CN1914317A - 转化酿酒酵母和使用其大量生产lk8蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备LK8蛋白的方法，更精确地讲，一种利用酿酒酵母而大量生产LK8蛋白的方法，所述酿酒酵母被编码具有血管发生抑制活性的LK8蛋白的基因转化。本发明的转化菌株和LK8蛋白的生产方法有望对LK8蛋白这一新的血管发生抑制剂的商业化做出巨大贡献。

Description

转化酿酒酵母和使用其大量生产LK8蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种LK8蛋白的制备方法，更具体地，一种用酿酒酵母来大量生产LK8蛋白的方法，所述酿酒酵母用编码具有血管发生抑制活性的LK8蛋白的基因转化。
背景技术
血管发生是给器官或组织提供新血管的生物学过程。特别地，新的毛细血管从旧的微血管生成，生长成为血管。血管发生，作为一种正常的生理过程，只在人体内有限的情形中观察到，例如在胎儿与胚胎发育期间、子宫成熟期间、胎盘增殖期间、黄体形成的过程中以及用于伤口愈合。即使对于这样的情形，当完成其工作时，血管发生也被精确地调控和终止。血管发生被一种血管发生调控因子严格地调控(Folkman，J.Nature Med.，1：27-31，1995)，血管发生的表型看来不同于血管发生刺激因子增量调节和血管发生抑制因子减量调节之间的平衡。
即使血管发生过程是很复杂和精细的，它也可以被描述如下。首先，血管发生的刺激被传输到旧血管，产生血管扩张和膜通透性增加。其次，血纤蛋白从扩张的血管中出来，然后在血管周围的细胞溶质中积累。第三，一种分解旧血管基底膜的酶被激活。第四，基底膜被破坏以致内皮细胞从血管中出来并在周围的细胞溶质中增殖，然后再迁移。最后，那些内皮细胞排列起来形成血管，产生新血管。
与血管发生有关的疾病例举为包括关节炎在内的炎性疾病、包括糖尿病视网膜病变在内的眼科疾病、包括牛皮癣在内的皮肤病和癌症这个在其他血管发生相关疾病中最有代表性的疾病(Folkman，J.，Nature Med.，1：27-31，1995)。特别地，血管发生对于原发肿瘤和转移肿瘤的生长是必需的(Folkman，J.，New Engl.J.Med.，285：1182-1186，1971；Folkman，J.，J.Biol.Chem.，267：10931-10934，1992)。那意味着当血管发生被抑制或终止时，肿瘤不能生长，表明血管发生的抑制作用也许对于肿瘤的长期治疗是一种有效的途径。
因此，急需发展一种新的血管发生抑制剂来抑制或终止血管发生，进而通过血管发生抑制剂有效地大量生产，以中等价格为使用者提供抑制剂。
血管发生抑制剂被认为是最有利的癌症治疗方法之一，因为它以供应营养到肿瘤的血管为对象，取代了直接攻击癌细胞，意味着它会降低耐药性。各种抑制肿瘤血管发生的抑制剂，例如在体内发现的天然抑制剂、合成抑制剂、整联蛋白抑制剂、信号传导抑制剂和蛋白水解抑制剂，已经被证实是有效的并正在临床试验中(Brower，V.，Nat.Biotechnol.，17：963-8，1999；Carmeliet，P.和Jain，R.K.，Nature，407：249-57，2000)。在国际专利公布WO 01/19868中宣称，在临床试验的那些抑制剂中，LK6、LK7和LK8作为人载脂蛋白Apo(a)的第36th、37th和38th的三环亚基，已经知道其具有血管发生抑制活性，以及上皮细胞生长抑制和迁移抑制活性。特别是，LK8蛋白表现出了最高的活性。为了对LK8蛋白的生产提供中等价格，以检验该蛋白的效应、用于临床试验和商业使用，开发一种通过培养LK8基因转化的重组菌株来实现大量生产LK8蛋白的方法是必要的。
因而，本发明人研究了LK8蛋白的功能和该蛋白有效商业应用的方法。最后，本发明人通过用含有LK8基因的质粒载体转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或将LK8基因插入到宿主染色体中来制备重组酿酒酵母，然后从中选择了大量生产LK8蛋白的菌株。本发明人也确定了对菌株生长最适的培养条件，并通过证实在所述的条件下高质量的LK8蛋白能够被大量生产，最终完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种能够大量生产血管发生抑制剂LK8蛋白的转化酵母菌株的制备方法，提供一种通过培养该菌株大量生产LK8蛋白的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种含有LK8表达盒的MδLK8重组表达载体，所述表达盒由启动子、分泌序列、SEQ ID No：1表示的LK8cDNA和终止子依次组成。
本发明也提供了通过用所述重组载体转染宿主菌株而制备的转化酿酒酵母菌株。
本发明更进一步提供了一种高表达LK8蛋白的转化体的制备方法，包括如下步骤：(1)用上述重组载体转化宿主菌株；(2)用G418硫酸盐抗生素处理后，培养第1步中制备的转化体；(3)用免疫测定法筛选LK8高表达的转化体。
本发明也提供了一种LK8蛋白大量生产的方法，包括如下步骤：(1)通过将重组LK8基因表达载体M LK8插入到宿主菌株中制备一株转化菌株；(2)将第1步制备的转化菌株进行种子培养和将该菌株在含有葡萄糖与半乳糖作为碳源的液体培养基中进行分批培养，通过调节空气供应和搅拌速度保持溶氧稳定；(3)第2步的培养液在含有半乳糖作为碳源的液体培养基中进行补料分批培养；和(4)从第3步得到的培养液中纯化LK8蛋白。
在下文中，本发明被详细描述。
