JP4465363B2 - 形質転換サッカロマイセス・セレビシエ菌株及びそれを使用したlk8蛋白質の生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、プロモーター、分泌配列、配列番号:1で記載されるLK8 cDNA及びターミネーター順序からなるLK8発現カセット、宿主菌株の染色体にLK8発現カセットを多重に挿入するためのδ塩基配列及び多重挿入後、選別の為のネオマイシン抵抗遺伝子(neo)を含むMδLK8組換え発現ベクターを提供する。ここで、MδLK8組換え発現ベクターは、該プロモーターはGAL1プロモーターで、分泌配列は配列番号:2で記載されるα-因子分泌シグナルで、ターミネーターはCYC1ターミネーターであることが好ましい。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのもので、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
ヒトアポリポ蛋白質(a)[apolipoprotein (a)]クリングル(kringle)領域V38のアミノ酸配列からなるLK8 cDNAを含む遺伝子を酵母内で発現させるための発現ベクターを下記のように製造した。
LK8蛋白質の発現の為の最適宿主菌株を選別するためにサッカロマイセス・セレビシエ菌株中でBJ3501(ATCC 208280, 米国)、BY4742(EUROSCARF Y10000, ドイツ)、CEN.PK2-1D(EUROSCARF 30000B, ドイツ)及び2805(Sohn, J.H., J. Microbiol. Biotechnol., 1991年, 第1巻, 266-273頁)を対象に実験を行なった。
GAL1プロモーター、α-因子分泌シグナル、LK8 cDNA塩基配列及びCYC1ターミネーターを含むLK8発現カセットを酵母の染色体内に挿入させるための組換えベクターを製造した。前記ベクターで形質転換された酵母菌株を収得した。
前記実施例3で選別した形質転換酵母菌株をコロニーイムノブロットを通じてLK8蛋白質を多量発現する菌株を1次選別した。
前記実施例4の1次コロニースクリーニングで選別した菌株を対象にドットブロットでLK8蛋白質をさらに多く発現する菌株を2次選別した。
前記実施例5の2次スクリーニングで選別した菌株を対象にELISA(酵素結合免疫測定法)をしてLK8蛋白質を多く発現する最終菌株を3次選別した。
本発明では、サッカロマイセス・セレビシエBJ3501//MδLK8#36形質転換菌株を一定な滅菌保管容器に数百個乃至数千個分注した後、同一状態で保管管理しながら組換え蛋白質生産時に種菌として種培養に使用できるよう維持管理する体系(本発明者らは、それを「ワーキングセルバンクシステム」という)を構築した。前記形質転換菌株を種菌に使用して24時間適切な菌体量と活性度(20倍に稀釈した時、OD600=0.8乃至1.2)を得られるようにYPD(酵母抽出物1%、ペプトン2%、グルコース2%を含む)培地で種菌培養した。
前記YPD培地で種菌培養を遂行した後、初期開始培地に前記実施例7-1で収得した種培養液を接種してバッチ培養を遂行した。本発明のバッチ培養及び流加培養工程は、細胞成長工程で、まずバッチ培養工程は、細胞成長及びガラクトースの適応工程として、種培養液を1%以上接種し、炭素源にグルコース及びガラクトースを使用して細胞を量的に増大させながらガラクトース適応期間を与えた。ここで、使用した初期培養培地は、グルコース1乃至5%(w/v)、ガラクトース1乃至5%(w/v)、酵母抽出物1乃至50g/L、カサミノ酸(casamino acid)1乃至10g/L、ウラシル0.1乃至5g/L、ヒスチジン0.1乃至5g/Lからなる。
流加培養工程は、発現誘導物質でありながら細胞の唯一な炭素源として使用されるガラクトースを添加して流加培養させて醗酵物質を収得する工程である。
酵母でLK8蛋白質のエピソーム性発現(episomal expression)と染色体性発現(chromosomal expression)時、LK8蛋白質の分泌効率を比較するために、前記実施例2でLK8の発現効率が最も高かった菌株サッカロマイセス・セレビシエBI3501/pMCLK8と前記実施例6で製造したサッカロマイセス・セレビシエBI3501//MδLK8#36を前記実施例7に示したバッチ式培養方法で培養した後、最大LK8分泌量を測定した(図10)。その結果、図10に示したようにバッチ培養30時間以後のLK8分泌量が染色体性発現(chromosomal expression, サッカロマイセス・セレビシエBI3501//MδLK8#36)の場合、エピソーム性発現(eipsomal expression, サッカロマイセス・セレビシエBI3501/pMCLK8)に比べて約2倍以上増加したことを確認することができた。
LK8蛋白質は、分子量9乃至10kDaの親水性(hydrophilic)が強い分子で、中性pHまたは有機溶媒には溶解度が低い特徴がある。また、培養液にLKタンパク質が発現される過程で正確なLK8蛋白質の分子量より小さいか大きい誘導体が発見された。これらは、LK8蛋白質のC-末端またはN-末端部位のアミノ酸がカットされたりまたは化学的な誘導体であると思料される。本工程は、LK8蛋白質のこのような物理化学的性質と培養上の特徴を考慮して高純度のLK8蛋白質を生産するために、陽イオン交換 クロマトグラフィー及び疎水性結合クロマトグラフィー(Hydrophobic interaction chromatography)を使用する精製工程を確立した。即ち、陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用してpHと塩濃度を調節して、不純物を除去して適正な蛋白質濃度のLK8蛋白質が溶出されるように誘導した。そして、疎水性結合クロマトグラフィーを使用して親水性(hydrophilic)が強いLK8蛋白質が固定相の樹脂(resin)に高い塩濃度を使用して結合させて、さらに低い塩濃度で不純物を除去して適正塩濃度でLK8蛋白質を溶出した後、疎水性が強い不純物即ち、疎水性が強い蛋白質、脂質またはエンドトキシン(endotoxin)等の非蛋白質性物質(nonproteineous contaminant)をさらに低い塩濃度で除去した。前記のクロマトグラフィー精製過程を下記に詳しく述べる。
