CN114480550A - 樟脑的酶促外消旋体拆分方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由樟脑生产富含1R‑(+)‑樟脑‑对映异构体或(1S)‑(‑)‑樟脑‑对映异构体的组合物的方法，一种由樟脑生产1R‑(+)‑樟脑或(1S)‑(‑)‑樟脑的方法，一种针对该方法提供的对映选择性冰片脱氢酶，一种由富含1R‑(+)‑樟脑‑对映异构体或富含1S‑(‑)‑樟脑‑对映异构体的组合物生产1R‑(‑)‑樟脑‑10‑磺酸或1S‑(+)‑樟脑‑10‑磺酸的方法，以及一种由1R‑(+)‑樟脑或1S‑(‑)‑樟脑生产1R‑(‑)‑樟脑‑10‑磺酸或1S‑(+)‑樟脑‑10‑磺酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种由樟脑生产富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物的方法，一种由樟脑生产1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的方法，一种针对该方法提供的对映选择性冰片脱氢酶，一种由富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物生产1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法，以及一种由1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑生产1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法。
背景技术
萜烯是天然物质中的最大种类之一。它们是根据其异戊二烯单元的数目来分类的碳氢化合物，包括半萜(一个异戊二烯单元)到多萜(超过八个异戊二烯单元)。单萜是异戊二烯的二聚体，可以分为无环、单环、双环和三环的化合物。含有氧或氮的单萜衍生物被称为类单萜。樟脑是一种双环的含氧单萜。在自然界中，它由植物产生(Banthorpe et al.,Sogo Kango 72,1972,115-155)，并被诸如恶臭假单胞菌(P.putida)的微生物降解(Bradshaw et al.,JACS,81,1959,788-824)。植物不仅可以合成(+)-樟脑而且可以合成(-)-樟脑，在此只有樟脑树的(+)-樟脑才能被经济地获得。(-)-樟脑可以通过昂贵的方法(即(-)-冰片的氧化)获得。此外，外消旋樟脑可以由α-蒎烯廉价地制成，α-蒎烯是纤维素和造纸工业的副产品(Zhen-Dong,Liang-Wu,Chemical Engineering,43,2009,1-8)。尤其是对用于药物合成的(-)-樟脑的需求正在稳步地增加(Xu et al.,Neurosci.,25,2005,8924-8937；Selescu et al.,Chem.Sense,38,2013；563-575；Sherkheli et al.,Pak.J..Pharm.Sci.,26,2013,431-438)。樟脑也用于生产樟脑-10-磺酸，其中外消旋樟脑用作反应物，并且由此得到的外消旋樟脑-10-磺酸由于昂贵的纯化步骤(在专利文献US 3,819,689 A或另一个专利文献IN 151660 A1中公开)而必须不利地分离。出于这个原因，期望能够直接使用非外消旋樟脑，并进而开发一个简单有效的方法来分离外消旋樟脑。酶动力学拆分(外消旋分离)是拆分外消旋混合物的常用方法(Breuer et al.,Angew.Chem.Int.,43,2004,788-824；Verho and Backvall,JACS,137,2015,3996-4006)。醇脱氢酶用于醇的氧化及其还原。然而对于樟脑而言，仅详细描述了5-外-羟基-樟脑脱氢酶(Hofer et al.，ChemCatChem,5,2013,3351-3357)。但是有一些冰片脱氢酶(BDH)是已知的，例如来自鼠尾草(Salvia officinalis)的选择性(+)-冰片脱氢酶或来自艾菊(Tanacetum vulgare)的选择性(-)-冰片脱氢酶(Dehal,Croteau,Arch.Biochem.Biophys.,258,1987,287-291；Drienovskáet al.,Phytochemistry,172,2020,112227)。不利的是，这些仅显示了很低的活性。此外，已知的还有各种不同的非选择性醇脱氢酶，特别是由Tsang(Tsang et al.,Appl.Environ.Microbiol.,82,2016,6378-6385)公开的来自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的非立体选择性冰片脱氢酶，其具有迄今为止已知的冰片脱氢酶的最高活性。
现有技术中没有公开任何有能力还原樟脑的冰片脱氢酶。
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是克服上述缺点。特别地，本发明所要解决的技术问题是提供可以在樟脑-对映异构体(特别是外消旋樟脑的混合物)中进行外消旋对映体拆分的方法和手段，特别是对映选择性地富集所期望的对映体的方法和手段，特别是以纯的形式获得所期望的对映体的方法和手段。特别地，本发明所要解决的技术问题是提供用于从外消旋樟脑混合物获得富含对映异构体的组合物(特别是对映异构体纯的1R-(+)-樟脑和/或1S-(-)-樟脑)的方法和手段。特别地，本发明所要解决的技术问题还是提供可以提供富含对映异构体(特别是对映异构体纯)的1R-(-)-樟脑-10-磺酸和/或1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法和手段。此外，本发明所要解决的另一个技术问题是提供廉价的和易于操作的方法和手段。
通过本发明的教导解决了该技术问题，特别是通过由樟脑制备富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物的方法，该方法包括以下方法步骤：
a)提供樟脑、反应介质和对映选择性冰片脱氢酶，
b)将方法步骤a)中提供的樟脑在反应介质中与对映选择性冰片脱氢酶一起转化，以及
c)获得包含1R-(+)-樟脑和(-)-冰片的、富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物或者包含1S-(-)-樟脑和(+)-冰片的、富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物。
在本发明的一个优选实施方案中，通过由樟脑生产富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物的方法解决了该技术问题，该方法包括以下方法步骤：
a)提供樟脑、反应介质和对映选择性(+)-冰片脱氢酶，
b)将方法步骤a)中提供的樟脑在反应介质中与对映选择性(+)-冰片脱氢酶一起转化，以及
c)获得包含1S-(-)-樟脑和(+)-冰片的、富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物。
根据本发明据此设置为，在第一方法步骤a)中提供樟脑和对映选择性冰片脱氢酶以及反应介质。在第二方法步骤b)中，樟脑在反应介质中与对映选择性冰片脱氢酶一起转化，其中据此有利地进行了樟脑的对映选择性转化，特别是还原。在这样转化的反应混合物中，根据方法步骤c)获得了包含1R-(+)-樟脑和(-)-冰片的、富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物或者包含1S-(-)-樟脑和(+)-冰片的、富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物。
在本发明的优选实施方式中，在方法步骤b)中所设置的在方法步骤a)中提供的樟脑的转化是还原。
通过这种方式，本发明可以从原料，即樟脑，以对映选择性的方式提供富含对映异构体的组合物，特别是富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物和富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物，特别是可以生产对映异构体纯的1R-(+)-樟脑和对映异构体纯的1S-(-)-樟脑。为此目的，本发明提供了对映选择性冰片脱氢酶(也被称为BDH)，特别是(+)-冰片脱氢酶，其能够还原樟脑。相应地，根据本发明所提供和使用的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)可以有利地用于樟脑的外消旋体拆分。因此，根据本发明可以特别简单、易于操作和廉价地实现樟脑的对映异构体分离，从而避免在设备和成本方面的高支出。本发明的优点还在于，其通常可以在提供樟脑之后磺化樟脑，用于以对映选择性的方式生产樟脑-10-磺酸，并因此可以生产1R-(-)-樟脑-10-磺酸和1S-(+)-樟脑-10-磺酸，而无需执行昂贵且大量的纯化步骤。
根据本发明，借助于对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)对樟脑进行转化，以便根据所使用的对映选择性冰片脱氢酶的对映选择性获得1R-(+)-樟脑和(-)-冰片的混合物或者1S-(-)-樟脑和(+)-冰片的混合物。
根据本发明所使用的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的特征特别在于，其具有与来自植物或微生物来源的冰片脱氢酶的野生型氨基酸序列等同的氨基酸序列，也就是说，除了氨基酸序列中的至少一个氨基酸取代之外均是相同的，更具体地说，根据本发明的冰片脱氢酶，特别是(+)-冰片脱氢酶的氨基酸序列相比于野生型冰片脱氢酶的氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代，这导致具有该至少一个氨基酸取代的冰片脱氢酶对映选择性地转化樟脑。
在一个优选的实施方案中，根据本发明所使用的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的特征尤其在于，其具有与来自恶臭假单胞菌(ATCC17453)的野生型氨基酸序列相同的氨基酸序列，即，除了氨基酸序列中的至少一个氨基酸取代之外均是相同的，更具体地说，根据本发明的冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列相比于来自恶臭假单胞菌(ATCC17453)的野生型冰片脱氢酶的氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代，这导致具有该至少一个氨基酸取代的冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)对映选择性地转化樟脑。
根据本发明设置的至少一个氨基酸取代被专门设计，以确保具有该至少一个氨基酸取代的酶的对映选择性。根据本发明设置的至少一个氨基酸取代是改变了所取代的氨基酸的功能性的氨基酸取代，也就是说，具有某种功能性的野生型氨基酸序列的至少一个被取代的氨基酸被替换为具有其他功能性的氨基酸。就本发明而言，天然存在的氨基酸被分成五个功能组，即，具有极性、非极性、酚性、酸性和碱性功能性的氨基酸。相应地，在一个优选的实施方案中，对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)具有至少一个氨基酸的至少一个氨基酸取代，该氨基酸具有极性、非极性、酚性、酸性和碱性五种功能性之一，其存在于植物或微生物来源的野生型冰片脱氢酶(特别是根据SEQ ID No.1的野生型冰片脱氢酶)中，其中被取代的氨基酸被具有其他四种功能性之一的氨基酸替换。本发明优选地设置为，至少一个存在于野生型氨基酸序列(特别是SEQ ID No.1)中的具有五种不同功能性之一的氨基酸被具有其他四种功能性之一的氨基酸所取代。
在特别优选的实施方案中，根据本发明所设置的至少一个氨基酸取代涉及这样的氨基酸：其形成野生型冰片脱氢酶的底物结合位点，特别是根据SEQ ID No.1的野生型冰片脱氢酶，特别是在从Q96至Y188的范围内，特别是选自I18、V92、G94、V95、Q96、R97、H98、S99、L112、N116、F142、G143、S144、E145、S146、G147、L148、T149、G150、E151、I152、D153、N154、G155、L156、Y157、A158、A159、T160、K161、A162、H165、V185、L186、P187、Y188、M189、V190、T191、L201、S202、P203、A205、L206、A207、K214、D216、I217、F223和L230(分别根据SEQ IDNo.1)的氨基酸。这些氨基酸在所给出的位置上特别是定义了冰片脱氢酶的底物结合位点。
在一个优选的实施方案中，根据本发明提供的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)是1R-(+)-樟脑-对映异构体选择性冰片脱氢酶(也被称为(+)-冰片脱氢酶)，其对映选择性地、优选是唯一地将1R-(+)-樟脑-对映异构体转化为(+)-冰片，由此使得将要获得的所期望的对映异构体是1S-(-)-樟脑-对映异构体。在本发明的另一个优选的实施方案中，对映选择性冰片脱氢酶是1S-(-)-樟脑-对映异构体选择性冰片脱氢酶，其对映选择性地、优选唯一地将1S-(-)-樟脑-对映异构体转化为(-)-冰片，由此使得将要获得的所期望的对映异构体是1R-(+)-樟脑-对映异构体。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明，在方法步骤a)中所提供的原料是樟脑外消旋体，或者是具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物。相应地，在一个实施方案中，在方法步骤a)中所提供的原料樟脑可以具有1:1比例的1R-(+)-樟脑和1S-(-)-樟脑。在另一个实施方案中，在方法步骤a)中所提供的原料樟脑可以是两种对映异构体的比例不同于1S-(-)-樟脑与1R-(+)-的1:1比例的混合物，并因此代表具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物。
根据本发明，通过对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，无论是从外消旋樟脑还是从具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物，均可以生产富含樟脑-对映异构体的组合物，其中富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物(即根据本发明可能发生的转化的产物)的优异之处在于1R-(+)-樟脑与1S-(-)-樟脑-对映异构体的比例，该比例不同于所使用的原料，即外消旋樟脑或具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物。根据本发明设置的方法，在方法步骤b)中所使用的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，导致在所用的樟脑中存在的两种对映异构体的物质量的比例会选择性地并且有针对性地改变。由此，一方面可以有利地由外消旋樟脑混合物生产富含樟脑-对映异构体的组合物。另一方面，还可以由具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物来制备富含樟脑-对映异构体的组合物，与在方法步骤a)中使用的具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物相比，该组合物具有1R-(+)-樟脑与1S-(-)-樟脑的不同的物质量比例。
根据本发明，优选地，在方法步骤a)中提供的樟脑是外消旋的。
根据本发明，优选地，在方法步骤a)中提供的樟脑是具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤a)中提供的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)对映选择性地转化1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑。
在一个特别优选的实施方案中，方法步骤a)中所提供的对映选择性冰片脱氢酶是对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其能够对映选择性地转化1R-(+)-樟脑，特别是由此获得富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物。在一个特别优选的实施方案中，方法步骤a)中所提供的对映选择性冰片脱氢酶是对映选择性(-)-冰片脱氢酶，其能够对映选择性地转化1S-(-)-樟脑，特别是由此在方法步骤c)中获得富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物。