本发明提供了一种含有LK8表达盒、δ序列和新霉素抗性基因的MδLK8重组表达载体，其中LK8表达盒依次包括启动子、分泌序列、由SEQ ID No：1表示的LK8cDNA和终止子，δ序列是为了将LK8表达盒在宿主菌株的染色体上多重插入(multiple insertion)，新霉素抗性基因(neo)是为了多重插入后的选择。在本发明的MδLK8重组表达载体的一个优选实施方案中，所述启动子是GAL1启动子。在本发明的一个优选实施方案中，所述的分泌序列是SEQ ID No：2表示的α-因子分泌信号。在本发明的另一个优选实施方案中，所述的终止子是CYC1终止子。
特别地，在这里，含有α-因子分泌信号和LK8cDNA的DNA片段是通过用限制性内切酶处理pMBRI-LK8表达载体(韩国专利公布No：2004-0069840)，这个载体常用在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株中生产LK8蛋白(见图1)。DNA片段被插入到p426GAL1载体中而构建了表达载体pMCLK8(6.9kb)，可用于酵母菌株中重组LK8表达盒的生产(见图2)。然后，构建了重组体MδLK8的表达载体(见图5)，用来将含有启动子、分泌序列、LK8cDNA序列和终止子的重组体LK8表达盒插入到酵母的染色体中，接下来是多重插入。
本发明也提供了一株用上述重组表达载体转染宿主菌株而得到的转化酿酒酵母菌株。在本发明的转化酿酒酵母的一个优选实施方案中，该宿主菌株是选自由酿酒酵母BJ3501、酿酒酵母BY4742、酿酒酵母CEN.PK2-1D和酿酒酵母2805组成的组。在本发明的转化酿酒酵母的一个更优选实施方案中，所述宿主菌株是酿酒酵母BJ3501。
在这里，一株宿主菌株酿酒酵母BJ3501被含有LK8基因的重组表达载体通过转染的方法进行转化，然后，染色体中特异性地带有若干LK8基因的转化酵母菌株被选择出来。用菌落免疫印迹、斑点印迹和ELISA(酶联免疫吸附测定)方法将超量分泌LK8蛋白的菌株选择出来，命名为酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36(见图6和图7)。这个菌株在2004年1月13日被保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(#52，Aeun-dong yousung-ku，Daejeun city，Korea)(保藏编号KCTC 10582BP)。
本发明进一步提供了一种高表达LK8蛋白的转化体的制备方法，包括如下步骤：(1)用上述重组载体转化宿主菌株；(2)在G418硫酸盐抗生素处理后，培养第1步中制备的转化体；和(3)用免疫测定法选择LK8高表达的转化体。在步骤2中，抗生素不只限于G418硫酸盐，但在本发明中优选5-20g/L的G418硫酸盐处理该菌株。在步骤3中，选择方法不只限于一种特定的免疫测定法，但优选菌落免疫印迹、斑点印迹测定或ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。还优选另外实行上述步骤3，在初步选择中更优选进行菌落免疫印迹，然后从初步选择所得菌株中实行二次选择时优选斑点印迹，最后用ELISA法从二次选择所得菌株中进行最终选择。
当LK8在本发明方法制备的在其染色体中含有多拷贝LK8基因的转化酵母菌株中表达时，与常规附加型表达方法相比，LK8蛋白的分泌量加倍或增至三倍，常规的附加型表达是外源基因以附加体的形式引入来表达和分泌外源基因。
本发明也提供了一种大量生产LK8蛋白的方法，包括如下步骤：(1)通过将重组LK8基因表达载体插入到宿主菌株中制备一株转化菌株；(2)将第1步制备的转化菌株进行种子培养和将该菌株在含有葡萄糖与半乳糖作为碳源的液体培养基中分批培养，通过调节空气供应和搅拌速度保持溶氧稳定；(3)将第2步的培养液在含有半乳糖作为碳源的液体培养基中进行补料分批培养；和(4)从第3步的培养液中纯化LK8蛋白。
本发明的大量生产LK8蛋白的方法在下文中将更加清晰地被逐步解释。
在本发明方法的一个优选实施方案中，所述的第1步是为了制备一株转化菌株，是将重组LK8基因表达载体插入到宿主菌株中而产生的。更特别地是，含有LK8表达盒的重组载体被引入到宿主菌株中，以致LK8基因的表达或分泌在质粒上被诱导。然后进行LK8基因和分泌序列在菌株染色体上的多重插入。表现出最佳LK8表达/分泌能力的菌株被选择出来，即转化的酿酒酵母菌株。
在本发明方法的步骤2中，上述步骤1的转化菌株进行种子培养，然后在含有葡萄糖与半乳糖作为碳源的液体培养基中分批培养，在此过程中通过调节空气供应和/或搅拌速度来保持溶氧稳定。这时，种子培养液优选的接种体积是5-10％(w/v)。分批培养优选在1-3vvm(5-801/minute)的通气量和/或200-1000rpm的搅拌速度条件下进行、液体培养基中含有1-5％(w/v)葡萄糖和1-5％(w/v)半乳糖作为碳源，溶氧调控在最大溶氧的40-90％。这时，液体培养基可以另外包含1-50g/l的酵母膏、1-10g/l的酪蛋白氨基酸、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的组氨酸。
在本发明方法的一个优选实施方案中，所述的转化酵母菌株被分装到数百或数千个无菌的贮存瓶中。它在同样的条件下被贮藏，这是为保存和控制菌株而建立的“工作细胞库系统”，以使它们在生产重组蛋白的每一次种子培养中都作为同样种子被使用。
在步骤2中，所述的种子培养进行24小时以保证从工作细胞库系统来的细胞达到所需的细胞量。本发明的分批培养是细胞生长阶段，其间细胞数目增加以及细胞变得适应表达诱导剂半乳糖。在分批培养的后期，由于细胞旺盛的呼吸使溶氧下降。为了防止溶氧下降，空气供应和搅拌速度应该被调节来保持溶氧在40％以上，直到分批培养结束。
