CN1283227A - 在丝状真菌中表达克隆 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过在丝状真菌宿主细胞中表达克隆来分离编码具有需要的特性的蛋白质的DNA序列的方法。分离的DNA序列可用于生产需要的蛋白质的方法中。

Description

在丝状真菌中表达克隆
                        发明领域
本发明涉及通过利用丝状真菌作为宿主表达克隆来鉴定编码需要的蛋白质的DNA序列的方法。
                         发明背景
越来越多的具有需要特性的蛋白质成分是通过重组DNA技术生产的。重组DNA生产技术要求编码需要的蛋白质成分的DNA序列是可得的。传统的克隆编码需要的蛋白质的DNA序列的方法的缺点是不得不纯化每个蛋白质成分才能允许确定它的(部分)氨基酸序列或者允许生产特异的抗体。然后，可利用(部分)氨基酸序列设计杂交筛选用的寡核苷酸探针。或者，利用特异的抗体免疫筛选大肠杆菌中的表达文库如λ-gt11。两个方法都需要纯化和鉴定需要的蛋白质，这是一个耗时的过程。所以，通过利用筛选方法(涉及选择表达需要的蛋白质活性的克隆)，新蛋白质成分的克隆可能是相当迅速的。
过去，基于表达克隆的这样的筛选方法已经成功地用于在例如芽胞杆菌(参见，US 4，469，791)和大肠杆菌(例如，W0 95/18219和W095/34662)中的原核基因产物的鉴定。在一些情况中，同样利用细菌如大肠杆菌中的表达克隆已经鉴定了真核基因产物(例如，W097/13853)。但是，通常，原核生物是不太合适的用于真核基因的表达克隆的宿主，因为许多这样的基因不能在细菌中正确表达。例如，真核基因经常含有内含子，它们在细菌中不能剪接。虽然，利用真核基因的cDNAs在细菌中表达克隆可以解决这一剪接问题，但是，在细菌中许多真核基因产物还是不能生产成活化形式，因为在细菌中这些真核蛋白质不能正确折叠，或者这些蛋白质被细菌蛋白酶快速降解。另外，通常细菌不能有效地分泌活化形式的分泌性真核蛋白质，并且与真核生物相反，细菌没有糖基化蛋白质的能力。
近来，利用酵母作为宿主表达克隆真核基因已经克服了这些问题中的许多问题。Strasser等人(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，(1989)184：699-706)已经报道了通过在啤酒酵母中表达克隆真菌基因组DNA来鉴定真菌α-淀粉酶。同样，WO93/11249报道了在啤酒酵母中表达克隆真菌cDNAs来鉴定真菌纤维素酶。但是，已知酵母的分泌能力很差，特别是当与丝状真菌相比。许多分泌性异源蛋白质只能很差地从酵母中分泌(参见，例如Kingsman等人，1987，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)，5：53-57)。另外，已知酵母能够超糖基化异源蛋白质(Innis，1989，见：酵母基因工程，Barr，Brake和Valenzuela(eds)，Butterworth，Boston，pp233-246)。差分泌作用和超糖基化这两者很可能干扰在酵母中表达克隆，因为它可以明显减少检测编码具有需要的特性的蛋白质的给定DNA序列的机会。特别是在编码真核生物如丝状真菌生产的并且经常是分泌的和糖基化的许多有用的酶的DNA序列中这个问题很突出。所以需要一种使检测编码分泌的和可能糖基化的蛋白质的DNA序列的机会最佳并且适用于鉴定编码真核生物特别是丝状真菌生产的蛋白质和酶的DNA序列的表达克隆系统。或者，该表达克隆系统应该也适用于编码真核或丝状真菌的非分泌蛋白质的DNA序列的鉴定。
                   附图的简要说明
图1：中间产物型表达载体，pGBTOP8的构建。文中有这一构建途径的详细说明。
图2：表达载体pGBFin2和pGBFin5的构建。文中有这一构建途径的详细说明。
图3：pGBFin12的物理图。
图4：pGBFin11的物理图。
图5：pGBFin13的物理图。
图6：pGBFin17的物理图。
图7：pGBFin18的物理图。
图8：pGBFin22的物理图。
图9：pGBFin19的物理图。
图10：pGBFin23的物理图。
图11：pGBFin6的物理图。
图12：pAN8-1的物理图。
图13：pGBFin14的物理图。
图14：pGBFin15的物理图。
                 本发明的说明
本发明涉及分离编码一个或多个具有需要的特性的蛋白质的DNA序列的方法。该方法优选地包括步骤：(a)从怀疑能够生产一个或多个具有需要的特性的蛋白质的生物体，在适当的克隆载体中制备DNA文库；(b)利用DNA文库转化丝状真菌宿主细胞；(c)在允许如DNA文库中存在的编码具有需要特性的蛋白质的DNA序列的表达的条件下培养(b)中获得的转化宿主细胞；和(d)通过分析(c)中生产的蛋白质来筛选表达具有需要的特性的蛋白质的转化宿主细胞的克隆。
任何能够转化丝状真菌宿主细胞和能够接受来自DNA文库的DNA片断的克隆载体都适用于本发明的方法。所以，用于本发明的克隆载体包括随机整合在丝状真菌宿主细胞的染色体中或整合在预定靶基团座上的整合克隆载体，以及自主维持的克隆载体如基于AMA1-序列的载体。在本发明的优选的方面，整合克隆载体包括定向克隆载体整合到预定基团座的与丝状真菌宿主细胞基因组中的预定靶基团座中的DNA序列同源的DNA片断。为了促进定向整合，在转化宿主细胞之前，优选地将克隆载体线性化。优选地进行的线性化是能够使至少一端，但优选地使克隆载体的两端侧接与靶基团座同源的序列。侧接靶基团座的同源序列的长度优选地至少0.5kb，更优选地至少1kb，最优选地至少2kb。在预定基团座整合克隆载体将促进文库中各个克隆的表达水平的均一性，从而增加文库中每个克隆以可检测的水平表达的机会。在本发明的更优选的方面，与靶基团座同源的克隆载体中的DNA序列源于能够在丝状真菌宿主细胞中高水平表达的基因。本文定义能够高水平表达的基因即高表达基因为，例如在诱导条件下其mRNA可占总细胞mRNA的至少0.5％(w/w)的基因，或者是其基因产物可占总细胞蛋白质的至少1％(w/w)，或在分泌性基因产物的情况中，可以分泌的水平至少为0.1克/升的基因。
在本发明的另一优选方面，克隆载体包括用于表达文库中编码具有需要的特性的蛋白质的DNA序列的启动子，因此，这一启动子优选地源于高表达的丝状真菌基因。令技术人员满意的是用于定向的同源DNA序列可能与启动子序列同在一个DNA片段上。
通过实例给出了许多优选的高表达真菌基因：来自曲霉或木霉的淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶，木聚糖酶，磷酸甘油醛脱氢酶，或纤维二糖水解酶基因。用于这些目的的最优选的高表达基因是黑曲霉葡糖淀粉酶基因，米曲霉TAKA-淀粉酶基因，构巢曲霉gpdA基因，或Tricho-derma reesei纤维二糖水解酶基因。这些高表达基因既适合作为克隆载体整合的靶基团座，也适合作为表达文库片断的高表达启动子的来源。
