Lys Ala Met Asn Met Leu Lys Ala Lys Leu Tyr
245 250 255
Gln Lys Lys Leu Glu Glu Gln Gln Ala Glu Leu Ala Glu Leu Arg Gly
260 265 270
Glu Gln Lys Glu Ile Gly Trp Gly Asn Gln Ile Arg Ser Tyr Val Phe
275 280 285
His Pro Tyr Ser Leu Val Lys Asp His Arg Thr Asn Val Glu Val Gly
290 295 300
Asn Val Gln Ala Val Met Asp Gly Glu Ile Asp Val Phe Ile Asp Ala
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Tyr Leu Arg Ala Lys Leu Lys
325
<210> 21
<211> 1578
<212> DNA
<213> Bacillus sp. X1
<400> 21
atgggtaacg atttcaagaa agaagtgctg agccgtcgta cctttgcgat cattagccat 60
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gagcgtgtgg cggcgggtca actgaccccg gttttctttg gtagcgcgct gaccaacttc 780
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<210> 22
<211> 526
<212> PRT
<213> Bacillus sp. X1
<400> 22
Met Gly Asn Asp Phe Lys Lys Glu Val Leu Ser Arg Arg Thr Phe Ala
1 5 10 15
Ile Ile Ser His Pro Asp Ala Gly Lys Thr Thr Leu Thr Glu Lys Leu
20 25 30
Leu Leu Phe Gly Gly Ala Ile Arg Asp Ala Gly Thr Val Lys Ala Lys
35 40 45
Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Thr Ser Asp Trp Met Glu Ile Glu Lys Gln
50 55 60
Arg Gly Ile Ser Val Thr Ser Ser Val Met Gln Phe Asp Tyr Asn Gly
65 70 75 80
Tyr Arg Val Asn Ile Leu Asp Thr Pro Gly His Gln Asp Phe Ser Glu
85 90 95
Asp Thr Tyr Arg Thr Leu Met Ala Val Asp Ser Ala Val Met Ile Ile
100 105 110
Asp Ser Ala Lys Gly Ile Glu Asp Gln Thr Ile Lys Leu Phe Lys Val
115 120 125
Cys Arg Met Arg Gly Ile Pro Ile Phe Thr Phe Ile Asn Lys Leu Asp
130 135 140
Arg Gln Gly Lys Gln Pro Leu Glu Leu Leu Ala Glu Leu Glu Glu Val
145 150 155 160
Leu Gly Ile Glu Ser Tyr Pro Met Asn Trp Pro Ile Gly Met Gly Lys
165 170 175
Glu Phe Leu Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Tyr Asn Arg Ile Glu Gln Phe
180 185 190
Arg Val Asn Glu Glu Glu Arg Phe Ile Pro Leu Asn Glu Asp Gly Glu
195 200 205
Ile Glu Gly Asn His Lys Leu Val Ser Ser Gly Leu Tyr Glu Gln Thr
210 215 220
Leu Glu Glu Ile Met Leu Leu Asn Glu Ala Gly Asn Glu Phe Ser Ala
225 230 235 240
Glu Arg Val Ala Ala Gly Gln Leu Thr Pro Val Phe Phe Gly Ser Ala
245 250 255
Leu Thr Asn Phe Gly Val Gln Thr Phe Leu Glu Thr Tyr Leu Gln Phe
260 265 270
Ala Pro Pro Pro Lys Ala Arg Asn Ser Ser Ile Gly Glu Ile Asp Pro
275 280 285
Leu Ser Glu Glu Phe Ser Gly Phe Val Phe Lys Ile Gln Ala Asn Met
290 295 300
Asn Pro Ala His Arg Asp Arg Ile Ala Phe Val Arg Ile Cys Ser Gly
305 310 315 320
Lys Phe Glu Arg Gly Met Ser Val Asn Leu Pro Arg Leu Gly Lys Gln
325 330 335
Leu Lys Leu Thr Gln Ser Thr Ser Phe Met Ala Glu Glu Arg Asn Thr
340 345 350
Val Glu Glu Ala Val Ser Gly Asp Ile Ile Gly Leu Tyr Asp Thr Gly
355 360 365
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Phe Glu Arg Leu Pro Gln Phe Thr Pro Glu Leu Phe Val Arg Val Ser
385 390 395 400
Ala Lys Asn Val Met Arg Gln Lys Ser Phe Tyr Lys Gly Leu His Gln
405 410 415
Leu Val Gln Glu Gly Ala Ile Gln Leu Tyr Lys Thr Val Lys Thr Asp
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Glu Tyr Leu Leu Gly Ala Val Gly Gln Leu Gln Phe Glu Val Phe Glu
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His Arg Met Lys Asn Glu Tyr Asn Ala Glu Val Leu Met Glu Arg Leu
450 455 460
Gly Ser Lys Ile Ala Arg Trp Ile Glu Asn Asp Glu Val Asp Glu Asn
465 470 475 480
Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Leu Val Lys Asp Arg Tyr Asp His Tyr
485 490 495
Val Phe Leu Phe Glu Asn Asp Phe Ala Leu Arg Trp Phe Gln Glu Lys
500 505 510
Asn Pro Thr Ile Lys Leu Tyr Asn Pro Met Asp Gln His Asp
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<210> 23
<211> 558
<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 23
atggccaaac aggttattca gcaggccaaa gaaaaaatgg ataaagccgt tcaggcattt 60
acccgtgaac tggcaagcat tcgtgcaggt cgtgcaaatg caggtctgct ggaaaaagtt 120
accgttgatt attatggtgt tccgacgccg attaatcagc tggcgagcat tagcgttccg 180
gaagcacgtc tgctggtgat tcagccgtat gataaaagcg caatcaaaga gatggaaaaa 240
gcaattctgg caagcgatct gggtctgacc ccgagcaatg atggtagcgt tattcgtctg 300
gttattccgc ctctgaccga agaacgtcgt cgcgaactgg cgaaactggt gaaaaaatac 360
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aagctggaaa agaatggcga aattaccgaa gatgaactgc gtagctatac cgatgaagtt 480
cagaaactga ccgatgatca tatcgcaaaa attgacgcca tcaccaaaga gaaagaaaaa 540
gaagtcatgg aagtttaa 558
<210> 24
<211> 185
<212> PRT
<213> Geobacillus
<400> 24
Met Ala Lys Gln Val Ile Gln Gln Ala Lys Glu Lys Met Asp Lys Ala
1 5 10 15
Val Gln Ala Phe Thr Arg Glu Leu Ala Ser Ile Arg Ala Gly Arg Ala
20 25 30
Asn Ala Gly Leu Leu Glu Lys Val Thr Val Asp Tyr Tyr Gly Val Pro
35 40 45
Thr Pro Ile Asn Gln Leu Ala Ser Ile Ser Val Pro Glu Ala Arg Leu
50 55 60
Leu Val Ile Gln Pro Tyr Asp Lys Ser Ala Ile Lys Glu Met Glu Lys
65 70 75 80
Ala Ile Leu Ala Ser Asp Leu Gly Leu Thr Pro Ser Asn Asp Gly Ser
85 90 95
Val Ile Arg Leu Val Ile Pro Pro Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Glu
100 105 110
Leu Ala Lys Leu Val Lys Lys Tyr Ser Glu Asp Ala Lys Val Ala Val
115 120 125
Arg Asn Ile Arg Arg Asp Ala Asn Asp Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys
130 135 140
Asn Gly Glu Ile Thr Glu Asp Glu Leu Arg Ser Tyr Thr Asp Glu Val
145 150 155 160
Gln Lys Leu Thr Asp Asp His Ile Ala Lys Ile Asp Ala Ile Thr Lys
165 170 175
Glu Lys Glu Lys Glu Val Met Glu Val
180 185
<210> 25
<211> 2637
<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 25
atgaaaaaac tgaccagcgc acaggttcgt cgcatgtttc tggaattttt tcaagaaaaa 60
ggtcatgccg ttgaaccgag cgcaagcctg attccggttg atgatccgag cctgctgtgg 120
attaatagcg gtgttgcaac cctgaaaaaa tactttgatg gtcgtattgt tccggaaaat 180
ccgcgtattt gtaatgccca gaaaagcatt cgtaccaacg atattgaaaa tgtgggtaaa 240
accgcacgcc atcacacctt ttttgaaatg ctgggcaatt ttagcatcgg cgattatttc 300
aaacgtgaag caattcattg ggcctgggaa tttctgacca gtgataaatg gattggtttt 360
gatccggaac gtctgagcgt taccgttcat ccggaagatg aagaagcata taacatttgg 420
cgcaatgaaa ttggtctgcc ggaagaacgt attattcgtc tggaaggtaa cttttgggat 480
attggtgaag gtccgagcgg tccgaatacc gaaatctttt atgatcgtgg tgaagccttt 540
ggtaatgatc cgaatgatcc tgaactgtat ccaggtggtg aaaatgatcg ttatctggaa 600
gtttggaatc tggtgtttag ccagtttaat cataatccgg atggcaccta tacaccgctg 660
ccgaaaaaaa acattgatac cggcatgggt ttagaacgta tgtgtagcat tctgcaggat 720
gttccgacca attttgaaac cgacctgttt ctgccgatta ttcgtgcaac cgagcagatt 780
gccggtgaac gttatggtga agatccggat aaagatgttg cctttaaagt gattgccgat 840
catattcgcg cagttacctt tgcaattggt gatggtgcac tgccgagcaa tgaaggtcgt 900
ggttatgttc tgcgtcgtct gctgcgtcgt gcagttcgtt atgcaaaaca tattggtatt 960
gaacgtccgt tcatgtatga actggttccg gttgttggtg aaatcatgca cgattattat 1020
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gaacagggtt ccgatgttat tccgggtgaa gaggcatttc gtctgtatga tacctatggt 1200
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gttgtgaaag atgttcagaa agcaccgaat ggtcagcatc tgcatgcaat tattgtggaa 1620
catggcaccg ttaaaaaagg tagccgttat accgcacgtg ttgatgaagc aaaacgtatg 1680
cgtattgtga aaaatcatac cgcaacacat ctgctgcatc aggcactgaa agacgttctg 1740
ggtcgtcatg ttaatcaggc aggtagcctg gttgcaccgg atcgtctgcg ttttgacttt 1800
acccattttg gtcaggttaa acccgaagaa ctggaacgta ttgaagcgat tgttaatgag 1860
cagatttgga aaagcctgcc ggtggatatt ttctataaac cgctggaaga ggcaaaagca 1920
atgggtgcaa tggcactgtt tggtgaaaaa tatggtgata ttgtgcgtgt ggttaaagtg 1980
ggtgattata gcctggaact gtgtggtggt tgtcatgtgc cgaataccag cgccattggt 2040
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accggtgaag cagcatatcg ttttatgagc gaacagctgg ccattctgca agaagcagca 2160
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ctgaaagaat tagaacgcga aaatgaaagc ctggcagccc gtctggcaca tatggaagca 2280
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caggcaaatg atatgaatca gctgcgtgcc atggccgatg atctgaaaca aaaactgggt 2400
acagcagtta ttgttctggc aagcgcacaa ggtggtaaag ttcagctgat tgcagccgtt 2460
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agcaaagttg gtgaagcact gggttatgtt gaaacctggg ttaaaagcgt gagctaa 2637
<210> 26
<211> 878
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 26
Met Lys Lys Leu Thr Ser Ala Gln Val Arg Arg Met Phe Leu Glu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Glu Lys Gly His Ala Val Glu Pro Ser Ala Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Asp Asp Pro Ser Leu Leu Trp Ile Asn Ser Gly Val Ala Thr Leu
35 40 45
Lys Lys Tyr Phe Asp Gly Arg Ile Val Pro Glu Asn Pro Arg Ile Cys
50 55 60
Asn Ala Gln Lys Ser Ile Arg Thr Asn Asp Ile Glu Asn Val Gly Lys
65 70 75 80
Thr Ala Arg His His Thr Phe Phe Glu Met Leu Gly Asn Phe Ser Ile
85 90 95
Gly Asp Tyr Phe Lys Arg Glu Ala Ile His Trp Ala Trp Glu Phe Leu
100 105 110
Thr Ser Asp Lys Trp Ile Gly Phe Asp Pro Glu Arg Leu Ser Val Thr
115 120 125
Val His Pro Glu Asp Glu Glu Ala Tyr Asn Ile Trp Arg Asn Glu Ile
130 135 140
Gly Leu Pro Glu Glu Arg Ile Ile Arg Leu Glu Gly Asn Phe Trp Asp
145 150 155 160
Ile Gly Glu Gly Pro Ser Gly Pro Asn Thr Glu Ile Phe Tyr Asp Arg
165 170 175
Gly Glu Ala Phe Gly Asn Asp Pro Asn Asp Pro Glu Leu Tyr Pro Gly
180 185 190
Gly Glu Asn Asp Arg Tyr Leu Glu Val Trp Asn Leu Val Phe Ser Gln
195 200 205
Phe Asn His Asn Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Pro Leu Pro Lys Lys Asn
210 215 220
Ile Asp Thr Gly Met Gly Leu Glu Arg Met Cys Ser Ile Leu Gln Asp
225 230 235 240
Val Pro Thr Asn Phe Glu Thr Asp Leu Phe Leu Pro Ile Ile Arg Ala
245 250 255
Thr Glu Gln Ile Ala Gly Glu Arg Tyr Gly Glu Asp Pro Asp Lys Asp
260 265 270
Val Ala Phe Lys Val Ile Ala Asp His Ile Arg Ala Val Thr Phe Ala
275 280 285
Ile Gly Asp Gly Ala Leu Pro Ser Asn Glu Gly Arg Gly Tyr Val Leu
290 295 300
Arg Arg Leu Leu Arg Arg Ala Val Arg Tyr Ala Lys His Ile Gly Ile
305 310 315 320
Glu Arg Pro Phe Met Tyr Glu Leu Val Pro Val Val Gly Glu Ile Met
325 330 335
His Asp Tyr Tyr Pro Glu Val Lys Glu Lys Ala Asp Phe Ile Ala Arg
340 345 350
Val Ile Arg Thr Glu Glu Glu Arg Phe His Glu Thr Leu His Glu Gly
355 360 365
Leu Ala Ile Leu Ala Glu Val Ile Glu Lys Ala Lys Glu Gln Gly Ser
370 375 380
Asp Val Ile Pro Gly Glu Glu Ala Phe Arg Leu Tyr Asp Thr Tyr Gly
385 390 395 400
Phe Pro Ile Glu Leu Thr Glu Glu Tyr Ala Ala Glu Ala Gly Met Thr
405 410 415
Val Asp His Ala Gly Phe Glu Arg Glu Met Glu Arg Gln Arg Glu Arg
420 425 430
Ala Arg Ala Ala Arg Gln Asp Val Asp Ser Met Gln Val Gln Gly Gly
435 440 445
Val Leu Gly Asp Ile Lys Asp Glu Ser Arg Phe Val Gly Tyr Asp Glu
450 455 460
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Arg Ile Val Lys Asn His Thr Ala Thr His Leu Leu His Gln Ala Leu
565 570 575
Lys Asp Val Leu Gly Arg His Val Asn Gln Ala Gly Ser Leu Val Ala
580 585 590
Pro Asp Arg Leu Arg Phe Asp Phe Thr His Phe Gly Gln Val Lys Pro
595 600 605
Glu Glu Leu Glu Arg Ile Glu Ala Ile Val Asn Glu Gln Ile Trp Lys
610 615 620
Ser Leu Pro Val Asp Ile Phe Tyr Lys Pro Leu Glu Glu Ala Lys Ala
625 630 635 640
Met Gly Ala Met Ala Leu Phe Gly Glu Lys Tyr Gly Asp Ile Val Arg
645 650 655
Val Val Lys Val Gly Asp Tyr Ser Leu Glu Leu Cys Gly Gly Cys His
660 665 670
Val Pro Asn Thr Ser Ala Ile Gly Leu Phe Lys Ile Val Ser Glu Ser
675 680 685
Gly Ile Gly Ala Gly Thr Arg Arg Ile Glu Ala Val Thr Gly Glu Ala
690 695 700
Ala Tyr Arg Phe Met Ser Glu Gln Leu Ala Ile Leu Gln Glu Ala Ala
705 710 715 720
Gln Lys Leu Lys Thr Ser Pro Lys Glu Leu Asn Ala Arg Leu Asp Gly
725 730 735
Leu Phe Ala Glu Leu Lys Glu Leu Glu Arg Glu Asn Glu Ser Leu Ala
740 745 750
Ala Arg Leu Ala His Met Glu Ala Glu His Leu Thr Arg Gln Val Lys
755 760 765
Asp Val Asn Gly Val Pro Val Leu Ala Ala Lys Val Gln Ala Asn Asp
770 775 780
Met Asn Gln Leu Arg Ala Met Ala Asp Asp Leu Lys Gln Lys Leu Gly
785 790 795 800
Thr Ala Val Ile Val Leu Ala Ser Ala Gln Gly Gly Lys Val Gln Leu
805 810 815
Ile Ala Ala Val Thr Asp Asp Leu Val Lys Lys Gly Phe His Ala Gly
820 825 830
Lys Leu Val Lys Glu Val Ala Ser Arg Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
835 840 845
Arg Pro Asp Leu Ala Gln Ala Gly Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Gly
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Glu Ala Leu Gly Tyr Val Glu Thr Trp Val Lys Ser Val Ser
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<210> 27
<211> 1674
<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 27
atgaatattg tgggccagat caaagaaaaa atgaaagaag aaattcgtca ggcagcagtt 60
cgtgcaggtc tggcaagcgc agatgaactg ccggatgttc tgctggaagt tccgcgtgat 120
aaagcacatg gtgattatag caccaatatt gcaatgcagc tggcacgtat tgcaaaaaaa 180
ccgcctcgtg caattgccga agcaattgtt ggtcagctgg atcgtgaacg tatgagcgtt 240
gcccgtattg aaattgcagg tccgggtttt atcaacttct atatggataa tcgttacctg 300
accgcagttg ttccggcaat tctgcaggca ggtcaggcat atggtgaaag taatgttggt 360
aatggtgaga aagtccaggt tgaatttgtt agcgcaaatc cgaccggtga tctgcatctg 420
ggtcatgcac gtggtgcagc agttggtgat agcctgtgta atattctggc aaaagcaggt 480
tttgatgtga cccgtgaata ctatattaat gatgcaggca agcagatcta caatctggcc 540
aaaagcgttg aagcacgtta ttttcaggca ctgggtgttg atatgccgct gccggaagat 600
ggttattatg gtgatgatat tgtggaaatc ggcaaaaaac tggccgaaga atatggtgat 660
cgtttcgttg aaatggaaga agaggaacgt ctggcatttt ttcgtgatta tggtctgcgt 720
tatgagctgg aaaaaatcaa aaaagatctg gccgattttc gcgttccgtt tgatgtttgg 780
tatagcgaaa ccagcctgta tgaaagcggt aaaattgatg aagcactgag caccctgcgt 840
gaacgtggtt atatctatga acaggatggt gcaacctggt ttcgtagcac cgcatttgga 900
gatgataaag atcgtgttct gattaaacag gacggcacct atacctatct gctgccggat 960
attgcatatc atcaggataa actgcgtcgc ggttttaaga aactgattaa catttggggt 1020
gccgatcatc atggttatat tcctcgcatg aaagcagcaa ttgcagcact gggttatgat 1080
ccggaagcac tggaagttga aattattcag atggtgaatc tgtatcagaa tggcgaacgt 1140
gtgaaaatga gcaaacgtac cggtaaagca gttaccatgc gtgaactgat ggaagaggtt 1200
ggtgttgatg cagttcgtta tttctttgca atgcgtagcg gtgataccca tctggatttt 1260
gatatggatc tggcagttag ccagagcaat gaaaatccgg tttattatgt tcagtatgcc 1320
catgcgcgtg ttagcagcat tctgcgtcag gcggaagaac agcatattag ctatgatggt 1380
gatctggcac tgcatcatct ggttgaaacc gaaaaagaaa ttgagctgct gaaagtgctg 1440
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acactgcaga atgcactggc cctgattggt gtgagcgcac cggaacaaat gtaa 1674
<210> 28
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<212> PRT
<213> Geobacillus
<400> 28
Met Asn Ile Val Gly Gln Ile Lys Glu Lys Met Lys Glu Glu Ile Arg
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Gln Ala Ala Val Arg Ala Gly Leu Ala Ser Ala Asp Glu Leu Pro Asp
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Val Leu Leu Glu Val Pro Arg Asp Lys Ala His Gly Asp Tyr Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Ala Met Gln Leu Ala Arg Ile Ala Lys Lys Pro Pro Arg Ala
50 55 60
Ile Ala Glu Ala Ile Val Gly Gln Leu Asp Arg Glu Arg Met Ser Val
65 70 75 80
Ala Arg Ile Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Ile Asn Phe Tyr Met Asp
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Asn Arg Tyr Leu Thr Ala Val Val Pro Ala Ile Leu Gln Ala Gly Gln
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145 150 155 160
Phe Asp Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Ile Asn Asp Ala Gly Lys Gln Ile
165 170 175
Tyr Asn Leu Ala Lys Ser Val Glu Ala Arg Tyr Phe Gln Ala Leu Gly
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Glu Ile Gly Lys Lys Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Asp Arg Phe Val Glu
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Met Glu Glu Glu Glu Arg Leu Ala Phe Phe Arg Asp Tyr Gly Leu Arg
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Tyr Glu Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp Leu Ala Asp Phe Arg Val Pro
245 250 255
Phe Asp Val Trp Tyr Ser Glu Thr Ser Leu Tyr Glu Ser Gly Lys Ile
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Asp Glu Ala Leu Ser Thr Leu Arg Glu Arg Gly Tyr Ile Tyr Glu Gln
275 280 285
Asp Gly Ala Thr Trp Phe Arg Ser Thr Ala Phe Gly Asp Asp Lys Asp
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Asn Ile Trp Gly Ala Asp His His Gly Tyr Ile Pro Arg Met Lys Ala
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<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 29
atggatgtga gcattattgg tggtaatcag tgtgttaaaa ccaccaccat tgccgaagtt 60
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tttcatacca aatatttcga tgaggatgca tatctgagcc agagcggtca gctgtatatg 600
gaagcagcag caatggcact gggtaaagtt tttagctttg gtccgacctt tcgtgccgaa 660
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tatccgtaa 1329
<210> 30
<211> 442
<212> PRT
<213> Geobacillus
<400> 30
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1 5 10 15
Ile Ala Glu Val Asn Gln Tyr Val Gly Gln Gln Val Thr Ile Gly Ala
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Tyr Pro Ile Thr Pro Lys Glu His Gly Val Glu Phe Leu Met Asp His
115 120 125
Arg His Leu Trp Leu Arg Ser Arg Arg Gln His Ala Ile Met Lys Ile
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Arg Asn Glu Ile Ile Arg Ala Thr Tyr Glu Phe Phe Asn Asp Arg Gly
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195 200 205
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Arg Arg His Leu Ile Glu Phe Trp Met Val Glu Pro Glu Met Ala Phe
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Tyr Glu Phe Glu Asp Asn Leu Arg Leu Gln Glu Glu Tyr Val Ser Tyr
245 250 255
Leu Val Gln Ser Val Leu Glu Arg Cys Arg Leu Glu Leu Gly Arg Leu
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Gly Arg Asp Val Ser Lys Leu Glu Leu Val Lys Pro Pro Phe Pro Arg
275 280 285
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Asp Ile Glu Trp Gly Asp Asp Phe Gly Ala Pro His Glu Thr Ala Ile
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Ala Glu Ser Phe Asp Lys Pro Val Phe Ile Thr His Tyr Pro Thr Ser
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Leu Lys Pro Phe Tyr Met Gln Pro Asp Pro Asn Arg Pro Asp Val Val
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Leu Cys Ala Asp Leu Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Gly Glu Ile Ile Gly
355 360 365
Gly Ser Glu Arg Ile His Asp Tyr Glu Leu Leu Lys Arg Arg Leu Glu
370 375 380
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Thr Val Ala Trp Ile Cys Gly Val Glu His Val Arg Glu Thr Ile Pro
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<210> 31
<211> 1773
<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 31
atggaacgca cctattattg tggtgaagtt ccggaaaccg cagttggtga acgtgttgtt 60