本发明方法的第3步是第2步的培养液在含有半乳糖作为碳源的液体培养基中进行补料分批培养。这时，溶氧必须保持在最大溶氧的20-80％，液体培养基优选包含20-50％(w/v)的半乳糖作为碳源。还优选调节半乳糖的供应速度以保持半乳糖在培养基中的含量在0.5-5％(w/v)之间。液体培养基可以另外包含1-50g/l的酵母膏、1-30g/l的蛋白胨、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的组氨酸。
半乳糖的供应是从补料分批培养开始进行控制的，以便在培养基中保持规则的半乳糖含量。也就是说，通过必要时加入半乳糖使培养基中半乳糖含量保持在低于5％(w/v)，为此必须在整个培养过程中检查溶氧，因此LK8蛋白的表达得到提高。通过补料分批培养，每1升培养上清液中可以获得几百毫克的LK8蛋白(见图8和图9)。
本发明方法第4步是为了从上述第3步的培养液中纯化LK8蛋白。LK8蛋白是分子量为9-10kD的亲水分子。在中性pH条件下，它有特性上的低溶解度。在培养液里LK8蛋白表达过程中，偶尔会产生分子量小于或大于LK8蛋白的衍生物。因而，为了从培养液中分离纯的LK8蛋白，利用LK8蛋白物理化学特性的纯化过程是需要的。
为了纯化本发明中的LK8蛋白，任何常规的蛋白质纯化方法都可以无限制地加以使用，但是色谱法是优选的。更优选包括离子交换色谱和疏水作用色谱在内的色谱法(见图10-图13)。在本发明方法的一个优选实施方案中，所述的离子交换色谱是阳离子交换色谱，LK8蛋白的洗脱优选在含有0-5M NaCl的洗脱液中在pH4.0-8.0之间进行。在使用疏水作用色谱的情况下，LK8蛋白的洗脱优选在含有0.1-5M的硫酸铵和0-500mM NaCl的磷酸钠洗脱溶液中在pH4-8之间进行。
特别地，在本发明方法的一个更优选实施方案中，LK8蛋白借助于阳离子交换色谱吸附在阳离子交换树脂上，然后通过调节pH或盐度除去杂质。LK8蛋白的洗脱在适当浓度下进行。这时，pH水平和盐浓度依赖于阳离子交换树脂的类型。在本发明方法的一个优选实施方案中，使用了SP(磺丙基)强离子交换树脂。在本领域人员中通常理解，当强离子交换色谱被用到时，与弱离子交换色谱相比，由于它的更强的离子键，LK8蛋白的冲洗和洗脱是在高盐浓度和高水平pH条件下进行的。因而，本发明不仅限于使用SP(磺丙基)阳离子交换树脂和缓冲液条件的实施方案，提示本发明可以包括在除去附着于LK8的杂质后，使用常规的阳离子交换树脂来浓缩LK8的任何纯化方法。
在本发明方法的一个优选实施方案中，用所述的阳离子交换色谱纯化得到的样品进一步用疏水作用色谱纯化。精确地讲，样品中亲水的LK8蛋白在高盐浓度下附着于疏水树脂，然后通过降低盐浓度除去杂质，随后是在适当的盐浓度下LK8的洗脱。在比适当洗脱盐浓度低的盐浓度下，高疏水杂质被除去。通常，疏水作用色谱用来纯化疏水蛋白。此时，不能被阳离子交换树脂除去的残留杂质必须利用其疏水特性来除去，由此纯化的LK8蛋白能够被大量生产。然而，本发明范围不局限于上述的疏水作用树脂和缓冲条件。本发明包括使用常规的疏水作用树脂除去LK8的杂质可能的纯化方法。
附图说明
图1是琼脂糖凝胶电泳照片，表示GAL1启动子的DNA片段(6.4kbp)和含有SEQ ID No：2表示的MATα(α-因子分泌信号)与SEQ ID No：1表示的LK8cDNA的DNA片段(500bp)，上述片段是用限制性内切酶EcoRI和BamH I处理pMBRI-LK8表达载体而制备的。
图2是pMCLK8(6.9kb)表达载体酶切图的示意图，表示pMCLK8是通过在p426GAL1载体的GAL1启动子和CYC1终止子之间插入一个含有SEQ ID No：2表示的α-因子分泌信号(MATα)和SEQ ID No：1表示的LK8cDNA的DNA片段而构建的，用于酵母中重组LK8蛋白的生产。
图3是表示考察LK8分泌和残糖的液相色谱结果的一组曲线图。为了挑选一个用于重组LK8蛋白生产的最佳宿主，酿酒酵母BJ3501，BY4742，CEN.PK2-1D和2805被LK8表达载体pMCLK8(6.9kb)转染。得到的转化酵母菌株被培养来附加地表达LK8蛋白。
图4是电泳照片，表示了在30和40小时培养后在每一个菌株中产生的LK8蛋白量免疫杂交检测的结果。
图5是表示重组载体MδLK8酶切图的示意图，MδLK8是为了将含有GAL1启动子、SEQ ID No：2表示的α-因子分泌信号、SEQ ID No：1表示的LK8cDNA和CYC1终止子的表达盒插入到酵母的染色体中而构建的。
图6是表示菌株初筛的一组照片。精确地讲，为了从染色体上含有LK8表达盒的转化酵母菌株中选择一个带有强G418硫酸盐抗性的菌株，进行了菌落印迹。胶片上的阴影被观察到：
A：用5g/l的G418硫酸盐处理，
B：用10g/l的G418硫酸盐处理，和
C：用15g/l的G418硫酸盐处理。
图7是表示一个菌株的第二轮筛选的照片。通过使用斑点印迹试剂盒，从初筛挑选到的菌株被固定在硝化纤维膜上。然后通过使用检测试剂盒，胶片中的阴影被观察到。
图8是曲线图，表示了在转化酵母菌株酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36的发酵过程中随时间变化的细胞生长(●)、补加的半乳糖累积量()和残余半乳糖(■)。
图9是转化酵母菌株酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36发酵过程中培养液上清的SDS-PAGE照片：
泳道1：梯状标记，
泳道2：培养开始38小时后，
