CN103173471A - 一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法，属于医药生物工程领域。技术方案包括：由大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌LamB信号肽的编码序列的人工合成的重组尿酸氧化酶的编码序列表达重组尿酸氧化酶的大肠杆菌操纵子；将上述操纵子克隆至携大肠杆菌质粒载体pBR322中获得的表达质粒；利用含有上述大肠杆菌操纵子的表达质粒转化W3110大肠杆菌空宿主得到的分泌表达重组尿酸氧化酶的工程菌；经阳离子层析、疏水层析、阴离子层析的重组尿酸氧化酶的纯化工艺。本发明的有益效果是用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子对蛋白表达的调控,用优化的大肠杆菌LamB信号肽引导尿酸氧化酶分泌表达，有良好的分泌表达效果。纯化方法简单易行，蛋白质纯化周期短，蛋白质收率高。

Description

一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法

技术领域

本发明涉及医药生物工程领域，具体涉及重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及重组尿酸氧化酶蛋白的层析分离纯化。

背景技术

尿酸氧化酶( urate oxygen oxidoreductase,EC 1. 7. 3. 3, 简称UC) 是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶, 它能够催化尿酸氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。许多物种中均发现有尿酸氧化酶存在, 但在高等哺乳动物( 猿和人类) 体内却缺乏有生物活性的尿酸氧化酶, 因而尿酸就作为嘌呤代谢的最终产物。

研究发现,尿酸水平与痛风、高血压、血管病、糖尿病、肾脏病及许多临床综合症相关。尿酸氧化酶作为检测血液中尿酸浓度的关键试剂, 在临床检测血液中的尿酸含量中起到重要的作用, 检测得到数据的准确性很大程度上取决于尿酸氧化酶的稳定性和可靠性。此外, 在临床治疗中由于尿酸氧化酶可以快速地降低血液中尿酸含量, 因此其治疗作用也受到广泛关注。

国外有关报道中表明:可以通过使用尿酸氧化酶治疗痛风病以及由于高尿酸水平引发的其它并发症。近年来有许多报道利用尿酸氧化酶来治疗肿瘤溶解综合症( 简称TLS) 。肿瘤溶解综合症是一种危及生命的代谢病发症,它主要发生在恶性肿瘤的患者的化疗过程中, 包括淋巴瘤和白血病的患者。由于在化疗开始后或者高度繁殖的肿瘤所引发的核酸的快速降解，导致高尿酸症是TLS产生的主要症状。当尿酸盐的浓度超过肾脏的排泄能力的时候, 病人就会在肾小管中沉淀尿酸, 然后发展成急性肾衰竭，使病人遭受极大的病痛。传统的预防和治疗高尿酸症的方法是利用别嘌呤醇, 碱化尿酸水解尿酸, 但碱化会产生副作用, 例如加剧血液高磷酸盐症和低血钙症, 使病人的病症更加复杂化。Stanton C等人在1996-1997年对52个病人的研究证明:尿酸氧化酶是传统的别嘌呤醇的一种安全、有效的替代品,可快速控制血浆中尿酸的浓度,降低病人在化疗中出现肿瘤溶解的风险。Bertrand Coiffier等人在2001-2002年对100位患有恶性非霍奇金淋巴瘤的病人在化疗中使用了重组尿酸氧化酶, 用来检测尿酸氧化酶在第一轮化疗过程中对预防肿瘤溶解症的效果和其使用的安全性,实验证明尿酸氧化酶可以有效地控制血液中尿酸的含量,在预防和治疗患有恶性非霍奇金淋巴瘤肿瘤溶解综合症中起到了很好的作用。

2001年6月，法国Sanofi-Synthelabo公司开发的重组黄曲霉尿酸氧化酶首次在德国和英国上市，用于治疗和预防具有高危肿瘤溶解综合症的血液恶性肿瘤病人的急性高尿酸血症。

然而，国外采用酿酒酵母来表达生产重组黄曲霉尿酸氧化酶，相对于酵母的长发酵周期和复杂的工艺控制，其13%的表达水平并不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下。而在大肠杆菌中，重组黄曲霉尿酸氧化酶的胞质表达效果不佳，如采用融合表达方式虽然可以解决表达量的问题，但是后续的蛋白酶切割条件不容易控制，同时也给生产应用引入了蛋白酶残留、非特异性切割等困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组尿酸氧化酶的高效分泌表达及纯化方法，克服现有技术中使用酿酒酵母生产重组黄曲霉尿酸氧化酶时，其发酵周期较长并且工艺控制复杂，其13%的表达水平并不理想，从而导致了最终产品的价格居高不下。大肠杆菌表达黄曲霉尿酸氧化酶时，其胞质表达形式的表达效果不佳；采用融合表达方式虽然可以解决表达量的问题，但是后续的蛋白酶切割条件不容易控制，同时也给生产应用引入了蛋白酶残留、非特异性切割等困难。对实际生产应用形成了制约的缺点。