根据本发明，优选地，在方法步骤a)中提供的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)是植物或微生物来源的，优选为微生物来源的，或者是合成生产的。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤a)中，除了所提供的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)、反应介质和樟脑之外，还提供了可选的至少一种缓冲体系、可选的至少一种还原性辅助因子(第一底物)以及可选的至少一种再生体系。特别优选地，特别是提供樟脑、反应介质、对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)、缓冲体系、还原性辅助因子和再生体系。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤a)中所提供的反应介质是水溶液，特别是缓冲水溶液，方法步骤b)特别是在缓冲水溶液中进行。就本发明而言，缓冲溶液是包含溶液的缓冲体系。
在一个特别优选的实施方案中，方法步骤b)在存在至少一种缓冲体系的情况下进行，所述缓冲体系例如柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或乙酸-乙酸盐缓冲液。
在一个优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃。
在一个优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质的pH值为pH 2.6至pH 8.0，特别是pH 3.7至pH 6.2，特别是pH 4.0至pH 6.5，特别是pH 4.0至pH 6.0，特别是pH 4.0至pH 5.0，特别是pH 4.5。优选地，pH值在pH 4.0和pH 6.5之间。
在一个特别优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质的温度以及pH值为20℃至45℃和pH 4.0至pH 6.5，特别是25℃至40℃和pH 4.0至pH 6.0，特别是28℃至32℃和pH4.0至pH 5.0，特别是30℃和pH 4.5。
根据本发明，优选地，方法步骤b)中的转化(特别是还原)是在反应介质中存在至少一种还原性辅助因子的情况下进行的，特别是NADH或NADPH，优选为NADH，或者是NADH/NADPH-类似物。
在一个特别优选的实施方案中，方法步骤b)中的转化是在存在再生体系的情况下进行的。该再生体系用于优选所使用的还原性辅助因子的再生。在优选的实施方案中，再生体系用于还原优选用于樟脑转化并在该过程中被氧化的还原性辅助因子。
在一个特别优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质包含还原性辅助因子，特别是在有或没有再生体系的情况下，特别是1至4000mol％，特别是1至3500mol％，特别是1至3000mol％，特别是1至2500mol％，特别是1至2000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子。
在一个优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质在没有再生体系的情况下包含还原性辅助因子，特别是80至4000mol％，特别是80至3500mol％，特别是80至3000mol％，特别是80至2500mol％，特别是80至2000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子。
在一个优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质包含至少一种还原性辅助因子和至少一种再生体系，特别是一种还原性辅助因子和一种再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子。
在一个优选的实施方案中，方法步骤b)中的反应介质包含至少一种还原性辅助因子和至少一种再生体系，该再生体系是电化学再生体系或酶促再生体系。
在一个优选的实施方案中，酶促再生体系包含能够用于还原的酶，特别是能够用于还原第二底物的酶，特别是脱氢酶，特别是糖基脱氢酶或甲酸脱氢酶，特别是葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶；以及第二底物，特别是将要被能够用于还原的酶还原的第二底物。在优选的实施方案中，第二底物特别是糖，特别是单糖，特别是葡萄糖；或者是酸，特别是甲酸。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，并且在有或没有再生体系的情况下包含还原性辅助因子，特别是1至4000mol％，特别是1至3500mol％，特别是1至3000mol％，特别是1至2500mol％，特别是1至2000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的pH值为pH 2.6至pH 8.0，特别是4.0至pH 6.5，特别是pH 4.0至pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是在有或没有再生体系的情况下的还原性辅助因子，特别是1至4000mol％，特别是1至3500mol％，特别是1至3000mol％，特别是1至2500mol％，在特别是1至2000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 6.0，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是在有或没有再生体系的情况下的还原性辅助因子，特别是1至4000mol％，特别是1至3500mol％，特别是1至3000mol％，特别是1至2500mol％，特别是1至2000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是有或没有再生体系情况下的还原性辅助因子，特别是1至4000mol％，特别是1至3500mol％，特别是1至3000mol％，特别是1至2500mol％，特别是1至2000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子，以及至少一种缓冲体系。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；以及作为第二底物的糖，特别是单糖，特别是葡萄糖。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；缓冲体系；和作为第二底物的糖，特别是单糖，特别是葡萄糖。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；以及能够用于还原的酶，特别是能够用于还原第二底物的酶，特别是葡萄糖脱氢酶，特别是当糖(特别是葡萄糖)作为第二底物存在于反应介质中时。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；缓冲体系；以及能够用于还原的酶，特别是能够用于还原第二底物的酶，特别是葡萄糖脱氢酶，特别是当糖(特别是葡萄糖)作为第二底物存在于反应介质中时。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；以及作为第二底物的酸，特别是甲酸。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；缓冲体系；以及作为第二底物的酸，特别是甲酸。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；以及能够用于还原的酶，特别是能够用于还原第二底物的酶，特别是甲酸脱氢酶，特别是当酸(特别是甲酸)作为第二底物存在于反应介质中时。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法步骤b)中的反应介质的温度为20℃至45℃，特别是25℃至40℃，特别是28℃至32℃，特别是30℃，pH值为pH 2.6到pH 8.0，特别是pH 4.0到pH 6.5，特别是pH 4.0到pH 5.0，特别是pH 4.5，并包含还原性辅助因子，特别是还原性辅助因子和再生体系，特别是1至2000mol％，特别是1至1800mol％，特别是1至1500mol％，特别是1至1200mol％，特别是1至1000mol％(基于所用的樟脑)的还原性辅助因子；缓冲体系；以及能够用于还原的酶，特别是能够用于还原第二底物的酶，特别是甲酸脱氢酶，特别是当酸(特别是甲酸)作为第二底物存在于反应介质中时。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤b)中，将在方法步骤a)中所提供的樟脑(特别是外消旋樟脑或具有对映异构体过量的1S-(-)-樟脑或1R-(+)-樟脑的混合物)转化，使得在方法步骤c)中所获得的富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物具有降低至少1％、至少10％、至少20％，至少40％、至少60％、至少80％、至少100％(基于原料中存在的1R-(+)-樟脑的比例)的1R-(+)-樟脑比例。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤b)中，将在方法步骤a)中所提供的樟脑(特别是外消旋樟脑或具有对映异构体过量的1S-(-)-樟脑或1R-(+)-樟脑的混合物)转化，使得在方法步骤c)中所获得的富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物具有降低至少1％、至少10％、至少20％，至少40％、至少60％、至少80％、至少100％(基于原料中存在的1S-(-)-樟脑的比例)的1S-(-)-樟脑比例。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤d)中，通过选择性的化学转化或物理分离方法(特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶)，将在方法步骤c)中所获得的由1R-(+)-樟脑和(-)-冰片组成的混合物或者由(1S)-(-)-樟脑和(+)-冰片组成的混合物分离成至少含樟脑的级分和含冰片的级分。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤e)中，将在方法步骤d)中所获得的(+)-冰片或(-)-冰片转化为1R-(+)-樟脑或(1S)-(-)-樟脑。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤f)中，将由方法步骤a)至c)所获得的富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物或富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物转化为1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸，该方法步骤f)包括以下步骤f1)至f4)：
f1)在有机溶剂(特别是乙酸酐)中，将硫酸添加到富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物中；
f2)在-20℃至22℃(特别是0℃至20℃)的温度下并经过10小时至100小时(特别是30小时至40小时)的时间，转化所获得的混合物；以及
f3)获得1R-(-)-樟脑-10-磺酸和(-)-冰片或者1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物，在此，优选接着进行以下步骤：
f4)通过选择性的化学转化或物理分离方法(特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶)，将所获得的1R-(-)-樟脑-10-磺酸和(-)-冰片或者1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物分离成至少含樟脑-10-磺酸的级分和含冰片的级分。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤g)中，将在方法步骤f4)中所获得的(+)-冰片或(-)-冰片转化为1R-(+)-樟脑或(1S)-(-)-樟脑。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤h)中，将在方法步骤d)、e)、g)中所获得的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑转化为1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸，该方法步骤h)包括以下步骤h1)至h3)：
h1)在有机溶剂(特别是乙酸酐)中，将硫酸添加到1R-(+)樟脑或(1S)-(-)-樟脑中；
h2)在-20℃至22℃(特别是0℃至20℃)的温度下并经过10小时至100小时(特别是30小时至40小时)的时间，转化所获得的混合物；以及
h3)获得1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤f1)或h1)中添加硫酸(特别是浓硫酸)，特别是100至1000mol％，特别是100至800mol％，特别是100至500mol100％，特别是100至300mol％，优选为100mol％(基于所用的樟脑)的硫酸。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤f1)或h1)中使用有机溶剂(特别是乙酸酐)，特别是200至2000mol％，特别是200至1600mol％，特别是200至1000mol％，特别是200至600mol％，优选200mol％(基于所用的樟脑)的有机溶剂(特别是乙酸酐)。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤f1)或h1)中使用硫酸(特别是浓硫酸)，特别是100至1000mol％，特别是100至800mol％，特别是100至500mol％，特别是100至300mol％，优选为100mol％(基于所用的樟脑)的硫酸，以及有机溶剂(特别是乙酸酐)，特别是200至2000mol％，特别是200至1600mol％，特别是200至1000mol％，特别是200至600mol％，优选200mol％(基于所用的樟脑)的有机溶剂(特别是乙酸酐)。
在特别优选的实施方案中，在方法步骤f1)或h1)中，以特别优选的摩尔比1:2:1使用硫酸(特别是浓硫酸)、有机溶剂(特别是乙酸酐)和樟脑。
根据本发明，本发明还涉及一种用于生产1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法，其包括以下方法步骤i1)至i5)：
i1)执行方法步骤a)至c)；
i2)在有机溶剂(特别是乙酸酐)中，将硫酸添加到富含1R-(+)樟脑-对映异构体或富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物中；
i3)在-20℃至22℃(特别是0℃至20℃)的温度下并经过10小时至100小时(特别是30小时至40小时)的时间，转化所获得的混合物；以及
i4)获得1R-(-)-樟脑-10-磺酸和(-)-冰片或者1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物；在此，优选接着进行以下步骤：
i5)通过选择性的化学转化或物理分离方法(特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶)，将所获得的1R-(-)-樟脑-10-磺酸和(-)-冰片或者1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物分离成至少含樟脑-10-磺酸的级分和含冰片的级分。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤j)中，将从方法步骤i5)所获得的(+)-冰片或(-)-冰片转化为1R-(+)樟脑或1S-(-)-樟脑。
根据本发明，本发明还涉及一种用于生产1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法，该方法包括以下方法步骤k1)至k4)：
k1)执行方法步骤a)至d)，或方法步骤a)至e)，或方法步骤a)至g)，或方法步骤a)至j)；
k2)在有机溶剂(特别是乙酸酐)中，将硫酸添加到由方法步骤d)、e)、g)或j)所获得的1R-(+)樟脑或(1S)-(-)-樟脑中；
k3)在-20℃至22℃(特别是0℃至20℃)的温度下并经过10小时至100小时(特别是30小时至40小时)的时间，转化所获得的混合物；以及