泳道3：培养开始86小时后，
泳道4：培养开始110小时后，
泳道5：培养开始134小时后，
泳道6：培养开始158小时后，
泳道7：培养开始184小时后，
泳道8：培养开始211小时后，
泳道9：对照LK8蛋白(200mg/l)，
泳道10：对照LK8蛋白(100mg/l)，
图10是电泳照片。为了比较两种方法(LK8基因的质粒表达和插入染色体后的表达)的LK8蛋白表达和分泌效果，转化的酵母菌株酿酒酵母BJ3501/pMCLK8和酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36被分批培养。分泌的LK8蛋白随时间的变化通过免疫印迹被定量：
泳道1：LK8标准，10mg/L，
泳道2：LK8标准，50mg/L，
泳道3：酿酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培养开始20小时后，
泳道4：酿酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培养开始30小时后，
泳道5：酿酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培养开始40小时后，
泳道6：酿酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培养开始20小时后，
泳道7：酿酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培养开始30小时后，
泳道8：酿酒酵母BJ3501/pMCLK8分批培养开始40小时后，
泳道9：酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36分批培养开始20小时后，
泳道10：酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36分批培养开始30小时后，
泳道11：酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36分批培养开始40小时后。
图11是表示用阳离子交换色谱进行LK8蛋白纯化步骤的色谱图。
冲洗：0.1-1M磷酸钠溶液，
洗脱：0.1-1M磷酸钠，0-2M氯化钠溶液，
清洗：0-2M氯化钠溶液。
图12是SDS-PAGE照片，表示SP-Sepharose阳离子交换色谱的每一个洗脱级分中的LK8蛋白。
泳道1：梯状标记，
泳道2：最终培养液的上清，
泳道3：最终培养液上清稀释5倍后的样品，
泳道4：未结合树脂的稀释样品，
泳道5：用于冲洗树脂的样品，
泳道6：洗脱组分#1，
泳道7：洗脱组分#2，
泳道8：洗脱组分#3，
泳道9：洗脱组分#4，和
泳道10：用氢氧化钠洗脱的样品。
图13是色谱图，表示在LK8蛋白的整个分泌和纯化过程中间，用疏水作用色谱进行特异的LK8蛋白纯化。
冲洗：0.1-1M磷酸钠溶液，
洗脱：0.1-3M硫酸铵，0.1-1M磷酸钠，氯化钠溶液，和
清洗：氯化钠溶液。
图14是聚丙烯酰胺凝胶电泳的照片，表示了SP-苯基琼脂糖(phenylsepharose)6FF(fast flow)疏水作用色谱的每一个级分中LK8蛋白含量。
泳道1：标记，
泳道2：从SP-sepharose阳离子交换树脂上洗脱的样品，
泳道3：未吸附树脂的样品，
泳道4：洗脱级分#1，
泳道5：洗脱级分#2，
泳道6：洗脱级分#3，
泳道7：用磷酸钠洗脱的样品，
泳道8：用蒸馏水洗脱的样品，和
泳道9：梯状标记。
具体实施方式
本发明实用的和目前优选的实施方案在如下的实施例中说明。
然而，应当理解本领域技术人员，考虑到本公开内容，可以在本发明的实质和范围内进行修改和改进。
<实施例1>重组LK8表达载体的构建
构建了一种在酵母中基因表达的载体，其中含有LK8cDNA基因，它是由人载脂蛋白[apolipoprotein(a)]三环区域的V38氨基酸序列组成的。
特别地，为了一起分离α-因子分泌信号和LK8cDNA，本发明人使用了pMBRI-LK8表达载体(韩国专利公布No.2004-0069840)，它已经用于巴斯德毕赤酵母中的重组LK8蛋白生产。用到了购自Invitrogen(荷兰)的pPIC9载体(8.0kb)，它作为一个构建pMBRI-LK8表达载体的空载体。精确地讲，pPIC9表达载体的AOX1启动子通过甲醇来诱导LK8基因的表达，在LK8蛋白分泌出细胞的过程中起作用，通过将目的基因LK8cDNA结合到α-因子分泌信号后的区域进行表达。为此目的，以pET15b/LK8(国际专利公开No.WO 01/19868)为模板用PCR扩增LK8基因。然后，扩增的基因用限制性内切酶Xho I和EcoR I消化。进行亚克隆将基因片段插入到pPIC9载体中，结果构建成pMBRI-LK8(8.25kb)。
pMBRI-LK8表达载体用限制性内切酶EcoR I处理7小时，接下来用PCR纯化试剂盒(Qiagen，美国)冲洗。载体用限制性内切酶BamH I处理7小时。DNA用电泳分离，含有SEQ ID No：2表示的α-因子分泌信号和SEQ ID No：1表示的LK8cDNA核苷酸序列的DNA片段用凝胶提取试剂盒(QIAGEN)获得(图1)。得到的DNA片段被插入到p426GAL1载体(ATCC 87833，美国)的GAL1启动子和CYC1终止子之间，以构建用于酵母中重组LK8生产的pMCLK8表达载体(6.9kb)。因为表达载体中含有GAL1启动子，蛋白的表达是被半乳糖诱导的。URA3标记用来在选择培养基中挑选转化的酵母菌株。
<实施例2>表达LK8蛋白的宿主菌株选择