在另一个优选的实施方案中，利用在丝状真菌中自主维持的克隆载体使各个文库克隆的表达水平均一化。在叙述含有AMA1序列的克隆载体的构建和利用的实施例8中公开了这样的自主维持的克隆载体的例子。AMA1是从构巢曲霉分离的能够在曲霉中自主维持的6.0kb的基因组DNA片断(参见例如，Aleksenko和Clutterbuck(1997)，真菌遗传生物学，21∶373-397)。用于本发明的方法的基于AMA1的克隆载体的优点是与整合型克隆载体相比具有更高的转化频率。基于AMA1的克隆载体也提供了在允许容易地检测文库中具有需要特性的蛋白质的合理水平均一表达各个文库克隆。但是，为了避免由于其低劣的分离而引起的基于AMA1的克隆载体的丢失，基于AMA1的克隆载体在转化体的生长过程中的确需要维持选择压力。
克隆载体可任选地进一步含有可操作地连接启动子和克隆位点上游的信号序列，从而能够分泌由插入克隆位点的文库中的DNA片段编码的蛋白质。分泌可以简化蛋白质的检测。在本发明的另一实施方案中，克隆载体含有编码高分泌的蛋白质的基因，如黑曲霉葡糖淀粉酶基因。在克隆载体中的高分泌基因含有用于文库片段的插入的克隆位点，该克隆位点的定位能够使文库片段编码的蛋白质作为与高分泌蛋白质的融合蛋白质产生。根据EP-A-O 429 628，这样将促进它们的分泌。
从用于丝状真菌的转化的许多标记基因可以选择克隆载体中的选择标记基因。例如，这些标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)基因，营养缺陷型标记基因如argB，trpC，或pyrG和提供抗性的抗生素抗性基因，所述抗性例如是抗腐草霉素，潮霉素B或G418。在本发明的优选方面，克隆载体含有的选择标记基因在转化体的选择过程中由真菌宿主细胞在足够水平表达以便避免偏向于选择在宿主细胞基因组中整合了多个拷贝的克隆载体的转化体。用于这一目的的优选的选择标记基因是与构巢曲霉gpdA启动子融合的构巢曲霉amdS编码序列。
本发明的宿主细胞是能够利用克隆载体转化的丝状真菌。对于至今测试的大多数丝状真菌，发现它们可以利用为曲霉属开发的转化方案(源于主要是Tilburn等人，1983，基因(Gene)26：205-221)转化。技术人员将会认识到丝状真菌宿主种类的成功转化不局限于利用本文具体例举的载体，选择标记系统，启动子和转化方案。
本文的丝状真菌的定义是丝状形式的真菌亚门的真核微生物，即其营养生长的途径是菌丝延长。优选的丝状真菌宿主细胞选自包括曲霉属，木霉属，镰孢属，青霉属和枝顶孢属的组。在另一优选的实施方案中，例如当需要的蛋白质是嗜热蛋白质时，优选的丝状真菌宿主细胞选自包括踝节菌属(Talaromyces)，梭孢壳属，毁丝霉属，嗜热子囊菌属，侧孢霉属，毛壳菌属，栉霉属和Scytalidium属的嗜热真菌的组。
在一个更优选的本发明的实施方案中，丝状真菌宿主细胞选自包括构巢曲霉，米曲霉，酱油曲霉，黑曲霉组的曲霉和Trichoderma reesei的组。根据Raper和Fennell(1965，见：曲霉属(The GenusAspergillus)，Williams和Wilkins公司，巴尔的摩，pp293-344)本文定义了黑曲霉组，该黑曲霉组包括由这些作者包括在其中的所有(黑色)曲霉。
在本发明的另一优选方面，至少当与一个整合型克隆载体组合用于本发明的方法中时，该丝状真菌宿主细胞含有多拷贝的预定靶基团座，所述整合型克隆载体含有与预定靶基团座中的DNA序列同源的DNA片段。更优选地，宿主细胞含有多拷贝的含有高表达基因(如上面例举的高表达真菌基因)的靶基团座。具有多拷贝的靶基团座的宿主细胞的优点是利用这些宿主细胞增加了整合定向转化的频率，所以增加了获得文库中每个单独克隆的有效表达的转化体的机会。
怀疑生产一个或多个具有需要的特性的蛋白质的生物体通常是真核生物，优选是真菌，最优选的是丝状真菌。这些生物体已知能生产许多种类的可用于工业应用的蛋白质。
在本发明的方法中，来自怀疑能够生产一个或多个具有需要特性的蛋白质的生物体的DNA片段的文库可能是基因组文库或cDNA文库。但是，优选地，利用cDNA文库以避免在宿主生物体中识别启动子或剪接信号的问题。优选地，从生长在允许表达具有需要的特性的蛋白质的条件下的源生物体分离的mRNA制备cDNA文库。
如果检测真菌宿主细胞表达的该蛋白质的测试方法是可得的，本发明的方法可以用于分离编码任何具有需要特性的蛋白质的DNA序列。优选地，该具有需要特性的蛋白质是酶。可以通过本发明的方法鉴定的酶的例子是糖酶，例如纤维素酶如内切葡聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶，半纤维素酶或果胶分解酶如木聚糖酶，木糖苷酶，甘露聚糖酶，半乳聚糖酶，半乳糖苷酶，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶，阿拉伯聚糖酶，聚半乳糖醛酸酶，裂合酶，或淀粉分解酶；磷酸酶如植酸酶，酯酶如脂肪酶，蛋白酶，氧化还原酶如氧化酶，转移酶，或异构酶。
在利用DNA文库转化丝状真菌宿主细胞后，筛选表达具有需要的特性的蛋白质的转化的克隆。根据检测具有需要的特性的蛋白质需要的测试方法，在固体培养基如琼脂平板上或在液体培养基中作为菌落繁殖和储藏转化的克隆，因此可以在微滴平板的孔中生长，储藏和/或测试各个文库克隆。
许多种类的检测具有需要的特性的蛋白质的系统是技术人员知道的。因为文库克隆可以在固体培养基上以及液体培养基中生长，这些检测系统包括了所有检测蛋白质或酶活性的可能的测试方法。这些测试系统的例子包括但不限于基于固体培养基上菌落周围的明亮带的测试，以及比色，测光，比浊，测粘度，免疫学，生物学，色谱法和其它可得的测试方法。
技术人员能够理解的是对本领域已知的克隆方法常规修改同样可用于本发明的方法。所述修改包括但不限于例如筛选文库克隆库，筛选许多具有需要特性的不同蛋白质的相同文库，以及再筛选，再分离和再克隆阳性克隆以保证更精确的结果。
技术人员可获得许多种方法从在筛选方法中鉴定的转化宿主细胞中分离编码具有需要特性的蛋白质的DNA序列，和随后鉴定分离的DNA序列。
按如上所述的本发明的筛选方法分离的DNA序列被用于生产DNA序列编码的具有需要特性的蛋白质，或促进它的生产。有利的是，在上面所述的筛选方法中分离的转化丝状真菌宿主细胞可直接用于生产具有需要特性的蛋白质的方法中，该方法是：在允许需要的蛋白质的表达的条件下培养转化的宿主细胞和任选地回收蛋白质。但是，通常，在本发明的筛选方法中分离的最初转化的宿主细胞将具有满足筛选目的但可以明显为经济生产目的明显改进的表达水平。为此，将DNA序列插入表达载体，该载体随后用于转化适当的宿主细胞。在表达载体中，DNA序列可操作地连接适当的表达信号，如启动子，非强制性地连接信号序列和终止子，它们能够指导宿主生物体中蛋白质的表达。适当的生产蛋白质的宿主细胞优选地是酵母或丝状真菌。优选地，酵母宿主细胞选自包括糖酵母属，克鲁维酵母属，Yarrowia，毕赤酵母属和汉逊酵母属的组。优选的丝状真菌宿主细胞选自上面作为优选的宿主细胞用于筛选方法而列出的相同的属。最优选的丝状真菌宿主细胞选自包括黑曲霉组的曲霉，米曲霉和Trichoderma reesei的组。通过技术人员可以得到的各种方案中的任一种，利用表达载体转化适当的宿主细胞。随后，将转化的宿主细胞用于生产需要的蛋白质的方法中，该方法是：在允许表达编码蛋白质的DNA序列的条件下培养转化宿主细胞和回收该蛋白质。
下面的实施例进一步说明了本发明。