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tttaaacagc tgctgatggt tggtggtgtg gaacgttatt atcagattgc acgttgtttt 660
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agcttcatcg agcaagagga tatcattgat ctgaccgaac gtatgatggc agcagttgtt 780
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cgtcgtgcac tggccgttga agatggtgac ctgctgctgt ttgttgcaga tgaaaaagca 1200
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<210> 32
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<212> PRT
<213> Geobacillus
<400> 32
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Glu Arg Val Val Leu Lys Gly Trp Val Gln Lys Arg Arg Asp Leu Gly
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Gly Leu Ile Phe Ile Asp Leu Arg Asp Arg Thr Gly Ile Val Gln Val
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Val Ala Ser Pro Asp Val Ser Ala Glu Ala Leu Ala Ala Ala Glu Arg
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Arg Tyr Leu Asp Leu Arg Arg Pro Val Met Phe Gln Thr Leu Ala Leu
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Arg His Lys Ile Thr Lys Thr Val Arg Asp Phe Leu Asp Ser Glu Arg
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Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Leu Thr Lys Ser Thr Pro Glu Gly
165 170 175
Ala Arg Asp Tyr Leu Val Pro Ser Arg Val His Pro Gly Glu Phe Tyr
180 185 190
Ala Leu Pro Gln Ser Pro Gln Ile Phe Lys Gln Leu Leu Met Val Gly
195 200 205
Gly Val Glu Arg Tyr Tyr Gln Ile Ala Arg Cys Phe Arg Asp Glu Asp
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Leu Arg Ala Asp Arg Gln Pro Glu Phe Thr Gln Ile Asp Ile Glu Met
225 230 235 240
Ser Phe Ile Glu Gln Glu Asp Ile Ile Asp Leu Thr Glu Arg Met Met
245 250 255
Ala Ala Val Val Lys Ala Ala Lys Gly Ile Asp Ile Pro Arg Pro Phe
260 265 270
Pro Arg Ile Thr Tyr Asp Glu Ala Met Ser Cys Tyr Gly Ser Asp Lys
275 280 285
Pro Asp Ile Arg Phe Gly Leu Glu Leu Val Asp Val Ser Glu Ile Val
290 295 300
Arg Asp Ser Ala Phe Gln Val Phe Ala Arg Ala Val Lys Glu Gly Gly
305 310 315 320
Gln Val Lys Ala Ile Asn Ala Lys Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Ser Arg
325 330 335
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340 345 350
Gly Leu Ala Trp Leu Lys Ala Glu Gly Glu Glu Leu Lys Gly Pro Ile
355 360 365
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370 375 380
Ala Val Glu Asp Gly Asp Leu Leu Leu Phe Val Ala Asp Glu Lys Ala
385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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500 505 510
Arg Gln Phe Gly Phe Leu Leu Glu Ala Phe Glu Tyr Gly Thr Pro Pro
515 520 525
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<210> 33
<211> 1401
<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 33
atgagcagca ttcgtctgta taataccctg acgcgtaaaa aagaaccgtt tgaaccgctg 60
gaaccgaaca aagttaaaat gtatgtttgt ggtccgaccg tgtataacta tattcatatt 120
ggtaatgccc gtgcagccat tgtgtttgat accattcgtc gttatctgga atttcgcggt 180
tatgatgtta cctatgtgag caattttacc gacgtggatg acaaactgat taaagcagca 240
cgtgaactgg gtgaaagcgt tccggcaatt gcagaacgtt ttattgaagc ctatttcgaa 300
gatattcagg ccctgggttg taaaaaagca gatattcatc cgcgtgtgac cgaaaatatc 360
gataccatta ttgaatttat ccaggcgctg atcgataaag gctatgcata tgaagttgat 420
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attgatgaac tgcaggcagg cgcacgtatt gaaattggtg aaaaaaaaga tgatccgctg 540
gattttgcac tgtggaaagc agcaaaagaa ggtgaaattt gttgggatag cccgtggggt 600
aaaggtcgtc ctggttggca tattgaatgt agcgcaatgg cacgtaaata tctgggtgat 660
acgattgata ttcatgccgg tggtcaggat ctgacctttc cgcatcatga aaatgaaatt 720
gcacagagcg aagcactgac cggtaaaccg tttgccaaat attggctgca taatggctat 780
ctgaacatca acaacgagaa aatgagcaaa agcctgggta attttgttct ggtgcatgat 840
attattcgcg agattgatcc gcaggttctg cgctttttta tgctgagcgt tcattatcgt 900
catccgatca attatagcga agaactgctg gaaagcgcac gtcgtggtct ggaacgtctg 960
aaaaccgcat atagcaatct gcagcaccgt ctgcaggcaa gcaccaatct gaccgataat 1020
gatgaagaat gggttagccg tattgccgat attcgtgcaa gctttattcg tgaaatggat 1080
gatgatttta acaccgccaa tggtattgcc gttctgtttg aactggcaaa acaggcaaat 1140
ctgtatctgc aagaaaaaac cacctccgaa aaagtgattc atgcatttct gcgtgaattt 1200
gaacagctgg cagatgttct gggtctgacc ctgaaacagg atgagctgct ggatgaagaa 1260
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acccgttgga aacgtggtta a 1401
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<213> Geobacillus
<400> 34
Met Ser Ser Ile Arg Leu Tyr Asn Thr Leu Thr Arg Lys Lys Glu Pro
1 5 10 15
Phe Glu Pro Leu Glu Pro Asn Lys Val Lys Met Tyr Val Cys Gly Pro
20 25 30
Thr Val Tyr Asn Tyr Ile His Ile Gly Asn Ala Arg Ala Ala Ile Val
35 40 45
Phe Asp Thr Ile Arg Arg Tyr Leu Glu Phe Arg Gly Tyr Asp Val Thr
50 55 60
Tyr Val Ser Asn Phe Thr Asp Val Asp Asp Lys Leu Ile Lys Ala Ala
65 70 75 80
Arg Glu Leu Gly Glu Ser Val Pro Ala Ile Ala Glu Arg Phe Ile Glu
85 90 95
Ala Tyr Phe Glu Asp Ile Gln Ala Leu Gly Cys Lys Lys Ala Asp Ile
100 105 110
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Ile Cys Trp Asp Ser Pro Trp Gly Lys Gly Arg Pro Gly Trp His Ile
195 200 205
Glu Cys Ser Ala Met Ala Arg Lys Tyr Leu Gly Asp Thr Ile Asp Ile
210 215 220
His Ala Gly Gly Gln Asp Leu Thr Phe Pro His His Glu Asn Glu Ile
225 230 235 240
Ala Gln Ser Glu Ala Leu Thr Gly Lys Pro Phe Ala Lys Tyr Trp Leu
245 250 255
His Asn Gly Tyr Leu Asn Ile Asn Asn Glu Lys Met Ser Lys Ser Leu
260 265 270
Gly Asn Phe Val Leu Val His Asp Ile Ile Arg Glu Ile Asp Pro Gln
275 280 285
Val Leu Arg Phe Phe Met Leu Ser Val His Tyr Arg His Pro Ile Asn
290 295 300
Tyr Ser Glu Glu Leu Leu Glu Ser Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Leu
305 310 315 320
Lys Thr Ala Tyr Ser Asn Leu Gln His Arg Leu Gln Ala Ser Thr Asn
325 330 335
Leu Thr Asp Asn Asp Glu Glu Trp Val Ser Arg Ile Ala Asp Ile Arg
340 345 350
Ala Ser Phe Ile Arg Glu Met Asp Asp Asp Phe Asn Thr Ala Asn Gly
355 360 365
Ile Ala Val Leu Phe Glu Leu Ala Lys Gln Ala Asn Leu Tyr Leu Gln
370 375 380
Glu Lys Thr Thr Ser Glu Lys Val Ile His Ala Phe Leu Arg Glu Phe
385 390 395 400
Glu Gln Leu Ala Asp Val Leu Gly Leu Thr Leu Lys Gln Asp Glu Leu
405 410 415
Leu Asp Glu Glu Ile Glu Ala Leu Ile Gln Lys Arg Asn Glu Ala Arg
420 425 430
Lys Asn Arg Asp Phe Ala Leu Ala Asp Arg Ile Arg Asp Glu Leu Arg
435 440 445
Ala Lys Asn Ile Ile Leu Glu Asp Thr Pro Gln Gly Thr Arg Trp Lys
450 455 460
Arg Gly
465
<210> 35
<211> 1665
<212> DNA
<213> E. coli
<400> 35
atgagcgaag cagaagcacg tccgaccaac tttattcgtc agattattga tgaagatctg 60
gccagcggta aacataccac cgttcatacc cgttttccgc ctgaaccgaa tggttatctg 120
catattggtc atgccaaaag catttgcctg aattttggta ttgcccagga ttataaaggt 180
cagtgcaatc tgcgtttcga tgataccaat ccggtgaaag aagatatcga atacgtcgag 240
agcatcaaaa atgatgttga atggctgggt tttcattgga gcggtaatgt tcgttatagc 300
agcgattatt ttgatcagct gcatgcctat gcaatcgaac tgattaacaa aggtctggcc 360
tatgttgatg aactgacacc ggaacaaatt cgtgaatatc gtggtacact gacccagcct 420
ggtaaaaata gcccgtatcg tgatcgtagc gttgaagaaa atctggccct gtttgaaaaa 480
atgcgtgccg gtggttttga agaaggtaaa gcctgtctgc gtgcaaaaat tgatatggca 540
agcccgttta ttgttatgcg tgatccggtt ctgtatcgca tcaaatttgc agaacatcat 600
cagaccggta acaaatggtg tatctatccg atgtatgatt tcacccattg cattagtgat 660
gccctggaag gtattaccca tagcctgtgt accctggaat ttcaggataa tcgtcgtctg 720
tatgattggg tgttagacaa tatcaccatt ccggtgcatc cgcgtcagta tgaatttagc 780
cgtctgaatc tggaatacac cgttatgagc aaacgtaaac tgaatctgct ggtgaccgat 840
aaacatgttg aaggttggga tgatccgcgt atgccgacca ttagcggtct gcgtcgtcgt 900
ggttataccg cagcaagcat ccgtgaattt tgtaaacgta ttggtgtgac caaacaggat 960
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ccgcgtgcaa tggcagttat cgatccggtt aaactggtga tcgaaaatta tcaaggtgaa 1080
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tataaacgtc tggttctggg taaagaagtt cgtctgcgta acgcctatgt tattaaagca 1260
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gataccctga gcaaagatcc ggcagatggt cgtaaagtta aaggtgttat tcattgggtt 1380
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cagggttttg ccgaaccgag cctgaaagat gcagttgcag gtaaagcatt tcagtttgaa 1560
cgcgaaggtt atttttgtct ggatagccgt catagcaccg cagaaaaacc ggtgtttaat 1620
cgtaccgttg gtctgcgtga tacctgggca aaagttggtg aataa 1665
<210> 36
<211> 554
<212> PRT
<213> E. coli
<400> 36
Met Ser Glu Ala Glu Ala Arg Pro Thr Asn Phe Ile Arg Gln Ile Ile
1 5 10 15
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35 40 45
Cys Leu Asn Phe Gly Ile Ala Gln Asp Tyr Lys Gly Gln Cys Asn Leu
50 55 60
Arg Phe Asp Asp Thr Asn Pro Val Lys Glu Asp Ile Glu Tyr Val Glu
65 70 75 80
Ser Ile Lys Asn Asp Val Glu Trp Leu Gly Phe His Trp Ser Gly Asn
85 90 95
Val Arg Tyr Ser Ser Asp Tyr Phe Asp Gln Leu His Ala Tyr Ala Ile
100 105 110
Glu Leu Ile Asn Lys Gly Leu Ala Tyr Val Asp Glu Leu Thr Pro Glu
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130 135 140
Pro Tyr Arg Asp Arg Ser Val Glu Glu Asn Leu Ala Leu Phe Glu Lys
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Met Arg Ala Gly Gly Phe Glu Glu Gly Lys Ala Cys Leu Arg Ala Lys
165 170 175
Ile Asp Met Ala Ser Pro Phe Ile Val Met Arg Asp Pro Val Leu Tyr
180 185 190
Arg Ile Lys Phe Ala Glu His His Gln Thr Gly Asn Lys Trp Cys Ile
195 200 205
Tyr Pro Met Tyr Asp Phe Thr His Cys Ile Ser Asp Ala Leu Glu Gly
210 215 220
Ile Thr His Ser Leu Cys Thr Leu Glu Phe Gln Asp Asn Arg Arg Leu
225 230 235 240
Tyr Asp Trp Val Leu Asp Asn Ile Thr Ile Pro Val His Pro Arg Gln
245 250 255
Tyr Glu Phe Ser Arg Leu Asn Leu Glu Tyr Thr Val Met Ser Lys Arg
260 265 270
Lys Leu Asn Leu Leu Val Thr Asp Lys His Val Glu Gly Trp Asp Asp
275 280 285
Pro Arg Met Pro Thr Ile Ser Gly Leu Arg Arg Arg Gly Tyr Thr Ala
290 295 300
Ala Ser Ile Arg Glu Phe Cys Lys Arg Ile Gly Val Thr Lys Gln Asp
305 310 315 320
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325 330 335
Asn Glu Asn Ala Pro Arg Ala Met Ala Val Ile Asp Pro Val Lys Leu
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Val Ile Glu Asn Tyr Gln Gly Glu Gly Glu Met Val Thr Met Pro Asn
355 360 365
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370 375 380
Glu Ile Trp Ile Asp Arg Ala Asp Phe Arg Glu Glu Ala Asn Lys Gln
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Tyr Lys Arg Leu Val Leu Gly Lys Glu Val Arg Leu Arg Asn Ala Tyr
405 410 415
Val Ile Lys Ala Glu Arg Val Glu Lys Asp Ala Glu Gly Asn Ile Thr
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<212> DNA
<213> Geobacillus
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aaagatgttg gtggcgattg ggttattgtt aaagcaaatg gtattccgac ctataacttt 600
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tttgcacatc tgaccctgat tgttaatgaa cagcgtaaaa aactgagcaa acgcgacgaa 780
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aacttttttg cactgttagg ttggtcaccg gaaggtgaag aagaaatctt taccaaagat 900
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<213> Geobacillus
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Lys Arg Asp Glu Ser Ile Ile Gln Phe Val Ser Gln Tyr Lys Glu Leu
260 265 270
Gly Tyr Leu Pro Glu Ala Met Phe Asn Phe Phe Ala Leu Leu Gly Trp
275 280 285
Ser Pro Glu Gly Glu Glu Glu Ile Phe Thr Lys Asp Glu Leu Ile Arg
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<400> 39
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cgtgatttta ccaatgttcg tcagtttaac ctgatgttca aaacctatca gggtgttacc 480
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cagccgctga aactgtatta ttcaggtccg atgtttcgtt atgaacgtcc tgaagcaggt 360
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gatgcagaag ttatggcact ggcaatgcat atttatgaag ccctgggtct gaaacgtatt 480
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accaatccgc tgcgtattct ggattgtaaa aaagatcgtg atcatgagct gatggcaacc 660
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gcaaccctgt gtggtggtgg tcgttataat ggtctggttc aagaaattgg tggtccggaa 900
acacctggta ttggttttgc actgagcatt gaacgtctgc tggcagcact ggatgccgaa 960
ggtgttgaac tgccggttga aagtggcctg gattgttatg ttgttgcagt tggtgaacgt 1020
gcaaaagatg aagcagtgcg tctggtttat gccctgcgtc gtagcggtct gcgtgttgat 1080
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cgtattggca aagaagaata a 1281
<210> 42
<211> 426
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<213> Geobacillus
<400> 42
Met Ala Phe Gln Ile Pro Arg Gly Thr Gln Asp Val Leu Pro Gly Asp
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Thr Glu Lys Trp Gln Tyr Val Glu His Val Ala Arg Asn Leu Cys Ser
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Leu Phe Leu Arg Gly Val Gly Asp Thr Thr Asp Ile Val Gln Lys Glu
50 55 60
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Glu Ala Glu Gly Phe Gly Ala Ala Ala Thr Leu Cys Gly Gly Gly Arg
275 280 285
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290 295 300
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420 425
<210> 43
<211> 2775
<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 43
atggactaca aagaaaccct gctgatgccg cagaccgaat ttccgatgcg tggtaatctg 60
ccgaaacgtg aaccggaaat gcagaaaaaa tgggaagaga tggatatcta ccgcaaagtt 120
caagaacgta ccaaaggtcg tccgctgttt gttctgcatg atggtccgcc ttatgcaaat 180
ggtgatattc atatgggtca tgccctgaac aaaatcctga aagatattat cgtgcgctat 240
aagagcatga atggttattg tgcaccgtat gttccaggtt gggataccca tggtctgccg 300
attgaaaccg cactggcaaa acagggtgtt gatcgtaaaa gcatgagcgt tgcagaattt 360
cgtaaacgtt gtgaacagta tgcctatgag cagattgata atcagcgtcg tcagtttaaa 420
cgtctgggtg ttcgtggtga ttgggataat ccgtatatta ccctgaaacc ggaatatgaa 480
gcacagcaga ttaaagtgtt tggcgagatg gcaaaaaaag gcctgatcta taaaggtctg 540
aaacctgttt attggagccc gagcagcgaa agtgcactgg cagaagcaga aattgagtat 600
aaagataaac gctccccgag catttatgtt gcctttccgg ttaaagatgg taaaggtgtt 660
ctggaaggtg atgaacgtat tgtgatttgg accaccacac cgtggaccat tccggcaaat 720
ctggcaattg cagttcatcc ggatctggat tatcatgttg ttgatgttag cggtaaacgt 780
tatgttgttg cagcagcact ggccgaaagc gttgcaaaag aaattggttg ggatgcatgg 840
tcagttgtga aaaccgttaa aggtaaagaa ctggaatatg tggttgcgaa acacccgttt 900
tatgaacgtg atagcctggt tgtttgtggt gaacatgtga ccaccgatgc aggcaccggt 960
tgtgttcata ccgcacctgg tcatggtgaa gatgattttc tggttggtca gaaatatggc 1020
ctgccggttc tgtgtccggt ggatgaacgt ggttatatga ccgaagaagc accgggtttt 1080
gaaggtatgt tttatgagga tgccaacaaa gcgattacgc agaaactgga agaagttggc 1140
gcactgctga aactgggttt tattacccat agctatccgc atgattggcg taccaaacag 1200
ccgaccattt ttcgtgcaac cacacagtgg tttgcaagca ttgataaaat tcgcaatgaa 1260
ctgctgcagg ccatcaaaga aacaaaatgg atcccggaat ggggtgaaat tcgcattcat 1320
aacatggttc gtgatcgcgg tgattggtgt attagccgtc agcgtgcatg gggtgttccg 1380
attccggtgt tttatggtga aaatggtgaa ccgattatca ccgatgaaac cattgaacat 1440
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gttgttgttc ctgcaaaagt tatggaacag tttggtgcag atattctgcg tctgtgggtt 1860
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gaagtgtatc gcaaaattcg taataccttt cgctttatgc tgggtaacct gtttgatttt 1980
gatccgaatc agaatgcagt tccgattggt gaactgggtg aagttgatcg ttatatgctg 2040
gccaaactga ataaactgat cgccaaagtg aaaaaagcct atgatagcta cgatttcgca 2100
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<210> 44
<211> 924
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 44
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1 5 10 15
Arg Gly Asn Leu Pro Lys Arg Glu Pro Glu Met Gln Lys Lys Trp Glu
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Glu Met Asp Ile Tyr Arg Lys Val Gln Glu Arg Thr Lys Gly Arg Pro
35 40 45
Leu Phe Val Leu His Asp Gly Pro Pro Tyr Ala Asn Gly Asp Ile His
50 55 60
Met Gly His Ala Leu Asn Lys Ile Leu Lys Asp Ile Ile Val Arg Tyr
65 70 75 80
Lys Ser Met Asn Gly Tyr Cys Ala Pro Tyr Val Pro Gly Trp Asp Thr
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His Gly Leu Pro Ile Glu Thr Ala Leu Ala Lys Gln Gly Val Asp Arg
100 105 110
Lys Ser Met Ser Val Ala Glu Phe Arg Lys Arg Cys Glu Gln Tyr Ala
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130 135 140
Arg Gly Asp Trp Asp Asn Pro Tyr Ile Thr Leu Lys Pro Glu Tyr Glu
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Ala Gln Gln Ile Lys Val Phe Gly Glu Met Ala Lys Lys Gly Leu Ile
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Tyr Lys Gly Leu Lys Pro Val Tyr Trp Ser Pro Ser Ser Glu Ser Ala
180 185 190
Leu Ala Glu Ala Glu Ile Glu Tyr Lys Asp Lys Arg Ser Pro Ser Ile
195 200 205
Tyr Val Ala Phe Pro Val Lys Asp Gly Lys Gly Val Leu Glu Gly Asp
210 215 220
Glu Arg Ile Val Ile Trp Thr Thr Thr Pro Trp Thr Ile Pro Ala Asn
225 230 235 240
Leu Ala Ile Ala Val His Pro Asp Leu Asp Tyr His Val Val Asp Val
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Ser Gly Lys Arg Tyr Val Val Ala Ala Ala Leu Ala Glu Ser Val Ala
260 265 270
Lys Glu Ile Gly Trp Asp Ala Trp Ser Val Val Lys Thr Val Lys Gly
275 280 285
Lys Glu Leu Glu Tyr Val Val Ala Lys His Pro Phe Tyr Glu Arg Asp
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Cys Val His Thr Ala Pro Gly His Gly Glu Asp Asp Phe Leu Val Gly
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Pro Thr Ile Phe Arg Ala Thr Thr Gln Trp Phe Ala Ser Ile Asp Lys
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Glu Trp Gly Glu Ile Arg Ile His Asn Met Val Arg Asp Arg Gly Asp
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Trp Cys Ile Ser Arg Gln Arg Ala Trp Gly Val Pro Ile Pro Val Phe
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Tyr Gly Glu Asn Gly Glu Pro Ile Ile Thr Asp Glu Thr Ile Glu His
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Asn Gly Ile Phe Thr Lys Glu Thr Asp Ile Met Asp Val Trp Phe Asp
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Phe Asn Ser Ser Leu Ser Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Lys Ala Pro
565 570 575
Tyr Lys Gly Val Leu Ser His Gly Phe Val Leu Asp Gly Glu Gly Arg
580 585 590
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Glu Gln Phe Gly Ala Asp Ile Leu Arg Leu Trp Val Ala Ser Val Asp
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Pro Tyr Asp Ala Ala Pro Ala Glu Ala Glu Arg Leu Asp His Val Ala
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<210> 45
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<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 45
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acctttcgta caccggatga tgatgacaaa ccgaaattct atgtgctgga tatgtttccg 120