k4)获得1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤i2)或k2)中添加硫酸(特别是浓硫酸)，特别是100至1000mol％，特别是100至800mol％，特别是100至500mol％，特别是100至300mol％，优选100mol％(基于所用的樟脑)的硫酸。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤i2)或k2)中使用有机溶剂(特别是乙酸酐)，特别是200至2000mol％，特别是200至1600mol％，特别是200至1000mol％，特别是200至600mol％，优选200mol％(基于所用的樟脑)的有机溶剂(特别是乙酸酐)。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤i2)或k2)中使用硫酸(特别是浓硫酸)，特别是100至1000mol％，特别是100至800mol％，特别是100至500mol％，特别是100至300mol％，优选100mol％(基于所用的樟脑)的硫酸；以及有机溶剂(特别是乙酸酐)，特别是200至2000mol％，特别是200至1600mol％，特别是200至1000mol％，特别是200至600mol％，优选为200mol％(基于所用的樟脑)的有机溶剂(特别是乙酸酐)。
在一个特别优选的实施方案中，在方法步骤i2)或k2)中，以特别优选的摩尔比1:2:1使用硫酸(特别是浓硫酸)、有机溶剂(特别是乙酸酐)和樟脑。
本发明还涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其包含至少一个氨基酸的至少一个氨基酸取代，该氨基酸具有野生型冰片脱氢酶(特别是根据SEQ IDNo.1的野生型冰片脱氢酶)的极性、非极性、酚性、酸性和碱性五种功能性之一，其特征在于，被取代的氨基酸被具有另外四种功能性之一的氨基酸所替换。
因此，根据本发明提供的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)包含野生型冰片脱氢酶(特别是根据SEQ ID No.1的野生型冰片脱氢酶)的氨基酸序列，除了下述情况之外：即，在该野生型序列(特别是根据SEQ ID No.1)中，进行至少一次氨基酸取代，使得所取代的氨基酸(其是极性、非极性、酚性、酸性或碱性氨基酸)被取代为具有与存在于野生型中的氨基酸的功能性不同的功能性的氨基酸。该至少一种氨基酸取代导致野生型冰片脱氢酶失去其不存在的对映选择性并变为对映选择性的。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)包含至少一个氨基酸的氨基酸取代，该氨基酸具有野生型冰片脱氢酶(特别是根据SEQ ID No.1的野生型冰片脱氢酶)的极性、非极性、酚性、酸性和碱性五种功能性之一，其特征在于，被取代的氨基酸被具有另外四种功能性之一的氨基酸(特别是至少一个具有极性和/或非极性功能性之一的氨基酸)所替换。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中至少一个在SEQ ID No.1中被取代的氨基酸选自I18、V92、G94、V95、Q96、R97、H98、S99、L112、N116、F142、G143、S144、E145、S146、G147、L148、T149、G150、E151、I152、D153、N154、G155、L156、Y157、A158、A159、T160、K161、A162、H165、V185、L186、P187、Y188、M189、V190、T191、L201、S202、P203、A205、L206、A207、K214、D216、I217、F223和L230(分别根据SEQ ID No.1)。这些氨基酸在所给出的位置上定义了特别是冰片脱氢酶的底物结合位点。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中至少一个在SEQ ID No.1中被取代的氨基酸选自I18、V95、Q96、R97、H98、S144、E145、S146、E151、I152、D153、N154、Y157、A158、K161、P187、Y188、M189、T191和S202(分别根据SEQ ID No.1)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中至少一个在SEQ ID No.1中被取代的氨基酸选自从Q96至Y188的范围，特别是选自Q96、H98、E145、S146、N154和Y188(分别根据SEQ ID No.1)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中至少一个在SEQ ID No.1中被取代的氨基酸选自Q96、H98、E145、S146、N154和Y188(分别根据SEQ ID No.1)，并且其中氨基酸Q96被R、F、Y、W、K、E、N、L、M取代；H98被F、Y、B、Q、R、K、E、L、M、N取代；E145被M、L、N、I、S、H、K、R、Q、S、Y、W取代；S146被G、A、V、I、L、N、D、E、T取代；N154被L、E、M、E、S、A、K、W、Y、F、Q、R取代；和/或Y188被W、H、R、Q、F、K、E、L、M、N取代。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其具有一个或两个氨基酸取代，其中当存在一个氨基酸取代时，其特别是发生在位置E145、S146或Y188之一处，或者其中当存在两个氨基酸取代时，它们发生在位置S146和Y188或者E145和Y188处(分别根据SEQ ID No.1)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中氨基酸E145被H、M、L、S或G取代(分别根据SEQ ID No.1)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中氨基酸Y188被T、A、V、I或L取代(分别根据SEQ ID No.1)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中氨基酸S146被A取代(SEQ ID No.3)。
在一个优选的实施方案中，在根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)中，氨基酸E145被选自以下的氨基酸取代：G(SEQ ID No.5)、H(SEQ ID No.7)、M(SEQ ID No.9)、L(SEQ ID No.11)、S(SEQ ID No.13)，特别是被S取代。
在一个特别优选的实施方案中，在根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)中，氨基酸Y188被选自以下的氨基酸取代：L(SEQ ID No.15)、I(SEQ IDNo.17)、V(SEQ ID No.19)、T(SEQ ID No.21)、A(SEQ ID No.23)，特别是被A取代。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)具有两个氨基酸取代，其中第一个氨基酸取代是氨基酸E145被选自M、L、S(特别是L)的氨基酸取代，第二个氨基酸取代是氨基酸Y188被选自T、A(特别是T)的氨基酸取代。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)具有两个氨基酸取代，其中第一个氨基酸取代是氨基酸S146被A取代，第二个氨基酸取代是氨基酸Y188被选自T、A(特别是T)的氨基酸取代。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其中冰片脱氢酶具有优选至少10的对映选择性和/或优选至少10％的转化率(基于外消旋樟脑)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的对映异构体比例(E(+))为至少6(E(+))、至少7(E(+))、至少12(E(+))、至少30(E(+))、至少50(E(+))、至少70(E(+))、至少90(E(+))、至少100(E(+))、至少大于100(E(+))。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有一个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的具有一个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的对映异构体比例(E(+))为至少6(E(+))、至少7(E(+))、至少10(E(+))、至少12(E(+))、至少100(E(+))、至少大于100(E(+))。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的对映异构体比例(E(+))为至少30(E(+))、至少40(E(+))、至少60(E(+))、至少70(E(+))、至少90(E(+))，至少100(E(+))，至少大于100(E(+))。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化率为至少2％、至少10％、至少20％、至少30％，至少40％，特别是50％(基于外消旋樟脑)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有一个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的具有一个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化率为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％，特别是50％(基于外消旋樟脑)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化率为至少2％、至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、特别是至少40％(基于外消旋樟脑)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化率和对映异构体比例(E(+))为至少2％和30(E(+))、5％和6(E(+))、至少11％和6(E(+))、至少17％和12(E(+))、至少29％和6(E(+))、至少50％和7(E(+))、至少5％和50(E(+))、至少10％和72(E(+))、至少11％和大于100(E(+))、至少16％和大于100(E(+))、至少22％和大于100(E(+))、至少40％和大于100(E(+))(基于外消旋樟脑的转化)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有一个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的具有一个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化率和对映异构体比例(E(+))为至少5％和6(E(+))、至少8％和6(E(+))、至少11％和6(E(+))、至少29％和6(E(+))、至少50％和7(E(+))、至少17％和12(E(+))、至少22％和大于100(E(+))(+))(基于外消旋樟脑的转化)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明的具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化率和对映异构体比例(E(+))为至少2％和30(E(+))、至少5％和50(E(+))、至少10％和70(E(+))、至少16％和大于100(E(+))、至少39％和大于100(E(+))、至少40％和大于100(E(+))(+))(基于外消旋樟脑的转化)。
在一个特别优选的实施方案中，在根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶中，氨基酸E145被选自G、H、M、L、S的氨基酸取代，其中在特别优选的对映选择性(+)-冰片脱氢酶中，氨基酸E145被S取代，且其具有50％的转化率(基于外消旋樟脑)和至少7(E(+))的对映异构体比例(E(+))。
在一个特别优选的实施方案中，在根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶中，氨基酸Y188被选自L、I、V、T、A的氨基酸取代，其中在特别优选的对映选择性(+)-冰片脱氢酶中，氨基酸Y188被A取代，且其具有至少23％的转化率(基于外消旋樟脑)和大于100(E(+))的对映异构体比例(E(+))。
在一个特别优选的实施方案中，在根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶中，氨基酸S146被A取代，其中根据本发明的其中氨基酸S146被A取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶具有至少为11％的转化率(基于外消旋樟脑)和至少为6.3(E(+))的对映异构体比例(E(+))。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶具有两个氨基酸取代，其中第一个氨基酸取代是氨基酸E145被选自M、L、S的氨基酸取代，第二个氨基酸取代是氨基酸Y188被选自T、A的氨基酸取代，其中根据本发明特别优选地，根据本发明的具有氨基酸E145被L取代和氨基酸Y188被T取代的两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶具有特别优选为至少16％的转化率(基于外消旋樟脑)和特别优选为大于100(E(+))的对映异构体比例(E(+))。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶具有两个氨基酸取代，其中第一个氨基酸取代是氨基酸S146被A的氨基酸取代，第二个氨基酸取代是氨基酸Y188被选自T、A的氨基酸取代，其中根据本发明的具有两个氨基酸取代(特别优选一个氨基酸取代为氨基酸S146被A取代，第二个氨基酸取代为氨基酸Y188被T取代)的对映选择性(+)-冰片脱氢酶具有特别优选为至少40％的转化率(基于外消旋樟脑)和特别优选为大于100(E(+))的对映异构体比例(E(+))。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其具有至少0.14、至少0.28、至少0.5、至少0.8、至少1.0、至少1.28的KM值(分别基于(-)-冰片，以mM为单位)和至多为0.09、至多为0.2、至多为0.33、至多为0.4、至多为0.45的KM值(分别基于(+)-冰片，以mM为单位)。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种对映选择性(+)-冰片脱氢酶，其具有至多为0.70、至多为0.5、至多为0.3、至多为0.2、至多为0.1、至多为0.061的KCat值(基于(-)-冰片，以sec-1为单位)和至少为0.49、至少为0.7、至少为1.0、至少为1.5、至少为1.97、至少为2.5、至少为3.0、至少为3.59的KCat值(基于(+)-冰片，以sec-1为单位)。
本发明还涉及多核苷酸(即多核苷酸分子)，特别是多核苷酸序列，特别是DNA序列，其编码根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)。
根据本发明的多核苷酸还可以附加地，优选在编码根据本发明的冰片脱氢酶的DNA序列的阅读框中，包含另外的DNA序列，其编码例如信号肽，特别是分泌信号。这种附加的DNA序列还可以编码允许或促进根据本发明的冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的纯化的氨基酸或氨基酸序列。
本发明还涉及含有根据本发明的多核苷酸(特别是多核苷酸序列)的载体，特别是质粒。
在一个特别优选的实施方案中，除了根据本发明的多核苷酸之外，载体还可以包含其他的结构性和/或功能性单元，例如调节性元件，例如启动子(Promotor)、增强子(Enhancer)、终止子(Terminator)，或其他的功能性单元，例如抗性基因(Resistenzgene)或连接物(Linker)。
本发明还涉及含有根据本发明的载体(特别是质粒)的宿主细胞。
在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞可以是真核或原核宿主细胞。在一个特别优选的实施方案中，原核宿主细胞可以是细菌宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。在一个特别优选的实施方案中，真核宿主细胞可以是动物细胞、植物细胞或真菌细胞。
本发明还涉及一种用于生产根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的方法，该方法包括以下方法步骤：
l)提供根据本发明的宿主细胞；