                  实施例名称phyA    编码植酸酶的无花果曲霉(A.ficuum)phyA基因xylA    编码木聚糖酶的塔宾曲霉(A.tubigensis)xylA基因amdS    编码乙酰胺酶的构巢曲霉(A.nidulans)amdS基因(Corrick等人，1987基因(Gene)53∶63-71)glaA    编码葡糖淀粉酶的黑曲霉glaA基因gpdA    编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的构巢曲霉gpdA基因(Punt等人，1988，基因，69∶49-57)PgpdA   gpdA启动子PglaA   glaA启动子TamdS   amdS终止子TglaA   glaA终止子GLA       黑曲霉葡糖淀粉酶蛋白质缩写kb        千碱基bp        碱基对oligo     寡核苷酸PCR       聚合酶链式反应PDA       马铃薯葡糖琼脂利用的寡核苷酸在实施例l-3中利用的寡核苷酸列出在序列表中。
                    材料和方法
一般方法
如Sambrook等人(1989)“分子克隆：实验室手册”，冷泉港实验室，冷泉港，纽约和Innis等人(1990)“PCR方案，方法和应用的指导手册”学术出版社，圣迭戈所述进行标准的分子克隆技术如DNA分离，凝胶电泳，核酸的酶限制修饰，Southern分析，大肠杆菌转化等等。从ISOGEN Bioscience(Maarssen，荷兰)获得合成的寡脱氧核苷酸。根据制造商的说明，在应用生物系统373A DNA测序仪上进行DNA测序分析。
DNA标记和杂交
根据ECLTM直接核酸标记和检测系统(Amersham LIFE SCIENCE，Little Chalfont，英格兰)或根据如Sambrooke等人1989所述的标准放射性标记技术进行DNA标记和杂交。
转化黑曲霉
根据进行如下修饰的Tiburn，J.等人(1983)基因(Gene)26，205-221和Kelly，J.和Hynes，M.(1985)EMBO J.4，475-479所述的方法进行黑曲霉的转化：在曲霉基本培养基中300rpm旋转振摇，30℃让孢子生长16小时。曲霉基本培养基每升含有：6克NaNO3，0.52克KCl，1．52克KH2PO4，1.12毫升4M的KOH，0.52克MgSO4.7H2O，10克葡萄糖，1克酪蛋白氨基酸，22毫克ZnSO4.7H2O，11毫克H3BO3，5毫克FeSO4.7H2O，1.7毫克CoCl2.6H2O，1.6毫克CuSO4.5H2O，5毫克MnCl2.2H2O，1.5毫克Na2MoO4.2H2O，50毫克EDTA，2毫克核黄素，2毫克盐酸硫胺素，2毫克尼克酰胺，1毫克盐酸吡哆醇，0.2毫克泛酸，4克生物素，10毫升青霉素(5000IU/毫升)链霉素(5000UG/毫升)溶液(Gibco)。
-利用Novozym 234TM(Novo工业)而不是解旋酶制备原生质体；
-在原生质体形成(60-90分钟)后，加入KC缓冲盐(0.8M KCl，9.5mM柠檬酸，pH6.2)直到最后体积45毫升，将原生质体悬浮液在4℃，在吊桶式转头中，3000rpm离心10分钟。将原生质体再悬浮于20毫升KC缓冲液中，随后加入25毫升STC缓冲液(1.2M山梨醇，10mM pH7.5的Tris-HCl，50mM CaCl2)。在4℃，在吊桶式转头中，3000rpm离心原生质体悬浮液10分钟，在STC缓冲液中洗涤，再悬浮于STC缓冲液中，原生质体的浓度为108个原生质体/毫升；
-在200升的原生质体悬浮液中，加入溶解于10升TE缓冲液(10mMpH7.5的Tris-HCl，0.1mM EDTA)和100升PEG溶液(20％PEG4000(Merck)，0.8M山梨醇，10mM的pH7.5的Tris-HCl，50mM CaCl2)的DNA片段。
-在室温下温育DNA-原生质体悬浮液10分钟后，慢慢加入1.5毫升PEG溶液(60％PEG 4000(Merck)，10mM pH7.5的Tris-HCl，50mMCaCl2)，重复混合各管。在室温下温育20分钟后，利用5毫升1.2M的山梨醇稀释悬浮液，颠倒混合，并且在室温下，4000rpm离心10分钟。在1毫升1．2M山梨醇中温和再悬浮原生质体，并且涂布在选择再生培养基上，在选择乙酰胺的情况中，它含有曲霉基本培养基而没有核黄素，盐酸硫胺素，尼克酰胺，吡哆醇，泛酸，生物素，酪蛋白氨基酸和葡萄糖，补充了10mM乙酰胺作为唯一的氮源和1M蔗糖作为渗压剂和C源，或者在选择腐草霉素的情况中，补充了1-30微克/毫升腐草霉素和1M蔗糖作为渗压剂的PDA上。利用2％ Oxoid No.1琼脂固化再生平板。在30℃温育6-10天后，将转化体的分生孢子转移到含有曲霉的选择培养基(在选择乙酰胺的情况中是含有乙酰胺作为唯一氮源的基本培养基，或在选择腐草霉素的情况中是补充了1-30微克/毫升腐草霉素的PDA)的平板上，培养基含有2％的葡萄糖而不是蔗糖和1.5％的琼脂糖而不是琼脂，在30℃温育5-10天。分离单个转化体，重复一次选择纯化步骤，然后保存纯化的转化体。
在真菌菌丝体上的直接PCR
在30℃，在含有PDA的平板上温育转化体两天。将约三分之一的菌落在补充了5毫克/毫升的NovozymTM 234的50升KC缓冲液(60克/升KCl，2克/升柠檬酸，pH6.2)中37℃温育2小时。随后加入100升(10mM Tris，50mM EDTA，150mM NaCl，1％SDS，pH8)和400升QIAquickTM PB缓冲液(Qiagen公司，Chatsworth，美国)。将萃取物温和地再悬浮于和加载在QIAquickTM自旋柱。在13000rpm在微型离心机中离心该柱1分钟，利用500升QIAquickTM PE缓冲液洗涤一次。通过最后的快速旋转除去痕量的乙醇。通过加入50升H2O并且随后在13000rpm离心1分钟而从柱上洗脱染色体DNA(PCR模板)。PCR反应包括10升 eLONGaseTM B缓冲液(LifeTechnologies，Breda，荷兰)，14升dNTPs(每个1.25mM)，1升eLONGaseTM酶混合物，1升模板和10-30pmol每种寡核苷酸，最后体积50升。根据实验确定每批购买物中寡核苷酸的最适含量。一般利用10-30pmol根据下面的循环条件进行反应：1×(2分钟)94℃，10×(15秒94℃，30秒55℃，4分钟68℃)，20×(15秒94℃，30秒，55℃4分钟，以趋向于20秒每个循环开始的68℃)，1×(10分钟68℃)。将样品加载在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
黑曲霉摇瓶发酵