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ctggcacgta tgaaacgtat gcagggttat aatgttctgc atccgatggg ttgggatgca 240
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gatggtgcac gtcgttttct ggatcgtgtt tggcgtctgt ttgttaccga aaatggtgaa 1920
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<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 46
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<213> Geobacillus stearothermophilus
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<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 48
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Gly Gly Leu Glu Lys Val Tyr Glu Ile Gly Arg Val Phe Arg Asn Glu
245 250 255
Gly Ile Ser Thr Arg His Asn Pro Glu Phe Thr Met Leu Glu Leu Tyr
260 265 270
Glu Ala Tyr Ala Asp Phe His Asp Ile Met Glu Leu Thr Glu Asn Leu
275 280 285
Ile Ala His Ile Ala Thr Glu Val Leu Gly Thr Thr Lys Ile Gln Tyr
290 295 300
Asp Glu His Val Val Asp Leu Thr Pro Glu Trp Arg Arg Leu His Met
305 310 315 320
Val Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Val Gly Val Asp Phe Trp Arg Gln Met
325 330 335
Ser Asp Glu Glu Ala Arg Glu Leu Ala Lys Glu His Gly Val Glu Val
340 345 350
Ala Pro His Met Thr Phe Gly His Ile Val Asn Glu Phe Phe Glu Gln
355 360 365
Lys Val Glu Ser His Leu Ile Gln Pro Thr Phe Ile Tyr Gly His Pro
370 375 380
Val Glu Ile Ser Pro Leu Ala Lys Lys Asn Pro Asp Asp Pro Arg Phe
385 390 395 400
Thr Asp Arg Phe Glu Leu Phe Ile Val Gly Arg Glu His Ala Asn Ala
405 410 415
Phe Thr Glu Leu Asn Asp Pro Ile Asp Gln Arg Gln Arg Phe Glu Ala
420 425 430
Gln Leu Lys Glu Arg Glu Gln Gly Asn Asp Glu Ala His Glu Met Asp
435 440 445
Glu Asp Phe Leu Glu Ala Leu Glu Tyr Gly Met Pro Pro Thr Gly Gly
450 455 460
Leu Gly Ile Gly Val Asp Arg Leu Val Met Leu Leu Thr Asn Ser Pro
465 470 475 480
Ser Ile Arg Asp Val Leu Leu Phe Pro Gln Met Arg His Lys
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<210> 49
<211> 1953
<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 49
atggaaaaaa agaccttcta tctgaccacg ccgatctatt atccgagcga tcgtctgcat 60
attggtcatg catataccac cgttgccggt gatgcaatgg cacgttataa acgtatgcgt 120
ggttatgatg ttatgtatct gaccggcacc gatgaacatg gtcagaaaat tcagcgtaaa 180
gccgaagaaa aaggtgttac accgcagcag tatgttgatg aaattgttgc aggtattcaa 240
gaactgtgga aaaaactgga tatcagctat gatgatttca tccgtaccac acaagaacgc 300
cataaaaaag ttgttgagca gatttttacc cgtctggttg aacagggtga tatttatctg 360
ggtgaatatg aaggttggta ttgtaccccg tgtgaaagct tttataccga acgtcagctg 420
gttgatggta attgtccgga ttgtggtcgt ccggttgaaa aagttaaaga ggaaagctat 480
tttttccgca tgagcaaata tgttgatcgc ctgctgcagt attatgaaga aaacccggat 540
ttcattcagc cggaaagccg taaaaatgag atgattaaca actttatcaa acctggcctg 600
gaagatctgg cagttagccg taccaccttt gattggggta ttaaagttcc gggtaatccg 660
aaacatgtga tctatgtttg gattgatgca ctggccaact atattaccgc attaggttat 720
ggcaccgata acgatgaaaa attccgtaaa tattggcctg ccgatgttca tctggttggt 780
aaagaaattg ttcgcttcca taccatttat tggccgatta tgctgatggc actgggtctg 840
ccgctgccga aaaaagtttt tggtcatggt tggctgctga tgaaagatgg taaaatgagc 900
aaaagcaaag gcaatgttgt tgatccggtt acactgattg atcgttatgg tctggatgca 960
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ggttttattg agcgcatcaa ttatgatctg gcaaatgatc tgggtaatct gctgcatcgt 1080
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acaccgtttg atcaagagct ggttcagacc gcacgtgaag ttgttcgtca gtatgaagag 1200
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ctgcagccgt ttctgacccg cacaccggaa cgtatgctgg cacagctggg tattaccgat 1440
catagcctga aagaatggga tagcctgtat gattttggtc tgattccgga aggcaccaaa 1500
gttcagaaag gtgaaccgct gtttccgcgt ctggatattg aagcagaagt ggaatatatc 1560
aaagcccata tgcaaggtgg taaaccggca gccgaaccgg ttaaagaaga aaaaaaagca 1620
gccgaagcag cggaaattag catcgatgaa tttgcaaaag ttgatctgcg tgttgccgaa 1680
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ggtggtgaaa aacgtcaggt tattagcggt attgccgaat tctataaacc ggaagaactg 1800
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<210> 50
<211> 650
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 50
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Met Ala Arg Tyr Lys Arg Met Arg Gly Tyr Asp Val Met Tyr Leu Thr
35 40 45
Gly Thr Asp Glu His Gly Gln Lys Ile Gln Arg Lys Ala Glu Glu Lys
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Gly Val Thr Pro Gln Gln Tyr Val Asp Glu Ile Val Ala Gly Ile Gln
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Glu Leu Trp Lys Lys Leu Asp Ile Ser Tyr Asp Asp Phe Ile Arg Thr
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Asn Asn Phe Ile Lys Pro Gly Leu Glu Asp Leu Ala Val Ser Arg Thr
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Tyr Val Trp Ile Asp Ala Leu Ala Asn Tyr Ile Thr Ala Leu Gly Tyr
225 230 235 240
Gly Thr Asp Asn Asp Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Trp Pro Ala Asp Val
245 250 255
His Leu Val Gly Lys Glu Ile Val Arg Phe His Thr Ile Tyr Trp Pro
260 265 270
Ile Met Leu Met Ala Leu Gly Leu Pro Leu Pro Lys Lys Val Phe Gly
275 280 285
His Gly Trp Leu Leu Met Lys Asp Gly Lys Met Ser Lys Ser Lys Gly
290 295 300
Asn Val Val Asp Pro Val Thr Leu Ile Asp Arg Tyr Gly Leu Asp Ala
305 310 315 320
Leu Arg Tyr Tyr Leu Leu Arg Glu Val Pro Phe Gly Ala Asp Gly Val
325 330 335
Phe Thr Pro Glu Gly Phe Ile Glu Arg Ile Asn Tyr Asp Leu Ala Asn
340 345 350
Asp Leu Gly Asn Leu Leu His Arg Thr Val Ala Met Ile Glu Lys Tyr
355 360 365
Phe Asp Gly Val Ile Pro Pro Tyr Arg Gly Pro Lys Thr Pro Phe Asp
370 375 380
Gln Glu Leu Val Gln Thr Ala Arg Glu Val Val Arg Gln Tyr Glu Glu
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405 410 415
Leu Ile Ser Arg Thr Asn Lys Tyr Ile Asp Glu Thr Gln Pro Trp Val
420 425 430
Leu Ala Lys Asp Glu Gln Lys Arg Asp Glu Leu Ala Ala Val Met Thr
435 440 445
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Gln Leu Asp Leu Gly Gly Glu Lys Arg Gln Val Ile Ser Gly Ile Ala
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<210> 51
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<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 51
atgaaagaac gcctgtatga actgaaacgt caggcactgg aacaaattgg tcaggcacgt 60
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<210> 52
<211> 344
<212> PRT
<213> Geobacillus
<400> 52
Met Lys Glu Arg Leu Tyr Glu Leu Lys Arg Gln Ala Leu Glu Gln Ile
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Gly Gln Ala Arg Asp Leu Arg Met Leu Asn Asp Val Arg Val Ala Tyr
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
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Ile Thr Glu Glu Ile Leu Leu Arg Thr His Thr Ser Pro Met Gln Ala
165 170 175
Arg Thr Met Glu Lys His Arg Gly Arg Gly Pro Val Lys Ile Ile Cys
180 185 190
Pro Gly Lys Val Tyr Arg Arg Asp Thr Asp Asp Ala Thr His Ser His
195 200 205
Gln Phe Thr Gln Ile Glu Gly Leu Val Val Asp Arg Asn Ile Arg Met
210 215 220
Ser Asp Leu Lys Gly Thr Leu Arg Glu Phe Ala Arg Lys Leu Phe Gly
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Glu Gly Arg Asp Ile Arg Phe Arg Pro Ser Phe Phe Pro Phe Thr Glu
245 250 255
Pro Ser Val Glu Val Asp Val Ser Cys Phe Arg Cys Glu Gly Arg Gly
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<210> 53
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<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 53
atgctggtta gctatcgttg gctgggtgaa tatgttgatc tgaccggtat taccgcaaaa 60
gaactggcag aacgtattac caaaagcggt attgaagttg aacgtgttga agcactggat 120
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ggtagcaaag aaattgttgt tcgtcgtgca aaagccggtg aaaccattat taccctggat 900
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gcactggcag gcgttatggg tggtgccaat agcgaagttc gtgatgatac caccaccgtt 1020
tttattgaag cagcctattt caccagtccg gttattcgtc aggccgttaa agatcatggt 1080
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attaatggtg ttctgggcac cgcaatgacc aaagaagaag tggctgccat tctgagcaat 1320
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580 585 590
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 55
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atgaatcgta ttggtgccat ggaactgttt atgcctgcac tgcagcctgc agaactgtgg 240
cagcagagcg gtcgttggta tagctatggt ccggaactga tgcgtctgaa agatcgtcat 300
gaacgtgatt ttgcactggg tccgacacat gaagagatga ttaccgcaat tgttcgtgat 360
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tatagcttcc ataccagcaa agaaagcctg gatgaaacct acaacaatat gtatgaagcc 540
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gcaattggtg gtaaagatac ccacgaattc atggttctga gcgatattgg tgaagatacc 660
attgcatata gtgatgcaag cgattatgca gccaatattg aaatggcacc ggttgttgca 720
acctatgaaa aaagtgatga acctccggca gaactgaaga aagttgccac accgggtcag 780
aaaaccattg ccgaagttgc aagccatctg caaattagtc cggaacgttg tattaaaagc 840
ctgctgttta atgtggatgg tcgttatgtt ctggtgctgg ttcgtggtga tcatgaagca 900
aatgaagtga aagtgaaaaa tgtgctggat gccaccgttg ttgaactggc aaaaccggaa 960
gaaaccgaac gtgttatgaa tgcaccgatt ggtagcctgg gtcctattgg tgttagcgaa 1020
gatgttaccg ttattgccga tcatgcagtt gcagcaattg ttaatggtgt ttgtggtgcc 1080
aatgaagagg gctatcatta cattggtgtg aatccgggtc gcgattttgc agttagccag 1140
tatgccgatc tgcgttttgt taaagaaggt gatccgagtc cggatggtaa aggcaccatt 1200
cgttttgcac gtggtattga agttggccat gtttttaaac tgggcaccaa atatagcgaa 1260
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<212> PRT
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Ser Arg Phe Val Phe Tyr Lys Gly Leu Gly Ala Arg Leu Glu Arg Ala
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Leu Ile Asn Phe Met Leu Asp Ile His Leu Asp Glu Phe Gly Tyr Glu
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<213> Geobacillus
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Gly Glu Ala Ala Phe Tyr Gly Pro Lys Leu Asp Val Gln Val Arg Ala
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Gly Lys Lys Ser Glu Arg Thr Leu Asn Ala Lys Glu Thr Val Glu Ala
85 90 95
Trp Ser Ala Arg Ile Gln Glu Gln Leu Ser Arg Phe Leu Asp Phe Glu
100 105 110
Ala His Gly Asn Pro Ala Lys Ile Lys Asn Asn Tyr Asp Trp Ile Gly
115 120 125
Pro Leu Asp Val Ile Thr Phe Leu Arg Asp Val Gly Lys His Phe Ser
130 135 140
Val Asn Tyr Met Met Ala Lys Glu Ser Val Gln Ser Arg Ile Glu Thr
145 150 155 160
Gly Ile Ser Phe Thr Glu Phe Ser Tyr Met Met Leu Gln Ala Tyr Asp
165 170 175
Phe Leu Arg Leu Tyr Glu Thr Glu Gly Cys Arg Leu Gln Ile Gly Gly
180 185 190
Ser Asp Gln Trp Gly Asn Ile Thr Ala Gly Leu Glu Leu Ile Arg Lys
195 200 205
Thr Lys Gly Glu Ala Arg Ala Phe Gly Leu Thr Ile Pro Leu Val Thr
210 215 220
Lys Ala Asp Gly Thr Lys Phe Gly Lys Thr Glu Ser Gly Thr Ile Trp
225 230 235 240
Leu Asp Lys Glu Lys Thr Ser Pro Tyr Glu Phe Tyr Gln Phe Trp Ile
245 250 255
Asn Thr Asp Asp Arg Asp Val Ile Arg Tyr Leu Lys Tyr Phe Thr Phe
260 265 270
Leu Ser Lys Glu Glu Ile Glu Ala Phe Glu Gln Glu Leu Arg Glu Ala
275 280 285
Pro Glu Lys Arg Ala Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Glu Val Thr Lys
290 295 300
Leu Val His Gly Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ala Val Arg Ile Ser Glu
305 310 315 320
Ala Leu Phe Ser Gly Asp Ile Gly Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ile Glu
325 330 335
Gln Gly Phe Lys Asp Val Pro Ser Phe Val His Glu Gly Gly Asp Val
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Pro Leu Val Glu Leu Leu Val Ser Ala Gly Ile Ser Pro Ser Lys Arg
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Gln Ala Arg Glu Asp Ile Gln Asn Gly Ala Ile Tyr Val Asn Gly Glu
370 375 380
Arg Leu Gln Asp Val Gly Ala Ile Leu Thr Ala Glu His Arg Leu Glu
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Gly Arg Phe Thr Val Ile Arg Arg Gly Lys Lys Lys Tyr Tyr Leu Ile
405 410 415
Arg Tyr Ala
<210> 65
<211> 2643
<212> DNA
<213> Geobacillus
<400> 65
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<212> PRT
<213> Geobacillus
<400> 66
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Phe Lys Ile Glu Glu His Val His Ser Val Gly His Ser Glu Arg Ser
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<212> DNA
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<213> Geobacillus stearothermophilus
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<213> Geobacillus subterraneus
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<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
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gtcggcgcca ttacggagtc agacatcttg ttggcaacga cctcgaacgc gatcgtcatc 1920
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<211> 784
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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420 425 430
Thr Gln Asp Gly Ile Asp His Leu Leu Glu Met Ile Leu Leu Val Ser
435 440 445
Glu Met Glu Glu Leu Lys Ala Asn Pro Asn Arg Arg Ala Leu Gly Thr
450 455 460
Val Ile Glu Ala Lys Leu Asp Lys Gly Arg Gly Pro Val Ala Thr Leu
465 470 475 480
Leu Val Gln Ala Gly Thr Leu Lys Val Gly Asp Pro Ile Val Val Gly
485 490 495
Thr Thr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Met Val Asn Asp Ser Gly Arg Arg
500 505 510
Val Lys Glu Ala Gly Pro Ser Met Pro Val Glu Ile Thr Gly Leu His
515 520 525
Asp Val Pro Gln Ala Gly Asp Arg Phe Met Val Phe Glu Asp Glu Lys
530 535 540
Lys Ala Arg Gln Ile Gly Glu Ala Arg Ala Gln Arg Gln Leu Gln Glu
545 550 555 560
Gln Arg Ser Val Lys Thr Arg Val Ser Leu Asp Asp Leu Phe Glu Gln
565 570 575
Ile Lys Gln Gly Glu Met Lys Glu Leu Asn Leu Ile Val Lys Ala Asp
580 585 590
Val Gln Gly Ser Val Glu Ala Leu Val Ala Ala Leu Gln Lys Ile Asp
595 600 605
Ile Glu Gly Val Arg Val Lys Ile Ile His Ala Ala Val Gly Ala Ile
610 615 620
Thr Glu Ser Asp Ile Leu Leu Ala Thr Thr Ser Asn Ala Ile Val Ile
625 630 635 640
Gly Phe Asn Val Arg Pro Asp Thr Asn Ala Lys Arg Ala Ala Glu Ser
645 650 655
Glu Asn Val Asp Ile Arg Leu His Arg Ile Ile Tyr Asn Val Ile Glu
660 665 670
Glu Ile Glu Ala Ala Met Lys Gly Met Leu Asp Pro Glu Tyr Glu Glu
675 680 685
Lys Val Ile Gly Gln Ala Glu Val Arg Gln Thr Phe Lys Val Ser Lys
690 695 700
Val Gly Thr Ile Ala Gly Cys Tyr Val Thr Asp Gly Lys Ile Thr Arg
705 710 715 720
Asp Ser Lys Val Arg Leu Ile Arg Gln Gly Ile Val Val Tyr Glu Gly
725 730 735
Glu Ile Asp Ser Leu Lys Arg Tyr Lys Asp Asp Val Arg Glu Val Ala
740 745 750
Gln Gly Tyr Glu Cys Gly Val Thr Ile Lys Asn Phe Asn Asp Ile Lys
755 760 765
Glu Gly Asp Val Ile Glu Ala Tyr Ile Met Gln Glu Val Ala Arg Ala
770 775 780
<210> 73
<211> 339
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 73
atggactacg gcaaattccg ctttgagcag caaaagaaag aaaaagaagc gcgcaaaaag 60
caaaaggtga tcaacattaa agaggtgcgc ctcagcccga caattgagga acacgacttt 120
aatacgaaac tacgcaatgc gcgcaagttt ttagaaaaag gcgataaagt gaaggcgacg 180
atccgcttta aagggcgggc gatcacccat aaagaaatcg ggcagcgcgt ccttgaccgc 240
ttctcggaag catgcgctga tatcgcggtc gtcgaaacgg cgccgaaatt ggaagggcgc 300
aacatgtttt tagtgctggc accgaaaaat gacaacaag 339
<210> 74
<211> 113
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 74
Met Asp Tyr Gly Lys Phe Arg Phe Glu Gln Gln Lys Lys Glu Lys Glu
1 5 10 15
Ala Arg Lys Lys Gln Lys Val Ile Asn Ile Lys Glu Val Arg Leu Ser
20 25 30
Pro Thr Ile Glu Glu His Asp Phe Asn Thr Lys Leu Arg Asn Ala Arg
35 40 45
Lys Phe Leu Glu Lys Gly Asp Lys Val Lys Ala Thr Ile Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Ile Thr His Lys Glu Ile Gly Gln Arg Val Leu Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Glu Ala Cys Ala Asp Ile Ala Val Val Glu Thr Ala Pro Lys
85 90 95
Leu Glu Gly Arg Asn Met Phe Leu Val Leu Ala Pro Lys Asn Asp Asn
100 105 110
Lys
<210> 75
<211> 2076
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 75
atggcaagag agttctcctt agaaaacact cgtaacatag gaatcatggc gcacattgac 60
gccggaaaaa cgacgacgac ggaacgaatc ctgttctaca caggccgcgt tcataaaatc 120
ggggaaacgc atgaaggctc agctacgatg gactggatgg aacaagagca agagcgcggg 180
attacgatta cgtcggcggc gacaacggcg caatggaaag gccatcgcat caacatcatc 240
gacacgccag ggcacgtcga cttcacggtt gaggttgaac gttcgttgcg cgtgttggac 300
ggagccatta cagttcttga cgcccaatct ggtgtagaac cgcaaacgga aacagtttgg 360
cgtcaagcga ctacatatgg tgttccgcgg attgtattcg tcaacaaaat ggacaaaatc 420
ggtgcggact tcttgtatgc ggtaaaaacg ctccatgacc gcttacaagc gaatgcctac 480
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gaagactacc gcgatttagc ggaagaatat catggcaagc tcattgaggc tgttgcggaa 660
ctcgatgaag agctgatgat gaaatattta gaaggagaag aaattacgaa agaagagctg 720
aaagccgcaa tccgtaaggc gacgatcaac gttgaattct atccagtctt ctgcggttca 780
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gttgggaagt tgacgttctt ccgcgtctac tccggaacgc ttgattccgg ttcttacgtc 1020
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caccgtcaag aaatttcgac agtctatgcc ggtgatattg cggcagcagt aggtttaaaa 1140
gaaacaacga ccggcgatac tctatgtgat gagaaaaatc ttgtcatctt agagtcgatg 1200
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tttgaatttg aaaatgcgat cgtcggtggg gtcgttccga aagagtacgt gccggctgtt 1620
caagctggat tggaagaagc gatgcaaaac ggtgtcttag ctggctaccc ggttgttgac 1680
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atcgccgatg aaattatcaa aaaaaataaa ggcgaa 2076
<210> 76
<211> 692
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 76
Met Ala Arg Glu Phe Ser Leu Glu Asn Thr Arg Asn Ile Gly Ile Met
1 5 10 15
Ala His Ile Asp Ala Gly Lys Thr Thr Thr Thr Glu Arg Ile Leu Phe
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Tyr Thr Gly Arg Val His Lys Ile Gly Glu Thr His Glu Gly Ser Ala
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65 70 75 80
Asp Thr Pro Gly His Val Asp Phe Thr Val Glu Val Glu Arg Ser Leu
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Arg Val Leu Asp Gly Ala Ile Thr Val Leu Asp Ala Gln Ser Gly Val
100 105 110
Glu Pro Gln Thr Glu Thr Val Trp Arg Gln Ala Thr Thr Tyr Gly Val
115 120 125
Pro Arg Ile Val Phe Val Asn Lys Met Asp Lys Ile Gly Ala Asp Phe
130 135 140
Leu Tyr Ala Val Lys Thr Leu His Asp Arg Leu Gln Ala Asn Ala Tyr
145 150 155 160
Pro Val Gln Leu Pro Ile Gly Ala Glu Asp Gln Phe Thr Gly Ile Ile
165 170 175
Asp Leu Val Glu Met Cys Ala Tyr His Tyr His Asp Asp Leu Gly Lys
180 185 190
Asn Ile Glu Arg Ile Glu Ile Pro Glu Asp Tyr Arg Asp Leu Ala Glu
195 200 205
Glu Tyr His Gly Lys Leu Ile Glu Ala Val Ala Glu Leu Asp Glu Glu
210 215 220