本发明的技术路线是：选择使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控下游基因转录，同时，优化改造了大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）的编码序列（SEQ2），突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构,使其更利于引导黄曲霉尿酸氧化酶的（SEQ3.1）的分泌表达，经实验证明，优化过后的信号肽具有更高的引导蛋白分泌的效率。以上述启动子、信号肽组合作为表达调控元件，能够使重组尿酸氧化酶在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，为最终开发低成本尿酸氧化酶制品奠定了基础。

本发明的技术方案是：

1、提供一种表达重组尿酸氧化酶的大肠杆菌操纵子，其结构包括：大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（phoA promoter，SEQ1）、大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）的编码序列（SEQ2）、人工合成的重组尿酸氧化酶的编码序列（SEQ3）。

2、提供将上述操纵子克隆至携大肠杆菌质粒载体pBR322中获得的表达质粒pPLS-UOX。

3、提供利用含有上述大肠杆菌操纵子的表达质粒pPLS-UOX转化W3110大肠杆菌空宿主得到的能够高效分泌表达重组尿酸氧化酶的工程菌pLS-UOX。

4、提供一种重组尿酸氧化酶的纯化工艺，其步骤包括：阳离子层析、疏水层析、阴离子层析。

本发明有益效果在于，设计出的大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（phoA promoter，SEQ1）实现对蛋白表达的调控,通过优化的大肠杆菌LamB信号肽（SEQ2.1）引导尿酸氧化酶（SEQ3.1）分泌表达。通过组合使用上述表达调控元件，得到了良好的分泌表达效果。经过层析分离纯化提取，具有工艺简单易行，层析步骤操作简单，蛋白质纯化周期短，蛋白质收率稳定高效，蛋白质质量稳定性高、操作重复性好，产品成本低廉等优点，适合大规模生产药品的制备。

附图说明

图1：表达载体pPLS-UOX 图。

图2：表达载体pPLS-UOX酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果影像。

图3：工程菌PLS-UOX摇瓶实验SDS-PAGE电泳结果影像。

图4：阳离子交换层析样品电泳图谱。

图5：疏水层析下样电泳图谱。

图6：阴离子交换层析下样电泳图谱。

具体实施方式

实施例1 重组尿酸氧化酶分泌表达质粒pPLS-UOX的构建（参阅图1）。

1、设计并合成大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（phoA promoter）。

在大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（phoA promoter）的序列的5’端和3’端分别引入了EcoRI和XbaI限制酶切位点。设计合成的寡核苷酸序列为SEQ1。

2、设计并合成大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）加重组尿酸氧化酶的编码序列。

天然大肠杆菌LamB信号肽的编码序列为：

ATGATGATTA CTCTGCGCAA ACTgCCTCTG GCGGTTGCCG TCGCAGCGGG CGTAATGTCT  GCTCAGGCAA  TGGCTGTTGA  TTTC

根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构和氨基酸残基的疏水性对信号肽引导分泌能力的影响，设计寡核苷酸序列为SEQ2。

根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计尿酸氧化酶的编码寡核苷酸序列为SEQ3。

最终合并合成大肠杆菌LamB信号肽加重组尿酸氧化酶的编码序列SEQ4。

4、用限制性内切酶EcoRI和XbaI处理质粒pBR322，与同样经过EcoRI和XbaI处理的大肠杆菌碱性磷酸酶启动子片段用T4 DNA Ligase连接，将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，用EcoRI和XbaI鉴定筛选连接正确的克隆，得到带有大肠杆菌碱性磷酸酶启动子片段的中间载体pPLS。

5、用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切处理含有合成的大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的质粒pPLS和大肠杆菌LamB信号肽加重组尿酸氧化酶的编码序列，回收目的片段并通过T4 DNA Ligase连接，将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞，涂氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，用NcoI和BamHI鉴定筛选连接正确的克隆（图2），最终得到重组尿酸氧化酶的分泌表达质粒pPLS-UOX，图谱如图1所示。

实施例2 重组尿酸氧化酶分泌表达工程菌PLS-UOX的构建。

用质粒pPLS-UOX转化大肠杆菌空宿主W3110，将转化子接种于AP5培养基中，37℃摇瓶培养。根据SDS-PAGE电泳鉴定表达结果（图3）优选得到分泌表达重组尿酸氧化酶的工程菌。

AP5培养基成分为：

0.15%            葡萄糖

1.1%             酸水解酪蛋白

0.06%            酵母抽提物 

0.019%           MgSO₄

0.107%           NH₄Cl

0.373%           KCl

0.12%            NaCl 

0.12mol/ L       三乙醇胺  pH7.4。

实施例3 重组尿酸氧化酶的分离纯化 

重组尿酸氧化酶菌体经高压均质破碎压力在30-40MPa，破菌液使用离心机离心力不低于8000g，收集离心上清；上清蛋白液调节Cond值低于阳离子层析平衡液Cond值进行阳离子层析，收集下样样品，纯化效果电泳鉴定结果如图4所示；阳离子层析下样样品调节pH值与疏水层析平衡液pH值一致进行疏水层析，收集下样样品，纯化效果电泳鉴定结果如图5所示；疏水层析下样样品Cond值低于阴离子层析平衡液Cond值进行阴离子层析，收集下样样品纯化效果电泳鉴定结果如图6所示。通过上述多种层析分离纯化步骤获得高收率、高活性、高纯度的尿酸氧化酶蛋白。