为了选择用于LK8蛋白表达的最佳宿主菌株，在多种酿酒酵母中，选择了BJ3501(ATCC 208280，美国)，BY4742(EUROSCARF Y10000，德国)，CEN.PK2-1D(EUROSCARF 30000B，德国)和2805(Sohn，J.H.，J.Microbiol.Biotechnol.，1：266-273，1991)用于实验。
特别地，利用碱性阳离子酵母试剂盒(Q-Biogene，加拿大)，上述每一个菌株都被上述实施例1中构建的表达载体转染。为了确定转化是否成功完成，菌株在无脲嘧啶的酵母氮基培养基[0.67％的无氨基酸酵母氮培养基(Difco，美国)和0.192％的无脲嘧啶的酵母合成缺失培养基补料(Difco，美国)]中培养。为了重组LK8的生产，每一株菌株在生物反应器(Biostat Q，B.Braun Biotech International，德国)中用YPDG培养基(2％的蛋白胨，1％的酵母膏，2％的葡萄糖，3％的半乳糖)培养(30℃，pH5.5，700rpm)。在发酵过程中，培养基每4小时回收，含有LK8蛋白的上清液通过离心(15,000rpm，5分钟)收集。培养液上清中的残糖浓度用液相色谱进行研究(图3)，用免疫印迹法定量分析分泌的重组LK8蛋白(图4)。
结果，LK8蛋白在每个转化菌株中分泌，表明pMCLK8表达载体成功地被引入。特别地，酿酒酵母BJ3501被证明是最佳的宿主，表现出了最高的每个细胞LK8蛋白分泌量。
<实施例3>LK8基因整合盒的构建和它在酵母染色体中的多重插入
构建了用于LK8表达盒插入酵母染色体的重组载体，所述表达盒由GAL1启动子、α-因子分泌信号、LK8cDNA的核苷酸序列和CYC1终止子组成。得到了一株被上述载体转染的转化菌株。
特别地，能够插入目的基因到δ序列(一种酵母染色体的过渡元件)中的pδneo载体(Lee，FWF.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，48：339，1997)被用作母载体。pδneo载体包括用于以同源重组进行多重插入的δ序列和用于插入载体选择的新霉素抗性基因(neo)。LK8表达盒和pδneo载体带有Sal I限制性酶识别位点。重组载体中的Sal I限制性酶识别位点对于载体在酵母染色体中的插入是必需的。因而，LK8表达盒中的Sal I限制性酶识别位点用DNA平端试剂盒(Takara，日本)除去。与此同时，用限制性内切酶Sac I和Kpn I切去上述实施例1中构建的pMCLK8载体的GAL1启动子和CYC1终止子的两端，将LK8表达盒分离出来。由于pδneo载体不具有Kpn I限制性酶识别位点，pδneo载体的Xba I限制性酶识别位点和分离出的LK8表达盒的Kpn I限制性酶识别位点都被制成平末端。然后，通过将LK8表达盒插入到以上构建的重组pδneo载体中，而构建了重组载体，命名为MδLK8(图5)。
通过用Sal I限制性内切酶处理，MδLK8被线性化。然后，用碱性阳离子酵母试剂盒(Q-Biogene，加拿大)将线性化的MδLK8转染一株酵母菌。为了使LK8表达盒能够大量地插入到酵母染色体中，线性化的MδLK8被浓缩到3μg/μl。
本发明中以线性化MδLK8重组整合盒转染的转化酵母利用含有G418硫酸盐的YPD平板(2％的蛋白胨，1％的酵母膏，2％的葡萄糖，2％的琼脂)进行筛选。这时，G418硫酸盐的浓度分别调整到5g/l，10g/l和15g/l，培养转化的酵母菌株。
结果，当LK8表达盒被大量插入酵母菌染色体中时，酵母甚至能够在高浓度G418硫酸盐的培养基中生长，LK8的活力也高(图6)。因此，由于LK8基因大量插入酵母染色体中，得到了数万个具有G418硫酸盐(甚至超过15g/l的浓度)抗性的转化酵母菌落。
<实施例4>用菌落免疫印迹法初筛LK8蛋白高产菌株
在上述实施例3选择得到的那些转化酵母菌株中，用菌落免疫印迹法初筛超量分泌LK8蛋白的菌株。
特别地，将转化酿酒酵母菌株涂布在YPD固体培养基上，接下来在30℃培养24小时。然后，观察到菌落的形成。无菌的纤维素膜被放在菌落上，然后小心地将其取下。与此同时，将硝化纤维膜放在YPD固体培养基上，把上述纤维素膜小心地放在硝化纤维膜上，不要产生气泡，使菌落附着在硝化纤维膜的上表面。然后，含有菌落的固体培养基在30℃培养48小时。将纤维素膜小心地取下，放在一个新的YPD固体培养基上。取下残留的硝化纤维膜用作印迹。
将硝化纤维膜放在添加了PBS缓冲液的溶液中，其中含有0.1％(v/v)的吐温20和5％(w/v)的脱脂奶粉，在室温下轻轻搅拌2小时。兔LK8抗体加入到同一溶液中，也在室温下轻轻搅拌1小时，接下来用含有0.1％吐温20的PBS缓冲液冲洗五次。将抗兔IgG-HRP(Sigma，美国)置于含有0.1％吐温20和5％脱脂奶粉的PBS缓冲溶液中，上述处理的硝化纤维膜被浸入其中，接下来在室温下轻轻搅拌1小时。用含有0.1％吐温20的PBS缓冲溶液冲洗五次。然后，硝化纤维膜被取出并转移到检测试剂盒(SuperSignal West Pico kit，Pierce，美国)提供的检测溶液(Pierce，美国)中，固定在放射胶片上。考察胶片上的阴影。
结果，阴影随表达的LK8的量而不同(图6)，特别地，那些显示更深阴影的菌株被初步选择出来。
<实施例5>用斑点印迹进行LK8蛋白高产菌株的第二轮筛选
在上述实施例4第一轮菌落筛选所得菌株中，分泌更多LK8蛋白的菌株用斑点印迹进行二次选择。