Leu Met Met Lys Tyr Leu Glu Gly Glu Glu Ile Thr Lys Glu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Ala Ala Ile Arg Lys Ala Thr Ile Asn Val Glu Phe Tyr Pro Val
245 250 255
Phe Cys Gly Ser Ala Phe Lys Asn Lys Gly Val Gln Leu Leu Leu Asp
260 265 270
Gly Val Val Asp Tyr Leu Pro Ser Pro Leu Asp Ile Pro Ala Ile Arg
275 280 285
Gly Ile Ile Pro Asp Thr Glu Glu Glu Val Ala Arg Glu Ala Arg Asp
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Val Gly Lys Leu Thr Phe Phe Arg Val Tyr Ser Gly Thr Leu Asp Ser
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Gly Ser Tyr Val Met Asn Ser Thr Lys Arg Lys Arg Glu Arg Ile Gly
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Asp Thr Leu Cys Asp Glu Lys Asn Leu Val Ile Leu Glu Ser Met
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435 440 445
Ile Ser Gly Met Gly Glu Leu His Leu Asp Ile Ile Val Asp Arg Met
450 455 460
Arg Arg Glu Phe Lys Val Glu Ala Asn Val Gly Ala Pro Gln Val Ala
465 470 475 480
Tyr Arg Glu Thr Phe Arg Gln Ser Ala Gln Val Glu Gly Lys Phe Ile
485 490 495
Arg Gln Ser Gly Gly Arg Gly Gln Tyr Gly His Val Trp Ile Glu Phe
500 505 510
Thr Pro Asn Glu Arg Gly Lys Gly Phe Glu Phe Glu Asn Ala Ile Val
515 520 525
Gly Gly Val Val Pro Lys Glu Tyr Val Pro Ala Val Gln Ala Gly Leu
530 535 540
Glu Glu Ala Met Gln Asn Gly Val Leu Ala Gly Tyr Pro Val Val Asp
545 550 555 560
Ile Lys Ala Lys Leu Phe Asp Gly Ser Tyr His Asp Val Asp Ser Ser
565 570 575
Glu Met Ala Phe Lys Ile Ala Ala Ser Met Ala Leu Lys Asn Ala Ala
580 585 590
Ala Lys Cys Glu Pro Val Leu Leu Glu Pro Ile Met Lys Val Glu Val
595 600 605
Val Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gly Asp Ile Met Gly Asp Ile Thr Ser
610 615 620
Arg Arg Gly Arg Val Glu Gly Met Glu Ala Arg Gly Asn Ala Gln Val
625 630 635 640
Val Arg Ala Met Val Pro Leu Ala Glu Met Phe Gly Tyr Ala Thr Ser
645 650 655
Leu Arg Ser Asn Thr Gln Gly Arg Gly Thr Phe Ser Met Val Phe Asp
660 665 670
His Tyr Glu Glu Val Pro Lys Asn Ile Ala Asp Glu Ile Ile Lys Lys
675 680 685
Asn Lys Gly Glu
690
<210> 77
<211> 1185
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 77
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ccaactccgc aacgtgaagt agacaaaccg ttcatgatgc cggttgagga cgtcttctcg 660
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<210> 78
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<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 78
Met Ala Lys Ala Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Val Asn Ile Gly
1 5 10 15
Thr Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Ala Ile
20 25 30
Thr Thr Val Leu Ala Lys Gln Gly Lys Ala Glu Ala Arg Ala Tyr Asp
35 40 45
Gln Ile Asp Ala Ala Pro Glu Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Cys Pro Gly His Ala Asp Tyr Val Lys Asn Met Ile Thr Gly Ala
85 90 95
Ala Gln Met Asp Gly Ala Ile Leu Val Val Ser Ala Ala Asp Gly Pro
100 105 110
Met Pro Gln Thr Arg Glu His Ile Leu Leu Ser Arg Gln Val Gly Val
115 120 125
Pro Tyr Ile Val Val Phe Leu Asn Lys Cys Asp Met Val Asp Asp Glu
130 135 140
Glu Leu Leu Glu Leu Val Glu Met Glu Val Arg Asp Leu Leu Ser Glu
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165 170 175
Lys Ala Leu Glu Gly Asp Ala Gln Trp Glu Glu Lys Ile Val Glu Leu
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gly Thr Val Ala Thr Gly Arg Val Glu Arg Gly Thr Leu Lys Val Gly
225 230 235 240
Asp Pro Val Glu Ile Ile Gly Leu Ser Asp Glu Pro Lys Ser Thr Thr
245 250 255
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260 265 270
Gly Asp Asn Ile Gly Ala Leu Leu Arg Gly Val Ser Arg Asp Glu Val
275 280 285
Glu Arg Gly Gln Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile Thr Pro His Thr
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Thr Asp Val Thr Gly Ile Ile Thr Leu Pro Glu Gly Val Glu Met Val
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Met Pro Gly Asp Asn Val Glu Met Thr Val Glu Leu Ile Ala Pro Ile
355 360 365
Ala Ile Glu Glu Gly Thr Lys Phe Ser Ile Arg Glu Gly Gly Arg Thr
370 375 380
Val Gly Ala Gly Ser Val Ser Glu Ile Ile Glu
385 390 395
<210> 79
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<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 79
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<210> 80
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<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 80
Met Ala Ile Thr Ala Gln Met Val Lys Glu Leu Arg Glu Lys Thr Gly
1 5 10 15
Ala Gly Met Met Asp Cys Lys Lys Ala Leu Thr Glu Thr Asn Gly Asp
20 25 30
Met Glu Lys Ala Ile Asp Trp Leu Arg Glu Lys Gly Ile Ala Lys Ala
35 40 45
Ala Lys Lys Ala Asp Arg Ile Ala Ala Glu Gly Met Thr Tyr Ile Ala
50 55 60
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Val Ala Lys Ile Gly Glu Lys Ile Thr Leu Arg Arg Phe Ala Val Val
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Asn Lys Ala Asp Asp Glu Thr Phe Gly Ala Tyr Leu His Met Gly Gly
145 150 155 160
Arg Ile Gly Val Leu Thr Leu Leu Ala Gly Asn Ala Thr Glu Glu Val
165 170 175
Ala Lys Asp Val Ala Met His Ile Ala Ala Leu His Pro Lys Tyr Val
180 185 190
Ser Arg Asp Glu Val Pro Gln Glu Glu Ile Ala Arg Glu Arg Glu Val
195 200 205
Leu Lys Gln Gln Ala Leu Asn Glu Gly Lys Pro Glu Asn Ile Val Glu
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Lys Met Val Glu Gly Arg Leu Lys Lys Phe Tyr Glu Asp Val Cys Leu
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260 265 270
Gly Glu Gly Leu Glu Lys Arg Gln Asp Asn Phe Ala Glu Glu Val Met
275 280 285
Ser Gln Val Arg Lys Gln
290
<210> 81
<211> 1827
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 81
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tttgaagtga ccgaagtcgg cgtgtttaca ccaaaaccaa aagttgtcga cgaactgatg 780
gtcggtgatg tcggctattt aactgcgtcg atcaaaaacg tacaagatac gcgcgtcggc 840
gatacgatta ccgatgccga acggccggct gctgagccac tccctggcta ccggaagctc 900
aatccgatgg tgttttgcgg catgtacccg atcgacacgg cgcgctacaa cgacttgcgc 960
gaagcgttag aaaagctgca gctcaacgat gcggcgcttc actttgaacc ggaaacgtcg 1020
caggcgctcg ggtttggctt tcgttgcggg tttctcggct tgcttcatat ggagattatc 1080
caagagcgga ttgaacgtga atttcatatc gatttaatta caacggcgcc gagcgttgtc 1140
tacaaagtat atttaacgga cggaacggaa gtcgatgtcg acaacccgac gaacatgccg 1200
gatccgcaaa aaatcgaccg catcgaagag ccgtatgtaa aagcgacgat tatggtgccg 1260
aacgactacg tcggaccggt gatggagctg tgccaaggaa agcgtggcac gttcgttgac 1320
atgcaatatt tagatgaaaa gcgggtcatg ttgatttacg atattccgct gtcggaaatc 1380
gtgtatgact ttttcgatgc gttaaagtcg aacacgaaag ggtatgcgtc gtttgactat 1440
gaattgatcg gttaccggcc gtccaatctt gtcaaaatgg atattttgtt gaatggcgaa 1500
aaaattgacg ctttatcgtt tattgttcac cgcgattcgg cttatgagcg cggcaaagtg 1560
atcgtcgaga agctgaaaga tttaattcca cgccaacagt ttgaagtgcc tgtgcaggcg 1620
gcgatcggca ataagatcat cgcccgttcg acgatcaagg cgctgcgtaa aaacgtgctc 1680
gccaaatgtt acggcggcga cgtgtcgcgg aaacggaaac tgcttgagaa acaaaaagaa 1740
ggaaagaaac ggatgaaaca aatcggttcg gtcgaagtgc cgcaggaagc gtttatggct 1800
gtcttgaaaa tcgacgacca gaaaaaa 1827
<210> 82
<211> 609
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 82
Met Asn Arg Glu Glu Arg Leu Lys Arg Gln Glu Arg Ile Arg Asn Phe
1 5 10 15
Ser Ile Ile Ala His Ile Asp His Gly Lys Ser Thr Leu Ala Asp Arg
20 25 30
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35 40 45
Thr Leu Asp Met Met Glu Leu Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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Ile Asp Asn Asn Leu Glu Ile Leu Pro Val Ile Asn Lys Ile Asp Leu
130 135 140
Pro Ser Ala Glu Pro Glu Arg Val Arg Gln Glu Ile Glu Asp Val Ile
145 150 155 160
Gly Leu Asp Ala Ser Glu Ala Val Leu Ala Ser Ala Lys Val Gly Ile
165 170 175
Gly Val Glu Asp Ile Leu Glu Gln Ile Val Glu Lys Ile Pro Ala Pro
180 185 190
Ser Gly Asp Pro Asp Ala Pro Leu Lys Ala Leu Ile Phe Asp Ser Leu
195 200 205
Tyr Asp Pro Tyr Arg Gly Val Val Ala Tyr Val Arg Ile Val Asp Gly
210 215 220
Thr Val Lys Pro Gly Gln Arg Ile Lys Met Met Ser Thr Gly Lys Glu
225 230 235 240
Phe Glu Val Thr Glu Val Gly Val Phe Thr Pro Lys Pro Lys Val Val
245 250 255
Asp Glu Leu Met Val Gly Asp Val Gly Tyr Leu Thr Ala Ser Ile Lys
260 265 270
Asn Val Gln Asp Thr Arg Val Gly Asp Thr Ile Thr Asp Ala Glu Arg
275 280 285
Pro Ala Ala Glu Pro Leu Pro Gly Tyr Arg Lys Leu Asn Pro Met Val
290 295 300
Phe Cys Gly Met Tyr Pro Ile Asp Thr Ala Arg Tyr Asn Asp Leu Arg
305 310 315 320
Glu Ala Leu Glu Lys Leu Gln Leu Asn Asp Ala Ala Leu His Phe Glu
325 330 335
Pro Glu Thr Ser Gln Ala Leu Gly Phe Gly Phe Arg Cys Gly Phe Leu
340 345 350
Gly Leu Leu His Met Glu Ile Ile Gln Glu Arg Ile Glu Arg Glu Phe
355 360 365
His Ile Asp Leu Ile Thr Thr Ala Pro Ser Val Val Tyr Lys Val Tyr
370 375 380
Leu Thr Asp Gly Thr Glu Val Asp Val Asp Asn Pro Thr Asn Met Pro
385 390 395 400
Asp Pro Gln Lys Ile Asp Arg Ile Glu Glu Pro Tyr Val Lys Ala Thr
405 410 415
Ile Met Val Pro Asn Asp Tyr Val Gly Pro Val Met Glu Leu Cys Gln
420 425 430
Gly Lys Arg Gly Thr Phe Val Asp Met Gln Tyr Leu Asp Glu Lys Arg
435 440 445
Val Met Leu Ile Tyr Asp Ile Pro Leu Ser Glu Ile Val Tyr Asp Phe
450 455 460
Phe Asp Ala Leu Lys Ser Asn Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr
465 470 475 480
Glu Leu Ile Gly Tyr Arg Pro Ser Asn Leu Val Lys Met Asp Ile Leu
485 490 495
Leu Asn Gly Glu Lys Ile Asp Ala Leu Ser Phe Ile Val His Arg Asp
500 505 510
Ser Ala Tyr Glu Arg Gly Lys Val Ile Val Glu Lys Leu Lys Asp Leu
515 520 525
Ile Pro Arg Gln Gln Phe Glu Val Pro Val Gln Ala Ala Ile Gly Asn
530 535 540
Lys Ile Ile Ala Arg Ser Thr Ile Lys Ala Leu Arg Lys Asn Val Leu
545 550 555 560
Ala Lys Cys Tyr Gly Gly Asp Val Ser Arg Lys Arg Lys Leu Leu Glu
565 570 575
Lys Gln Lys Glu Gly Lys Lys Arg Met Lys Gln Ile Gly Ser Val Glu
580 585 590
Val Pro Gln Glu Ala Phe Met Ala Val Leu Lys Ile Asp Asp Gln Lys
595 600 605
Lys
<210> 83
<211> 555
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 83
atgatttcag tgaacgattt tcgcacaggg cttacgattg aggtcgacgg cgagatttgg 60
cgcgtccttg agttccagca tgttaagccg ggcaaagggg cggcgttcgt ccgttcgaag 120
ctgcgcaact tgcgtaccgg cgccattcaa gagcggacgt tccgcgctgg cgaaaaagta 180
aaccgggcac aaattgatac gcgcaaaatg caatatttat acgctaacgg cgacttgcat 240
gtctttatgg atatggaaac atacgaacaa atcgagctgc cagcgaaaca aattgagtat 300
gagctgaagt tcttaaaaga aaacatggaa gtatttatca tgatgtatca aggcgaaacg 360
atcggtgttg agctgccgaa caccgtcgag ttgaaagtcg ttgaaacaga gccgggcatc 420
aaaggtgaca cggcttccgg cggttcgaag ccggccaagc tcgaaaccgg tcttgtcgtt 480
caagtgccgt ttttcgtcaa tgaaggcgac acgctcatca ttaacacggc tgacggtacg 540
tacgtttcgc gggca 555
<210> 84
<211> 185
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 84
Met Ile Ser Val Asn Asp Phe Arg Thr Gly Leu Thr Ile Glu Val Asp
1 5 10 15
Gly Glu Ile Trp Arg Val Leu Glu Phe Gln His Val Lys Pro Gly Lys
20 25 30
Gly Ala Ala Phe Val Arg Ser Lys Leu Arg Asn Leu Arg Thr Gly Ala
35 40 45
Ile Gln Glu Arg Thr Phe Arg Ala Gly Glu Lys Val Asn Arg Ala Gln
50 55 60
Ile Asp Thr Arg Lys Met Gln Tyr Leu Tyr Ala Asn Gly Asp Leu His
65 70 75 80
Val Phe Met Asp Met Glu Thr Tyr Glu Gln Ile Glu Leu Pro Ala Lys
85 90 95
Gln Ile Glu Tyr Glu Leu Lys Phe Leu Lys Glu Asn Met Glu Val Phe
100 105 110
Ile Met Met Tyr Gln Gly Glu Thr Ile Gly Val Glu Leu Pro Asn Thr
115 120 125
Val Glu Leu Lys Val Val Glu Thr Glu Pro Gly Ile Lys Gly Asp Thr
130 135 140
Ala Ser Gly Gly Ser Lys Pro Ala Lys Leu Glu Thr Gly Leu Val Val
145 150 155 160
Gln Val Pro Phe Phe Val Asn Glu Gly Asp Thr Leu Ile Ile Asn Thr
165 170 175
Ala Asp Gly Thr Tyr Val Ser Arg Ala
180 185
<210> 85
<211> 1017
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 85
atggatccag ccgttatcaa cgacccgaaa aagttgcgcg attattcgaa agagcaggct 60
gatttgactg aaacggtgca aacgtaccgt gaatacaagt ccgttcgcag tcagctcgcg 120
gaagcgaagg ctatgctgga agaaaaactt gagccagagc tgcgcgagat ggtgaaagag 180
gaaattgatg agctcgaaga acgggaagaa gcgctcgttg agaagttgaa agtgttgctt 240
ttgccgaaag atccgaatga tgagaaaaac gtcattatgg aaattcgtgc cgccgccggt 300
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tcgcaagggt ggaaaacgga agtgatcgaa gcaagcccaa caggtcttgg cggctataaa 420
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gctcatcgcg tccaacgcgt cccggaaacg gaatcaggcg gacgcatcca tacatcgacg 540
gcaacggtcg cctgcttgcc ggaaatggaa gaagtcgaag tcgaaattca tgaaaaagac 600
attcgcgtcg atacgtacgc ctcgagcggg ccagggggac aaagcgtgaa cacgacgatg 660
tcagccgtac gcctcaccca tattccgacc ggcattgtcg ttacttgcca agacgaaaaa 720
tcgcaaatta aaaacaaaga aaaagcgatg aaagtgttgc gcgcccgcat ttacgacaaa 780
taccagcaag aagcgcgcgc cgagtatgac caaacgcgta agcaagcagt cggcaccggc 840
gatcgctcag agcgcatccg cacgtacaac ttcccgcaaa accgcgtcac tgaccaccgt 900
atcgggttga cgattcaaaa gcttgacctc gtgttagacg ggcagctcga tgaaattatc 960
gaggcgctca ttttagacga ccagtcgaaa aaactggagc aagcgaacga tgcgtcg 1017
<210> 86
<211> 339
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 86
Met Asp Pro Ala Val Ile Asn Asp Pro Lys Lys Leu Arg Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Lys Glu Gln Ala Asp Leu Thr Glu Thr Val Gln Thr Tyr Arg Glu Tyr
20 25 30
Lys Ser Val Arg Ser Gln Leu Ala Glu Ala Lys Ala Met Leu Glu Glu
35 40 45
Lys Leu Glu Pro Glu Leu Arg Glu Met Val Lys Glu Glu Ile Asp Glu
50 55 60
Leu Glu Glu Arg Glu Glu Ala Leu Val Glu Lys Leu Lys Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Lys Asp Pro Asn Asp Glu Lys Asn Val Ile Met Glu Ile Arg
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Gly Glu Glu Ala Ala Leu Phe Ala Gly Asp Leu Tyr
100 105 110
Arg Met Tyr Thr Arg Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Trp Lys Thr Glu Val
115 120 125
Ile Glu Ala Ser Pro Thr Gly Leu Gly Gly Tyr Lys Glu Ile Ile Phe
130 135 140
Met Val Asn Gly Lys Gly Ala Tyr Ser Lys Leu Lys Phe Glu Asn Gly
145 150 155 160
Ala His Arg Val Gln Arg Val Pro Glu Thr Glu Ser Gly Gly Arg Ile
165 170 175
His Thr Ser Thr Ala Thr Val Ala Cys Leu Pro Glu Met Glu Glu Val
180 185 190
Glu Val Glu Ile His Glu Lys Asp Ile Arg Val Asp Thr Tyr Ala Ser
195 200 205
Ser Gly Pro Gly Gly Gln Ser Val Asn Thr Thr Met Ser Ala Val Arg
210 215 220
Leu Thr His Ile Pro Thr Gly Ile Val Val Thr Cys Gln Asp Glu Lys
225 230 235 240
Ser Gln Ile Lys Asn Lys Glu Lys Ala Met Lys Val Leu Arg Ala Arg
245 250 255
Ile Tyr Asp Lys Tyr Gln Gln Glu Ala Arg Ala Glu Tyr Asp Gln Thr
260 265 270
Arg Lys Gln Ala Val Gly Thr Gly Asp Arg Ser Glu Arg Ile Arg Thr
275 280 285
Tyr Asn Phe Pro Gln Asn Arg Val Thr Asp His Arg Ile Gly Leu Thr
290 295 300
Ile Gln Lys Leu Asp Leu Val Leu Asp Gly Gln Leu Asp Glu Ile Ile
305 310 315 320
Glu Ala Leu Ile Leu Asp Asp Gln Ser Lys Lys Leu Glu Gln Ala Asn
325 330 335
Asp Ala Ser
<210> 87
<211> 981
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 87
atggccgcgc ccggcttttg ggatgaccag aaagcggcgc aggcgatcat ttccgaagcg 60
aatgcgctca aggaattagt cggcgagttt gaatcgctcg cggaacggtt cgacaacttg 120
gaagtgacgt atgagttgtt gaaagaggag ccggatgacg agctgcaggc tgaacttgtg 180
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gagccgtacg accaaaataa cgcgattttg gagcttcatc cgggtgcggg cggcacggaa 300
tcgcaagact gggcgtcgat gctgttgcgc atgtacacgc gctgggcgga gaaaaaagga 360
tttaaagtcg aaacactgga ttatctccca ggcgaggaag ccggggtgaa aagcgtcacc 420
ttgcttatca agggacataa tgcatacggc tacttaaagg cggaaaaagg ggtacaccgg 480
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gaagtcgtgc cggagatgga cgataacatt gagattgaga tccgtccgga agagctgaaa 600
atcgacacgt accgctcaag cggtgcgggc gggcagcacg tcaacacgac cgactccgcg 660
gtgcgcatca cccacttgcc gaccggcatt gtcgttacgt gccaatcgga gcggtcgcaa 720
attaaaaacc gcgaaaaagc gatgaatatg ttaaaagcga agctgtatca aaagaaaatg 780
gaggaacagc aagctgaact cgccgagctg cgcggcgagc aaaaagaaat cggctggggc 840
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gtggaggtcg gcaacgtgca agcggtgatg gatggggaaa tcgatgtgtt cattgacgcg 960
tatttgcgcg cgaaattgaa g 981
<210> 88
<211> 327
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 88
Met Ala Ala Pro Gly Phe Trp Asp Asp Gln Lys Ala Ala Gln Ala Ile
1 5 10 15
Ile Ser Glu Ala Asn Ala Leu Lys Glu Leu Val Gly Glu Phe Glu Ser
20 25 30
Leu Ala Glu Arg Phe Asp Asn Leu Glu Val Thr Tyr Glu Leu Leu Lys
35 40 45
Glu Glu Pro Asp Asp Glu Leu Gln Ala Glu Leu Val Glu Glu Ala Lys
50 55 60
Lys Leu Thr Lys Asp Phe Ser Gln Phe Glu Leu Gln Leu Leu Leu Asn
65 70 75 80
Glu Pro Tyr Asp Gln Asn Asn Ala Ile Leu Glu Leu His Pro Gly Ala
85 90 95
Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Trp Ala Ser Met Leu Leu Arg Met Tyr
100 105 110
Thr Arg Trp Ala Glu Lys Lys Gly Phe Lys Val Glu Thr Leu Asp Tyr
115 120 125
Leu Pro Gly Glu Glu Ala Gly Val Lys Ser Val Thr Leu Leu Ile Lys
130 135 140
Gly His Asn Ala Tyr Gly Tyr Leu Lys Ala Glu Lys Gly Val His Arg
145 150 155 160
Leu Val Arg Ile Ser Pro Phe Asp Ala Ser Gly Arg Arg His Thr Ser
165 170 175
Phe Val Ser Cys Glu Val Val Pro Glu Met Asp Asp Asn Ile Glu Ile
180 185 190
Glu Ile Arg Pro Glu Glu Leu Lys Ile Asp Thr Tyr Arg Ser Ser Gly
195 200 205
Ala Gly Gly Gln His Val Asn Thr Thr Asp Ser Ala Val Arg Ile Thr
210 215 220
His Leu Pro Thr Gly Ile Val Val Thr Cys Gln Ser Glu Arg Ser Gln
225 230 235 240
Ile Lys Asn Arg Glu Lys Ala Met Asn Met Leu Lys Ala Lys Leu Tyr
245 250 255
Gln Lys Lys Met Glu Glu Gln Gln Ala Glu Leu Ala Glu Leu Arg Gly
260 265 270
Glu Gln Lys Glu Ile Gly Trp Gly Ser Gln Ile Arg Ser Tyr Val Phe
275 280 285
His Pro Tyr Ser Leu Val Lys Asp His Arg Thr Asn Val Glu Val Gly
290 295 300
Asn Val Gln Ala Val Met Asp Gly Glu Ile Asp Val Phe Ile Asp Ala
305 310 315 320
Tyr Leu Arg Ala Lys Leu Lys
325
<210> 89
<211> 555
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 89
atggcaaagc aagtgatcca acaggcgaaa gaaaaaatgg ataaagctgt gcaagcgttc 60
agccgcgagt tggcgaccgt ccgtgccggt cgggcgaacg cggggttgct tgagaaagta 120
accgttgact attacggtgt cgcaacgccg atcaaccagc tcgctacgat cagcgtgccg 180
gaagcgcgta tgcttgtcat tcagccgtat gacaaatcgg tcattaaaga aatggaaaaa 240
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gtcattccgc cgcttactga agaacgtcgc cgtgaactgg cgaagctcgt caaaaaatat 360
tcggaagaag cgaaagttgc ggtgcgcaac atccgtcgcg atgcaaacga tgagctgaaa 420
aaactcgaga aaaatagcga gattacggaa gatgagctgc gcagctatac cgacgaagtg 480
caaaagctga ccgacagcca tatcgccaaa attgacgcca tcacaaaaga gaaagaaaaa 540
gaagtgatgg aagta 555
<210> 90
<211> 185
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 90