重组尿酸氧化酶的活性鉴定

1、取测活缓冲液2.0ml，加入尿酸贮液1.5ml，混匀后置30℃水浴平衡5min；

2、向上述反应液中加入1.0ml 供试品，混合均匀后于30℃反应5min；

3、反应结束后加入0.5ml 反应终止液终止反应；

4、按2010年版《中国药典》三部附录II A：紫外-可见分光光度法，在波长292nm

处测定吸收度；

5、取测活缓冲液2.0ml，加入尿酸贮液1.5ml 和0.5ml 反应终止液，再加入1.0ml

供试品，混合均匀后于30℃反应5min 后做为反应管尿酸起始值，取测活缓冲液3.5ml 和0.5ml 反应终止液，再加入1.0ml 供试品，混合均匀后做为样品空白；

6、取尿酸标准液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml 分别置于试管中，分别加测活缓冲液4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml 使终体积为4.5ml。混匀后置30℃水浴平衡5min，加入0.5ml 反应终止液，吸收度测定方法同步骤4；

7、确量取4.5ml 测活缓冲液，30℃水浴平衡5min，加入0.5ml 反应终止液作为空白对照；

8、标准曲线尿酸浓度对应其吸收度，求直线回归方程，将测得供试品反应管吸收度代入直线回归方程，即得供试品反应管尿酸的浓度；

  酶活性测定结果列表

样品	对照品	样品
			酶比活性EAU/mg	16	17.9

SEQ1：大肠杆菌色碱性磷酸酶启动子（phoA promoter）序列：

SEQ2：经过优化改造的大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）的编码序列：

SEQ2.1：经过优化改造的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽（alkaline phosphatase signal peptide）的氨基酸序列：

   

 SEQ3：人工合成的重组尿酸氧化酶的编码序列：

SEQ3.1：重组尿酸氧化酶的氨基酸序列：

 

SEQ4：大肠杆菌LamB信号肽加重组尿酸氧化酶的编码序列：

 

SEQ1：大肠杆菌色碱性磷酸酶启动子（phoA promoter）序列：

SEQ2：经过优化改造的大肠杆菌LamB信号肽（LamB signal peptide）的编码序列：

SEQ2.1：经过优化改造的大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽（alkaline phosphatase signal peptide）的氨基酸序列：

SEQ3：人工合成的重组尿酸氧化酶的编码序列：

SEQ3.1：重组尿酸氧化酶的氨基酸序列：

SEQ4：大肠杆菌LamB信号肽加重组尿酸氧化酶的编码序列： 

 

Claims (8)

1.一种表达重组尿酸氧化酶的大肠杆菌操纵子，其结构包括：大肠杆菌碱性磷酸酶启动子（SEQ1）、经过优化改造的LamB信号肽的编码序列（SEQ2）、人工合成的重组尿酸氧化酶的编码序列（SEQ3）。

2.含有权利要求1所述的大肠杆菌操纵子的大肠杆菌质粒pPLS-UOX，其特征在于，通过将权利要求1所述的操纵子克隆至大肠杆菌质粒载体pBR322中而获得。

3.一种高效分泌表达重组尿酸氧化酶的工程菌PLS-UOX，其特征在于，是用权利要求3所述的表达质粒转化的W3110大肠杆菌空宿主。

4.一种重组尿酸氧化酶分离纯化提取方法，其步骤包括：收集菌体经高压均质破碎；破菌液离心，收集离心上清液；蛋白上清液经过阳离子层析、疏水层析、阴离子层析，最终得到高纯度的重组尿酸氧化酶蛋白。

5.根据权利要求4所述的重组尿酸氧化酶分离纯化提取方法，其特征在于菌体经高压均质破碎压力在30-40MPa，破菌液使用离心机离心力不低于8000g。

6.根据权利要求4所述的重组尿酸氧化酶蛋白层析分离纯化提取方法，其特征在于：采用阳离子层析处理蛋白离心上清液，层析柱出口端液体pH及Cond值与平衡液一致，调节离心上清液的Cond值低于平衡液Cond值即进行上样，上样后使用洗脱液进行洗脱，并收集目标峰蛋白。

7.根据权利要求4所述的重组尿酸氧化酶蛋白层析分离纯化提取方法，其特征在于：采用疏水层析阳离子层析纯化液，层析柱出口端液体pH及Cond值与平衡液一致即进行上样，上样后使用洗脱液进行洗脱，并收集目标峰蛋白。

8.根据权利要求4所述的重组尿酸氧化酶蛋白层析分离纯化提取方法，其特征在于：采用阴离子层析处理疏水层析纯化液，层析柱出口端液体pH及Cond值与平衡液一致，调节上样样品的Cond值低于平衡液Cond值即进行上样，上样后使用洗脱液进行洗脱，并收集目标峰蛋白。

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