在重组体和对照黑曲霉菌株中，在根据制造商的指导制备的选择培养基平板或PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂，Oxoid)上涂布孢子或菌丝体产生了大批量的孢子。在30℃生长3-7天后，在平板上加入0.01％TritonX-100后收集孢子。在利用无菌软化水洗涤后，将约107个选定转化体和对照菌株的孢子接种到含有20毫升液体预培养基的摇瓶中，每升预培养液体培养基含有：30克麦芽糖.H2O，5克酵母提取物，10克水解酪蛋白，1克KH2PO4，0.5克MgSO4.7H2O，0.03克ZnCl2，0.02克CaCl2，0.01克MnSO4.4H2O，0.3克FeSO4.7H2O，3克吐温80，10毫升青霉素(5000IU/毫升)/链霉素(5000UG/毫升)，pH5.5和在选择腐草霉素的情况下1-30微克/毫升的腐草霉素。在34℃让这些培养物生长20-40小时。将10毫升该培养物接种到100毫升黑曲霉发酵培养基，每升发酵培养基含有：70克葡萄糖，25克水解酪蛋白，12.5克酵母提取物，1克KH2PO4，2克K2SO4，0.5克MgSO4.7H2O，0.03克ZnCl2，0.02克CaCl2，0.01克MnSO4.4H2O，0.3克FeSO4.7H2O，10毫升青霉素(5000IU/毫升)/链霉素(5000UG/毫升)，利用4N H2SO4调节pH到5.6，和在选择腐草霉素的情况下1-30微克/毫升的腐草霉素。在34℃让这些培养物生长6天。将取自发酵肉汤的样品离心(10分钟，5.000rpm，吊桶式离心机中)，并且收集上清液。对这些上清液进行木聚糖酶或植酸酶活性的测试(参见下面)。
植酸酶活性测试
在96孔微滴盘中的30升含有0.25M pH5.5的乙酸钠缓冲液，1mM植酸(钠盐，Sigma P-3168)的底物混合物中加入摇瓶黑曲霉发酵(参照20升软化水)的20微升上清液(需要时可以稀释)，并且在室温下温育25分钟。加入150升终止混合物(300毫升0.67％(NH4)6Mo7O24.4H2O，2％的H2SO4，3.3％三氯乙酸中含有14.6克FeSO4.7H2O)终止反应。在室温下温育5分钟后，在Anthosreader(Proton和Wilton)中分光光度测量690纳米处蓝色吸光值。测量值表明植酸酶的活性在0-175单位/毫升的范围。如EPO 0 420 358A所述测量植酸酶活性。木聚糖酶活性的测定
将上清液(需要时可预先稀释)在0.25M pH4.5的乙酸钠缓冲液中稀释5倍。将20微升稀释的上清液转移到微滴盘，加入50微升底物(4％w/v的在70℃溶解于软化水中的Remazol 亮蓝RBB-Xylan)，并且通过抽吸完全混合。在室温下温育反应物30分钟。加入200升96％乙醇终止反应，在室温下温育10分钟。在反应终止后，在室温下在Beckman GPK离心机中，2500rpm离心微滴平板10分钟。将100升上清液转移到新微滴盘中，在Anthosreader(Proton和Wilton)，分光光度测量620纳米处蓝色吸光值。根据溶解于0.25M pH4.5的乙酸钠缓冲液的木聚糖酶标准物，从校正曲线计算比活性。测量值表明木聚糖酶的活性范围是0-150EXU/毫升。木聚糖酶的活性单位如EP 0 463 706定义。RNA分离
在补充了0.1％酵母提取物和3％斯卑尔特燕麦(oat spelt)木聚糖(Serva)的曲霉基本培养基中培养塔宾曲霉菌株DS116813(CBS323.90)，每升所述基本培养基含有6克NaNO3，0.52克KCl，1．52克KH2PO4，1.12毫升4M KOH，0.52克MgSO4.7H2O，22毫克ZnSO4.7H2O，11毫克H3BO3，5毫克FeSO4.7H2O，1．7毫克CoCl2.6H2O，1.6毫克CuSO4.5H2O，5毫克MnCl2.2H2O，1.5毫克Na2MoO4.2H2O，50毫克EDTA，10克葡萄糖。在100毫升培养基中接种2·108个孢子，在30℃，300rpm的旋转振摇温育器中培养48小时。利用Miracloth过滤包过滤收集菌丝体，利用软化水充分洗涤，在纸巾之间挤压，除去过量的水。立即在液氮中冷冻菌丝体，利用研钵和杵研磨成细粉末。将得到的粉末转移到无菌的50毫升管中并称量，在每1-1．2克研磨的菌丝体中加入10毫升TRIzol试剂(Gibco/BRL)(最多每管25毫升)。剧烈混合立即溶解菌丝体粉末(涡旋1分钟)，接着在室温下温育5分钟，并偶尔混合。加入0.2(初始TRIzol)体积的氯仿(每10毫升初始使用的TRIzol加入2毫升)，涡旋，保留在室温下10分钟。随后，在4℃，6000g离心混合物30分钟。将上面的水相转移到新管中，加入0.5(初始TRIzol)体积的异丙醇(每10毫升初始使用的TRIzol加入5毫升异丙醇)沉淀总RNA。在室温下沉淀10分钟后，在6000g离心30分钟回收RNA。在除去上清液后，利用一个体积的70％的乙醇漂洗RNA沉淀。在除去乙醇后，空气干燥RNA沉淀。将干燥的RNA沉淀溶解于3毫升GTS缓冲液(100mMpH7.5的Tris-Cl，4M硫氰酸胍，0.5％十二烷基肌氨酸钠)。利用10微升RNA溶液确定核酸的质量和浓度。通过在CsCl溶液中离心纯化RNA
利用修改的Sambrooke等人(分子克隆，第二版，冷泉港实验室，1989)所述的方法进一步纯化分离的RNA。
将96克CsCl溶解于70毫升pH7.5的10mM EDTA中制备CsCl/EDTA溶液。加DEPC直到最后浓度为0.1％。在室温下保留溶液30分钟，随后在液体循环下，在15磅/平方英寸(psi)的压力下高压灭菌20分钟。在冷却溶液后，利用DEPC处理的水将体积调节到100毫升。将1.5毫升的该CsCl/EDTA溶液加入每个同质异晶聚合物(2”×0.5”，5毫升容量)超离心试管。在1.5毫升CsCl/EDTA垫上铺3毫升RNA样品(在GTS中)。利用GTS填充超离心管到距离管顶5毫米之内。利用GTS精确地平衡填充的超离心管，放置于匹配的超离心桶中。在20℃慢慢加速到35.000rpm离心超离心管18小时，关掉闸刀降速。在离心后，用清洁的巴士德吸管分别吸走CsCl垫上的顶层和部分垫层(管中留下0.5厘米CsCl垫层)。用热的剃刀片切下管的底部，除去残留的液体。用70％的乙醇在室温下填充管底部。倒转管底，空气干燥RNA沉淀。将RNA沉淀溶解于1毫升的TE(PHARMACIA mRNA纯化试剂盒的洗脱缓冲液；参见mRNA分离)。再次取10微升检测质量和含量。
mRNA分离
为了分离mRNA，利用了PHARMACIA纯化试剂盒(Cat#27-9258-02)的修改的方案(利用重力流动而不是离心)。
重复颠倒让PHARMACIA柱完全再悬浮，利用重力流动填充柱。将柱放置于50℃的温度下，利用1毫升高盐缓冲液洗涤。在65℃，加热RNA溶液(在TE中)5分钟。然后加入200微升样品缓冲液，将RNA溶液加载到柱上。收集流出物，然后再加载到柱上。利用0.5毫升高盐缓冲液洗涤柱3次，随后利用0.5毫升低盐缓冲液洗涤几次，直到再没有吸收紫外的物质从柱中洗脱出来。用预热(65℃)的洗脱缓冲液洗脱poly(A)+RNA，从中收集4-5个0.25毫升的级分。通过分光光度确定各个级分的浓度，合并0.D.260/280比例至少1.5的级分。加入0.1体积的样品缓冲液和2体积的无水乙醇，在-20℃保温溶液过夜。
Northern分析
在含有6％甲醛的琼脂糖凝胶上并利用1×MOPS(20mM MOPS/pH7.0，1mM EDTA)作为电泳缓冲液电泳分离RNA。在总体积20升的加载缓冲液(最后浓度：20mM MOPS/pH7.0，1mM EDTA，6％甲醛，50％甲酰胺，0.05克溴化乙锭)中溶解样品(约10克总RNA或1克mRNA)，在68℃加热10分钟变性。在100伏电压下电泳3-4小时后，在紫外照明器下可见RNA。为了Northern分析，将凝胶在软化水中洗涤20分钟，并通过毛细印迹转移到Hybond-N+(Amersham)尼龙膜上。在80℃烘烤2小时将RNA固定在膜上。利用Sambrook等人1989所述的ECLTM系统或标准放射活性标记技术检测特定的转录物。