特别地，在实施例4初步选择得到的菌株被接种到含有YPG(2％的蛋白胨，1％的酵母膏，2％的半乳糖)液体培养基的试管中，接下来在30℃用180rpm转速振荡培养48小时。48小时后，培养液在5,000rpm离心5分钟，只收获上清。上清液用PBS稀释10倍，利用斑点印迹试剂盒(Bio-Rad，美国)将其附着于硝化纤维膜上。硝化纤维膜在0.5％(v/v)的戊二醛溶液中放5-10分钟，然后转移到50mM的甘氨酸溶液中，接下来用PBS缓冲液冲洗。然后，取出硝化纤维膜转移到固定在放射性胶片上的检测溶液中。通过检测试剂盒研究胶片上的阴影，和上述实施例4中描述的步骤类似。
结果，阴影随表达的LK8的量而不同(图7)，特别地，那些显示更深阴影的菌株被二次选择出来。
<实施例6>用ELISA法进行LK8蛋白高产菌株的第三轮筛选
在上述实施例5第二轮菌落筛选所得菌株中，大量分泌LK8蛋白的菌株用ELISA(酶联免疫吸附测定)法最终挑选。
特别地，二次选择得到的菌株被接种到含有YPD液体培养基的试管中，接下来在30℃用180rpm转速振荡培养48小时。培养液接种到含有50ml YPG液体培养基的摇瓶中。然后，用YPG液体培养基调整OD，摇瓶中的终体积设定到50ml。在30℃下用180rpm转速振荡培养48小时。培养液进行离心，只收获上清。
兔抗LK8抗体以0.25μg/孔的量置于免疫组件(MaxisorpTMImmunomodule，Nunc，美国)上，接下来用包被缓冲液(0.1M碳酸钠，pH9.6)进行包被用于ELISA。包被的免疫组件用含有1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％吐温20的PBS缓冲溶液处理，然后在室温下放置2小时。上清液用含有0.1％吐温20的PBS缓冲液稀释1000倍，放在免疫组件中在37℃进一步反应1小时。然后，免疫组件用含有1％BSA和0.1％吐温20的PBS缓冲溶液冲洗。
另一方面，大鼠抗LK8抗体用含有1％BSA和0.1％吐温20的PBS缓冲溶液稀释。溶液置于免疫组件中，接下来在37℃反应1小时。当反应结束时，免疫组件用含有1％BSA和0.1％吐温20的PBS缓冲溶液冲洗。
为上述反应过程，每一个免疫组件用TMB染色试剂(TMB过氧化物酶底物，KPL，美国)染色15分钟，然后用1M的磷酸盐溶液终止染色反应。测定OD405来定量LK8蛋白的表达。
【表1】
用标准曲线定量LK8的表达
  样品菌株   1   102   11   17   25   B9   B12   B31   B36
  μg/ml   113   97   57   80   104   63   59   103   129
用标准曲线定量LK8的表达(表1)。总之，表现了最佳LK8表达的菌株是B36，命名为酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36’。这个菌株于2004年1月13日被保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(#52，Aeun-dong yousung-ku，Daejeun city，Korea)(保藏编号KCTC10582BP)。
用DNA印迹杂交来研究菌株的重组LK8cDNA的拷贝数。结果，确定约有8个拷贝的LK8基因被成功地插入。
<实施例7>酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36的种子培养、分批培养和补料分批培养
<7-1>种子培养
在本发明中，转化酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36菌株被分装在数百或数千个无菌贮存瓶中，在同样的条件下保管，这就是本发明人为保存菌株而建立的“工作细胞库系统”，以使菌株适合在生产重组蛋白的种子培养时作为一个种子被使用。作为种子，转化菌株在YPD培养基(1％的酵母膏，2％的蛋白胨，2％葡萄糖)中培养24小时来保证所要的细胞量[和活力(在稀释20倍的情况下，OD600＝0.8-1.2)]。
<7-2>分批培养
在YPD培养基中进行种子培养。然后，在接种了上述实施例7-1的种子培养液的初始培养基中进行分批培养。在这个阶段，种子培养液接种量在1％以上，葡萄糖和半乳糖用作碳源以提高细胞数目并让它们适应半乳糖。初始培养基由1-5％(w/v)的葡萄糖、1-5％(w/v)的半乳糖，1-50g/l的酵母膏、1-10g/l的酪蛋白氨基酸、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的组氨酸组成。
依照培养基的组成，通气量调节到1-3vvm，搅拌速度控制在200-1000rpm。结果，在整个分批培养阶段溶氧保持在40％以上。
在这个阶段，细胞浓度达到了O.D.(600nm)为30以上。
<7-3>补料分批培养
补料分批培养是通过加入用作诱导剂和唯一碳源的半乳糖来提高细胞量和LK8蛋白分泌水平的阶段。
特别地，补料培养基含有20-50％(w/v)的半乳糖、1-50g/l的酵母膏、1-30g/l的蛋白胨、0.1-5g/l的尿嘧啶和0.1-5g/l的组氨酸，用于补料分批培养。这时，为了诱导LK8蛋白的超量分泌，以1ml/hr-30ml/hr的速度补加补料培养基，保持培养基中半乳糖的含量在5％(w/v)以下。
为了在补料分批培养中保持半乳糖浓度不变，定期测定它在培养液中的含量，然后在整个发酵过程中控制半乳糖的补加速度，使得LK8表达和分泌的增加(图8)。从补料分批培养看，培养液上清的LK8蛋白分泌了有每升几百毫克之多(图9)。
<实施例8>LK8的附加体表达和LK8染色体表达的比较