m)在能够表达根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的条件下，在培养基中培养在方法步骤l)中所提供的宿主细胞；以及
n)获得在方法步骤m)中表达的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，宿主细胞和培养基以及能够表达根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的条件使得能够实现：对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)由宿主细胞分泌并在培养基中获得，由此可以通过惯用的方法将其分离。
在另一个优选的实施方案中，宿主细胞和培养基以及用于表达根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的条件使得能够实现：冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)被保留在细胞内，并通过后续的裂解宿主细胞的方法步骤(例如使用压力或剪切力的方法、通过洗涤剂溶解、渗透压休克、超声波、电裂解方法或其他的常规方法)来释放，然后在步骤n)中获得，特别是可以分离。
就本发明而言，术语“获得物质或组合物”应理解为，在前面的方法步骤中通过转化从反应物中所获得的物质或组合物，可从各自的培养基或反应介质或溶剂中获得，特别是从中分离，因此，特别是将获得组合物理解为对所期望的组合物或物质的浓缩(特别是分离)。为此所使用的方法可以是物理的、化学的方法或生物的方法。
就本发明而言，具有酸性功能性的氨基酸是指选自天门冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的氨基酸。
就本发明而言，具有碱性功能性的氨基酸是指选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)和焦赖氨酸(O)的氨基酸。
就本发明而言，具有极性功能性的氨基酸是指选自丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、硒代半胱氨酸(U)、苏氨酸(T)、天门冬酰氨(N)和谷氨酰胺(Q)的氨基酸。
就本发明而言，具有非极性功能性的氨基酸是指选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)和甲硫氨酸(M)的非极性氨基酸。
就本发明而言，具有酚性功能性的氨基酸是指氨基酸酪氨酸(Y)。
就本发明而言，由所期望的对映异构体1和非期望的对映异构体2组成的对映异构体组合物的“对映异构体富含”或“对映异构体过量”是指对映异构体组合物的所期望的对映异构体1的相对比例，并通过下式计算：
其中ee是对映异构体的相对比例，m1是所期望的对映异构体1的质量比例，m2是不期望的对映异构体2的质量比例。根据本发明，ee≥0.99的组合物被认为是特别优选的，并且作为所期望的对映异构体的近似于对映异构体纯的组合物。
就本发明而言，“所期望的对映异构体”是指优选不被冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)转化的对映异构体，而“不期望的对映异构体”是指优选被冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)转化的对映异构体。
在一个优选的实施方案中，所期望的对映异构体是1R-(+)-樟脑-对映异构体。在另一个优选的实施方案中，所期望的对映异构体是1S-(-)-樟脑-对映异构体。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明所提供的对映选择性冰片脱氢酶是(+)-冰片脱氢酶，因此所期望的对映异构体是1S-(-)-樟脑-对映异构体。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明所提供的对映选择性冰片脱氢酶是(-)-冰片脱氢酶，因此所期望的对映异构体是1R-(+)-樟脑-对映异构体。
就本发明而言，“ees”是指，基于经转化的组合物中的所期望的对映异构体和不期望的对映异构体，不期望的对映异构体在经转化的组合物中的相对比例。根据本发明，优选的是ees≥0.99，因为此时几乎所有不期望的对映异构体已经被转化，并且所期望的对映异构体几乎完全(特别是完全)存在于转化的组合物中。
就本发明而言，“eep”是指，基于经转化的组合物中的所期望的对映异构体和不期望的对映异构体，所期望的对映异构体在经转化的组合物中的相对比例。根据本发明，优选的是eep≥0.99，因为此时几乎所有不期望的对映异构体已经被转化，并且所期望的对映异构体几乎完全(特别是完全)存在于转化的组合物中。
就本发明而言，“转化率”通过下式计算：
转化率＝ees/(ees+eep)
就本发明而言，“对映异构体比例”是指通过酶促外消旋体拆分形成的化合物中的对映异构体比例。
就本发明而言，“对映异构体比例”通过下式计算：
E＝ln((eep*(1-ees))/(eep+ees))/ln((eep*(1+ees))/(eep+ees))
其中E是对映异构体比例；ees是基于经转化的组合物中的所期望的对映异构体和不期望的对映异构体，不期望的对映异构体在经转化的组合物中的相对比例；eep是基于经转化的组合物中的所期望的对映异构体和不期望的对映异构体，所期望的对映异构体在经转化的组合物中的相对比例。
根据本发明，优选地，E≥100，因为此时所期望的对映异构体唯一地或几乎唯一地存在于经转化的组合物中。
就本发明而言，有关对映异构体比例(E)和转化率的信息(Angaben)涉及能够用于转化樟脑的根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶，特别是E(+)和相应的基于根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的转化，其特别有利地能够将1R-(+)-樟脑转化为(+)-冰片；以及特别是E(-)和相应的基于根据本发明的对映选择性(-)-冰片脱氢酶的转化，其特别有地能够将1S-(-)-樟脑转化为(-)-冰片。
在一个特别优选的实施方案中，在允许樟脑还原的反应混合物中，确定对映异构体比例E(+)或E(-)以及相应的(+)-或(-)-冰片脱氢酶的相应转化率，特别是根据在实施例2、特别是实施例2e)中所给出的方法来确定。
就本发明而言，“樟脑”是指外消旋樟脑混合物和包含对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的樟脑混合物。
就本发明而言，“外消旋樟脑”和/或“外消旋樟脑混合物”和/或“樟脑外消旋体”是指由不同的化学对映异构体樟脑化合物，特别是两种樟脑化合物组成的组合物，它们以彼此之间等摩尔比的方式存在，特别是以1:1的摩尔比存在。
就本发明而言，“化合物”是指一个分子或多个相同的分子。
就本发明而言，“手性的”和/或“手性”是指不能与其镜像重叠的化合物。
就本发明而言，“对映异构体”是指具有相同结构的至少两种手性化合物，其中该至少两种手性化合物表现为像和镜像。
就本发明而言，“具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物”是指具有非等摩尔比的樟脑-对映异构体的混合物。
就本发明而言，具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物是在根据本发明的组合物中，在方法步骤b)中用于根据本发明的外消旋体拆分的原料。
就本发明而言，具有对映异构体过量的1R-(+)-樟脑的混合物是相对于1至49mol％1S-(-)-樟脑而含有99至51mol％1R-(+)-樟脑的混合物(基于两种樟脑-对映异构体)。
就本发明而言，具有对映异构体过量的1S-(-)-樟脑的混合物是相对于1至49mol％1R-(+)-樟脑而含有99至51mol％1S-(-)-樟脑的混合物(基于两种樟脑-对映异构体)。
就本发明而言，在一个优选的实施方案中，具有对映异构体过量的1S-(-)-樟脑或1R-(+)-樟脑的混合物是其中存在至多10mol％、至多5mol％、至多1mol％、至多0.5mol％、至多0.1mol％(基于混合物)的冰片(特别是不存在冰片对映异构体)的混合物。
就本发明而言，富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物或富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物是在方法步骤b)中根据本发明的外消旋体拆分的产物。
就本发明而言，富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物是在方法步骤b)中根据本发明的外消旋体拆分(特别是通过对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶))的产物。
就本发明而言，在一个特别优选的实施方案中，“富含1R-(+)-樟脑-对映异构体的组合物”是指这样的组合物：其在利用对映选择性冰片脱氢酶转化之后的1R-(+)-樟脑-对映异构体相对于1S-(-)-樟脑-对映异构体的比例高于用于利用对映选择性冰片脱氢酶进行转化的原料(即樟脑)中的比例。
就本发明而言，“富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物”是指这样的组合物：其在利用对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)转化之后的1S-(-)-樟脑-对映异构体相对于1R-(+)-樟脑-对映异构体的比例高于用于利用对映选择性冰片脱氢酶进行转化的原料(即樟脑)中的比例。
就本发明而言，在特别优选的实施方案中，“富含1R-(+)-樟脑-对映异构体或1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物”是指含有1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑(特别是1S-(-)-樟脑)的组合物，其中两种对映异构体不是等摩尔地存在，即，不是以1:1摩尔比存在，特别是仅含有1S-(-)-樟脑或1R-(+)-樟脑。
就本发明而言，“富含樟脑对映异构体的组合物”是指含有1至99mol％樟脑对映异构体和99至1mol％冰片对映异构体的组合物(基于富含对映异构体的组合物中的所有樟脑对映异构体和冰片对映异构体)。
就本发明而言，“富含1R-(+)樟脑-对映异构体或(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物”也是指富含1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的组合物，其含有(特别是主要含有)两种已知的对映异构体化合物，特别是含有至少50％，特别是至少60％，特别是至少70％，特别是至少80％，特别是至少90％，特别是至少95％，特别是至少99％(基于对映异构体化合物的干物质质量相对于组合物的干物质质量)，特别是由对映异构体化合物组成。
就本发明而言，“对映选择性”是指两种对映异构体在转化过程中的反应速度比例。因此，高的对映选择性代表了一种对映异构体相对于另一种对映异构体优先转化，特别是更快转化。
就本发明而言，“对映选择性冰片脱氢酶”是指根据本发明的冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)，其对映选择性地转化樟脑(特别是1R-(+)-樟脑)，以及在可选的实施方案中的所有如下所述的酶：其在能够还原樟脑的反应混合物中，特别是在根据实施例2(特别是实施例2e))的条件下会导致可比较的对映异构体比例和/或转化率，优选对映异构体比例为6.0(E(+))、特别是7.0(E(+))、特别是12.1(E(+))、特别是30.5(E(+))、特别是72.6(E(+))、特别是大于100(E(+))，或者转化率和对映异构体比例为大于2％和30.5(E(+))，特别是大于5％和6(E(+))，特别是大于17％和12.1(E(+))，特别是大于10％和72.6(E(+))，特别是大于11％和大于100(E(+))(基于外消旋樟脑)，特别是基于在相同反应条件下所使用的根据本发明的冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶，其具有序列号SEQ ID No.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39其中之一)的对映异构体比例和/或转化率。
就本发明而言，“对映选择性(+)-冰片脱氢酶”是指这样的对映选择性冰片脱氢酶：其对映选择性地(优选唯一地)将1R-(+)-樟脑-对映异构体转化为(+)-冰片。
就本发明而言，“对映选择性(-)-冰片脱氢酶”是指这样的对映选择性冰片脱氢酶：其对映选择性地(优选唯一地)将1S-(-)-樟脑-对映异构体转化为(-)-冰片。
就本发明而言，缩写“NAD”是指烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸。就本发明而言，“NADH”是指NAD的还原形式。就本发明而言，缩写“NADP”是指烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸-磷酸酯。就本发明而言，“NADPH”是指NADP的还原形式。
就本发明而言，“NADH/NADPH-类似物”是指例如硫代烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸(S-NAD)、烟酸-腺嘌呤-二核苷酸(O-NAD)、烟酰胺-次黄嘌呤-二核苷酸(NHD)、烟酰胺-鸟嘌呤-二核苷酸这样的化合物，或者其他具有与NADH和/或NADPH相似(优选相同)的活性的化合物。
就本发明而言，在方法步骤a)中可选地提供的“还原性辅助因子”也被称为第一底物。
就本发明而言，“再生体系”是指用于回收还原性辅助因子(特别是用于还原被氧化的辅助因子)的体系。
就本发明而言，“再生体系”是指这样的体系：其具有能够用于还原的酶，特别是能够用于还原第二底物的酶，特别是脱氢酶，特别是糖基脱氢酶或甲酸脱氢酶，特别是葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶；以及第二底物，特别是将要被能够用于还原的酶还原的第二底物，特别是糖，特别是单糖(例如葡萄糖)或酸(特别是甲酸)。
就本发明而言，以单字母代码表示的氨基酸的所有位置信息均基于来自恶臭假单胞菌(ATCC17453)的野生型冰片脱氢酶的氨基酸序列，正如其在SEQ ID No.1中所给出的那样。
就本发明而言，根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的特定突变体是通过以单字母代码表示的在SEQ ID No.1中所取代的氨基酸的信息，后跟被取代的氨基酸所处的基于SEQ ID No.1的位置信息，和随后的以单字母代码表示的用于替换所取代的氨基酸且具有另一种功能性的氨基酸。例如，标记S146A表示：在具有野生型冰片脱氢酶序列的SEQ ID No.1中，位于位置146的氨基酸S被具有不同功能性的氨基酸(也就是A)取代。
在一个优选的实施方案中，方法步骤a)中所提供的对映选择性冰片脱氢酶对映选择性地转化1R-(+)-樟脑。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤d)中，通过选择性的化学转化或物理分离方法(特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶)，将在方法步骤c)中所获得的1S-(-)-樟脑和(+)-冰片的混合物分离成至少含樟脑的级分和含冰片的级分。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤e)中，将在方法步骤d)中所获得的(+)-冰片转化为1R-(+)樟脑。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤f)中，将由方法步骤a)至c)所获得的富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物转化为1S-(+)-樟脑-10-磺酸，该方法步骤f)包括以下步骤f1)至f4)：
f1)在有机溶剂(特别是乙酸酐)中，将硫酸添加到富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物中；
f2)在-20℃至22℃(特别是0℃至20℃)的温度下并经过10小时至100小时(特别是30小时至40小时)的时间，转化所获得的混合物；以及
f3)获得1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物；在此，优选接着进行以下步骤：
f4)通过选择性的化学转化或物理分离方法(特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶)，将所获得的1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物分离成至少含樟脑-10-磺酸的级分和含冰片的级分。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤g)中，将在方法步骤f4)中所获得的(+)-冰片转化为1R-(+)樟脑。