Met Ala Lys Gln Val Ile Gln Gln Ala Lys Glu Lys Met Asp Lys Ala
1 5 10 15
Val Gln Ala Phe Ser Arg Glu Leu Ala Thr Val Arg Ala Gly Arg Ala
20 25 30
Asn Ala Gly Leu Leu Glu Lys Val Thr Val Asp Tyr Tyr Gly Val Ala
35 40 45
Thr Pro Ile Asn Gln Leu Ala Thr Ile Ser Val Pro Glu Ala Arg Met
50 55 60
Leu Val Ile Gln Pro Tyr Asp Lys Ser Val Ile Lys Glu Met Glu Lys
65 70 75 80
Ala Ile Leu Ala Ser Asp Leu Gly Val Thr Pro Ser Asn Asp Gly Ser
85 90 95
Val Ile Arg Leu Val Ile Pro Pro Leu Thr Glu Glu Arg Arg Arg Glu
100 105 110
Leu Ala Lys Leu Val Lys Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Val Ala Val
115 120 125
Arg Asn Ile Arg Arg Asp Ala Asn Asp Glu Leu Lys Lys Leu Glu Lys
130 135 140
Asn Ser Glu Ile Thr Glu Asp Glu Leu Arg Ser Tyr Thr Asp Glu Val
145 150 155 160
Gln Lys Leu Thr Asp Ser His Ile Ala Lys Ile Asp Ala Ile Thr Lys
165 170 175
Glu Lys Glu Lys Glu Val Met Glu Val
180 185
<210> 91
<211> 2676
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 91
atgagagttt ttttatataa aagaccaaag gggaggattg ttatgaaaaa gttaacatct 60
gccgaagtgc ggcgtatgtt tttgcagttt ttccaagaaa aaggccatgc ggtcgagccg 120
agcgcttcgc tcattcctgt cgatgacccg tcgttattat ggatcaacag cggtgtcgcg 180
acgctgaaaa aatattttga tggccgtatc atcccggaca acccgcgcat ttgcaatgcg 240
caaaaatcga tccgcacaaa cgacatcgaa aatgtcggga aaacggctcg ccaccatacg 300
ttttttgaaa tgctcggcaa cttttcgatc ggcgattatt tcaagcgtga agcgattcat 360
tgggcatggg agtttttaac aagtgaaaag tggattggtt ttgatccaga gcggttgtca 420
gtcactgttc atccggaaga cgaagaggcg tataacattt ggcgcaacga gatcggtctt 480
cctgaagagc ggattattcg tttagaagga aacttctggg atatcggtga aggcccgagc 540
ggtccgaaca cggaaatttt ttatgaccgc ggtgaagcgt tcggcaacga tccaaacgat 600
ccagaactgt atccaggcgg ggaaaatgac cgctacttag aagtatggaa tctcgtcttt 660
tcacagttca accataaccc ggacggcacg tacacgccgc tgccgaagaa aaacatcgat 720
accggcatgg gcttagagcg gatgtgctcg attttgcaag atgtaccgac gaactttgaa 780
actgatttgt tcatgccgat catccgcgcg actgagcaga tcgcgggtga gcaatacggc 840
aaagatccga ataaagacgt tgcttttaag gtcatcgctg accatattcg tgccgtgacg 900
tttgcggtcg gcgacggggc gctgccgtcg aacgaaggac gaggctatgt attgcgccgc 960
ctgcttcgcc gcgctgtgcg ctatgcgaaa caaatcggca ttgaccgtcc atttatgtat 1020
gagcttgttc cggttgtcgg tgaaattatg caagactatt atccggaagt gaaagaaaaa 1080
gccgatttca tcgcccgcgt cattcggacg gaagaagagc ggttccacga aacgcttcat 1140
gaagggctcg ccattttggc agaagtgatg gaaaaggcga aaaaacaagg aagcaccgtc 1200
attccaggag aagaggcgtt ccgcttgtac gatacgtacg gcttcccgct cgagctgacg 1260
gaagaatatg ctgctgaagc gggcatgtcg gtcgatcacg ccggttttga gcgcgagatg 1320
gagcgccagc gcgaacgggc ccgtgccgct cgccaagatg tcgattcgat gcaagtgcaa 1380
ggcggggtgc tcggcgacat taaagacgaa agccgttttg tcggctacga tgagctcgtc 1440
gtttcttcga cggtcattgc catcattaaa gacggacagc tcgtggagga agtcgggact 1500
ggcgaggaag cacaaatcat cgttgatgtg acgccgtttt acgccgaaag cggcggacaa 1560
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ggcgatcgct atacggcgcg cgtcgatgaa gtgaagcggt cgcaaatcgt gaaaaaccat 1740
acggcgaccc acttgcttca tcaagcgtta aaagacgttc ttggccgcca tgtcaaccag 1800
gccggatcac tcgttgcccc ggatcggctt cgctttgact ttactcattt cgggcaagtg 1860
aagcctgatg agctcgagcg cattgaggcg atcgtcaatg aacaaatttg gaagagtatt 1920
ccggtcgaca ttttttacaa accgctcgag gaagcaaaag cgatgggggc gatggcgctg 1980
tttggtgaaa aatacggcga tatcgtccgc gttgttaaag ttggcgacta cagcttagag 2040
ttgtgcggcg gctgccatgt gccgaataca gcggccattg ggttgtttaa aatcgtctcc 2100
gagtccggca tcggtgccgg cacgcgccgg attgaagcgg tgactgggga agcggcatac 2160
cgctttatga gcgaacagct tgctctgttg caagaagcgg cgcaaaagct gaaaacgagc 2220
ccgagagagc tgaatgcccg ccttgatggg ctgtttgccg aactgcgcca actgcagcgc 2280
gaaaatgagt cgcttgctgc ccgtctcgcc catatggagg cggaacacct cacccgtcaa 2340
gtgaaagagg tgggcggtgt gccggtatta gccgcaaaag tgcaggcgaa cgacatgaac 2400
caattgcggg cgatggctga tgacttgaag caaaaactag ggacggcggt catcgtgtta 2460
gcggccgtgc aaggtggcaa agtccaattg attgctgcgg tgactgatga cttagtgaaa 2520
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<210> 92
<211> 892
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 92
Met Arg Val Phe Leu Tyr Lys Arg Pro Lys Gly Arg Ile Val Met Lys
1 5 10 15
Lys Leu Thr Ser Ala Glu Val Arg Arg Met Phe Leu Gln Phe Phe Gln
20 25 30
Glu Lys Gly His Ala Val Glu Pro Ser Ala Ser Leu Ile Pro Val Asp
35 40 45
Asp Pro Ser Leu Leu Trp Ile Asn Ser Gly Val Ala Thr Leu Lys Lys
50 55 60
Tyr Phe Asp Gly Arg Ile Ile Pro Asp Asn Pro Arg Ile Cys Asn Ala
65 70 75 80
Gln Lys Ser Ile Arg Thr Asn Asp Ile Glu Asn Val Gly Lys Thr Ala
85 90 95
Arg His His Thr Phe Phe Glu Met Leu Gly Asn Phe Ser Ile Gly Asp
100 105 110
Tyr Phe Lys Arg Glu Ala Ile His Trp Ala Trp Glu Phe Leu Thr Ser
115 120 125
Glu Lys Trp Ile Gly Phe Asp Pro Glu Arg Leu Ser Val Thr Val His
130 135 140
Pro Glu Asp Glu Glu Ala Tyr Asn Ile Trp Arg Asn Glu Ile Gly Leu
145 150 155 160
Pro Glu Glu Arg Ile Ile Arg Leu Glu Gly Asn Phe Trp Asp Ile Gly
165 170 175
Glu Gly Pro Ser Gly Pro Asn Thr Glu Ile Phe Tyr Asp Arg Gly Glu
180 185 190
Ala Phe Gly Asn Asp Pro Asn Asp Pro Glu Leu Tyr Pro Gly Gly Glu
195 200 205
Asn Asp Arg Tyr Leu Glu Val Trp Asn Leu Val Phe Ser Gln Phe Asn
210 215 220
His Asn Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Pro Leu Pro Lys Lys Asn Ile Asp
225 230 235 240
Thr Gly Met Gly Leu Glu Arg Met Cys Ser Ile Leu Gln Asp Val Pro
245 250 255
Thr Asn Phe Glu Thr Asp Leu Phe Met Pro Ile Ile Arg Ala Thr Glu
260 265 270
Gln Ile Ala Gly Glu Gln Tyr Gly Lys Asp Pro Asn Lys Asp Val Ala
275 280 285
Phe Lys Val Ile Ala Asp His Ile Arg Ala Val Thr Phe Ala Val Gly
290 295 300
Asp Gly Ala Leu Pro Ser Asn Glu Gly Arg Gly Tyr Val Leu Arg Arg
305 310 315 320
Leu Leu Arg Arg Ala Val Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Ile Asp Arg
325 330 335
Pro Phe Met Tyr Glu Leu Val Pro Val Val Gly Glu Ile Met Gln Asp
340 345 350
Tyr Tyr Pro Glu Val Lys Glu Lys Ala Asp Phe Ile Ala Arg Val Ile
355 360 365
Arg Thr Glu Glu Glu Arg Phe His Glu Thr Leu His Glu Gly Leu Ala
370 375 380
Ile Leu Ala Glu Val Met Glu Lys Ala Lys Lys Gln Gly Ser Thr Val
385 390 395 400
Ile Pro Gly Glu Glu Ala Phe Arg Leu Tyr Asp Thr Tyr Gly Phe Pro
405 410 415
Leu Glu Leu Thr Glu Glu Tyr Ala Ala Glu Ala Gly Met Ser Val Asp
420 425 430
His Ala Gly Phe Glu Arg Glu Met Glu Arg Gln Arg Glu Arg Ala Arg
435 440 445
Ala Ala Arg Gln Asp Val Asp Ser Met Gln Val Gln Gly Gly Val Leu
450 455 460
Gly Asp Ile Lys Asp Glu Ser Arg Phe Val Gly Tyr Asp Glu Leu Val
465 470 475 480
Val Ser Ser Thr Val Ile Ala Ile Ile Lys Asp Gly Gln Leu Val Glu
485 490 495
Glu Val Gly Thr Gly Glu Glu Ala Gln Ile Ile Val Asp Val Thr Pro
500 505 510
Phe Tyr Ala Glu Ser Gly Gly Gln Ile Ala Asp Gln Gly Val Phe Glu
515 520 525
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530 535 540
Gly Gln His Leu His Ser Ile Val Val Glu Arg Gly Ala Val Lys Lys
545 550 555 560
Gly Asp Arg Tyr Thr Ala Arg Val Asp Glu Val Lys Arg Ser Gln Ile
565 570 575
Val Lys Asn His Thr Ala Thr His Leu Leu His Gln Ala Leu Lys Asp
580 585 590
Val Leu Gly Arg His Val Asn Gln Ala Gly Ser Leu Val Ala Pro Asp
595 600 605
Arg Leu Arg Phe Asp Phe Thr His Phe Gly Gln Val Lys Pro Asp Glu
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Pro Val Asp Ile Phe Tyr Lys Pro Leu Glu Glu Ala Lys Ala Met Gly
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Ala Met Ala Leu Phe Gly Glu Lys Tyr Gly Asp Ile Val Arg Val Val
660 665 670
Lys Val Gly Asp Tyr Ser Leu Glu Leu Cys Gly Gly Cys His Val Pro
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Leu Lys Thr Ser Pro Arg Glu Leu Asn Ala Arg Leu Asp Gly Leu Phe
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Val Ile Val Leu Ala Ala Val Gln Gly Gly Lys Val Gln Leu Ile Ala
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Val Lys Glu Val Ala Ser Arg Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Pro
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<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 93
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<210> 94
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<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 94
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<213> Geobacillus subterraneus
<400> 96
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290 295 300
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435 440 445
Ile Arg Asp Glu Leu Lys Ala Lys Asn Ile Ile Leu Glu Asp Thr Pro
450 455 460
Gln Gly Thr Arg Trp Lys Arg Gly Ser
465 470
<210> 101
<211> 1488
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 101
atggaattgg aggtttggac gatggcaaaa aacgtgcgcg tgcgctatgc gccgagcccg 60
actggccatt tgcatatcgg tggggcacgg acagcgctgt ttaactattt gtttgcccgc 120
cattacggcg gaaaaatgat cgtccgcatc gaagatacgg atattgaacg gaacgttgaa 180
ggcggcgaag agtcgcagct tgaaaactta aaatggcttg gcatcgatta tgacgaatcg 240
attgataagg acggcggata tgggccgtat cgtcagacgg aacggctcga tatctatcgg 300
aagtatgtga acgagctgct tgaacaaggg catgcgtata aatgtttttg tacaccggaa 360
gagctcgagc gggaacgtga ggagcaacgg gcggcaggta ttgctgctcc gcaatacagc 420
ggcaaatgcc gccatttaac gccggagcaa gttgccgagc ttgaagcaca aggaaaaccg 480
tatacgatcc gcttgaaagt gccggaaggg aaaacgtatg aagtagatga tttagtgcgc 540
ggtaaagtga cgtttgaatc gaaagacatc ggcgattggg tcattgtgaa ggcgaacggt 600
attccgacgt acaactttgc cgttgtcatt gatgaccatt tgatggaaat cagccatgtg 660
ttccgcggtg aggagcattt atccaacacg ccgaaacagc taatggtgta cgaatatttc 720
ggttgggagc caccgcaatt cgcccatatg acattgattg tcaacgagca gcggaaaaag 780
ctatccaagc gcgatgaatc gattatccag ttcgtgtcgc aatataaaga gctcggctat 840
ttgccggagg cgatgttcaa ctttttcgcc cttcttggct ggtcgccgga aggagaagaa 900
gaaattttta cgaaggacga gctcatccgc atttttgatg tcgcccggct gtcgaaatcg 960
ccgtcgatgt ttgatacgaa aaagctgaca tggatgaaca accaatatat caaaaagctg 1020
gatctcgaca ggcttgtcga gctggcgttg ccgcatttag tgaaagccgg acgcctgccg 1080
gcagatatga gtgatgagca gcggcaatgg gcacgcgatt tgattgcctt gtaccaagag 1140
caaatgagct acggtgcgga gatcgtttcg ctgtccgagc tgttctttaa agaagaagtc 1200
gaatacgaag acgaagcccg ccaagtgctc gccgaagaac aagtaccgga tgtgctctcc 1260
gcctttttgg cgaatgtgcg tgagcttgag ccgtttacgg cggatgagat taaagcagcg 1320
atcaaagcag tgcaaaaatc gacagggcaa aaaggcaaga agctgtttat gccgattcgc 1380
gccgcagtga ctgggcaaac acacggaccg gaactgccgt ttgccatcca actgcttggc 1440
aaacaaaagg tgattgaacg gctcgaacgg gcactgcatg aaaaattt 1488
<210> 102
<211> 496
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 102
Met Glu Leu Glu Val Trp Thr Met Ala Lys Asn Val Arg Val Arg Tyr
1 5 10 15
Ala Pro Ser Pro Thr Gly His Leu His Ile Gly Gly Ala Arg Thr Ala
20 25 30
Leu Phe Asn Tyr Leu Phe Ala Arg His Tyr Gly Gly Lys Met Ile Val
35 40 45
Arg Ile Glu Asp Thr Asp Ile Glu Arg Asn Val Glu Gly Gly Glu Glu
50 55 60
Ser Gln Leu Glu Asn Leu Lys Trp Leu Gly Ile Asp Tyr Asp Glu Ser
65 70 75 80
Ile Asp Lys Asp Gly Gly Tyr Gly Pro Tyr Arg Gln Thr Glu Arg Leu
85 90 95
Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Val Asn Glu Leu Leu Glu Gln Gly His Ala
100 105 110
Tyr Lys Cys Phe Cys Thr Pro Glu Glu Leu Glu Arg Glu Arg Glu Glu
115 120 125
Gln Arg Ala Ala Gly Ile Ala Ala Pro Gln Tyr Ser Gly Lys Cys Arg
130 135 140
His Leu Thr Pro Glu Gln Val Ala Glu Leu Glu Ala Gln Gly Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Thr Ile Arg Leu Lys Val Pro Glu Gly Lys Thr Tyr Glu Val Asp
165 170 175
Asp Leu Val Arg Gly Lys Val Thr Phe Glu Ser Lys Asp Ile Gly Asp
180 185 190
Trp Val Ile Val Lys Ala Asn Gly Ile Pro Thr Tyr Asn Phe Ala Val
195 200 205
Val Ile Asp Asp His Leu Met Glu Ile Ser His Val Phe Arg Gly Glu
210 215 220
Glu His Leu Ser Asn Thr Pro Lys Gln Leu Met Val Tyr Glu Tyr Phe
225 230 235 240
Gly Trp Glu Pro Pro Gln Phe Ala His Met Thr Leu Ile Val Asn Glu
245 250 255
Gln Arg Lys Lys Leu Ser Lys Arg Asp Glu Ser Ile Ile Gln Phe Val
260 265 270
Ser Gln Tyr Lys Glu Leu Gly Tyr Leu Pro Glu Ala Met Phe Asn Phe
275 280 285
Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Pro Glu Gly Glu Glu Glu Ile Phe Thr
290 295 300
Lys Asp Glu Leu Ile Arg Ile Phe Asp Val Ala Arg Leu Ser Lys Ser
305 310 315 320
Pro Ser Met Phe Asp Thr Lys Lys Leu Thr Trp Met Asn Asn Gln Tyr
325 330 335
Ile Lys Lys Leu Asp Leu Asp Arg Leu Val Glu Leu Ala Leu Pro His
340 345 350
Leu Val Lys Ala Gly Arg Leu Pro Ala Asp Met Ser Asp Glu Gln Arg
355 360 365
Gln Trp Ala Arg Asp Leu Ile Ala Leu Tyr Gln Glu Gln Met Ser Tyr
370 375 380
Gly Ala Glu Ile Val Ser Leu Ser Glu Leu Phe Phe Lys Glu Glu Val
385 390 395 400
Glu Tyr Glu Asp Glu Ala Arg Gln Val Leu Ala Glu Glu Gln Val Pro
405 410 415
Asp Val Leu Ser Ala Phe Leu Ala Asn Val Arg Glu Leu Glu Pro Phe
420 425 430
Thr Ala Asp Glu Ile Lys Ala Ala Ile Lys Ala Val Gln Lys Ser Thr
435 440 445
Gly Gln Lys Gly Lys Lys Leu Phe Met Pro Ile Arg Ala Ala Val Thr
450 455 460
Gly Gln Thr His Gly Pro Glu Leu Pro Phe Ala Ile Gln Leu Leu Gly
465 470 475 480
Lys Gln Lys Val Ile Glu Arg Leu Glu Arg Ala Leu His Glu Lys Phe
485 490 495
<210> 103
<211> 1398
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 103
atggaggagg atgatgacat ggctgcaaca atggaagaaa tcgttgccca cgccaagcat 60
cgcggcttcg tgtttccggg gtcggaaatt tacggtgggc tggcgaacac atgggattac 120
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gaagcatccg gccatttagg caacttcaac gatccgatgg tcgactgcaa acagtgtaaa 300
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gtcgttgacg gtttgccgct tgccaagatg gaagagctta tccgtgaata cgacatcgct 420
tgtccagaat gcggcagtcg tgactttacg aacgtgcgtc agtttaattt aatgttcaaa 480
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cgcacacgtg aatttgaaca aatggagctt gagtttttct gcaaaccggg cgaagagctg 720
aaatggttcg actactggaa acaattttgc aaggaatggc tgttgtcgct cggcatgaac 780
gaagaacata tccgcctgcg cgaccatacg aaagaagaat tatcccacta tagtaatgcg 840
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gataaaaaaa ttgccttt 1398
<210> 104
<211> 466
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 104
Met Glu Glu Asp Asp Asp Met Ala Ala Thr Met Glu Glu Ile Val Ala
1 5 10 15
His Ala Lys His Arg Gly Phe Val Phe Pro Gly Ser Glu Ile Tyr Gly
20 25 30
Gly Leu Ala Asn Thr Trp Asp Tyr Gly Pro Leu Gly Val Glu Leu Lys
35 40 45
Asn Asn Ile Lys Arg Ala Trp Trp Lys Lys Phe Val Gln Glu Ser Pro
50 55 60
His Asn Val Gly Leu Asp Ala Ala Ile Leu Met Asn Pro Lys Thr Trp
65 70 75 80
Glu Ala Ser Gly His Leu Gly Asn Phe Asn Asp Pro Met Val Asp Cys
85 90 95
Lys Gln Cys Lys Ala Arg His Arg Ala Asp Lys Leu Ile Glu Gln Ala
100 105 110
Leu Glu Glu Lys Gly Ile Glu Met Val Val Asp Gly Leu Pro Leu Ala
115 120 125
Lys Met Glu Glu Leu Ile Arg Glu Tyr Asp Ile Ala Cys Pro Glu Cys
130 135 140
Gly Ser Arg Asp Phe Thr Asn Val Arg Gln Phe Asn Leu Met Phe Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Gln Gly Val Thr Glu Ser Ser Ala Asn Glu Ile Tyr Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Thr Ala Gln Gly Ile Phe Val Asn Phe Lys Asn Val Gln Arg
180 185 190
Thr Met Arg Lys Lys Leu Pro Phe Gly Ile Ala Gln Ile Gly Lys Ser
195 200 205
Phe Arg Asn Glu Ile Thr Pro Gly Asn Phe Thr Phe Arg Thr Arg Glu
210 215 220
Phe Glu Gln Met Glu Leu Glu Phe Phe Cys Lys Pro Gly Glu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Trp Phe Asp Tyr Trp Lys Gln Phe Cys Lys Glu Trp Leu Leu Ser
245 250 255
Leu Gly Met Asn Glu Glu His Ile Arg Leu Arg Asp His Thr Lys Glu
260 265 270
Glu Leu Ser His Tyr Ser Asn Ala Thr Thr Asp Ile Glu Tyr Gln Phe
275 280 285
Pro Phe Gly Trp Gly Glu Leu Trp Gly Ile Ala Ser Arg Thr Asp Tyr
290 295 300
Asp Leu Lys Gln His Met Glu His Ser Gly Glu Asp Phe His Tyr Leu
305 310 315 320
Asp Gln Glu Thr Asn Glu Arg Tyr Ile Pro Tyr Cys Ile Glu Pro Ser
325 330 335
Leu Gly Ala Asp Arg Val Thr Leu Ala Phe Met Ile Asp Ala Tyr Asp
340 345 350
Glu Glu Glu Leu Glu Asp Gly Thr Thr Arg Thr Val Met His Leu His
355 360 365
Pro Ala Leu Ala Pro Tyr Lys Ala Ala Val Leu Pro Leu Ser Lys Lys
370 375 380
Leu Gly Asp Gly Ala Arg Arg Ile Tyr Glu Glu Leu Ala Lys His Phe
385 390 395 400
Met Val Asp Tyr Asp Glu Thr Gly Ser Ile Gly Lys Arg Tyr Arg Arg
405 410 415
Gln Asp Glu Ile Gly Thr Pro Phe Cys Ile Thr Tyr Asp Phe Glu Ser
420 425 430
Glu Gln Asp Gly Gln Val Thr Val Arg Asp Arg Asp Thr Met Glu Gln
435 440 445
Val Arg Leu Pro Ile Gly Glu Leu Lys Ala Phe Leu Asp Lys Lys Ile
450 455 460
Ala Phe
465
<210> 105
<211> 1278
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 105
atggcttttc aaattccaag agggacacaa gatttattac cgggtgaaac ggaaaaatgg 60
caatatgtcg aacaagtggc ccgcgacctg tgtagacggt acggctatga agaaatacgg 120
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cagccggtca agttgtatta tgcgggacca atgttccgtt atgagcggcc ggaagccgga 360
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<210> 106
<211> 426
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 106
Met Ala Phe Gln Ile Pro Arg Gly Thr Gln Asp Leu Leu Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Glu Lys Trp Gln Tyr Val Glu Gln Val Ala Arg Asp Leu Cys Arg
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Arg Tyr Gly Tyr Glu Glu Ile Arg Thr Pro Ile Phe Glu His Thr Glu
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Met Tyr Thr Phe Glu Asp Lys Gly Gly Arg Ala Leu Thr Leu Arg Pro
65 70 75 80
Glu Gly Thr Ala Pro Val Val Arg Ala Phe Val Glu His Lys Leu Tyr
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Gly Ser Pro Asn Gln Pro Val Lys Leu Tyr Tyr Ala Gly Pro Met Phe
100 105 110
Arg Tyr Glu Arg Pro Glu Ala Gly Arg Phe Arg Gln Phe Val Gln Phe
115 120 125
Gly Val Glu Ala Ile Gly Ser Ser Asp Pro Ala Ile Asp Ala Glu Val
130 135 140
Met Ala Leu Ala Met His Ile Tyr Lys Ala Leu Gly Leu Lys His Ile
145 150 155 160
Arg Leu Val Ile Asn Ser Leu Gly Asp Val Asp Ser Arg Arg Ala His
165 170 175
Arg Glu Ala Leu Val Arg His Phe Ser Asp Arg Ile His Glu Leu Cys
180 185 190
Pro Asp Cys Gln Ala Arg Leu Glu Thr Asn Pro Leu Arg Ile Leu Asp
195 200 205
Cys Lys Lys Asp Arg Asp His Glu Leu Met Ala Ser Ala Pro Ser Ile
210 215 220
Leu Asp Tyr Leu Asn Asp Glu Ser Arg Ala Tyr Phe Glu Lys Val Lys
225 230 235 240
Gln Tyr Leu Thr Met Leu Asp Ile Pro Phe Val Ile Asp Ser Arg Leu
245 250 255
Val Arg Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn His Thr Thr Phe Glu Ile Met Ser
260 265 270
Glu Ala Glu Gly Phe Gly Ala Ala Ala Thr Leu Cys Gly Gly Gly Arg
275 280 285
Tyr Asn Gly Leu Val Gln Glu Ile Gly Gly Pro Glu Thr Pro Gly Ile