在碱性琼脂糖凝胶上电泳分析cDNA
这一对照分析步骤显示出了合成的cDNA的大小，并用于检测潜在存在的发夹结构。因为第二链合成的特异活性比第一链合成的特异活性低得多，所以，第二链合成利用的体积10倍于第一链合成利用的体积。
经过在54毫升水中熔化0.6克琼脂糖，冷却到55℃，加入6毫升10×的碱性缓冲液(0.3M NaOH，20mM EDTA)，混合和灌制来制备一个薄的1％的琼脂糖凝胶。将样品与2X的碱性凝胶加载缓冲液(30mMNaOH，20％甘油，1/10体积的饱和溴酚蓝)混合(1∶1)。在1×的碱性缓冲液中电泳样品(边上跑32P-标记的分子量标记)。将凝胶在7％的乙酸中固定30分钟，在Whatman 3MM纸上印迹，并干燥。将干燥的凝胶在X光胶片上曝光，在自动胶片处理机中显影。
cDNA合成
为了合成cDNA，利用了SuperscriptTM选择系统(Gibco-BRL)和STRATAGENE cDNA合成试剂盒。
当利用SuperscriptTM选择系统合成cDNA时，根据制造商的说明，除了将寡核苷酸6967用于第一链的合成，和将寡核苷酸7676(5’-磷酸化)和7677(非磷酸化)用作衔接子之外，利用了5微克mRNA。通过混合在10mM的Tris-HCl/pH7.5，1mM的EDTA，1mM的MgCl2中的等摩尔量的寡核苷酸7676与7677进行这两个寡核苷酸的退火。在80℃水浴温育混合物10分钟，然后允许将水慢慢冷却到室温。
为了利用Strategene cDNA合成试剂盒合成cDNA，将在所述的pGBFIN载体中克隆的方案最佳化。主要的改变是：1)通过TCA沉淀定量合成的cDNA的量。2)删除在cDNA未端的磷酸化，而将cDNA与具有磷酸化末端的载体DNA连接。3)在用XhoI消化后，而不是在大小分级分离后利用酚/氯仿萃取cDNA。4)在合成第一链时利用MMLV-RT(STRATAGENE)和THERMOSCRIPT(Gibco/BRT)两者，产生的cDNA的长度总是比单独利用任一个酶产生的cDNA长。5)另外进行利用[α32P]dATP(为了预防干扰合成利用800居里/毫摩尔)追踪的对照反应作为质量参照；
将第一链成分和poly(A)+RNA合并，根据方案混合，在室温下保留10分钟允许引物-模板退火。
在第一链反应物中加入1.5微升MMLV-RT(50单位/微升)和1微升THERMOSCRIPT(15单位/微升，GibcoBRL)，获得的最后反应体积为50微升。在混合后，取5微升反应混合物，加到0.5微升[α32P]dATP(800居里/毫摩尔)获得具有放射活性的第一链对照反应物。将第一链合成反应物在37℃温育0.5小时，接着在55℃温育0.5小时。
将非放射活性的第一链合成反应物放置于冰上，加入20微升10×第二链缓冲液，6微升第二链dNTP混合物，114微升无菌蒸馏水，2微升[α32P]dATP(800居里/毫摩尔)，2微升RNase H(1．5单位/毫升)和11微升DNA聚合酶I(9.0单位/微升)。在混合后，在16℃保温反应混合物2.5小时。在保温后，移取10微升并冷冻。
TCA沉淀估计合成的cDNA的量
将1微升第一链放射活性(对照)反应物与20微升水混合。同样，将2微升第二链合成反应物与20微升水混合。将各5微升这样获得溶液点在Whatmann玻璃纤维滤纸(GF/C或GF/A，23毫米直径)上(每个对照溶液做4份)，空气干燥。将滤纸转移到200毫升冰冷的5％三氯乙酸(TCA)和20mM焦磷酸钠中。每2分钟更换冰冷的TCA/焦磷酸钠溶液3-4次。用70％的乙醇在室温下漂洗滤纸2分钟。将每个滤纸插入闪烁瓶中，加入10毫升闪烁液，计算放射活性物质，在此基础上计算cDNA的特异活性。
将cDNA末端平齐化以及衔接子的连接
在第二链合成反应物中，加入23微升末端平齐化的dNTP混合物和2微升Pfu DNA聚合酶(2.5单位/微升)，然后在72℃温育反应混合物30分钟。将反应混合物进行酚/氯仿萃取[200微升溶液1∶1(v/v)，pH7-8]，氯仿萃取(200微升)，加入20微升3M的乙酸钠和400微升绝对乙醇接着在-20℃保温过夜而使cDNA沉淀。通过离心收集cDNA，利用70％的乙醇洗涤，空气干燥获得的cDNA沉淀，再悬浮于8微升衔接子溶液。加入1微升10×的连接酶缓冲液，1微升rATP和1微升T4 DNA连接酶，在8℃过夜或在4℃下2天保温连接混合物。然后，在70℃下保温30分钟失活连接酶。
限制酶消化cDNA和大小分级分离
在cDNA中加入10微升无菌水(为了补偿删除了的磷酸化步骤中的体积)，28微升限制酶缓冲液和3微升限制酶(40单位/微升)。在37℃保温反应物1.5小时。在加入30微升无菌水和10微升10×STE后，用100微升酚/氯仿萃取反应混合物，接着用100微升氯仿萃取。在加入200微升绝对乙醇(和在-20℃过夜沉淀)后通过离心收集cDNA。干燥，再悬浮于14微升1×STE，加入3.5微升柱加载染料。
将SEPHAROSE CL-2B基质和STE缓冲液平衡到室温，再悬浮，用于在1毫升的玻璃吸头中装柱。
在SEPHAROSE基质固定后，用10-15毫升STE洗涤柱。加载样品，然后加3毫升STE，收集0.3毫升的级分(用Geiger计数器检测整个过程)。在闪烁计数器中测量估计每个级分的放射活性。
非变性凝胶电泳分析
将3毫升10×TBE，5毫升30％丙烯酰胺[(w/v)，29：1的丙烯酰胺：双-丙烯酰胺)和22毫升水混合，除去气体，然后加入150微升新鲜制备的10％过硫酸铵和20微升TEMED。将溶液加到装配好的凝胶模子，静置。每个含有放射活性的级分(从柱中收集)取8微升，与2微升5×加载缓冲液混合。在样品的旁边加载了放射活性分子量标记，电泳。在电泳后，在100毫升7％的乙酸中固定凝胶20-30分钟，在Whatmann 3MM纸上干燥，在X光胶片上曝光。
加工cDNA级分
根据来自非变性凝胶电泳的结果，合并含有需要的大小分布的级分。(通常，收集具有0.5kb以上的cDNA的级分。如果需要，连接选定的不同大小的级分和载体可以构建亚文库)。
移取2微升的合并级分，点在Whatman GF/C滤纸上。用10毫升冰冷的TCA/焦磷酸盐溶液洗涤滤纸3次，用10毫升70％的乙醇漂洗，干燥和利用液体闪烁体计数，估计存在的cDNA的量。加入2个体积的绝对乙醇而在-20℃过夜沉淀合并的级分，通过离心收集。加入纯化的tRNA到10微克/毫升作为载体辅助沉淀。在洗涤后，空气干燥沉淀，再悬浮于无菌的TE或水中，浓度为10-20纳克/微升。与大于5∶1的摩尔比例将cDNA与载体DNA连接。随后，根据(相应的)方案，把连接混合物转化至XL10-Gold细菌细胞(STRATAGENE)。
                         实施例11．1  表达载体pGBFin2的描述和构建1．1．a基本原理