为了比较LK8蛋白在附加体表达和LK8染色体表达的分泌效能，在实施例2中表现出最高LK8表达效能的酿酒酵母BI3501/pMCLK8和在实施例6中制备的酿酒酵母BI3501/MδLK8#36用实施例7-2中的分批培养方法进行培养，然后测定它们中最大的LK8分泌量(图10)。结果，如图9所示，在分批培养30小时后，被染色体表达(酿酒酵母BI3501/MδLK8#36)所诱导的LK8分泌量是附加体表达(酿酒酵母BI3501/pMCLK8)所诱导的两倍。
<实施例9>用色谱法进行LK8蛋白的纯化
LK8蛋白是分子量为9-10kDa的亲水分子，其特征在于在中性pH条件下或有机溶剂中的低溶解度。在LK蛋白的表达过程中，培养液中观察到了其他比LK8蛋白更高或更低分子量的衍生物。那些衍生物似乎是从LK8蛋白的C-末端或N-末端切下的氨基酸或化学衍生物。基于LK8蛋白这样的物理化学特性和培养条件，为了生产高纯度的LK8蛋白，在本发明中建立了利用阳离子交换色谱和疏水作用色谱的纯化方法。精确地讲，通过阳离子交换色谱调节pH和盐浓度以除去杂质，接下来是LK8蛋白的洗脱。然后，进行疏水作用色谱使高亲水的LK8蛋白在高盐浓度条件下附着在固定的树脂上。通过降低盐浓度将杂质除去。在适当的盐浓度下进行LK8蛋白的洗脱，然后疏水杂质(疏水蛋白质、脂质或包括内毒素在内的非蛋白污染物)通过降低盐浓度被除去。本发明的纯化方法在下文中更加精确地逐步加以解释。
<9-1>阳离子交换色谱纯化
实施例7中获得的培养液在8,000rpm离心获得上清液。上清液用0.1-1M磷酸钠(一碱价的)溶液稀释4倍，pH调节到4以下。溶液用0.45μm的滤膜过滤。用SP-sepharose FF(fast flow)树脂填充柱子，接下来用0.1-1M磷酸钠溶液(一碱价的)平衡。然后，稀释的上清液被加载到SP-sepharose柱上。0.1-1M的磷酸钠溶液流过柱子到基线走直。用0.1-1M的磷酸钠溶液(pH5-7)冲洗柱子以除去杂质。然后，用含有0-2M NaCl的0.1-1M磷酸钠溶液(pH5-9)溢流进行LK8蛋白的洗脱。
从色谱图(图11)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(图12)确定，大部分杂质被0.1-1M的磷酸钠溶液冲洗而除去，只有LK8蛋白被含有0-2MNaCl的磷酸钠溶液从级分中洗脱出来。
<9-2>疏水作用色谱纯化
用SP-sepharose 6FF(fast flow)树脂填充柱子，接下来用含有0.1-3M硫酸铵和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸钠溶液(pH5-9)平衡柱子。实施例9-1中洗脱的样品用硫酸铵溶解(终浓度：0.1-3M)。然后，溶液被加载到SP-sepharose柱上。含有0.1-3M硫酸铵和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸钠溶液(pH5-9)流过柱子到基线走直。柱子用含有0.1-3M硫酸铵和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸钠溶液(pH5-9)冲洗。然后，用含有0.1-2M硫酸铵和0-2M NaCl的0.1-1M磷酸钠溶液(pH5-9)溢流进行LK8蛋白的洗脱。用滤膜(10,000D，Sigma，美国)以0.1-1M的磷酸钠溶液对洗脱的LK8蛋白进行透析。
从色谱图(图1)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(图13)确定，大部分杂质被含有0-2M NaCl的0.1-1M磷酸钠溶液(pH5-9)冲洗除去，只有LK8蛋白用硫酸铵和NaCl溶液从级分中洗脱出来。
【表2】
  LK8(mg)   回收率(％)
  加载   204.3   100
  SP-sepharose FF   160.6   80.1
  SP-phenylsepharose 6FF   134.9   66
上文说明了，通过阳离子交换色谱从实施例7制备的培养液中纯化LK8蛋白的回收率是80.1％，疏水作用色谱的回收率是66％(表2)。
工业适用性
在上文中说明了，通过在酿酒酵母菌株中插入LK8基因表达的染色体整合盒而制备了转化菌株。通过为上述菌株的分批培养和补料分批培养提供优化的培养条件，LK8基因能够在大规模发酵罐中有效地表达和分泌。利用本发明中有效的纯化方法，可以实现LK8蛋白的大量生产。因此，本发明的LK8蛋白的转化菌株和生产方法有望对LK8蛋白这一新型血管发生抑制剂的商业化做出巨大的贡献。
本领域技术人员应当理解，为了实现本发明同样的目的，前面说明书中公开的概念和特定实施方案可能容易地被用作修改或设计其他实施方案的基础。本领域技术人员还将理解，这样等价的实施方案没有背离如后附权利要求所阐明的本发明的实质和范围。
序列表
SEQ ID No：1是编码LK8蛋白的cDNA序列。
SEQ ID No：2是编码酿酒酵母α-因子分泌信号的DNA序列。
序列表
<110>财团法人牧岩生命工学研究所
<120>转化酿酒酵母和使用其大量生产LK8蛋白的方法
<130>4fpo-11-16
<150>KR10-2004-0005033
<151>2004-01-27
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>258
<212>DNA
<213>人类
<220>
<221>基因
<222>(1)..(258)
<223>LK8cDNA
<400>1
gaacaggact gcatgtttgg gaatgggaaa ggataccggg gcaagaaggc aaccactgtt    60