本发明还涉及一种生产1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法，其包括以下方法步骤i1)至i5)：
i1)执行根据权利要求1的方法步骤a)至c)的方法步骤；
i2)在有机溶剂(特别是乙酸酐)中，将硫酸添加到富含(1S)-(-)-樟脑对映异构体的组合物中；
i3)在-20℃至22℃(特别是0℃至20℃)的温度下并经过10小时至100小时(特别是30小时至40小时)的时间，转化所获得的混合物；以及
i4)获得1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物；在此，优选接着进行以下步骤：
i5)通过选择性的化学转化或物理分离方法(特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶)，将所获得的1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物分离成至少含樟脑-10-磺酸的级分和含冰片的级分。
在一个优选的实施方案中，在方法步骤j)中，将从方法步骤i5)中所获得的(+)-冰片转化为1R-(+)樟脑。
本发明的其他优选的实施方案由从属权利要求给出。
下面将参照实施例对本发明进行详细说明，但不应将其理解为限制性的。序列表说明：
SEQ ID No.1描述了来自恶臭假单胞菌(ATCC17453)的野生型冰片脱氢酶的氨基酸序列，SEQ ID No.2描述了相关的DNA序列。恶臭假单胞菌(ATCC17453)具有冰片脱氢酶，特别是(+)-冰片脱氢酶，其中根据本发明克隆的冰片脱氢酶基因编码了260个氨基酸的多肽链，其优选具有27.5kDa的质量和5.35的pI。
SEQ ID No.3描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸S146被A取代(S146A)，并且SEQ ID No.4描述了相关的DNA序列。SEQ IDNo.5描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸E145被G取代(E145G)，并且SEQ ID No.6描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.7描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸E145被H取代(E145H)，并且SEQ ID No.8描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.9描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸E145被M取代(E145M)，并且SEQID No.10描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.11描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸E145被L取代(E145L)，并且SEQ ID No.12描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.13描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸E145被S取代(E145S)，并且SEQ ID No.14描述了相关的DNA序列。SEQID No.15描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸Y188被L取代(Y188L)，并且SEQ ID No.16描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.17描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸Y188被I取代(Y188I)，并且SEQ ID No.18描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.19描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸Y188被V取代(Y188V)，并且SEQID No.20描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.21描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸Y188被T取代(Y188T)，并且SEQ ID No.22描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.23描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其中氨基酸Y188被A取代(Y188A)，并且SEQ ID No.24描述了相关的DNA序列。SEQID No.25描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸E145被M取代(E145M)且氨基酸Y188被A取代(Y188A)，并且SEQ IDNo.26描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.27描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸E145被M取代(E145M)且氨基酸Y188被T取代(Y188T)，并且SEQ ID No.28描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.29描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸E145被L取代(E145L)且氨基酸Y188被T取代(Y188T)，并且SEQ ID No.30描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.31描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸E145被L取代(E145L)且氨基酸Y188被A取代(Y188A)，并且SEQ ID No.32描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.33描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸E145被S取代(E145S)且氨基酸Y188被T取代(Y188T)，并且SEQ ID No.34描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.35描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸E145被S取代(E145S)且氨基酸Y188被A取代(Y188A)，并且SEQ ID No.36描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.37描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸S146被A取代(S146A)且氨基酸Y188被T取代(Y188T)，并且SEQ ID No.38描述了相关的DNA序列。SEQ ID No.39描述了对映选择性冰片脱氢酶(特别是(+)-冰片脱氢酶)的氨基酸序列，其具有两个氨基酸取代：氨基酸S146被A取代(S146A)且氨基酸Y188被A取代(Y188A)，并且SEQ ID No.40描述了相关的DNA序列。SEQID No.41描述了载体的DNA序列。SEQ ID No.42描述了用于反应的引物(Primer)的DNA序列。SEQ ID No.43描述了引物的His标记的变体的DNA序列。
附图说明
附图示出了：
图1示意性示出了通过根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶对樟脑进行的根据本发明的酶促外消旋体拆分，其中在上部的反应中，外消旋樟脑通过对映选择性(+)-冰片脱氢酶被拆分；在下部的反应中，外消旋樟脑通过对映选择性(-)-冰片脱氢酶被拆分，
图2示意性地示出了根据本发明的外消旋体拆分和磺化的方法步骤，和
图3示出了使用以下缩写的根据本发明的载体的图谱：
BDH：冰片脱氢酶
MCS：多克隆位点
ori：复制起点
f1 origin：复制起点
Kan：卡那霉素抗性基因
lacI：用于lac阻遏子的基因
rop：用于rop蛋白的基因
具体实施方式
实施例
实施例1：根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶的生产
a)克隆
在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上，在30℃下培养恶臭假单胞菌(ATCC17453)。选择单个克隆并转移至10μl Aquadest(蒸馏水)中，并用作DNA模板(Matrize)。用于BDH基因扩增的PCR条件为在98℃下进行DNA变性5分钟，在98℃下进行25次变性循环10秒，在61℃下进行引物退火20秒，并且在72℃下进行链延伸30秒。最后在72℃下孵育10分钟的步骤在使用Phusion DNA聚合酶的情况下结束反应。
以下一对寡核苷酸用于反应：
5-GATCCCATGGATGAAACCGCTAGCAGG-3和
5-GATAGCGGCCGCTCAACCAGACAATCGATTG-3(SEQ ID No.42)。
以下引物用于生成His标记的变体：
5-TTGGTCTCGGATGCACCACCACCACCACCACAAACCGCTAGCAGGTAAAAG-3和5-GATAGCGGCCGCTCAACCAGACAATCGATTG-3(SEQ ID No.43)。
PCR产物通过NcoI或BsaI和NotI来消化，然后在用相同限制酶消化的pET28a中克隆。然后对所有构建体进行测序。
b)诱变(方法步骤l))
野生型酶通过在Q96、H98、E145、S146、N154和Y188位置处的定点诱变而改变。用于诱变的引物如所述地设计(Edelheit et al.,BMC Biotechnol.,9,2009,61)。PCR条件为在95℃下进行DNA变性2分钟，在95℃下进行16次变性循环45秒，在55℃下进行引物退火30秒，在72℃下进行链延伸12分钟。最后在72℃下孵育10分钟的步骤在使用Pfu DNA聚合酶的情况下结束反应。然后在反应混合物中添加1μl DpnI并在37℃下孵育2小时，然后在大肠杆菌DH10B中进行连接和转化。根据本发明的氨基酸取代如下表1所示进行。
表1：所选择的用于定点诱变的氨基酸取代。
Q96：R、F、Y、W、K、E、N、L、M。
H98：F、Y、W、Q、R、K、E、L、M、N。
E145：M、L、N、I、S、H、K、R、Q、F、Y、W、G。
S146：G、A、V、I、L、N、D、E、T。
N154：L、I、M、E、S、H、K、W、Y、F、Q、R。
Y188：W、H、R、Q、F、K、E、L、M、N。
c)酶生产(方法步骤m))
利用载体pET28a冰片脱氢酶(根据图3的载体)，通过电穿孔转化大肠杆菌BL21(DE3)。将转化溶液涂在含有100μg/ml卡那霉素的LB琼脂上，并在37℃下孵育过夜。然后将单个菌落转移到含有100μg/ml卡那霉素的50ml LB培养基中，并在37℃下振荡(140U/min)孵育过夜。从该预培养物中接种主培养物并调整至0.2的光密度(600nm)。在140U/min和37℃下，将主培养物在含有100μg/ml卡那霉素的200ml LB中孵育，直到达到0.6的光密度。然后添加1mM IPTG。然后在140U/min和16℃下进行蛋白质表达过夜。将培养物在3500×g下离心，并将细胞沉淀(Zellpellet)用于酶纯化。
d)酶纯化(方法步骤n))
所有纯化步骤均在4℃下进行。将细胞沉淀重新悬浮在含有50mM磷酸钾缓冲液、pH8.0、20mM咪唑和0.5M氯化钠的缓冲液A中。然后在法式细胞破碎器(French-Presse)中在1350bar下破碎细胞。在以30.000×g离心30分钟后，引导含有BDH的可溶性级分通过0.2μm无菌过滤器，然后装载到1ml HisTrap FF-Ror-1ml-柱上。该柱事先用缓冲液A平衡。用pH7.5的50mM磷酸钾缓冲液、50mM咪唑和0.5M氯化钠洗涤柱，然后用pH 7.5的50mM磷酸钾缓冲液、300mM咪唑和0.5M氯化钠洗脱BDH酶。将BDH级分合并，并使用HiPrep 26/10脱盐柱和pH7.5的50mM磷酸钾缓冲液进行脱盐。蛋白质可以在4℃下存储至少1周而活性仅有轻微损失。
实施例2：根据本发明的对映选择性(+)-BDH的活性研究
a)分析方法
在利用含有1mM己基苯作为内标的等量的乙酸乙酯从试验中提取产物后，对分析产物进行分析。使用连接有MS检测器(单四极杆)的Shimadzu GCMS Model 2010Q Plus进行GC分析。在FS-HYDRODEXβ-6TBD毛细管柱(25m×0.25mm)上进行色谱分离。在250℃下注入1.0μl样品(分流-不分流进样器)。烘箱温度在60℃保持8分钟，然后以2.0℃/分钟的升温速率升至150℃，再以45℃/分钟的升温速率升至200℃并保持两分钟。柱内流速为1.9ml/分钟(载气：氦气)。产物是通过将它们的保留时间和质谱与真实标准品进行比较来确定的。
b)酶活性(从冰片到樟脑的对映选择性氧化)
氧化反应混合物包含30μg酶、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM NAD+和1mM底物(30℃)。通过添加酶开始反应。还原反应混合物包含500μg酶、50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.0)、1mM NADH和1mM底物(30℃)，用于酶分析。为了筛选所操作的酶变体，还添加了12.5mM甲酸和1mg甲酸脱氢酶。通过添加BDH酶开始反应。为了确定最适合的pH，将酶在适当的缓冲液中脱盐，并按所述的那样测量活性。通过在反应之前和反应期间在适当温度下孵育测试溶液来确定最佳温度。动力学分析在最佳pH和温度条件(pH 5.0和30℃)下进行。在存在1mM底物和0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mM辅助因子的情况下测定NAD+的Km和Kcat。在存在1mM NAD+和0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1和2mM底物的情况下测定用于(+)-冰片和(-)-冰片的NAD+的Km和Kcat。使用SigmaPlot v13.0酶动力学模块进行数据分析。
c)外消旋体拆分(从樟脑到冰片的对映选择性还原)(方法步骤a)至c))
反应混合物含有50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)、500μg BDH、12.5mM葡萄糖、17U/ml葡萄糖脱氢酶、0.05mM NADH和2mM樟脑外消旋体。通过添加BDH开始反应。混合物在30℃下振荡孵育。135分钟后，1R-(+)-樟脑完全转化。
d)(+)-冰片脱氢酶活性的验证
采用分光光度法来验证冰片脱氢酶的活性。通过添加NAD+引发反应。氧化反应混合物包含30μg酶、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM NAD+和1mM底物(30℃)。通过添加酶开始反应，并在340nm处用光度计跟踪NADH形成速率。
e)测定(+)-BDH酶的樟脑还原酶活性
还原反应混合物包含500μg酶、50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)、1mM NADH和1mM底物(30℃)，用于酶分析。为了筛选所操作的酶变体，还添加了12.5mM甲酸和1mg甲酸脱氢酶。添加冰片脱氢酶开始反应，孵育24小时。
表2：樟脑的动力学外消旋体拆分，通过野生型冰片脱氢酶以及根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶来催化。