290 295 300
Gly Phe Ala Leu Ser Ile Glu Arg Leu Leu Ala Ala Leu Glu Ala Glu
305 310 315 320
Gly Ile Glu Leu Pro Ile His Arg Gly Ile Asp Cys Tyr Val Val Ala
325 330 335
Val Gly Glu Arg Ala Lys Asp Glu Thr Val Arg Leu Val Tyr Glu Leu
340 345 350
Arg Arg Ala Gly Leu Arg Val Glu Gln Asp Tyr Leu Gly Arg Lys Met
355 360 365
Lys Ala Gln Leu Lys Ala Ala Asp Arg Leu Gly Ala Ser Phe Val Ala
370 375 380
Ile Ile Gly Asp Glu Glu Leu Glu Lys Gln Thr Ala Ala Val Lys His
385 390 395 400
Met Ala Ser Gly Glu Gln Thr Asp Val Pro Leu Gly Glu Leu Ala Ser
405 410 415
Phe Leu Ile Glu Arg Thr Lys Arg Glu Glu
420 425
<210> 107
<211> 2772
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 107
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cttcaagggg atgaacgaat cgtcatttgg acgacgacac cgtggacgat tccagcgaac 720
ttggcgatcg ccgttcaccc ggatttggac tactatattg tcgaagcaaa cgggcaaaaa 780
tacgttgttg ctgcggcctt ggcggaatcg gtagcgaaag aagtcggctg ggaggcatgg 840
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cttccggttc tttgcccggt tgatgagcgc ggctatatga cagaagaagc gcctggattt 1080
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ttattgccgg aaggattcac ccatccgtcc agcccgaacg gcctctttac gaaagagacg 1560
gatattatgg acgtctggtt tgactccggt tcgtcgcatc aagccgtgct tgttgaacgc 1620
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ctcaccgaca tgccggagtc aatggccatc gatggtgaag aagcgctgct tgcgaaatgg 2400
gatgcgttta tggatgtacg agatgacatt ttaaaagcgc tcgagaatgc gcgtaatgaa 2460
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<210> 108
<211> 924
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 108
Met Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Met Pro Gln Thr Glu Phe Pro Met
1 5 10 15
Arg Gly Asn Leu Pro Lys Arg Glu Pro Glu Met Gln Lys Lys Trp Glu
20 25 30
Glu Met Asp Ile Tyr Arg Lys Val Gln Glu Arg Thr Lys Gly Arg Pro
35 40 45
Leu Phe Val Leu His Asp Gly Pro Pro Tyr Ala Asn Gly Asp Ile His
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Met Gly His Ala Leu Asn Lys Ile Leu Lys Asp Ile Ile Val Arg Tyr
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His Gly Leu Pro Ile Glu Thr Ala Leu Thr Lys Gln Gly Val Asp Arg
100 105 110
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115 120 125
Tyr Glu Gln Ile Asp Asn Gln Arg Gln Gln Phe Lys Arg Leu Gly Val
130 135 140
Arg Gly Asp Trp Asp Asn Pro Tyr Ile Thr Leu Lys Pro Glu Tyr Glu
145 150 155 160
Ala Gln Gln Ile Lys Val Phe Gly Glu Met Ala Lys Lys Gly Leu Ile
165 170 175
Tyr Lys Gly Leu Lys Pro Val Tyr Trp Ser Pro Ser Ser Glu Ser Ala
180 185 190
Leu Ala Glu Ala Glu Ile Glu Tyr Lys Asp Lys Arg Ser Pro Ser Ile
195 200 205
Tyr Val Ala Phe Pro Val Lys Asp Gly Lys Gly Val Leu Gln Gly Asp
210 215 220
Glu Arg Ile Val Ile Trp Thr Thr Thr Pro Trp Thr Ile Pro Ala Asn
225 230 235 240
Leu Ala Ile Ala Val His Pro Asp Leu Asp Tyr Tyr Ile Val Glu Ala
245 250 255
Asn Gly Gln Lys Tyr Val Val Ala Ala Ala Leu Ala Glu Ser Val Ala
260 265 270
Lys Glu Val Gly Trp Glu Ala Trp Ser Val Val Lys Thr Val Lys Gly
275 280 285
Lys Glu Leu Glu Tyr Val Val Ala Lys His Pro Phe Tyr Glu Arg Asp
290 295 300
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305 310 315 320
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370 375 380
Leu Ser Phe Ile Thr His Ser Tyr Pro His Asp Trp Arg Thr Lys Gln
385 390 395 400
Pro Thr Ile Phe Arg Ala Thr Thr Gln Trp Phe Ala Ser Ile Asp Lys
405 410 415
Ile Arg Asp Gln Leu Leu Asp Ala Ile Lys Glu Thr Lys Trp Val Pro
420 425 430
Glu Trp Gly Glu Ile Arg Ile His Asn Met Val Arg Asp Arg Gly Asp
435 440 445
Trp Cys Ile Ser Arg Gln Arg Ala Trp Gly Val Pro Ile Pro Val Phe
450 455 460
Tyr Gly Glu Asn Gly Glu Pro Ile Ile Thr Asp Glu Thr Ile Glu His
465 470 475 480
Val Ser Asn Leu Phe Arg Gln Tyr Gly Ser Asn Val Trp Phe Glu Arg
485 490 495
Glu Ala Lys Asp Leu Leu Pro Glu Gly Phe Thr His Pro Ser Ser Pro
500 505 510
Asn Gly Leu Phe Thr Lys Glu Thr Asp Ile Met Asp Val Trp Phe Asp
515 520 525
Ser Gly Ser Ser His Gln Ala Val Leu Val Glu Arg Asp Asp Leu Glu
530 535 540
Arg Pro Ala Asp Leu Tyr Leu Glu Gly Ser Asp Gln Tyr Arg Gly Trp
545 550 555 560
Phe Asn Ser Ser Leu Ser Thr Ala Val Ala Val Thr Gly Lys Ala Pro
565 570 575
Tyr Lys Gly Val Leu Ser His Gly Phe Val Leu Asp Gly Glu Gly Arg
580 585 590
Lys Met Ser Lys Ser Leu Gly Asn Val Val Val Pro Ala Lys Val Met
595 600 605
Glu Gln Leu Gly Ala Asp Ile Leu Arg Leu Trp Val Ala Ser Val Asp
610 615 620
Tyr Gln Ala Asp Val Arg Ile Ser Asp Asn Ile Leu Lys Gln Val Ser
625 630 635 640
Glu Val Tyr Arg Lys Ile Arg Asn Thr Phe Arg Phe Met Leu Gly Asn
645 650 655
Leu Phe Asp Phe Asp Pro Asn Gln Asn Ala Val Pro Val Gly Glu Leu
660 665 670
Gly Glu Val Asp Arg Tyr Met Leu Ala Lys Leu Asn Lys Leu Ile Ala
675 680 685
Lys Val Lys Lys Ala Tyr Asp Ser Tyr Asp Phe Ala Ala Val Tyr His
690 695 700
Glu Met Asn His Phe Cys Thr Val Glu Leu Ser Ala Phe Tyr Leu Asp
705 710 715 720
Met Ala Lys Asp Ile Leu Tyr Ile Glu Ala Ala Asp Cys Arg Ala Arg
725 730 735
Arg Ala Val Gln Thr Val Leu Tyr Glu Thr Val Val Ala Leu Ala Lys
740 745 750
Leu Ile Ala Pro Ile Leu Pro His Thr Ala Asp Glu Val Trp Glu His
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Ile Pro Asn Arg Lys Glu Gln Val Glu Ser Val Gln Leu Thr Asp Met
770 775 780
Pro Glu Ser Met Ala Ile Asp Gly Glu Glu Ala Leu Leu Ala Lys Trp
785 790 795 800
Asp Ala Phe Met Asp Val Arg Asp Asp Ile Leu Lys Ala Leu Glu Asn
805 810 815
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820 825 830
Val Tyr Pro Lys Asp Glu Val Arg Ala Leu Leu Ala Ser Ile Asn Glu
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Ser Tyr Asp Ala Ala Pro Ala Glu Ala Glu Arg Leu Asn His Val Ala
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Val Ile Val Arg Pro Ala Glu Gly Glu Thr Cys Glu Arg Cys Trp Thr
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<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 109
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<213> Geobacillus subterraneus
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Pro Val Asp Val Tyr Ile Gly Gly Ala Glu His Ala Val Leu His Leu
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Pro Asp Asp Ile Val Glu Ser His Gly Ala Asp Thr Leu Arg Leu Tyr
595 600 605
Glu Met Phe Met Gly Pro Leu Glu Ala Ser Ile Ala Trp Ser Thr Lys
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
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<213> Geobacillus subterraneus
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ttgcagccgt ttttgacacg cacgccagag cgcatttttg cccagctcgg cattgccgac 1440
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ggcggcgaga aacggcaagt catctctggt atcgctgaat tttacaaacc agaggaactc 1800
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<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
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115 120 125
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Phe Thr Pro Glu Gly Phe Ile Glu Arg Ile Asn Tyr Asp Leu Ala Asn
340 345 350
Asp Leu Gly Asn Leu Leu Asn Arg Thr Val Ala Met Ile Lys Lys Tyr
355 360 365
Phe Asp Gly Val Ile Pro Pro Tyr Arg Gly Pro Lys Thr Pro Phe Asp
370 375 380
Glu Glu Leu Val Gln Thr Ala Arg Glu Val Val Arg Gln Tyr Glu Glu
385 390 395 400
Ala Met Glu Arg Met Glu Phe Ser Val Ala Leu Ala Ser Val Trp Gln
405 410 415
Leu Ile Gly Arg Thr Asn Lys Tyr Ile Asp Glu Thr Gln Pro Trp Val
420 425 430
Leu Ala Lys Asp Glu Ser Lys Arg Glu Glu Leu Ala Ser Val Met Thr
435 440 445
His Leu Ala Glu Ser Leu Arg His Thr Ala Val Leu Leu Gln Pro Phe
450 455 460
Leu Thr Arg Thr Pro Glu Arg Ile Phe Ala Gln Leu Gly Ile Ala Asp
465 470 475 480
Arg Ser Leu Lys Glu Trp Asp Ser Leu Tyr Glu Phe Gly Leu Ile Pro
485 490 495
Glu Gly Thr Asn Val Gln Lys Gly Glu Pro Leu Phe Pro Arg Leu Asp
500 505 510
Ile Glu Ala Glu Val Glu Tyr Ile Lys Ala His Met Gln Gly Gly Lys
515 520 525
Pro Ala Val Glu Pro Val Lys Glu Glu Lys Gln Ala Ala Glu Thr Ala
530 535 540
Glu Ile Ser Ile Asp Glu Phe Ala Lys Val Asp Leu Arg Val Ala Glu
545 550 555 560
Val Val His Ala Glu Arg Met Lys Asn Ala Asn Lys Leu Leu Lys Leu
565 570 575
Gln Leu Asp Leu Gly Gly Glu Lys Arg Gln Val Ile Ser Gly Ile Ala
580 585 590
Glu Phe Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Ile Gly Lys Lys Val Ile Cys Val
595 600 605
Ala Asn Leu Lys Pro Ala Lys Leu Arg Gly Glu Trp Ser Glu Gly Met
610 615 620
Ile Leu Ala Gly Gly Asn Gly Gly Glu Phe Ser Leu Ala Thr Val Asp
625 630 635 640
Gln His Val Pro Asn Gly Thr Lys Ile Lys
645 650
<210> 115
<211> 1074
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 115
atgagggacg ggttttttta ttttgttaga ggagggattg gcgtgaaaga acggttgcat 60
gagcttgaac gagaagcgct tgaaaaaatt gaacaagctg gcgatttaaa agcgctcaac 120
gatgtgcgtg tcgcctattt aggcaaaaaa gggccgatta ccgaagtgct gcgcggcatg 180
ggagcattgc cgtcagaaga gcgtccgaaa attggtgcgc ttgccaatga ggtaagagag 240
gcgatccaaa aggcgctcga agcaaaacaa acgaaactgg aagaagaaga agtcgagcgg 300
aagttggcgg ctgaagcgat cgatgtgacg cttccgggcc gtccggtgaa actggggaat 360
cctcatccgc tgacgcgcgt catcgaggaa attgaagatt tgtttatcgg catgggctat 420
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<210> 116
<211> 358
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 116
Met Arg Asp Gly Phe Phe Tyr Phe Val Arg Gly Gly Ile Gly Val Lys
1 5 10 15
Glu Arg Leu His Glu Leu Glu Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ile Glu Gln
20 25 30
Ala Gly Asp Leu Lys Ala Leu Asn Asp Val Arg Val Ala Tyr Leu Gly
35 40 45
Lys Lys Gly Pro Ile Thr Glu Val Leu Arg Gly Met Gly Ala Leu Pro
50 55 60
Ser Glu Glu Arg Pro Lys Ile Gly Ala Leu Ala Asn Glu Val Arg Glu
65 70 75 80
Ala Ile Gln Lys Ala Leu Glu Ala Lys Gln Thr Lys Leu Glu Glu Glu
85 90 95
Glu Val Glu Arg Lys Leu Ala Ala Glu Ala Ile Asp Val Thr Leu Pro
100 105 110
Gly Arg Pro Val Lys Leu Gly Asn Pro His Pro Leu Thr Arg Val Ile
115 120 125
Glu Glu Ile Glu Asp Leu Phe Ile Gly Met Gly Tyr Thr Val Ala Glu
130 135 140
Gly Pro Glu Val Glu Thr Asp Tyr Tyr Asn Phe Glu Ala Leu Asn Leu
145 150 155 160
Pro Lys Gly His Pro Ala Arg Asp Met Gln Asp Ser Phe Tyr Ile Thr
165 170 175
Glu Glu Ile Leu Leu Arg Thr His Thr Ser Pro Met Gln Ala Arg Thr
180 185 190
Met Glu Lys His Arg Gly Arg Gly Pro Val Lys Ile Ile Cys Pro Gly
195 200 205
Lys Val Tyr Arg Arg Asp Thr Asp Asp Ala Thr His Ser His Gln Phe
210 215 220
Thr Gln Ile Glu Gly Leu Val Val Asp Arg Asn Ile Arg Met Ser Asp
225 230 235 240
Leu Lys Gly Thr Leu Arg Glu Phe Ala Arg Lys Leu Phe Gly Glu Gly
245 250 255
Arg Asp Ile Arg Phe Arg Pro Ser Phe Phe Pro Phe Thr Glu Pro Ser
260 265 270
Val Glu Val Asp Val Ser Cys Phe Arg Cys Glu Gly His Gly Cys Ser
275 280 285
Val Cys Lys Gly Thr Gly Trp Ile Glu Ile Leu Gly Ala Gly Met Val
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His Pro Asn Val Leu Glu Met Ala Gly Phe Asp Ser Lys Thr Tyr Thr
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Gly Phe Ala Phe Gly Met Gly Pro Glu Arg Ile Ala Met Leu Lys Tyr
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Gly Ile Asp Asp Ile Arg His Phe Tyr Gln Asn Asp Leu Arg Phe Leu
340 345 350
Gln Gln Phe Leu Arg Val
355
<210> 117
<211> 2412
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 117
atgctcgttt cttatcgttg gctaggcgaa tacgtcgatt tgacgggcgt gacggcggaa 60
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cacgatgaag tgctcgaact cgccttgacg ccgaatcgcg ccgattgctt aagcatgctt 540
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ggttcgaagg agatcgtcgt tcgtcgtgcc aaggcgggag aaatgatcgt gacgcttgac 900
gatgtcgagc ggaagctgac tgaagatcat ctcgtcatca caaacggccg tgagccggtc 960
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ttcatcgaag ccgcgtattt tacgagcccg gtcatccgcc aggcggtgaa agaccacggg 1080
ttgcgcagcg aagcgagcac ccggtttgaa aaagggattg atccggcgcg gacgaaagaa 1140
gcgctcgagc gcgctgctgc tttgatggca gaatacgccg gcggcgaggt cgtcagcggt 1200
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ttgcaattct cgtttacgga agataatgga acgtttacaa tccatgttcc atcgcgccgc 1380
cgcgatatta cgatcgaaga agatattatc gaggaagtcg cccgtttgta tggctacgac 1440
catttgccag cgactttgcc ggtggccgaa gcaaaaccgg gcgagttgac accgtaccaa 1500
gcgaaacgcc gccgtgtccg ccgctatttc gaaggcgcgg gcttgttcca ggcgatcacg 1560
tattcgctta ccagtccgga caaagcgacg cggtttgctt tggagacaac cgaaccagtc 1620
cgcttggcgt tgccgatgag tgaggagcgg agcgttctcc ggcaaagctt ggtgccgcat 1680
ttgctcgaag cggcgagcta caaccgtgcc cgccaagttg agaacgtcgc gctatatgaa 1740
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gtgcttgacg gcaaagagat cggctttgtc ggccagctcc atccggctgt acaaaaagag 2040
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gtgttgcgcg gg 2412
<210> 118
<211> 804
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 118
Met Leu Val Ser Tyr Arg Trp Leu Gly Glu Tyr Val Asp Leu Thr Gly
1 5 10 15
Val Thr Ala Glu Gln Leu Ala Asp Arg Ile Thr Lys Ser Gly Ile Glu
20 25 30
Val Glu Arg Val Glu Ala Leu Glu Arg Gly Met Lys Gly Val Val Ile
35 40 45
Gly His Val Leu Glu Cys Glu Pro His Pro Asn Ala Asp Lys Leu Arg
50 55 60
Lys Cys Leu Val Asp Leu Gly Glu Gly Glu Pro Val Gln Ile Ile Cys
65 70 75 80
Gly Ala Pro Asn Val Ala Lys Gly Gln Lys Val Ala Val Ala Lys Val
85 90 95
Gly Ala Arg Leu Pro Gly Asn Phe Lys Ile Lys Arg Ala Lys Leu Arg
100 105 110
Gly Glu Glu Ser Asn Gly Met Ile Cys Ser Leu Gln Glu Leu Gly Val
115 120 125
Glu Thr Lys Val Val Pro Lys Glu Tyr Ala Glu Gly Ile Phe Val Phe
130 135 140
Pro Ser Asp Ala Pro Val Gly Ala Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gly Leu
145 150 155 160
His Asp Glu Val Leu Glu Leu Ala Leu Thr Pro Asn Arg Ala Asp Cys
165 170 175
Leu Ser Met Leu Gly Val Ala Tyr Glu Val Ala Ala Ile Leu Gly Arg
180 185 190
Asp Val Lys Leu Pro Glu Thr Ala Val Asn Glu Asn Glu Glu Ser Val
195 200 205
His Asp Tyr Ile Ser Val Arg Val Glu Ala Pro Glu Asp Asn Pro Leu
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Tyr Ala Gly Arg Ile Val Lys Asn Val Gln Ile Gly Pro Ser Pro Leu
225 230 235 240
Trp Met Gln Ala Arg Leu Met Ala Ala Gly Ile Arg Pro His Asn Asn
245 250 255
Val Val Asp Ile Thr Asn Tyr Ile Leu Leu Glu Tyr Gly Gln Pro Leu
260 265 270
His Ala Phe Asp Tyr Asp Arg Leu Gly Ser Lys Glu Ile Val Val Arg
275 280 285
Arg Ala Lys Ala Gly Glu Met Ile Val Thr Leu Asp Asp Val Glu Arg
290 295 300
Lys Leu Thr Glu Asp His Leu Val Ile Thr Asn Gly Arg Glu Pro Val
305 310 315 320
Ala Leu Ala Gly Val Met Gly Gly Ala Asn Ser Glu Val Gln Asp Asp
325 330 335
Thr Lys Thr Val Phe Ile Glu Ala Ala Tyr Phe Thr Ser Pro Val Ile
340 345 350
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355 360 365
Phe Glu Lys Gly Ile Asp Pro Ala Arg Thr Lys Glu Ala Leu Glu Arg
370 375 380
Ala Ala Ala Leu Met Ala Glu Tyr Ala Gly Gly Glu Val Val Ser Gly
385 390 395 400
Ile Val Glu Ala Asn Thr Trp Lys Glu Glu Pro Val Val Val Thr Val
405 410 415
Ala Leu Glu Arg Ile Asn Gly Val Leu Gly Thr Ala Met Thr Lys Glu
420 425 430
Glu Val Ala Gly Ile Leu Ser Asn Leu Gln Phe Ser Phe Thr Glu Asp
435 440 445
Asn Gly Thr Phe Thr Ile His Val Pro Ser Arg Arg Arg Asp Ile Thr
450 455 460
Ile Glu Glu Asp Ile Ile Glu Glu Val Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Asp
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His Leu Pro Ala Thr Leu Pro Val Ala Glu Ala Lys Pro Gly Glu Leu
485 490 495
Thr Pro Tyr Gln Ala Lys Arg Arg Arg Val Arg Arg Tyr Phe Glu Gly
500 505 510
Ala Gly Leu Phe Gln Ala Ile Thr Tyr Ser Leu Thr Ser Pro Asp Lys
515 520 525
Ala Thr Arg Phe Ala Leu Glu Thr Thr Glu Pro Val Arg Leu Ala Leu
530 535 540
Pro Met Ser Glu Glu Arg Ser Val Leu Arg Gln Ser Leu Val Pro His
545 550 555 560
Leu Leu Glu Ala Ala Ser Tyr Asn Arg Ala Arg Gln Val Glu Asn Val
565 570 575
Ala Leu Tyr Glu Ile Gly Ser Val Tyr Leu Ser Lys Gly Glu Asn Val
580 585 590
Gln Pro Ala Glu Lys Glu Arg Leu Ala Gly Val Ile Thr Gly Leu Trp
595 600 605
His Ala His Leu Trp Gln Gly Glu Lys Lys Ala Ala Asp Phe Tyr Val
610 615 620
Ala Lys Gly Val Leu Asp Gly Leu Phe Ala Leu Leu Gly Leu Ser Asp
625 630 635 640
Arg Ile Ser Tyr Arg Pro Ala Lys Arg Ala Asp Leu His Leu Gly Arg
645 650 655
Thr Ala Glu Ile Val Leu Asp Gly Lys Glu Ile Gly Phe Val Gly Gln
660 665 670
Leu His Pro Ala Val Gln Lys Glu Tyr Asp Leu Lys Glu Thr Tyr Val
675 680 685
Phe Glu Leu Ala Phe Ala Glu Leu Leu Asn Thr Glu Gly Glu Thr Ile
690 695 700
Arg Tyr Glu Ser Ile Pro Arg Phe Pro Ser Val Val Arg Asp Ile Ala
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Leu Val Val Asp Asp Asn Val Glu Ala Gly Ala Leu Lys Gln Ala Ile
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Tyr Lys Gly Asp Arg Leu Pro Ala Gly Lys Lys Ser Leu Ala Phe Ser
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Leu Arg Tyr Tyr Asp Pro Glu Arg Thr Leu Thr Asp Glu Glu Val Thr
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Ala Val His Glu Arg Val Leu Ala Ala Val Glu Glu Gln Phe Gly Ala
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Val Leu Arg Gly
<210> 119
<211> 1755
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 119
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caaagtcaag ggtttattcc gacattgcgc gaagtgccgg cggacgcgga agtgaaaagc 120
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<213> Geobacillus subterraneus
<400> 120
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Leu Leu Met Arg Gln Ser Gln Gly Phe Ile Pro Thr Leu Arg Glu Val
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Pro Ala Asp Ala Glu Val Lys Ser His Gln Leu Leu Leu Arg Ala Gly
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ccagtcggtc agtcggaaga agataatgtc gaagtgcgaa gatgggggga accgcgttcg 420
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tactatgcgg cttacagcgc gtgcttccgc gccgaagctg gctcggctgg ccgtgacacg 840
cgggggctca tccgccagca ccaattcaat aaagtggagc tcgtcaagtt cgtcaagccg 900
gaggattcat atgacgagtt ggaaaaattg acgcaccaag ccgaaacgat cctgcaacgg 960
ctcggacttc cgtatcgcgt cgtagccttg tgtacagggg atctgggatt ttcagcggcg 1020
aagacgtatg atattgaggt gtggctgcca agctatggaa cgtatcggga aatttcgtcg 1080
tgcagcaact ttgaggcgtt ccaggcgcgc cgagctaata tccgcttccg tcgcgagccg 1140
aaagcaaagc cagaatatgt gcatacgcta aacggttcgg ggctagccat cggccgcacg 1200
gttgctgcca ttttggaaaa ctaccaacaa gaagacggat cggtcgtcat cccggaagcg 1260
ctccgtccat atatggggaa tcgggatgtc attcgc 1296
<210> 122
<211> 432