actgggacgc catgccagga atgggctgcc caggagcccc atagacacag cacgttcatt    120
ccagggacaa ataaatgggc aggtctggaa aaaaattact gccgtaaccc tgatggtgac    180
atcaatggtc cctggtgcta cacaatgaat ccaagaaaac tttttgacta ctgtgatatc    240
cctctctgtg catcctct                                                  258
<210>2
<211>255
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(255)
<223>α-因子分泌信号
<400>2
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct    60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt    120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat    180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta    240
tctctcgaga aaaga                                                     255

Claims (18)

1.一种MδLK8重组表达载体，其包括：依次含有启动子、分泌序列、SEQ ID No：1表示的LK8 cDNA和终止子的LK8表达盒，用于将LK8表达盒多重插入到宿主菌株染色体中的6序列，和在多重插入后用于选择的新霉素抗性基因(neo)。
2.权利要求1所述的MδLK8重组表达载体，其中，所述启动子是GAL1启动子，分泌序列是SEQ ID No：2表示的α-因子分泌信号，终止子是CYC1终止子。
3.通过用权利要求1所述载体转染宿主菌株而制备的一种转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
4.权利要求3所述的转化酿酒酵母菌株，其中所述宿主菌株选自由酿酒酵母BJ3501、酿酒酵母BY4742、酿酒酵母CEN.PK2-1D和酿酒酵母2805组成的组。
5.权利要求3所述的转化酿酒酵母菌株，其中所述菌株是酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36(保藏编号：KCTC 10582BP)。
6.一种制备高表达LK8蛋白的转化体的方法，该方法包括如下步骤：
(1)用权利要求1所述的重组载体转化宿主菌株；
(2)用G418硫酸盐抗生素处理后，培养步骤1中制备的转化体；和
(3)用免疫测定法选择LK8高表达的转化体。
7.权利要求6所述的方法，其中所述G418的处理浓度为5-20g/L。
8.权利要求6所述的方法，其中所述免疫测定法选自由菌落免疫印迹测定、斑点印迹测定和ELISA法(酶联免疫吸附测定)组成的组。
9.权利要求6所述的方法，其中所述的步骤3重复一到三次。
10.权利要求6所述的方法，其中所述的步骤3由如下步骤组成：1)用菌落免疫印迹进行初步选择；2)用斑点印迹从初步选择所得菌株中进行二次选择；和3)用ELISA法从二次选择所得菌株中进行最后选择。
11.一种大量生产LK8蛋白的方法，该方法包括如下步骤：
(1)通过在宿主菌株中插入权利要求1所述的重组LK8基因表达载体，制备一种转化菌株；
(2)将第1步制备的转化菌株进行种子培养和将所述菌株在含有葡萄糖与半乳糖作为碳源的液体培养基中进行分批培养，通过调节空气供应和/或搅拌速度来保持溶氧稳定；
(3)用含有半乳糖的补料培养基对步骤2的培养液进行补料分批培养；和
(4)从步骤3的培养液中纯化LK8蛋白。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述的步骤1的转化菌株是权利要求3的转化酿酒酵母。
13.如权利要求11所述的方法，其中第2步所述的分批培养是在1-3vvm(5-80l/分钟)的通气量和/或200-1000rpm的搅拌速度的条件下在液体培养基中进行的，所述液体培养基中含有1-5％(w/v)的葡萄糖和1-5％(w/v)的半乳糖作为碳源，其中将溶氧调节在最大溶氧的40-90％。
14.如权利要求11所述的方法，其中第3步所述的补料分批培养是用含有10-50％(w/v)半乳糖为碳源的液体培养基完成的，其中调整补料培养基的补料速度以保持所述培养基中半乳糖的含量为0.5-5％(w/v)。
15.如权利要求11所述的方法，其中第4步所述的LK8蛋白的纯化是通过色谱法完成的。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述的色谱法包括离子交换色谱和疏水作用色谱。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的交换色谱是阳离子交换色谱，LK8蛋白的洗脱是用含有0-5M NaCl的洗脱缓冲液(pH 4.0-8.0)完成的。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述的疏水作用色谱是用含有0.1-5M硫酸铵和0-500mM NaCl的0-100mM磷酸钠洗脱缓冲液(pH4-8)洗脱LK8蛋白而完成的。
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