在表2中示出了根据方法步骤a)至c)，在使用野生型冰片脱氢酶以及根据本发明的具有以下氨基酸取代的(+)-冰片脱氢酶的情况下，根据本发明的外消旋体拆分的结果：氨基酸S146被A取代，或者氨基酸E145被选自G、H、M、L和S的氨基酸取代，或者氨基酸Y188被选自L、I、V、T和A的氨基酸取代。可以看到根据实施例2c)和e)确定并各自相关的对映异构体富集率ees和eep、转化率(基于外消旋樟脑)和(+)对映异构体比例E(+)。在此，野生型冰片脱氢酶的转化率为27％，(+)-对映异构体比例1.7(E(+))。还显示了11种根据本发明的具有氨基酸取代的(+)-冰片脱氢酶的实验结果，其具有至少5％和至少6(E(+))的转化率和(+)-对映异构体比例。因此，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶具有显著的转化率和显著的(+)-对映选择性。与野生型相比，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶BDH_E145M、BDH_E145L、BDH_E145S具有增加的转化率，同时具有突出的(+)-对映选择性。与野生型相比，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶BDH_Y188V、BDH_Y188T、BDH_Y188A，特别是BDH_Y188T和BDH_Y188A，具有显著的转化率和明显增加的(+)-对映选择性。相应地，根据本发明的具有氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶在任何情况下与野生型冰片脱氢酶相比均具有增加的(+)-对映异构体比例，从至少6(E(+))至超过100(E(+))。
表3：樟脑的动力学外消旋体拆分，通过野生型冰片脱氢酶以及根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶来催化。
在表3中示出了根据方法步骤a)至c)，在使用根据本发明的冰片脱氢酶的野生型以及根据本发明的具有以下两个氨基酸取代的(+)-冰片脱氢酶的情况下，根据本发明的外消旋体拆分的结果：氨基酸E145被选自M、L和S的氨基酸取代且氨基酸Y188被选自T和A的氨基酸取代，或者氨基酸S146被A取代且氨基酸Y188被选自T和A的氨基酸取代。可以看到根据实施例2c)和e)确定并各自相关的对映异构体富集率ees和eep、转化率(基于外消旋樟脑)和(+)-对映异构体比例E(+)。在此，野生型冰片脱氢酶的转化率为27％，(+)-对映异构体比例为1.7(E(+))。还显示了8种根据本发明的具有两个氨基酸取代的(+)-冰片脱氢酶的实验结果，其具有至少2％和至少30.5(E(+))的转化率和(+)-对映异构体比例。因此，根据本发明的对映选择性冰片脱氢酶具有转化率(特别是显著的转化率)和显著的(+)-对映选择性。与野生型相比，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶BDH_E145M/Y188T、BDH_E145M/Y188A、BDH_E145L/Y188T、BDH_E145L/Y188A、BDH_E145S/Y188T具有明显增加的(+)-对映选择性。与野生型相比，根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶BDH_S146A/Y188T和BDH_S146A/Y188A具有明显增加的转化率和明显增加的(+)-对映选择性。相应地，根据本发明的具有两个氨基酸取代的对映选择性(+)-冰片脱氢酶在任何情况下与野生型冰片脱氢酶相比均具有增加的(+)对映异构体比例，从至少30.5(E(+))至超过100(E(+))。
表4：非对映选择性野生型的和根据本发明的对映选择性(+)-冰片脱氢酶BDH_S146A/Y188T和BDH_S146A/Y188A的动力学分析。
Km＝米氏常数，
KCat＝速率决定步骤的速率常数，
mM＝毫摩尔浓度，
sec-1＝1/秒
在表4中示出了野生型冰片脱氢酶和根据本发明的两个特别优选的、具有氨基酸S146被A取代且氨基酸Y188被T取代以及氨基酸S146被A取代且氨基酸Y188被A取代的两个氨基酸取代的(+)-冰片脱氢酶的动力学酶分析的结果。可以看到根据实施例2b)确定的各个米氏常数Km和反应速率KCat。在此，野生型具有基于(-)-冰片的Km 0.13和基于(+)-冰片的Km 0.08以及基于(-)-冰片的KCat 0.705和基于(+)-冰片的KCat 0.488。根据本发明的这两个特别优选的、具有氨基酸S146被A取代且氨基酸Y188被T取代以及氨基酸S146被A取代且氨基酸Y188被A取代的两个氨基酸取代的(+)-冰片脱氢酶具有基于(-)-冰片的Km 0.28和1.28，和基于(+)-冰片的Km 0.33和0.45，以及基于(-)-冰片的KCat 0.061和0.148，和基于(+)-冰片的KCat 1.97和3.59，并因此显示了针对(+)-冰片对映异构体的氧化更高的对映选择性。
序列表
<110> 弗劳恩霍夫应用研究促进协会（FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNGDER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V.）
<120> 樟脑的酶促外消旋体拆分方法
<130> 111614
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 1
Met Lys Pro Leu Ala Gly Lys Arg Ile Ile Val Thr Gly Gly Ala Gln
1 5 10 15
Gly Ile Gly Ala Ser Val Val Arg Ala Tyr Leu Ala Ala Gly Ala Thr
20 25 30
Val Val Ser Met Asp Met Asn Asp Lys Leu Gly Gln Gln Val Val Ser
35 40 45
Glu Ala Ile Glu Lys His Pro Asp Cys Ser Ala Arg Tyr Cys His Cys
50 55 60
Asp Ile Thr Asp Arg Thr Ala Val Glu Lys Val Phe Ala Ala Ala Thr
65 70 75 80
Trp Asp Met Gly Gly Leu Asp Val Met Val Asn Val Ala Gly Val Gln
85 90 95
Arg His Ser Ser Pro Asp Ala Ile Ser Glu Asp Leu Phe Asp Leu Leu
100 105 110
Phe Arg Val Asn Val Leu Gly Thr Met Asn Thr Asn Gly Val Ala Tyr
115 120 125
Ser Leu Met Lys Ser Gln Gly Thr Gly Asn Ile Ile Asn Phe Gly Ser
130 135 140
Glu Ser Gly Leu Thr Gly Glu Ile Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Ala Thr
145 150 155 160
Lys Ala Ala Val His Thr Trp Thr Arg Asn Val Ala Arg Gln Trp Gly
165 170 175
Pro Asp Gly Ile Arg Ile Asn Ala Val Leu Pro Tyr Met Val Thr Pro
180 185 190
Met Tyr Val Asp Phe Arg Asn Ala Leu Ser Pro Glu Ala Leu Ala Ser
195 200 205
His Asp Ala Ala Thr Lys Ala Asp Ile Pro Leu Gly Gly Lys Phe Gly
210 215 220
Asp Val Asp Lys Asp Leu Ala Pro Val Met Val Phe Leu Ala Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ser His Phe Ile Thr Gly Gln Met Phe Pro Val Asp Gly Gly Leu
245 250 255
Ile Ala Val Arg
260
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 2
atgaaaccgc tagcaggtaa aagaatcatc gtcactggtg gagcacaggg tatcggagcg 60
tcagtcgtgc gcgcctacct ggccgcgggc gcaactgtag tgtcaatgga catgaacgac 120
aaactggggc aacaggtcgt ctccgaggcc attgagaaac accccgactg cagcgcccgc 180
tactgccatt gcgacattac tgatcgcact gcagtggaaa aggttttcgc cgcggcgacc 240
tgggacatgg gcggcctgga cgtcatggtc aacgtagcgg gtgtacagcg ccatagctct 300
ccagacgcca tatcggaaga tctgttcgac ttactgttcc gcgtcaacgt actaggcacc 360
atgaacacca acggcgtggc ctattcgctg atgaaatccc agggcacagg caatatcatc 420
aacttcggct ccgaatcggg cttaacaggc gagatcgaca acggcctata tgccgcaacc 480
aaggccgcgg tacatacctg gactcgcaat gtggctcgcc aatggggccc tgacggcatc 540
cgcatcaatg ccgttctgcc ctacatggtc acccctatgt acgtcgactt ccgcaatgcc 600
ctgtcaccag aagcgcttgc ctcccatgac gccgccacca aggccgacat accgctaggc 660
ggaaaatttg gcgatgtcga caaggacttg gcaccagtga tggtcttcct cgccagcgac 720
gcctcccact tcatcaccgg ccagatgttc ccggtagacg gtgggcttat tgcggtgcga 780
tga 783
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35 40 45
Glu Ala Ile Glu Lys His Pro Asp Cys Ser Ala Arg Tyr Cys His Cys
50 55 60
Asp Ile Thr Asp Arg Thr Ala Val Glu Lys Val Phe Ala Ala Ala Thr
65 70 75 80
Trp Asp Met Gly Gly Leu Asp Val Met Val Asn Val Ala Gly Val Gln
85 90 95
Arg His Ser Ser Pro Asp Ala Ile Ser Glu Asp Leu Phe Asp Leu Leu
100 105 110
Phe Arg Val Asn Val Leu Gly Thr Met Asn Thr Asn Gly Val Ala Tyr
115 120 125
Ser Leu Met Lys Ser Gln Gly Thr Gly Asn Ile Ile Asn Phe Gly Ser
130 135 140
Ser Ser Gly Leu Thr Gly Glu Ile Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Ala Thr
145 150 155 160
Lys Ala Ala Val His Thr Trp Thr Arg Asn Val Ala Arg Gln Trp Gly
165 170 175
Pro Asp Gly Ile Arg Ile Asn Ala Val Leu Pro Ala Met Val Thr Pro
180 185 190
Met Tyr Val Asp Phe Arg Asn Ala Leu Ser Pro Glu Ala Leu Ala Ser
195 200 205
His Asp Ala Ala Thr Lys Ala Asp Ile Pro Leu Gly Gly Lys Phe Gly
210 215 220
Asp Val Asp Lys Asp Leu Ala Pro Val Met Val Phe Leu Ala Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ser His Phe Ile Thr Gly Gln Met Phe Pro Val Asp Gly Gly Leu
245 250 255
Ile Ala Val Arg
260
<210> 36
<211> 783
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 36
atgaaaccgc tagcaggtaa aagaatcatc gtcactggtg gagcacaggg tatcggagcg 60
tcagtcgtgc gcgcctacct ggccgcgggc gcaactgtag tgtcaatgga catgaacgac 120
aaactggggc aacaggtcgt ctccgaggcc attgagaaac accccgactg cagcgcccgc 180
tactgccatt gcgacattac tgatcgcact gcagtggaaa aggttttcgc cgcggcgacc 240
tgggacatgg gcggcctgga cgtcatggtc aacgtagcgg gtgtacagcg ccatagctct 300
ccagacgcca tatcggaaga tctgttcgac ttactgttcc gcgtcaacgt actaggcacc 360
atgaacacca acggcgtggc ctattcgctg atgaaatccc agggcacagg caatatcatc 420
aacttcggct ccagctcggg cttaacaggc gagatcgaca acggcctata tgccgcaacc 480
aaggccgcgg tacatacctg gactcgcaat gtggctcgcc aatggggccc tgacggcatc 540
cgcatcaatg ccgttctgcc cgcgatggtc acccctatgt acgtcgactt ccgcaatgcc 600
ctgtcaccag aagcgcttgc ctcccatgac gccgccacca aggccgacat accgctaggc 660
ggaaaatttg gcgatgtcga caaggacttg gcaccagtga tggtcttcct cgccagcgac 720
gcctcccact tcatcaccgg ccagatgttc ccggtagacg gtgggcttat tgcggtgcga 780
tga 783
<210> 37
<211> 260
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 37
Met Lys Pro Leu Ala Gly Lys Arg Ile Ile Val Thr Gly Gly Ala Gln
1 5 10 15
Gly Ile Gly Ala Ser Val Val Arg Ala Tyr Leu Ala Ala Gly Ala Thr
20 25 30
Val Val Ser Met Asp Met Asn Asp Lys Leu Gly Gln Gln Val Val Ser
35 40 45
Glu Ala Ile Glu Lys His Pro Asp Cys Ser Ala Arg Tyr Cys His Cys
50 55 60
Asp Ile Thr Asp Arg Thr Ala Val Glu Lys Val Phe Ala Ala Ala Thr
65 70 75 80
Trp Asp Met Gly Gly Leu Asp Val Met Val Asn Val Ala Gly Val Gln
85 90 95
Arg His Ser Ser Pro Asp Ala Ile Ser Glu Asp Leu Phe Asp Leu Leu
100 105 110
Phe Arg Val Asn Val Leu Gly Thr Met Asn Thr Asn Gly Val Ala Tyr
115 120 125
Ser Leu Met Lys Ser Gln Gly Thr Gly Asn Ile Ile Asn Phe Gly Ser
130 135 140
Glu Ala Gly Leu Thr Gly Glu Ile Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Ala Thr
145 150 155 160
Lys Ala Ala Val His Thr Trp Thr Arg Asn Val Ala Arg Gln Trp Gly
165 170 175
Pro Asp Gly Ile Arg Ile Asn Ala Val Leu Pro Thr Met Val Thr Pro