前記実施例7で収得した培養液を8,000rpmで遠心分離して上澄み液を採取した。前記上澄み液を0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム(monobasic)で4倍に稀釈してpH4以下に調整した後、0.45μmのフィルター膜(filter membrane)でろ過した。SP-セファロースFF(SP-sepharose fast flow)樹脂をカラムに充填した後、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液(monobasic)で平衡させた。以後、稀釈した上澄み液をSP-セファロースカラムに積載した。その後、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液を通過させて基底ラインまで移動させた後、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウムをpH5乃至7に合わせた溶液で再び洗浄して不純物を除去した。続けて、0乃至2Mのを含むpH5乃至9、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液を流し送ってLK8蛋白質を溶出させた。
SP-セファロース 6FF(SP-sepharose 6 fast flow)樹脂をカラムに充填して、0.1乃至3Mの硫酸アンモニウムと0乃至2MのNaClを含むpH5乃至9、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液で平衡させた。前記実施例9-1で溶出した試料を最終濃度0.1乃至3Mになるように硫酸アンモニウムを添加して溶解させた後、SP-セファロースカラムに積載し、0.1乃至3Mの硫酸アンモニウムと0乃至2MのNaClを含むpH5乃至9、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液を通過させて基底ラインまで移動させた。続けて、0.1乃至3Mの硫酸アンモニウムと0乃至2MのNaClを含むpH5乃至9、0.1乃至1Mのリン酸化ナトリウム溶液で洗浄した後、0.1乃至2Mの硫酸アンモニウムと0乃至2MのNaClを含むpH5乃至9、0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液を通過させてLK8蛋白質を溶出させた。溶出したLK8蛋白質を分子量10,000Dろ過膜(Sigma, 米国)で0.1乃至1Mのリン酸ナトリウム溶液を使用して透析(dialysis)した。
配列番号:1は、LK8蛋白質をコードするcDNA配列である。
配列番号:2は、S.cerevisiae菌株のα-因子分泌シグナルをコードするcDNA配列である。
Claims (8)
- サッカロマイセス・セレビシエBJ3501/MδLK8#36(寄託番号:KCTC 10582BP)であることを特徴とする、形質転換サッカロマイセス・セレビシエ菌株。
- 以下の工程を含む、LK8蛋白質の大量生産方法:
(1)請求項1の形質転換菌株を種培養した後、空気供給量及び/または撹拌速度の調節により溶存酸素量を一定に維持しながら、炭素源としてグルコース及びガラクトースを含む液体培地にバッチ培養する工程、
(2)工程(1)の培養液を、ガラクトースを含むフィード培地(feed medium)に流加培養する工程、及び
(3)工程(2)の培養液でLK8蛋白質を精製する工程。 - 工程(1)のバッチ培養を、1〜3vvm(5〜80L/分)の空気供給量及び/または200〜1000rpmの撹拌速度で、炭素源として1〜5%(w/v)のグルコース及び1〜5%(w/v)のガラクトースを含む液体培地中で、最大溶存酸素量の40〜90%に溶存酸素量を調整して、実施することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 工程(2)の流加培養を、炭素源としてガラクトース10〜50%(W/V)を含んだ液体培地を用いて、培地内のガラクトース濃度が0.5〜5%(W/V)に維持されるようにフィード培地の供給速度を調節して、実施することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 工程(3)のLK8蛋白質精製を、クロマトグラフィーによって実施することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性結合クロマトグラフィーを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーが、陽イオン交換クロマトグラフィーであって、0〜5M NaClを含む溶出バッファー(pH4.0〜8.0)でLK8蛋白質を溶出することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記疎水性結合クロマトグラフィーが0.1〜5M硫酸アンモニウム及び0〜500mM NaClを含む0〜100mMリン酸ナトリウム溶出バッファー(pH4〜8)でLK8蛋白質を溶出させることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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