许多因子可以促进在黑曲霉中的表达筛选，这些因子当组合使用时很可能产生最佳的结果。为了获得足够数目的真菌转化体，有效的转化系统是优选的。在克隆过程中，应该小心保持文库中的cDNA的完整。另外，当cDNA的基因产物的表达水平足够高时筛选将最成功。所以，在表达克隆构建体时，用于驱动cDNA的表达的功能单位起源于高表达的基因。在整合系统中，优选地将表达盒指导到高表达的基团座，更优选地，在基因组中该基团座已经得到扩增。在这一实施例中，选择在黑曲霉菌株DS2978(1997年4月8日保藏在Centraalbureau voorSchimmelcultures，Baarn，荷兰，登记号CBS 646.97)的基因组中存在3个拷贝的glaA基因座。构建和测试设计为能够有效导向这一基因座和允许使用不同的cDNA克隆方案的几个表达载体(参见实施例1-7)。1．1．b整合表达载体的基本设计
为了导向整合进丝状真菌的基因组，线性DNA分子是优选的。另外，5’和3’末端(侧接)优选地含有与需要的整合位点同源的DNA。所以，转化片段含有表达盒(适当的启动子和终止子调节的需要的基因)以及与5’和3’导向区域侧接的选择标记。为了繁殖该质粒，在大肠杆菌载体中克隆这些片段。设计得到的表达载体使在转化片段线性化和分离的过程中，除去大肠杆菌序列。
为了选择转化体，利用了表达是由构巢曲霉gpdA启动子控制的amdS选择标记。利用强gpdA启动子将主要得到一个拷贝的转化体。
为了获得高水平表达，将cDNA与glaA启动子融合。然后，在一系列整合型表达载体中在glaA启动子的建议的转录起始点导入(稀有切割)酶(例如Pacl和Ascl[实施例1]，EcoRI和XhoI[实施例4和6]或HindIII和XhoI[实施例7])的独特限制位点的许多组合。
因为rDNA分子定向插入(导向)基因组是通过同源重组进行的，rDNA盒子优选地侧接与基因组的靶位点同源的DNA片段。所以，整合盒子的5’和3末端侧接了约2kb的与glaA基因座同源的DNA序列。为了简化从构建体除去大肠杆菌DNA，导入了独特的NotI位点(NotI限制位点是稀少的，所以导入的cDNA的不需要的消化的危险最小)。
1．1．c构建中间产物型表达载体，pGBTOP8
将等摩尔量的寡核苷酸AB5358和AB5359退火，连接在pTZ18R的EcoRI和HindIII限制位点中，所以导入了NotI-XhoI-EcoRI-SnaBI-HindIII多接头(EcoRI位点没有恢复)。将得到的质粒命名为pGBTOP1。从质粒pAB6-1(在15.5kb HindIII片段上含有完整的黑曲霉glaA基因座，这一片段如我们前面的一个专利，EP-A-0 635 574)所述克隆进pUC19)分离了含有glaA基因的启动子区的1.8kb的XhoI-EcoRI片段，然后将它克隆在质粒pGBTOP1的XhoI-EcoRI位点，产生质粒pBGTOP2。
为了介导把构建体导向glaA的3’非编码区，在表达盒的任一末端克隆了这一区的两个不同部分。将这些部分命名为3’glaA和3”glaA，后者是该区中最下游的部分。
利用寡核苷酸AB5291和AB5292(寡核苷酸AB5291设计为中断不需要的EcoRI位点)进行PCR产生3”glaA片段。在利用寡核苷酸AB5361和AB5292的第二个PCR反应中利用产生的PCR片段作为模板，所以在片段中产生了NotI位点。利用NotI和XhoI消化PCR片段，克隆到质粒pGBTOP2的相应的限制位点，产生了pGBTOP5。
通过PCR法，将glaA的3’非编码区中的不需要的EcoRI位点中断了。利用寡核苷酸AB5288(5’)，AB5293(3’逆转)，AB5290(内部，逆转)和AB5289(内部，编码)进行融合PCR反应。寡核苷酸AB5290和5289是设计为在这一位置中断EcoRI位点的互补寡核苷酸，而寡核苷酸AB5293设计为中断第二个EcoRI位点。利用SnaBI和HindIII消化得到的融合PCR产物，克隆进pGBTOP2的相应位点，得到pGBTOP6。在利用寡核苷酸AB5363和AB5567的第二个PCR反应中，将pGBTOP6用作模板。利用SnaBI和HindIII消化得到的PCR产物，然后克隆进pGBTOP5的相应位点，得到质粒pGBTOP8(参见图1)。
1．1．d构建pGBFin2
利用寡核苷酸6963和7266，和作为模板的10纳克载体pAB6-1(EP-A-0 635 574)，产生了PglaA特异PCR片段。利用EcoRI和SmaI消化这一片段，然后导入EcoRI和SnaBI消化的载体pGBTOP-8，得到载体pGBFin1。通过序列分析验证导入的PCR片段的序列。
通过PCR将XhoI位点导入PgpdA-amdS片段。利用寡核苷酸7423和7424和作为模板的质粒pGBAAS1(EP-A-0 635 574)，产生了3.1kb的片段。利用EcoRI消化这一片段，导入pTZ19R的EcoRI位点，得到质粒pTZamdSX-1。利用来自质粒pGBAAS-1的相应片段取代2.6kb的pTZamdSX-1中的XhoI-ClaI，避免PCR方法引起的突变。利用来自质粒pTZamdSX-1的相应片段取代pTZamdSX-1中的0.5kb的KpnI-ClaI，避免PCR方法引起的突变。对得到的质粒pTZamdSX-2的残留的0.5kb片段的序列分析，表明在PgpdA片段中有一个单突变。
从载体pTZamdSX-2分离含有PgpdA-amdS选择盒子的3.1kb的XhoI片段，然后导入pGBFinl的独特的XhoI位点，得到载体pGBFin2(参见图2)。
1．2利用表达载体pGBFin2表达植酸酶
1．2．a基本原理
为了最优化地应用黑曲霉中的表达筛选，有效地将表达构建体导向黑曲霉DS2978的glaA基因座和足够高的水平表达需要的cDNA是优选的。所以，利用模型基因phyA测试表达构建体的特性，为此前面已经确定了在glaA基因座中整合的每个基因拷贝预期生产的蛋白质。
1．2．b植酸酶表达载体，pGBFin5的构建
利用寡核苷酸6964和6965和作为模板的质粒pAF2-2S(如EP-A-O420 358所述)通过PCR产生了phyA片段。将该PCR片段克隆在载体pTZ18R的Smal位点，得到pTZFyt1。对pTZFytl的插入片段的分析序列表明与pAF2-2S中存在的序列没有偏差。从pTZFyt1分离了含有完全的phyA序列的1．7kb的AscI-PacI片段，并克隆在AscI-PacI消化的pGBFin2，得到载体pGBFin5(参见图2)。
1．2．c利用pGBFin5转化黑曲霉DS2978
利用NotI(150个单位，在37℃4小时)消化质粒pGBFin5(100克)。利用等体积的酚-氯仿-异戊醇(24∶23∶1)萃取除去蛋白质。通过乙醇沉淀浓缩DNA，如上所述用于转化黑曲霉DS2978。在选择基本培养基平板上纯化转化体，随后贮藏。
1．2．d分析pGBFin5转化体
利用寡核苷酸5454和5456分析将整合盒子导向glaA基因座的24个独立的转化体，利用phyA特异寡核苷酸6964和6965分析phyA基因的存在。
在很多转化体(24个中的12个=50％)中都能够发现将pGBFin5整合盒子正确地导向glaA基因座的PCR产物，而所有转化体显示在它们的基因组中存在phyA拷贝的PCR产物。
在摇瓶发酵实验中分析6个阳性转化体的植酸酶的生产。所有转化体的植酸酶活性是140-180单位/毫升。这样的生产水平表明在每个转化体中整合了一个拷贝的pGBFin5。
结论是，在表达克隆实验中，导向频率和表达水平两者对设计的表达系统的应用而言是足够的。
                              实施例2