180 185 190
Met Tyr Val Asp Phe Arg Asn Ala Leu Ser Pro Glu Ala Leu Ala Ser
195 200 205
His Asp Ala Ala Thr Lys Ala Asp Ile Pro Leu Gly Gly Lys Phe Gly
210 215 220
Asp Val Asp Lys Asp Leu Ala Pro Val Met Val Phe Leu Ala Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ser His Phe Ile Thr Gly Gln Met Phe Pro Val Asp Gly Gly Leu
245 250 255
Ile Ala Val Arg
260
<210> 38
<211> 783
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 38
atgaaaccgc tagcaggtaa aagaatcatc gtcactggtg gagcacaggg tatcggagcg 60
tcagtcgtgc gcgcctacct ggccgcgggc gcaactgtag tgtcaatgga catgaacgac 120
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tactgccatt gcgacattac tgatcgcact gcagtggaaa aggttttcgc cgcggcgacc 240
tgggacatgg gcggcctgga cgtcatggtc aacgtagcgg gtgtacagcg ccatagctct 300
ccagacgcca tatcggaaga tctgttcgac ttactgttcc gcgtcaacgt actaggcacc 360
atgaacacca acggcgtggc ctattcgctg atgaaatccc agggcacagg caatatcatc 420
aacttcggct ccgcgtcggg cttaacaggc gagatcgaca acggcctata tgccgcaacc 480
aaggccgcgg tacatacctg gactcgcaat gtggctcgcc aatggggccc tgacggcatc 540
cgcatcaatg ccgttctgcc caccatggtc acccctatgt acgtcgactt ccgcaatgcc 600
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tga 783
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<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 39
Met Lys Pro Leu Ala Gly Lys Arg Ile Ile Val Thr Gly Gly Ala Gln
1 5 10 15
Gly Ile Gly Ala Ser Val Val Arg Ala Tyr Leu Ala Ala Gly Ala Thr
20 25 30
Val Val Ser Met Asp Met Asn Asp Lys Leu Gly Gln Gln Val Val Ser
35 40 45
Glu Ala Ile Glu Lys His Pro Asp Cys Ser Ala Arg Tyr Cys His Cys
50 55 60
Asp Ile Thr Asp Arg Thr Ala Val Glu Lys Val Phe Ala Ala Ala Thr
65 70 75 80
Trp Asp Met Gly Gly Leu Asp Val Met Val Asn Val Ala Gly Val Gln
85 90 95
Arg His Ser Ser Pro Asp Ala Ile Ser Glu Asp Leu Phe Asp Leu Leu
100 105 110
Phe Arg Val Asn Val Leu Gly Thr Met Asn Thr Asn Gly Val Ala Tyr
115 120 125
Ser Leu Met Lys Ser Gln Gly Thr Gly Asn Ile Ile Asn Phe Gly Ser
130 135 140
Glu Ala Gly Leu Thr Gly Glu Ile Asp Asn Gly Leu Tyr Ala Ala Thr
145 150 155 160
Lys Ala Ala Val His Thr Trp Thr Arg Asn Val Ala Arg Gln Trp Gly
165 170 175
Pro Asp Gly Ile Arg Ile Asn Ala Val Leu Pro Ala Met Val Thr Pro
180 185 190
Met Tyr Val Asp Phe Arg Asn Ala Leu Ser Pro Glu Ala Leu Ala Ser
195 200 205
His Asp Ala Ala Thr Lys Ala Asp Ile Pro Leu Gly Gly Lys Phe Gly
210 215 220
Asp Val Asp Lys Asp Leu Ala Pro Val Met Val Phe Leu Ala Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ser His Phe Ile Thr Gly Gln Met Phe Pro Val Asp Gly Gly Leu
245 250 255
Ile Ala Val Arg
260
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<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
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atgaaaccgc tagcaggtaa aagaatcatc gtcactggtg gagcacaggg tatcggagcg 60
tcagtcgtgc gcgcctacct ggccgcgggc gcaactgtag tgtcaatgga catgaacgac 120
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tactgccatt gcgacattac tgatcgcact gcagtggaaa aggttttcgc cgcggcgacc 240
tgggacatgg gcggcctgga cgtcatggtc aacgtagcgg gtgtacagcg ccatagctct 300
ccagacgcca tatcggaaga tctgttcgac ttactgttcc gcgtcaacgt actaggcacc 360
atgaacacca acggcgtggc ctattcgctg atgaaatccc agggcacagg caatatcatc 420
aacttcggct ccgcgtcggg cttaacaggc gagatcgaca acggcctata tgccgcaacc 480
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cgcatcaatg ccgttctgcc cgcgatggtc acccctatgt acgtcgactt ccgcaatgcc 600
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<211> 6117
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 41
gatgcaccac caccaccacc acaaaccgct agcaggtaaa agaatcatcg tcactggtgg 60
agcacagggt atcggagcgt cagtcgtgcg cgcctacctg gccgcgggcg caactgtagt 120
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ccccgactgc agcgcccgct actgccattg cgacattact gatcgcactg cagtggaaaa 240
ggttttcgcc gcggcgacct gggacatggg cggcctggac gtcatggtca acgtagcggg 300
tgtacagcgc catagctctc cagacgccat atcggaagat ctgttcgact tactgttccg 360
cgtcaacgta ctaggcacca tgaacaccaa cggcgtggcc tattcgctga tgaaatccca 420
gggcacaggc aatatcatca acttcggctc cgaatcgggc ttaacaggcg agatcgacaa 480
cggcctatat gccgcaacca aggccgcggt acatacctgg actcgcaatg tggctcgcca 540
atggggccct gacggcatcc gcatcaatgc cgttctgccc tacatggtca cccctatgta 600
cgtcgacttc cgcaatgccc tgtcaccaga agcgcttgcc tcccatgacg ccgccaccaa 660
ggccgacata ccgctaggcg gaaaatttgg cgatgtcgac aaggacttgg caccagtgat 720
ggtcttcctc gccagcgacg cctcccactt catcaccggc cagatgttcc cggtagacgg 780
tgggcttatt gcggtgcgat gagtacggcc ccgcccctga ggaggcaata tgttcttttc 840
aaaggaaaag caaacggcaa tcgattgtct ggttgagcgg ccgcactcga gcaccaccac 900
caccaccact gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 960
accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 1020
ttgctgaaag gaggaactat atccggattg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat 1080
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 1140
cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 1200
aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 1260
ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 1320
ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 1380
caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 1440
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 1500
taacgtttac aatttcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 1560
tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgaa ttaattctta gaaaaactca 1620
tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 1680
aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga 1740
tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 1800
tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 1860
aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 1920
tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 1980
cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 2040
aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 2100
tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 2160
ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc 2220
tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 2280
tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 2340
catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct agagcaagac 2400
gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt 2460
tttattgttc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 2520
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 2580
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 2640
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 2700
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 2760
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 2820
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 2880
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 2940
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3000
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3060
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3120
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 3180
ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 3240
ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 3300
cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc 3360
acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 3420
tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac 3480
ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 3540
ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc 3600
agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat 3660
ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg 3720
ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc 3780
tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg 3840
atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc 3900
ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag 3960
gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg 4020
gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg 4080
ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg 4140
attcattctg ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga 4200
gcacgatcat gcgcacccgt ggggccgcca tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga 4260
aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata 4320
ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga 4380
cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg 4440
cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg aaggctctca 4500
agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc 4560
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 4620
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt 4680
gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg 4740
tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata 4800
taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc 4860
agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc 4920
atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg 4980
gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta 5040
tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg 5100
atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg 5160
gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca 5220
ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc 5280
agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg 5340
cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc 5400
gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc 5460
aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc 5520
atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg 5580
cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt 5640
ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag 5700
gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat 5760
taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc 5820
atgcaaggag atggcgccca acagtccccc ggccacgggg cctgccacca tacccacgcc 5880
gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct tccccatcgg tgatgtcggc 5940
gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg ccggccacga tgcgtccggc 6000
gtagaggatc gagatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga 6060
gcggataaca attcccctct agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatac 6117
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 42
gatcccatgg atgaaaccgc tagcagggat agcggccgct caaccagaca atcgattg 58
<210> 43
<211> 82
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC17453
<400> 43
ttggtctcgg atgcaccacc accaccacca caaaccgcta gcaggtaaaa ggatagcggc 60
cgctcaacca gacaatcgat tg 82
Claims (27)
1.一种用于由樟脑生产富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物的方法，其包括以下方法步骤：
a)提供樟脑、反应介质和对映选择性(+)-冰片脱氢酶，
b)将方法步骤a)中提供的樟脑在反应介质中与对映选择性(+)-冰片脱氢酶一起转化，以及
c)获得包含1S-(-)-樟脑和(+)-冰片的、富含1S-(-)-樟脑-对映异构体的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在方法步骤a)中提供的樟脑是外消旋的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在方法步骤a)中提供的樟脑是包含对映异构体过量的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑的混合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在方法步骤a)中提供的对映选择性冰片脱氢酶对映选择性地转化1R-(+)-樟脑。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在方法步骤a)中提供的对映选择性冰片脱氢酶是植物或微生物来源的，优选是微生物来源的，或者是合成生产的。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中方法步骤b)中的转化是在存在至少一种还原性辅助因子的情况下进行的，特别是NADH或NADPH，优选为NADH，或者是NADH/NADPH-类似物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在方法步骤d)中，通过选择性的化学转化或物理分离方法，特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶，将在方法步骤c)中所获得的由(1S)-(-)-樟脑和(+)-冰片组成的混合物分离成至少含樟脑的级分和含冰片的级分。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在方法步骤e)中，将在方法步骤d)中所获得的(+)-冰片转化为1R-(+)樟脑。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在方法步骤f)中，将从方法步骤a)至c)所获得的富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物转化为1S-(+)-樟脑-10-磺酸，其中方法步骤f)包括以下步骤f1)至f4)：
f1)在有机溶剂、特别是乙酸酐中，将硫酸添加到富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物中，
f2)在-20℃至22℃、特别是0℃至20℃的温度下并经过10小时至100小时、特别是30小时至40小时的时间，转化所获得的混合物，以及
f3)获得1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物，在此，优选接着进行以下步骤：
f4)通过选择性的化学转化或物理分离方法，特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶，将所获得的1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物分离成至少含樟脑-10-磺酸的级分和含冰片的级分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在方法步骤g)中，将在方法步骤f4)中所获得的(+)-冰片转化为1R-(+)樟脑。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在方法步骤h)中，将在方法步骤d)、e)或g)中所获得的1R-(+)-樟脑或1S-(-)-樟脑转化为1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸，其中方法步骤h)包括以下步骤h1)至h3)：
h1)在有机溶剂、特别是乙酸酐中，将硫酸添加到1R-(+)樟脑或(1S)-(-)-樟脑中，
h2)在-20℃至22℃、特别是0℃至20℃的温度下并经过10小时至100小时、特别是30小时至40小时的时间，转化所获得的混合物，以及
h3)获得1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸。
12.一种用于生产1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法，包括以下方法步骤i1)至i5)：
i1)执行根据权利要求1的方法步骤a)至c)所述的方法步骤，
i2)在有机溶剂、特别是乙酸酐中，将硫酸添加到富含(1S)-(-)-樟脑-对映异构体的组合物中，
i3)在-20℃至22℃、特别是0℃至20℃的温度下并经过10小时至100小时、特别是30小时至40小时的时间，转化所获得的混合物，以及
i4)获得1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物，在此，优选接着进行以下步骤：
i5)通过选择性的化学转化或物理分离方法，特别是通过至少一种色谱法或蒸馏法或结晶，将所获得的1S-(+)-樟脑-10-磺酸和(+)-冰片的组合物分离成至少含樟脑-10-磺酸的级分和含冰片的级分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在方法步骤j)中，将从方法步骤i5)所获得的(+)-冰片转化为1R-(+)樟脑。
14.一种用于生产1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸的方法，其包括以下方法步骤k1)至k4)：
k1)执行根据权利要求7的方法步骤a)至d)所述的方法步骤，或根据权利要求8的方法步骤a)至e)所述的方法步骤，或根据权利要求10的方法步骤a)至g)所述的方法步骤，或根据权利要求13的方法步骤a)至j)所述的方法步骤；
k2)在有机溶剂、特别是乙酸酐中，将硫酸添加到由方法步骤d)、e)、g)或j)所获得的1R-(+)樟脑或(1S)-(-)-樟脑；
k3)在-20℃至22℃、特别是0℃至20℃的温度下并经过10小时至100小时、特别是30小时至40小时的时间，转化所获得的混合物；以及
k4)获得1R-(-)-樟脑-10-磺酸或1S-(+)-樟脑-10-磺酸。
15.一种对映选择性冰片脱氢酶，其包含至少一个氨基酸的至少一个氨基酸取代，所述氨基酸具有根据SEQ ID No.1的野生型冰片脱氢酶的极性、非极性、酚性、酸性和碱性五种功能性之一，其特征在于，被取代的氨基酸被具有另外四个功能性之一的氨基酸所取代。
16.根据权利要求15所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中SEQ ID No.1中至少一个被取代的氨基酸选自I18、V92、G94、V95、Q96、R97、H98、S99、L112、N116、F142、G143、S144、E145、S146、G147、L148、T149、G150、E151、I152、D153、N154、G155、L156、Y157、A158、A159、T160、K161、A162、H165、V185、L186、P187、Y188、M189、V190、T191、L201、S202、P203、A205、L206、A207、K214、D216、I217、F223和L230(分别根据SEQ ID No.1)。
17.根据权利要求15或16所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中SEQ ID No.1中至少一个被取代的氨基酸选自I18、V95、Q96、R97、H98、S144、E145、S146、E151、I152、D153、N154、Y157、A158、K161、P187、Y188、M189、T191和S202(分别根据SEQ ID No.1)。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中SEQ ID No.1中至少一个被取代的氨基酸在氨基酸序列中位于Q96至Y188的范围内，特别是选自Q96、H98、E145、S146、N154和Y188(分别根据SEQ ID No.1)。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶，其具有一个或两个氨基酸取代，其中当存在一个氨基酸取代时，其特别是发生在位置E145、S146或Y188之一处，或者其中当存在两个氨基酸取代时，它们发生在位置S146和Y188或者E145和Y188处(分别根据SEQ ID No.1)。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中氨基酸E145被H、M、L、S或G取代(分别根据SEQ ID No.1)。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中氨基酸Y188被T、A、V、I或L取代(分别根据SEQ ID No.1)。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中氨基酸S146被A取代(根据SEQ ID No.1)。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶，其中所述冰片脱氢酶具有优选至少10的对映选择性和/或优选至少10％的转化率(基于外消旋的樟脑)。
24.一种多核苷酸，其编码根据权利要求15至23中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶。
25.一种载体，其包含根据权利要求24所述的多核苷酸。
26.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的载体。
27.一种用于生产根据权利要求15至23中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶的方法，其包括以下方法步骤：
l)提供根据权利要求26所述的宿主细胞，
m)在能够表达根据权利要求15至23中任一项所述的对映选择性冰片脱氢酶的条件下，在培养基中培养在方法步骤l)中所提供的宿主细胞，以及
n)获得在方法步骤m)中表达的对映选择性冰片脱氢酶。
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