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 122
Met Val Asp Lys Glu Val Lys Arg Met Leu Asp Val Lys Leu Leu Arg
1 5 10 15
Thr Gln Phe Gln Glu Val Lys Glu Lys Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asp
20 25 30
Leu Ala Asn Ile Asp Arg Phe Glu Gln Leu Asp Lys Glu Arg Arg Arg
35 40 45
Leu Ile Ala Gln Val Glu Glu Leu Lys Ser Lys Arg Asn Glu Val Ser
50 55 60
Gln Gln Ile Ala Val Leu Lys Arg Glu Lys Lys Asp Ala Glu Ser Leu
65 70 75 80
Ile Val Glu Met Arg Glu Val Gly Asp Arg Ile Lys Gln Met Asp Glu
85 90 95
Gln Ile Arg Gln Leu Glu Glu Glu Leu Asp Ser Leu Leu Leu Ser Ile
100 105 110
Pro Asn Val Pro His Glu Ser Val Pro Val Gly Gln Ser Glu Glu Asp
115 120 125
Asn Val Glu Val Arg Arg Trp Gly Glu Pro Arg Ser Phe Ser Phe Glu
130 135 140
Pro Lys Pro His Trp Asp Ile Ala Asp Gln Leu Gly Leu Leu Asp Phe
145 150 155 160
Glu Arg Ala Ala Lys Val Ala Gly Ser Arg Phe Val Phe Tyr Lys Gly
165 170 175
Leu Gly Ala Arg Leu Glu Arg Ala Leu Ile Asn Phe Met Leu Asp Ile
180 185 190
His Leu Asp Glu Phe Gly Tyr Gln Glu Val Leu Pro Pro Tyr Leu Val
195 200 205
Asn Arg Ala Ser Met Ile Gly Thr Gly Gln Leu Pro Lys Phe Ala Glu
210 215 220
Asp Ala Phe His Leu Asp Asn Glu Asp Tyr Phe Leu Ile Pro Thr Ala
225 230 235 240
Glu Val Pro Val Thr Asn Leu His Arg Asp Glu Ile Leu Thr Ala Asp
245 250 255
Asp Leu Pro Leu Tyr Tyr Ala Ala Tyr Ser Ala Cys Phe Arg Ala Glu
260 265 270
Ala Gly Ser Ala Gly Arg Asp Thr Arg Gly Leu Ile Arg Gln His Gln
275 280 285
Phe Asn Lys Val Glu Leu Val Lys Phe Val Lys Pro Glu Asp Ser Tyr
290 295 300
Asp Glu Leu Glu Lys Leu Thr His Gln Ala Glu Thr Ile Leu Gln Arg
305 310 315 320
Leu Gly Leu Pro Tyr Arg Val Val Ala Leu Cys Thr Gly Asp Leu Gly
325 330 335
Phe Ser Ala Ala Lys Thr Tyr Asp Ile Glu Val Trp Leu Pro Ser Tyr
340 345 350
Gly Thr Tyr Arg Glu Ile Ser Ser Cys Ser Asn Phe Glu Ala Phe Gln
355 360 365
Ala Arg Arg Ala Asn Ile Arg Phe Arg Arg Glu Pro Lys Ala Lys Pro
370 375 380
Glu Tyr Val His Thr Leu Asn Gly Ser Gly Leu Ala Ile Gly Arg Thr
385 390 395 400
Val Ala Ala Ile Leu Glu Asn Tyr Gln Gln Glu Asp Gly Ser Val Val
405 410 415
Ile Pro Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Met Gly Asn Arg Asp Val Ile Arg
420 425 430
<210> 123
<211> 1947
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 123
atgccagacg ttattcgcat tacgttcccg gacggggcga aaaaggagtt tccgagcgga 60
acgtcaactg aggacatcgc tgcctcgatc agtccgggat tgaagaaaaa agcgattgcc 120
gggaaactga acggccggtt tgttgattta cgcacgccgc ttcaagaaga cggcgagctt 180
gtcattatta cccaggacat gcctgaggca cttgatattt tgcgtcatag caccgcccat 240
ttaatggcgc aagcgatcaa gcggctgtat gacaacgtca agcttggcgt cggcccggtc 300
attgaaaacg gcttctacta tgatattgat atggaacata agctgacgcc ggatgatttg 360
ccgaaaattg aggcggaaat gcgcaaaatc gtaaaggaaa atcttgacgt tgttcgcaaa 420
gaggtgagcc gtgacgaggc gattcgcctg tatgaaaaaa ttggtgatca cttgaaactg 480
gagctcatca acgatattcc ggaaggcgag acgatttcca tttacgagca aggcgagttt 540
ttcgatcttt gtcggggtgt gcacgtgccg tcgaccggga aaatcaaaga gttcaagctg 600
ctcagcatct cgggggccta ctggcgcggt gacagcaaca acaaaatgct gcagcgtatt 660
tacggtacgg cgtttttcaa aaaagaagat ctggaccatt atttgcagtt gctcgaagag 720
gcgaaagagc gcgatcatcg caaattgggc aaagagcttg agctatttac gacatcacaa 780
aaagtcggac aaggactgcc gctttggttg ccgaaagggg cgacgatccg tcgcttgatt 840
gaacggtaca ttgtcgataa agaaatcgcc cttggttatg atcatgtata tacgccggtg 900
ctcggcagtg tggagctgta taaaacctca ggacactggg accattataa agaaaacatg 960
ttcccaccga tggaaatgga taacgaagag ctcgtgctgc ggccgatgaa ctgcccgcac 1020
catatgatga tttataaaag caagcttcat agctaccgtg agctgccgat ccgcatcgcc 1080
gagctcggca cgatgcatcg ctacgaaatg tccggggcgc ttactggact gcagcgtgtc 1140
cgcggcatga cgctcaacga cgcccatatt ttcgtgcgcc cggatcaaat taaagacgag 1200
tttaagcgcg tcgttaattt gattttggaa gtatacaaag actttgggct ggacgaatat 1260
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tacgaagcgg aaggggaagc agcgttttac ggaccgaagc tcgatgtgca agtgcgcacg 1440
gcactcggca aagatgagac gctgtcgact gtacagcttg acttcctctt gccggagcgg 1500
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tttccaacgt ggctcgcccc ggtgcaagtg gaagtcatcc cggtatcgtc ggaagcccat 1680
ctcgattatg cgtatgaagt gaaacaagcg ctgcaagtaa acggcttccg cgtcgaagtc 1740
gacgaacggg atgaaaaaat cggctataaa atccgcgaag cgcaaatgca aaaaattcct 1800
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ggtgaaaaag aaagcgagac tgtggcgctt gacaagttta tcgcgatgct agaagaagat 1920
gtgcggcaaa aacgagtgaa aaaacga 1947
<210> 124
<211> 649
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 124
Met Pro Asp Val Ile Arg Ile Thr Phe Pro Asp Gly Ala Lys Lys Glu
1 5 10 15
Phe Pro Ser Gly Thr Ser Thr Glu Asp Ile Ala Ala Ser Ile Ser Pro
20 25 30
Gly Leu Lys Lys Lys Ala Ile Ala Gly Lys Leu Asn Gly Arg Phe Val
35 40 45
Asp Leu Arg Thr Pro Leu Gln Glu Asp Gly Glu Leu Val Ile Ile Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Met Ala Gln Ala Ile Lys Arg Leu Tyr Asp Asn Val Lys Leu Gly
85 90 95
Val Gly Pro Val Ile Glu Asn Gly Phe Tyr Tyr Asp Ile Asp Met Glu
100 105 110
His Lys Leu Thr Pro Asp Asp Leu Pro Lys Ile Glu Ala Glu Met Arg
115 120 125
Lys Ile Val Lys Glu Asn Leu Asp Val Val Arg Lys Glu Val Ser Arg
130 135 140
Asp Glu Ala Ile Arg Leu Tyr Glu Lys Ile Gly Asp His Leu Lys Leu
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Glu Leu Ile Asn Asp Ile Pro Glu Gly Glu Thr Ile Ser Ile Tyr Glu
165 170 175
Gln Gly Glu Phe Phe Asp Leu Cys Arg Gly Val His Val Pro Ser Thr
180 185 190
Gly Lys Ile Lys Glu Phe Lys Leu Leu Ser Ile Ser Gly Ala Tyr Trp
195 200 205
Arg Gly Asp Ser Asn Asn Lys Met Leu Gln Arg Ile Tyr Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Phe Lys Lys Glu Asp Leu Asp His Tyr Leu Gln Leu Leu Glu Glu
225 230 235 240
Ala Lys Glu Arg Asp His Arg Lys Leu Gly Lys Glu Leu Glu Leu Phe
245 250 255
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260 265 270
Gly Ala Thr Ile Arg Arg Leu Ile Glu Arg Tyr Ile Val Asp Lys Glu
275 280 285
Ile Ala Leu Gly Tyr Asp His Val Tyr Thr Pro Val Leu Gly Ser Val
290 295 300
Glu Leu Tyr Lys Thr Ser Gly His Trp Asp His Tyr Lys Glu Asn Met
305 310 315 320
Phe Pro Pro Met Glu Met Asp Asn Glu Glu Leu Val Leu Arg Pro Met
325 330 335
Asn Cys Pro His His Met Met Ile Tyr Lys Ser Lys Leu His Ser Tyr
340 345 350
Arg Glu Leu Pro Ile Arg Ile Ala Glu Leu Gly Thr Met His Arg Tyr
355 360 365
Glu Met Ser Gly Ala Leu Thr Gly Leu Gln Arg Val Arg Gly Met Thr
370 375 380
Leu Asn Asp Ala His Ile Phe Val Arg Pro Asp Gln Ile Lys Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Arg Val Val Asn Leu Ile Leu Glu Val Tyr Lys Asp Phe Gly
405 410 415
Leu Asp Glu Tyr Ser Phe Arg Leu Ser Tyr Arg Asp Pro Gln Asp Lys
420 425 430
Glu Lys Tyr Tyr Asp Asp Asp Glu Met Trp Glu Lys Ala Gln Arg Met
435 440 445
Leu Arg Glu Ala Met Asp Glu Leu Gly Leu Asp Tyr Tyr Glu Ala Glu
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Gly Glu Ala Ala Phe Tyr Gly Pro Lys Leu Asp Val Gln Val Arg Thr
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Ala Leu Gly Lys Asp Glu Thr Leu Ser Thr Val Gln Leu Asp Phe Leu
485 490 495
Leu Pro Glu Arg Phe Asp Leu Thr Tyr Ile Gly Glu Asp Gly Lys Pro
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His Arg Pro Val Val Ile His Arg Gly Val Val Ser Thr Met Glu Arg
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Phe Val Ala Phe Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Gly Ala Phe Pro Thr Trp
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Leu Ala Pro Val Gln Val Glu Val Ile Pro Val Ser Ser Glu Ala His
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Leu Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Lys Gln Ala Leu Gln Val Asn Gly Phe
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Arg Val Glu Val Asp Glu Arg Asp Glu Lys Ile Gly Tyr Lys Ile Arg
580 585 590
Glu Ala Gln Met Gln Lys Ile Pro Tyr Met Leu Val Val Gly Asp Lys
595 600 605
Glu Ala Ala Glu Arg Ala Val Asn Val Arg Arg Tyr Gly Glu Lys Glu
610 615 620
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Val Arg Gln Lys Arg Val Lys Lys Arg
645
<210> 125
<211> 984
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 125
atgaaaacca ttttttctgg cattcagcca agcggcgtca ttacccttgg caactacatt 60
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<210> 126
<211> 328
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 126
Met Lys Thr Ile Phe Ser Gly Ile Gln Pro Ser Gly Val Ile Thr Leu
1 5 10 15
Gly Asn Tyr Ile Gly Ala Met Arg Gln Phe Val Glu Leu Gln His Glu
20 25 30
Tyr Asn Cys Tyr Phe Cys Ile Val Asp Gln His Ala Ile Thr Val Pro
35 40 45
Gln Asn Pro Asn Glu Leu Gln Gln Asn Ile Arg Arg Leu Ala Ala Leu
50 55 60
Tyr Leu Ala Val Gly Ile Asp Pro Lys Gln Ala Thr Leu Phe Val Gln
65 70 75 80
Ser Glu Val Pro Ala His Ala Gln Ala Ala Trp Met Leu Gln Cys Ile
85 90 95
Val Tyr Ile Gly Glu Leu Glu Arg Met Thr Gln Phe Lys Asp Lys Ser
100 105 110
Ala Gly Lys Glu Ala Val Ser Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Pro Pro Leu
115 120 125
Met Ala Ala Asp Ile Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Ile Val Pro Val Gly
130 135 140
Glu Asp Gln Lys Gln His Ile Glu Leu Thr Arg Asp Leu Ala Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asn Lys Arg Tyr Gly Glu Leu Phe Thr Ile Pro Glu Ala Arg Ile
165 170 175
Pro Lys Ile Gly Ala Arg Ile Met Ser Leu Thr Asp Pro Thr Lys Lys
180 185 190
Met Ser Lys Ser Asp Pro Asn Pro Lys Ser Phe Ile Thr Leu Leu Asp
195 200 205
Asp Ala Lys Thr Ile Glu Lys Lys Ile Lys Ser Ala Val Thr Asp Ser
210 215 220
Glu Gly Thr Ile Arg Tyr Asp Lys Glu Ala Lys Pro Gly Ile Ser Asn
225 230 235 240
Leu Leu Asn Ile Tyr Ser Ile Leu Ser Gly Gln Pro Ile Asp Glu Leu
245 250 255
Glu Arg Gln Tyr Glu Gly Lys Gly Tyr Gly Val Phe Lys Ser Asp Leu
260 265 270
Ala Gln Val Val Ile Glu Thr Leu Gln Pro Ile Gln Glu Arg Tyr Tyr
275 280 285
His Trp Leu Glu Ser Glu Glu Leu Asp Arg Val Leu Asp Glu Gly Ala
290 295 300
Glu Lys Ala Asn Arg Val Ala Ser Glu Met Val Arg Lys Met Glu Gln
305 310 315 320
Ala Met Gly Leu Gly Arg Arg Arg
325
<210> 127
<211> 1257
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 127
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<211> 419
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 128
Met Asn Leu Leu Glu Glu Leu Gln Trp Arg Gly Leu Val Asn Gln Thr
1 5 10 15
Thr Asp Glu Asp Gly Leu Arg Lys Leu Leu Asn Glu Glu Lys Val Thr
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Leu Tyr Cys Gly Phe Asp Pro Thr Ala Asp Ser Leu His Ile Gly His
35 40 45
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Pro Ile Ala Leu Val Gly Gly Ala Thr Gly Leu Ile Gly Asp Pro Ser
65 70 75 80
Gly Arg Lys Ser Glu Arg Thr Leu Asn Ala Lys Glu Thr Val Glu Thr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Pro Leu Asp Val Ile Ser Phe Leu Arg Asp Ile Gly Lys His Phe Ser
130 135 140
Val Asn Tyr Met Leu Ala Lys Glu Ser Val Gln Ser Arg Ile Glu Met
145 150 155 160
Gly Ile Ser Phe Thr Glu Phe Ser Tyr Met Met Leu Gln Ala Tyr Asp
165 170 175
Phe Leu Asn Leu Tyr Glu Thr Glu Gly Cys Arg Leu Gln Ile Gly Gly
180 185 190
Ser Asp Gln Trp Gly Asn Ile Thr Ala Gly Leu Glu Leu Ile Arg Arg
195 200 205
Thr Lys Gly Glu Ala Lys Ala Phe Gly Leu Thr Val Pro Leu Val Thr
210 215 220
Lys Ala Asp Gly Thr Lys Phe Gly Lys Thr Glu Ser Gly Ala Val Trp
225 230 235 240
Leu Asp Pro Glu Lys Thr Ser Pro Tyr Glu Phe Tyr Gln Phe Trp Ile
245 250 255
Asn Thr Asp Asp Arg Asp Val Ile Arg Tyr Leu Lys Tyr Phe Thr Phe
260 265 270
Leu Thr Lys Glu Glu Ile Asp Ala Leu Glu Gln Glu Leu Arg Glu Ala
275 280 285
Pro Glu Lys Arg Val Ala Gln Lys Thr Leu Ala Ser Glu Val Thr Lys
290 295 300
Leu Val His Gly Glu Glu Ala Leu Asn Gln Ala Ile Arg Ile Ser Glu
305 310 315 320
Ala Leu Phe Ser Gly Asp Ile Ala Glu Leu Thr Ala Ala Glu Ile Glu
325 330 335
Gln Gly Phe Lys Asn Val Pro Ser Phe Val His Glu Gly Gly Asp Val
340 345 350
Pro Leu Val Glu Leu Leu Val Ala Ala Gly Ile Ser Pro Ser Lys Arg
355 360 365
Gln Ala Arg Glu Asp Val Gln Asn Gly Ala Ile Tyr Val Asn Gly Glu
370 375 380
Arg Ile Gln Asp Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Glu His Arg Leu Glu
385 390 395 400
Gly Arg Phe Thr Val Ile Arg Arg Gly Lys Lys Lys Tyr Tyr Leu Ile
405 410 415
Arg Tyr Ala
<210> 129
<211> 2727
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 129
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acaggcaaac tgcatttggg ccatgcgtgg gatacgacgc tgcaagacat cattacgcgc 300
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gccacccagg cgaaagtgga agaaaaattg cgccaacaag gactgtcccg ctacgattta 420
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atttaccgcg gtgaatacat tatcaactgg gatccggcga ccaaaaccgc cttgtccgac 660
atcgaggtca tttacaagga agtgaaaggt gcgctttatc atttgcgcta tccgctcgct 720
gacggctcgg gctacattga agtagcgaca acccgtccag aaacgatgct cggtgacacg 780
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ggttccggcg cggtaaaaat tacaccggca cacgatccga acgactttga agttggcaac 960
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agcggcgccg ttgttgaacc gtatttgtcg acacaatggt tcgtaaaaat gaagccgctc 1200
gcggaagctg ccatcaagat gcagcaaaca gaaggaaaag tgcaatttgt gccggagcgg 1260
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gaaatggcga agctgccgct ttacggcgat gatgagacag cgaaaaagac gacgcgttca 2100
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accgaggaaa tttggcaaaa cttgccgcat gacggcgaat cgattaccgt tgcctcgtgg 2220
ccgcaagtgc gtccggagct gtcaaacgaa gaagcggcgg aagaaatgcg gatgctcgtt 2280
gacattatcc gcgcggtccg aaacgttcgt gccgaagtca atacgccgcc gagcaaaccg 2340
attgcgctct acattaagac aaaagacgaa caagtgcgcg cagcgcttat gaaaaaccgc 2400
gcttatctcg aacggttctg caatccgagc gaattgatca ttgacacgga tgttccggcg 2460
ccagaaaaag cgatgactgc tgtcgtcaca ggggcagagc tcattttgcc gcttgaagga 2520
ctcatcaata tcgaagaaga aatcaagcgg cttgagaaag agctcgacaa atggaacaaa 2580
gaagtcgagc gtgtcgaaaa gaaactggcg aacgaaggct ttttggcaaa agcgccggct 2640
catgtcgtcg aggaagagcg gcgcaagcgg caagattaca tcgaaaaacg cgaagcagtg 2700
aaagcgcgtc ttgccgagtt gaaacgg 2727
<210> 130
<211> 909
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 130
Met Lys Gly Ala Phe Leu Leu Ala Tyr Arg Thr Val Asp Pro Val Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ile Val Tyr His Met Lys Glu Gly Ile Lys Val Ala Gln
20 25 30
His Glu Val Ser Met Pro Pro Lys Tyr Asp His Arg Ala Val Glu Ala
35 40 45
Gly Arg Tyr Asp Trp Trp Leu Lys Gly Lys Phe Phe Glu Thr Thr Gly
50 55 60
Asp Pro Asp Lys Gln Pro Phe Thr Ile Val Ile Pro Pro Pro Asn Val
65 70 75 80
Thr Gly Lys Leu His Leu Gly His Ala Trp Asp Thr Thr Leu Gln Asp
85 90 95
Ile Ile Thr Arg Met Lys Arg Met Gln Gly Tyr Asp Val Leu Trp Leu
100 105 110
Pro Gly Met Asp His Ala Gly Ile Ala Thr Gln Ala Lys Val Glu Glu
115 120 125
Lys Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ser Arg Tyr Asp Leu Gly Arg Glu Lys
130 135 140
Phe Leu Glu Glu Thr Trp Lys Trp Lys Glu Glu Tyr Ala Gly His Ile
145 150 155 160
Arg Ser Gln Trp Ala Lys Leu Gly Leu Gly Leu Asp Tyr Thr Arg Glu
165 170 175
Arg Phe Thr Leu Asp Glu Gly Leu Ser Lys Ala Val Arg Glu Val Phe
180 185 190
Val Ser Leu Tyr Arg Lys Gly Leu Ile Tyr Arg Gly Glu Tyr Ile Ile
195 200 205
Asn Trp Asp Pro Ala Thr Lys Thr Ala Leu Ser Asp Ile Glu Val Ile
210 215 220
Tyr Lys Glu Val Lys Gly Ala Leu Tyr His Leu Arg Tyr Pro Leu Ala
225 230 235 240
Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Glu Val Ala Thr Thr Arg Pro Glu Thr Met
245 250 255
Leu Gly Asp Thr Ala Val Ala Val His Pro Asp Asp Glu Arg Tyr Lys
260 265 270
His Leu Ile Gly Lys Met Val Lys Leu Pro Ile Val Gly Arg Glu Ile
275 280 285
Pro Ile Ile Ala Asp Glu Tyr Val Asp Met Glu Phe Gly Ser Gly Ala
290 295 300
Val Lys Ile Thr Pro Ala His Asp Pro Asn Asp Phe Glu Val Gly Asn
305 310 315 320
Arg His Asn Leu Pro Arg Ile Leu Val Met Asn Glu Asp Gly Thr Met
325 330 335
Asn Glu Asn Ala Leu Gln Tyr Gln Gly Leu Asp Arg Phe Glu Cys Arg
340 345 350
Lys Gln Ile Val Arg Asp Leu Gln Glu Gln Gly Val Leu Phe Lys Ile
355 360 365
Glu Glu His Val His Ser Val Gly His Ser Glu Arg Ser Gly Ala Val
370 375 380
Val Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Gln Trp Phe Val Lys Met Lys Pro Leu
385 390 395 400
Ala Glu Ala Ala Ile Lys Met Gln Gln Thr Glu Gly Lys Val Gln Phe
405 410 415
Val Pro Glu Arg Phe Glu Lys Thr Tyr Leu His Trp Leu Glu Asn Ile
420 425 430
Arg Asp Trp Cys Ile Ser Arg Gln Leu Trp Trp Gly His Arg Ile Pro
435 440 445
Ala Trp Tyr His Lys Glu Thr Gly Glu Ile Tyr Val Asp His Glu Pro
450 455 460
Pro Ala Asp Ile Glu Asn Trp Glu Gln Asp Pro Asp Val Leu Asp Thr
465 470 475 480
Trp Phe Ser Ser Ala Leu Trp Pro Phe Ser Thr Met Gly Trp Pro Asp
485 490 495
Thr Glu Ala Pro Asp Tyr Lys Arg Tyr Tyr Pro Thr Asp Val Leu Val
500 505 510
Thr Gly Tyr Asp Ile Ile Phe Phe Trp Val Ser Arg Met Ile Phe Gln
515 520 525
Gly Leu Glu Phe Thr Gly Lys Arg Pro Phe Lys Asp Val Leu Ile His
530 535 540
Gly Leu Val Arg Asp Ala Gln Gly Arg Lys Met Ser Lys Ser Leu Gly
545 550 555 560
Asn Gly Val Asp Pro Met Asp Val Ile Asp Gln Tyr Gly Ala Asp Ala
565 570 575
Leu Arg Tyr Phe Leu Ala Thr Gly Ser Ser Pro Gly Gln Asp Leu Arg
580 585 590
Phe Ser Thr Glu Lys Val Glu Ala Thr Trp Asn Phe Ala Asn Lys Ile
595 600 605
Trp Asn Ala Ser Arg Phe Ala Leu Met Asn Met Gly Gly Met Thr Tyr
610 615 620
Glu Glu Leu Asp Leu Ser Gly Glu Lys Thr Val Ala Asp His Trp Ile
625 630 635 640
Leu Thr Arg Leu Asn Glu Thr Ile Asp Thr Val Thr Lys Leu Ala Asp
645 650 655
Lys Tyr Glu Phe Gly Glu Val Gly Arg Thr Leu Tyr Asn Phe Ile Trp
660 665 670
Asp Asp Leu Cys Asp Trp Tyr Ile Glu Met Ala Lys Leu Pro Leu Tyr
675 680 685
Gly Asp Asp Glu Thr Ala Lys Lys Thr Thr Arg Ser Val Leu Ala Tyr
690 695 700
Val Leu Asp Asn Thr Met Arg Leu Leu His Pro Phe Met Pro Phe Ile
705 710 715 720
Thr Glu Glu Ile Trp Gln Asn Leu Pro His Asp Gly Glu Ser Ile Thr
725 730 735
Val Ala Ser Trp Pro Gln Val Arg Pro Glu Leu Ser Asn Glu Glu Ala
740 745 750
Ala Glu Glu Met Arg Met Leu Val Asp Ile Ile Arg Ala Val Arg Asn
755 760 765
Val Arg Ala Glu Val Asn Thr Pro Pro Ser Lys Pro Ile Ala Leu Tyr
770 775 780
Ile Lys Thr Lys Asp Glu Gln Val Arg Ala Ala Leu Met Lys Asn Arg
785 790 795 800
Ala Tyr Leu Glu Arg Phe Cys Asn Pro Ser Glu Leu Ile Ile Asp Thr
805 810 815
Asp Val Pro Ala Pro Glu Lys Ala Met Thr Ala Val Val Thr Gly Ala
820 825 830
Glu Leu Ile Leu Pro Leu Glu Gly Leu Ile Asn Ile Glu Glu Glu Ile
835 840 845