2．1构建和分析cDNA文库
2．1．a基本原理
从预期包括需要的转录物的mRNA的库中构建表达文库。为了这一原因，虽然通常不必要，优选地从在诱导条件下生长的培养物分离的菌丝体分离mRNA。分析分离的mRNA中需要的转录物的存在和mRNA的质量。如果mRNA是完整的并且包括需要的转录物，它可以用于cDNA的合成。在表达载体pGBFin2中克隆cDNA需要在cDNA的5’末端存在PacI位点和在cDNA的3’末端存在AscI位点。因此，设计第一链引物寡核苷酸和利用的衔接子序列以满足这些要求。设计衔接子方式是使衔接子与pGBFin2中的PacI位点相容，而在cDNA连接进载体后，不恢复PacI位点。这就能够明显区别含有cDNA插入片段的载体分子和没有可能的插入片段的载体分子。
2．2从塔宾曲霉制备cDNA文库。制备诱导木聚糖酶活性的mRNA。
在诱导条件下生长塔宾曲霉DS116813(CBS 323.90)。在不同时间点取培养基样品，分析木聚糖酶活性。在培养66小时后，活性达到最大，而直到开始实验后7天，木聚糖酶的活性水平保持恒定。在不同时间点取菌丝体样品，然后从这些样品分离总RNA。利用木聚糖酶特异探针在Northern印迹实验中分析xylA特异转录物的存在。在诱导48小时后测定最大的xylA mRNA水平，而在66小时后，xylA mRNA仍然是可检测的。在诱导培养基中的菌丝体的更长保温时间后，没有检测到xy1AmRNA。在所有的情况中，xy1A特异转录物明显是完整的。从诱导48小时后分离到的全部RNA中分离mRNA。在显示xy1A mRNA是完整的Northern分析后，利用寡核苷酸6967作为合成第一链用的引物，将这一mRNA用于cDNA合成(根据SuperscriptTM选择系统[Gibco-BRL])。在PacI特异接头退火后，利用AscI消化cDNA，然后利用带有cDNA合成试剂盒(SuperscriptTM选择系统[Gibco-BRL])的Sephacryl柱分离大小。分别利用Northern-和Southern印迹分析以及用PCR分析方法分析mRNA和cDNA中是否存在样品中的完整xylA。将得到的cDNA连接进AscI-PacI消化的pGBFin2，然后通过电穿孔导入大肠杆菌得到约17000个转化体的初级文库。分析任意的24个菌落表明其中5个质粒没有插入片段，而其余的质粒具有大小0.5-2kb的插入片段。刮平板合并大肠杆菌文库，放入总体积25毫升的2×TY培养基。利用10毫升培养基制备甘油储备液，而在其余的大肠杆菌悬浮液中加入2×TY直到最后体积为100毫升。在37℃生长2小时后，从这一培养物分离质粒DNA。
                         实施例3
3．1 在黑曲霉中构建和分析表达文库
3．1．a 基本原理
如前面实施例2．2所述，利用从大肠杆菌的cDNA文库分离的DNA转化黑曲霉DS2978。将转化体在作为唯一N源乙酰胺上生长，选择存在amdS选择标记的转化体。因为amdS选择标记和cDNA表达盒都存在在整合片段上，在乙酰胺上的生长能够表明存在cDNA表达盒。将amdS阳性转化体的分生孢子转移到选择培养基平板上以避免分离假阳性菌落，然后转移到含有固化的PDA斜面的微滴平板上。将这一主文库用于筛选需要的酶例如木聚糖酶的生产。如果生产酶的转化体可直接用于大规模的酶生产，这是有用的，所以需要确定在摇瓶发酵中的酶生产水平。
3．2 转化黑曲霉DS2978
从如上所述的扩增的大肠杆菌cDNA文库分离DNA。利用NotI(150单位)在37℃消化总质粒DNA(100克)4小时，除去大肠杆菌衍生的质粒序列，和利用PacI(30单位)消化。在用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(24∶23∶1)萃取纯化DNA后，乙醇沉淀回收DNA，然后溶解于100升无菌软化水。利用2·107原生质体和10克质粒DNA进行多个黑曲霉DS2978转化。在30℃温育约10天后，挑选1900个转化体，将分生孢子转移到含有选择培养基的平板上。在30℃温育3天后，将每个转化体的分生孢子转移到96孔微滴盘的各个孔中，每个孔含有约100升的固化PDA。
3．3分析黑曲霉表达文库。
将各个转化体的分生孢子转移到由曲霉基本培养基制成的木聚糖酶检测平板，所述基本培养基每升含有6克NaNO3，0.52克KCl，1．52克KH2PO4，1.12毫升4M KOH，0.52克MgSO4·7H2O，22毫克ZnSO4·7H2O，11毫克H3BO3，5毫克FeSO4·7H2O，1.7毫克CoCl2·6H2O，1.6毫克CuSO4·5H2O，5毫克MnCl2·2H2O，1.5毫克Na2MoO4·2H2O，50毫克EDTA，10克葡萄糖，其中补充了2％的斯卑尔特燕麦木聚糖和2％的细菌琼脂#1(OXoid，英格兰)，由于存在未溶解的木聚糖，培养基的表观是混浊的。在30℃温育2天后，可以观察到10个菌落形成晕圈，表明木聚糖酶降解了木聚糖。分离阳性转化体的分生孢子，用于接种PDA平板。从单个菌落分离DNA，利用寡核苷酸5454和5456通过PCR分析glaA基因座(“靶”)处表达质粒的整合。
17个菌落中有8个显示被导向到一个glaA基因座了(47％)。
3．4 分析转化体中木聚糖酶的生产水平
在摇瓶发酵中让木聚糖酶平板测试中鉴定的木聚糖酶生产转化体生长。在发酵5天后取培养基样品，分析木聚糖酶活性。结果表示在表1。
3．5．木聚糖酶生产菌株的基因分析
3．5．a基本原理
在真菌中已经发现了多个木聚糖酶编码基因。所以，需要确定是否在表达克隆实验中鉴定的每个木聚糖酶生产菌株都含有相同的cDNA。另外，在各个木聚糖酶生产菌株之间发现有明显的差异。这些差异可能是存在不同的木聚糖酶编码基因或cDNA的5’非编码区中的差异引起的。cDNA的5’非编码区中的差异的原因可能是在RNA或mRNA分离过程中mRNA的部分降解，或合成的cDNA不完整。为了研究这个问题，确定了导入的cDNA的5’-序列。3．5．b分析木聚糖酶生产克隆
如上述为每个木聚糖酶生产转化体制备PCR模板。利用寡核苷酸6856(xylA内部)和6963(PglaA)，在PCR实验中分析转化体中是否存在含有xylA cDNA的表达构建体。发现转化体#5C2和#7A8包含带有与PglaA融合的xylA基因的表达盒。
利用寡核苷酸6963(特异于PglaA)和6967(特异于3’末端cDNA)，产生了预期含有完整的cDNA以及200bp的PglaA的PCR片段。利用寡核苷酸6963确定6个转化体的PCR片段的部分DNA序列。检测存在xylA基因(2个克隆)和xylB(4个克隆)的序列(在我们以前的专利申请EP-A-O 463706和WO 94/14965中分别叙述了xylA和xylB DNA序列)。发现了不同长度的5’非翻译区。但是，在cDNA的5’非翻译区的长度和不同的xylB转化体的木聚糖酶生产水平之间没有观察到相关性。相反，在xylA阳性转化体#5C2中发现的短的5’非翻译区可以导致XYLA活性的明显降低。但是，很清楚，酶生产水平仍然是足以在平板测试中鉴定这一转化体的。表1.分析木聚糖生产转化体。在发酵实验中分析阳性转化体的木聚糖酶生产水平。测定cDNA插入片段的部分序列确定了木聚糖酶编码基因的特征。在文章中有详细的描述。
表1.