Lys Arg Leu Glu Lys Glu Leu Asp Lys Trp Asn Lys Glu Val Glu Arg
850 855 860
Val Glu Lys Lys Leu Ala Asn Glu Gly Phe Leu Ala Lys Ala Pro Ala
865 870 875 880
His Val Val Glu Glu Glu Arg Arg Lys Arg Gln Asp Tyr Ile Glu Lys
885 890 895
Arg Glu Ala Val Lys Ala Arg Leu Ala Glu Leu Lys Arg
900 905
<210> 131
<211> 963
<212> DNA
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 131
atgctgatga cgaacattgt ctttatggga acgcctgatt ttgcggtgcc ggttttacgg 60
cagctgcttg atgacgggta tcgggttgtt gccgttgtta cgcagccgga caagccgaaa 120
gggcgaaagc gcgagcttgt tccgcccccc gttaaggtcg aggcgcaaaa acacggcatc 180
ccggtattgc aaccgacgaa aattcgtgaa ccggaacaat acgaacaagt gctggcgttt 240
gcgcctgact tgatcgtgac cgcggcattt ggacaaattt tgcctaaggc tctgcttgac 300
gctcccaaat atggctgcat taatgttcac gcctcgcttc ttcccgagct gcgcggcggt 360
gcgccgatcc attatgccat ttggcaaggg aaaacgaaaa caggtgtcac gattatgtat 420
atggcggaaa agttggatgc cggcgacatg ttgacgcaag tcgaagtgcc gattgaagaa 480
accgataccg tcggcacact gcatgataaa ttgagcgctg ccggggctaa actattatca 540
gaaacgctcc cgcttttatt ggaaggtaac cttgcgccta ttccgcaaga ggaagagaaa 600
gcgacatatg ctccgaatat ccggcgtgaa caagagcgga ttgactgggc gcagcctggt 660
gaggcgattt acaaccatat ccgtgctttt catccgtggc cggttacgta tacgacatac 720
gacgggaacg tttggaaaat ctggtggggc gaaaaagtgc cggcgccaag cttagcgtcg 780
ccaggcacga ttttatcgct tgaggaagac ggcatcgtcg tcgccaccgg cagtgagacg 840
gccattaaaa ttactgaatt gcagccggcc ggcaaaaagc gaatggcggc cagcgagttt 900
ttgcgcggtg ctggcagccg gcttgcggtc ggcacgaagc taggagagaa caatgaacgt 960
acg 963
<210> 132
<211> 321
<212> PRT
<213> Geobacillus subterraneus
<400> 132
Met Leu Met Thr Asn Ile Val Phe Met Gly Thr Pro Asp Phe Ala Val
1 5 10 15
Pro Val Leu Arg Gln Leu Leu Asp Asp Gly Tyr Arg Val Val Ala Val
20 25 30
Val Thr Gln Pro Asp Lys Pro Lys Gly Arg Lys Arg Glu Leu Val Pro
35 40 45
Pro Pro Val Lys Val Glu Ala Gln Lys His Gly Ile Pro Val Leu Gln
50 55 60
Pro Thr Lys Ile Arg Glu Pro Glu Gln Tyr Glu Gln Val Leu Ala Phe
65 70 75 80
Ala Pro Asp Leu Ile Val Thr Ala Ala Phe Gly Gln Ile Leu Pro Lys
85 90 95
Ala Leu Leu Asp Ala Pro Lys Tyr Gly Cys Ile Asn Val His Ala Ser
100 105 110
Leu Leu Pro Glu Leu Arg Gly Gly Ala Pro Ile His Tyr Ala Ile Trp
115 120 125
Gln Gly Lys Thr Lys Thr Gly Val Thr Ile Met Tyr Met Ala Glu Lys
130 135 140
Leu Asp Ala Gly Asp Met Leu Thr Gln Val Glu Val Pro Ile Glu Glu
145 150 155 160
Thr Asp Thr Val Gly Thr Leu His Asp Lys Leu Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Lys Leu Leu Ser Glu Thr Leu Pro Leu Leu Leu Glu Gly Asn Leu Ala
180 185 190
Pro Ile Pro Gln Glu Glu Glu Lys Ala Thr Tyr Ala Pro Asn Ile Arg
195 200 205
Arg Glu Gln Glu Arg Ile Asp Trp Ala Gln Pro Gly Glu Ala Ile Tyr
210 215 220
Asn His Ile Arg Ala Phe His Pro Trp Pro Val Thr Tyr Thr Thr Tyr
225 230 235 240
Asp Gly Asn Val Trp Lys Ile Trp Trp Gly Glu Lys Val Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Leu Ala Ser Pro Gly Thr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Asp Gly Ile
260 265 270
Val Val Ala Thr Gly Ser Glu Thr Ala Ile Lys Ile Thr Glu Leu Gln
275 280 285
Pro Ala Gly Lys Lys Arg Met Ala Ala Ser Glu Phe Leu Arg Gly Ala
290 295 300
Gly Ser Arg Leu Ala Val Gly Thr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Glu Arg
305 310 315 320
Thr
<210> 133
<211> 358
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 133
Met Phe Asp Arg Leu Glu Ala Val Glu Gln Arg Tyr Glu Lys Leu Asn
1 5 10 15
Glu Leu Leu Met Glu Pro Asp Val Ile Asn Asp Pro Lys Lys Leu Arg
20 25 30
Asp Tyr Ser Lys Glu Gln Ala Asp Leu Gly Glu Thr Val Gln Thr Tyr
35 40 45
Arg Glu Tyr Lys Ser Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Lys Ala Met
50 55 60
Leu Glu Glu Lys Leu Glu Pro Glu Leu Arg Glu Met Val Lys Glu Glu
65 70 75 80
Ile Gly Glu Leu Glu Glu Arg Glu Glu Ala Leu Val Glu Lys Leu Lys
85 90 95
Val Leu Leu Leu Pro Lys Asp Pro Asn Asp Glu Lys Asn Val Ile Met
100 105 110
Glu Ile Arg Ala Ala Ala Gly Gly Glu Glu Ala Ala Leu Phe Ala Gly
115 120 125
Asp Leu Tyr Arg Met Tyr Thr Arg Tyr Ala Glu Ser Gln Gly Trp Lys
130 135 140
Thr Glu Val Ile Glu Ala Ser Pro Thr Gly Leu Gly Gly Tyr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Ile Phe Met Ile Asn Gly Lys Gly Ala Tyr Ser Lys Leu Lys Phe
165 170 175
Glu Asn Gly Ala His Arg Val Gln Arg Val Pro Glu Thr Glu Ser Gly
180 185 190
Gly Arg Ile His Thr Ser Thr Ala Thr Val Ala Cys Leu Pro Glu Met
195 200 205
Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile Asn Glu Lys Asp Ile Arg Val Asp Thr
210 215 220
Phe Ala Ser Ser Gly Pro Gly Gly Gln Ser Val Asn Thr Thr Met Ser
225 230 235 240
Ala Val Arg Leu Thr His Ile Pro Thr Gly Ile Val Val Thr Cys Gln
245 250 255
Asp Glu Lys Ser Gln Ile Lys Asn Lys Glu Lys Ala Met Lys Val Leu
260 265 270
Arg Ala Arg Ile Tyr Asp Lys Tyr Gln Gln Glu Ala Arg Ala Glu Tyr
275 280 285
Asp Gln Thr Arg Lys Gln Ala Val Gly Thr Gly Asp Arg Ser Glu Arg
290 295 300
Ile Arg Thr Tyr Asn Phe Pro Gln Asn Arg Val Thr Asp His Arg Ile
305 310 315 320
Gly Leu Thr Ile Gln Lys Leu Asp Gln Val Pro Asp Gly His Leu Asp
325 330 335
Glu Ile Ile Glu Ala Leu Ile Leu Asp Asp Gln Ala Lys Lys Leu Glu
340 345 350
Gln Ala Asn Asp Ala Ser
355
<210> 134
<211> 255
<212> PRT
<213> Aequorea victoria
<400> 134
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ser Lys Gly Glu
1 5 10 15
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp
20 25 30
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
35 40 45
Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Leu
65 70 75 80
Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys
85 90 95
Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys
100 105 110
Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
115 120 125
Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn
145 150 155 160
Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Tyr Phe
165 170 175
Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His
180 185 190
Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp
195 200 205
Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu
210 215 220
Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Asp Val Thr Ala Ala Gly Ile
225 230 235 240
Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Ser Glu Pro Glu Ala
245 250 255
<210> 135
<211> 225
<212> PRT
<213> Aequorea victoria
<400> 135
Met Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly
1 5 10 15
Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp
20 25 30
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys
35 40 45
Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val
50 55 60
Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe
65 70 75 80
Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe
85 90 95
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly
100 105 110
Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His
130 135 140
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn
145 150 155 160
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
165 170 175
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
180 185 190
Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn
195 200 205
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
210 215 220
Ile
225
<210> 136
<211> 883
<212> PRT
<213> T7 Bacteriophage
<400> 136
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys
65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys
145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp
225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile
305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe
385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys
465 470 475 480
Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro
485 490 495
Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu
500 505 510
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln
530 535 540
His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn
545 550 555 560
Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys
565 570 575
Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn
580 585 590
Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys
595 600 605
Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly
610 615 620
Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly
625 630 635 640
Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln
645 650 655
Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln
660 665 670
Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr
675 680 685
Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys
690 695 700
Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg
705 710 715 720
Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp
725 730 735
Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu
740 745 750
Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu
755 760 765
Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His
770 775 780
Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu
785 790 795 800
Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr
805 810 815
Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met
820 825 830
Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln
835 840 845
Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu
850 855 860
Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe
865 870 875 880
Ala Phe Ala
Claims (61)
- 재조합 무세포(recombinant cell-free) 발현을 위한 시스템으로서,
- 적어도 다음 구성요소를 갖는 핵심 재조합 단백질 혼합물:
- 다수의 개시 인자(initiation factor, IF);
- 다수의 연장 인자(elongation factor, EF);
- 다수의 펩타이드 방출 인자(release factor, RF);
- 적어도 하나의 리보솜 재순환 인자(ribosome recycling factor, RRF);
- 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS); 및
- 적어도 하나의 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF);
- 적어도 하나의 핵산 합성 주형;
- 시험관내 거대분자 합성에 필수적인 무세포 반응 구성요소를 갖는 반응 혼합물을 포함하고, 그리고
- 여기서, 상기 구성요소들은 거대분자의 무세포 발현을 위해 구성된 생물반응기에 위치하는 시스템. - 제1항에 있어서, 상기 핵심 재조합 단백질 혼합물의 구성요소는 박테리아로부터 유래된 핵심 재조합 단백질 혼합물을 포함하는 시스템.
- 제2항에 있어서, 상기 박테리아로부터 유래된 상기 핵심 재조합 단백질 혼합물은 적어도 하나의 구성요소가 호열성 박테리아로부터 유래되는 핵심 재조합 단백질 혼합물을 포함하는 시스템.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 호열성 박테리아는 호열성 바실러스과(Bacillaceae) 박테리아, 또는 지오바실러스(Geobacillus) 호열성 박테리아를 포함하는 시스템.
- 제4항에 있어서, 상기 지오바실러스 호열성 박테리아는 지오바실러스 서브테라뉴스(Geobacillus subterraneus) 및 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리아로부터 유래된 상기 핵심 재조합 단백질 혼합물은 적어도 하나의 구성요소가 비호열성 박테리아, 또는 비호열성 및 호열성 박테리아의 조합으로부터 유래되는 핵심 재조합 단백질 혼합물을 포함하는 시스템.
- 제6항에 있어서, 상기 비호열성 박테리아가 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)를 포함하는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 다수의 개시 인자(IF)는 호열성 박테리아로부터 유래된 다수의 개시 인자를 포함하는 시스템.
- 제1항 또는 제8항에 있어서, 상기 호열성 박테리아로부터 유래되는 복수의 개시 인자가 IF1, IF2, IF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제1항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 개시 인자가 서열번호 2, 4, 6, 70, 72 및 74로 이루어진 아미노산 서열의 그룹 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 다수의 연장 인자(EF)는 호열성 박테리아로부터 유래된 다수의 연장 인자를 포함하는 시스템.
- 제1항 또는 제11항에 있어서, 상기 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 연장 인자가 EF-G; EF-Tu; EF-Ts; EF-4; EF-P, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제1항, 제11항, 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 연장 인자가 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자(RF)는 호열성 박테리아, 또는 바실러스 박테리아로부터 유래되는 다수의 펩타이드 방출 인자를 포함하는 시스템.
- 제1항 또는 제14항에 있어서, 상기 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 펩타이드 방출 인자가 RF1, RF2 및 RF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제1항, 제14항, 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자가 서열번호 18, 20, 22, 86, 88로 이루어지는 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자(RRF)는 호열성 박테리아로부터 유래된 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
- 제1항 또는 제17항에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
- 제1항, 제17항, 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자가 아미노산 서열인 서열번호 14 및 90, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS)는 호열성 박테리아, 또는 E. 콜라이(E. coli)로부터 유래되는 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소를 포함하는, 시스템.
- 제1항 또는 제20항에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 AlaRS; ArgRS; AsnRS; AspRS; CysRS; GlnRS; GluRS; GlyRS; HisRS; IleRS; LeuRS; LysRS; MetRS; PheRS (a); PheRS (b); ProRS; SerRS; ThrRS; TrpRS; TyrRS; 및 ValRS, 또는 이들 중 임의의 것의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제1항, 제20항, 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 서열번호 26, 28, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어진 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF)가 호열성 박테리아로부터 유래된 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
- 제1항 또는 제23항에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
- 제1항, 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 아미노산 서열인 서열번호 68 및 132, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 핵산 합성 주형이 DNA 주형을 포함하는 시스템.
- 제26항에 있어서, 상기 DNA 주형이 다음을 갖는 선형 DNA 주형을 포함하는 시스템:
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 표적 서열로서, 여기서 상기 표적 서열은 선택적으로 코돈 최적화될 수 있음;
- 적어도 하나의 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS);
- 적어도 하나의 발현 생성물 절단 부위; 및
- 적어도 하나의 태그(tag). - 제1항에 있어서, 상기 핵산 합성 주형이 RNA 주형을 포함하는 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 다음 구성요소 중 하나 이상을 포함하는 시스템:
- 다량의 리보솜, 및 선택적으로 호열성 박테리아에서 유래되는 다량의 리보솜;
- 다량의 RNase 억제제;
- 다량의 RNA 중합효소;
- 다량의 tRNA, 및 선택적으로 호열성 박테리아에서 유래되는 다량의 tRNA;
- 완충액; 및
- 다량의 아미노산. - 제29항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 다음 구성요소 중 하나 이상을 추가로 포함하는 시스템:
- 트리스-아세테이트;
- Mg(OAc)2;
- K+-글루타메이트;
- 아미노-아세테이트;
- NaCl;
- KC1;
- MgCk;
- DTT;
- 옥틸-b-글리코사이드;
- NAD;
- NADP;
- 소르비톨;
- FADH;
- CoA;
- PLP; 및
- SAM. - 제1항 또는 제29항에 있어서, 에너지원을 추가로 포함하는 시스템.
- 제32항에 있어서, 상기 에너지원이 다량의 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP)를 포함하는 시스템.
- 제32항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 트리포스페이트가 아데닌 트리포스페이트(ATP); 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 트리포스페이트 UTP 및 시티딘 트리포스페이트(CTP)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 트리포스페이트를 포함하는 시스템.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에너지원이 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템을 포함하는 시스템.
- 제34항에 있어서, 상기 무기 폴리포스페이트 기반의 에너지 재생 시스템이 다음을 포함하는 시스템:
- 다음을 포함하는 세포의 아데노신 트리포스페이트(ATP) 에너지 재생 시스템:
- 다량의 아데노실 키나제(Gst AdK) 효소;
- 다량의 폴리포스페이트 키나제(TaqPPK) 효소;
- 다량의 무기 폴리포스페이트(PPi); 및
- 다량의 아데노신 모노포스페이트(AMP);
- 상기 AdK 및 PPK 효소는 상승적으로 작용하여 PPi 및 AMP로부터 세포 ATP 에너지를 재생함. - 제1항에 있어서, 상기 생물반응기가 연속 유동 생물반응기를 포함하는 시스템.
- 다음을 포함하는 재조합 무세포 발현 반응 혼합물:
- 다수의 개시 인자(IF);
- 다수의 연장 인자(EF);
- 다수의 방출 인자(RF)
- 적어도 하나의 리보솜 재순환 인자(RRF);
- 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS); 및
- 적어도 하나의 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF). - 제37항에 있어서, 상기 다수의 개시 인자(IF)는 호열성 박테리아로부터 유래되는 다수의 개시 인자를 포함하는 시스템.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 개시 인자가 IF1, IF2, IF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 개시 인자가 서열번호 2, 4, 6, 70, 72 및 74로 이루어지는 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제37항에 있어서, 상기 다수의 연장 인자(EF)는 호열성 박테리아로부터 유래되는 다수의 연장 인자를 포함하는 시스템.
- 제37항 또는 제41항에 있어서, 상기 호열성 박테리아로부터 유래되는 상기 다수의 연장 인자가 EF-G, EF-Tu, EF-Ts, EF-4, EF-P, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제37항, 제41항, 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 연장 인자가 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84로 이루어지는 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제37항에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자(RF)는 호열성 박테리아, 또는 바실러스 종 박테리아로부터 유래되는 다수의 방출 인자를 포함하는 시스템.
- 제37항 또는 제44항에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자가 RF1, RF2 및 RF3, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제37항, 제44항, 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 펩타이드 방출 인자가 서열번호 18, 20, 22, 86, 88로 이루어지는 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제37항에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자(RRF)는 호열성 박테리아로부터 유래되는 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
- 제37항 또는 제47항에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
- 제37항, 제47항, 및 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리보솜 재순환 인자가 아미노산 서열인 서열번호 14 및 90, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 리보솜 재순환 인자를 포함하는 시스템.
- 제37항에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소(RS)는 적어도 하나가 호열성 박테리아에서 유래되는 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소를 포함하는, 시스템.
- 제37항 또는 제50항에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 AlaRS; ArgRS; AsnRS; AspRS; CysRS; GlnRS; GluRS; GlyRS; HisRS; IleRS; LeuRS; LysRS; MetRS; PheRS (a); PheRS (b); ProRS; SerRS; ThrRS; TrpRS; TyrRS; 및 ValRS, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체를 포함하는 시스템.
- 제37항, 제50항, 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 아미노아실-tRNA-합성효소가 서열번호 26, 28. 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130으로 이루어지는 아미노산 서열의 그룹, 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로부터 선택되는 시스템.
- 제37항에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제(MTF)가 호열성 박테리아로부터 유래되는 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
- 제37항 또는 제53항에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 지오바실러스로부터 유래되는 시스템.
- 제37항, 제53항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제가 아미노산 서열인 서열번호 68 및 132, 또는 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열에 따른 메티오닐-tRNA 트랜스포밀라제를 포함하는 시스템.
- 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 뉴클레오타이드:
- 서열번호 1, 3, 5 69, 71, 73;
- 서열번호 7, 9, 11, 13, 15, 75, 77, 79, 81 및 83;
- 서열번호 17, 19, 21, 85 및 87;
- 서열번호 23, 및 89; 및
- 서열번호 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129 및 131. - 프로모터에 작동가능하게 연결된, 제56항의 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 발현 벡터.
- 제57항의 발현 벡터 중 하나에 의해 형질전환된 박테리아.
- 제58항에 있어서, 상기 박테리아가 E. 콜라이를 포함하는 형질전환된 박테리아.
- 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드:
- 서열번호 2, 4, 6, 70, 72 및 74;
- 서열번호 8, 10, 12, 14, 16, 76, 78, 80, 82, 및 84;
- 서열번호 18, 20, 22, 86, 88;
- 서열번호 14, 및 90;
- 서열번호 26, 28, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 94, 96, 서열번호 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 및 130; 및
- 서열번호 68 및 132, 또는 이들 중 임의의 단편 또는 변이체. - 제60항의 펩타이드 중 적어도 하나를 사용하는 무세포 발현 시스템.
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