  转化体  E×U/ml  基因                序列    说明
  DS2978     3  -  亲代菌株
   #2G1    64 xy/B cctcaagccaagtctctttcaacATG
  #3A11    290  xy/B gtctctttcaacATG
  #3A12    27   nd
  #4C10    401  xy/B ctcctcaagccaagtctctttcaacATG
   #5C2    37  xy/A atcatcATG
   #5C12     2  -  平板测试中阴性
   #7A8    505  xy/A aaaagccctttactacttcatacatcaatcatcATG
   #7B4    51   nd
   #11E3    272  xy/B ctcaagccaagtctctttcaacATG
  #14Ｂ1    43   nd
   #1485    52   nd
nd=没有测定
                       实施例44．1构建和分析适合于EcoRI-XhoI介导的cDNA克隆(pGBFIN11)的整合表达载体
4．1．a基本原理
表达文库是从cDNA库构建的。通过前面所述的筛选格式筛选(检测)编码需要活性的cDNA。因为在大多数情况下，在真正鉴定cDNA中缺乏限制位点之前，cDNA的准确特征(例如，在cDNA内存在限制酶位点)是未知的。所以，在实施例2中所述的构建过程中，需要的cDNA仍然含有内部AscI位点从而作为不能筛选的非完全长度的失活克隆被克隆化的可能性是存在的。
从而，允许克隆具有EcoRI-XhoI粘端而没有避免内部限制位点的危险的cDNA的质粒pGBFIN11已经构建了。用于第一链cDNA的合成的3’引物含有(非甲基化)XhoI位点，而在cDNA的合成过程中，利用了甲基化dCTP。作为结果，可利用XhoI消化cDNA，避免cDNA因为内部XhoI位点的片段化(这些XhoI位点甲基化了，所以不能被消化)。pGBFIN11是pGBFIN2衍生的载体，其中已经除去了现有的XhoI和EcoRI位点，然后，cDNA克隆位点从PacI-AscI改变成EcoRI-XhoI。所以，在表达载体中的所有特征和功能是相同的，除了用于克隆cDNA的限制位点。
4．1．b构建pGBFIN11载体
在第一步中，通过PCR除去存在于gpdA启动子的5’末端的已有XhoI，HindIII，ScaI和EcoRI，导入(稀少)切割位点SnaBI，产生中间产物构建体pGBFIN12。在第二个PCR步骤中，调节现有的glaA启动子和cDNA克隆位点，方式是1)将现有的PacI-AscI cDNA克隆位点改变成EcoRI-XhoI克隆位点，Ⅱ)同时，失活启动子中的EcoRI位点，Ⅲ)同时，缩短该启动子(在pGBFIN2的位置6084的Sall位点开始而不是从pGBFIN2中的位置5289的XhoI位点开始)和Ⅳ)同时，失活存在于位置5289的XhoI位点，并导入(第二个)稀少切割限制酶。图3中描述了得到的质粒(pGBFIN11)。
4．2利用载体pGBFIN11表达植酸酶
4．2．a基本原理
以实施例1．2中对pGBFIN2载体所述的相似方法，在pGBFIN11载体中插入测试基因(例如，植酸酶)。在测试pGBFIN5载体的同时，另外测试了得到的载体pGBFIN13以证实这一pGBFIN11型载体的功能。
4．2．b构建植酸酶表达载体，pGBFIN13
与pGBFIN2载体(实施例1；1．2．b)中所述的情况相似，同样利用模型基因phyA测试了pGBFIN11载体的功能性。
4．2．c利用pGBFIN13转化黑曲霉
与pGBFIN2载体(实施例1：1．2．c)中所述的情况相似，为了产生可以用于转化过程中的导向的线性片段，利用NotI消化pGBFIN13载体。在转化后，为了允许随后分析，纯化了任意选定的转化体。
4．2．d分析pGBFIN13转化体
再次，与pGBFIN2载体(实施例1：1．2．d)所述的情况相似，测试了纯化的pGBFIN13转化体中准确基因座上构建体的导向和植酸酶的表达。导向频率和植酸酶的表达都在前面对pGBFIN2转化体的叙述中的范围中。所以，结论是对于pGBFIN11载体，导向频率和表达水平都足以在具有EcoRI-XhoI粘端的cDNA的表达克隆中应用设计的表达系统。
                      实施例5
5．1．a基本原理
在证实了pGBFIN11载体的功能性后，测试了基于这一类型的载体(EcoRI-XhoI粘端)的完全表达克隆系统。因为EcoRI-XhoI cDNA克隆位点的导入允许利用STRATAGENE cDNA克隆试剂盒，测试了结合新的pGBFIN11载体的这一系统的可应用性(该系统的优点是在限制消化过程中避免消化完整cDNA产生3’粘性克隆位点)。与实施例2和3中所述相似，利用已经在材料和方法中详细叙述的用于在pGBFIN载体中克隆的最佳化STRATEGENE方案，用起源于黑曲霉的RNA库产生了cDNA库(具有EcoRI-XhoI粘端)。将这一cDNA库克隆进入pGBFIN11载体产生大肠杆菌文库。随后，将克隆效率与pGBFIN2载体中以前的文库构建相比。5．1．b从木聚糖酶诱导的曲霉培养物制备cDNA文库
如材料和方法中已经叙述，将已知在收获时表达木聚糖酶的菌丝体(如前面所述)用于萃取总RNA。随后，通过CsCl垫离心进一步纯化总RNA库。在检测了RNA的质量后，利用Pharmacia纯化试剂盒根据修改的方案分离mRNA。为了合成cDNA，利用了Strategene cDNA合成试剂盒。为了最佳地克隆进pGBFin载体，修改了相应的cDNA合成方案。主要的变化包括：1)通过TCA沉淀定量cDNA的量；2)删除了磷酸化cDNA的末端，将cDNA连接进没有脱磷酸化的载体DNA。这防止了在一个载体中连接多个插入片段(可预防载体中存在的几个(如果不是全部的)插入片段的表达)。3)在利用XhoI消化后，而不是在大小分级分离后，利用酚/氯仿萃取cDNA。4)在第一链的合成中利用MMLV-RT和Thermoscript，产生的cDNA比单独利用任一酶产生的cDNA长。5)利用[α32P]dATP(为了预防干扰合成采用800居里/毫摩尔)追踪对照反应用作质量参照。根据修改的方案构建cDNA库。对于pGBFin11，制备了双重消化(EcoRI-XhoI)很好的pGBFin11载体(背景连接＜1％)的库。将产生的cDNA库连接进pGBFin11载体中，转化到大肠杆菌XL1O-Gold细菌细胞以产生文库。
5．1．c．分析大肠杆菌cDNA文库(在pGBFin11载体中)
在这一实施例中叙述的方法产生了明显增加的连接和转化效率。有了根据最佳方法分离的cDNA库，获得与双重消化很好的pGBFin11载体结合的库以便获得从1微克pGBFin11开始的106-107大小的大肠杆菌文库是可能的。
其次，通过杂交实验，在大肠杆菌cDNA文库中，gpdA和xylB cDNA的频率可以确立。因为gpdA基因代表较长的基因，xylB基因是较短的，全长克隆的百分数的比较可以明确产生的cDNA的质量和鉴定在短和长mRNA之间产生全长cDNA的效率是否有差异。
在鉴定了阳性xylB和gpdA克隆之后，将选定数目的克隆测序以确定在起源于这些特定基因的cDNA群体内全长克隆的百分数。对于gpdA和xylB cDNA，显示全长克隆的百分数都在85％以上。另外，测序显示没有克隆含有多个插入片段。
所以结论是，最佳化的RNA纯化，cDNA合成和克隆方案导致cDNA文库构建的效率和质量(即文库的大小和频率，全长百分数，和在表达载体中只克隆一个cDNA片段)显著提高。
5．1．d．将含有的pGBFin11构建体xylB转化到黑曲霉并筛选木聚糖酶活性
将许多鉴定了的(和在5．1．c中分析过的)xylB克隆转化到黑曲霉(与对pGBFin5和pGBFin13载体已经叙述的相似)。在纯化了选定数目的转化体后，在平板上筛选这些转化体的木聚糖酶活性。在木聚糖酶平板测试中，所有测试的转化体是阳性的，证明pGBFin11载体在黑曲霉中用于表达克隆的可应用性。
实施例6
6．1可用于EcoRI-XhoI介导的cDNA克隆的第二个整合表达载体(pGBFin22)的构建
6．1．a基本原理
在构建pGBFin11载体的过程中，对第二个PCR片段(在实施例4列出的其它修改方法中，用于失活葡糖淀粉酶启动子中的EcoRI位点)测序证明修饰准确。这证明了指出的限制位点修饰准确，但同时显示在葡糖淀粉酶启动子的更上游的部分中有许多小的PCR错误。所以，根据在pGBFin12中没有改变的葡糖淀粉酶启动子区，构建了新的载体，该载体中没有导入的PCR错误，适于克隆具有EcoRI-XhoI粘端的cDNA。
6．1．b构建表达载体pGBFin22
在pGBFin12(图3)中，在XhoI消化后，通过用T4 DNA聚合酶填充末端和回连失活残留的XhoI位点，产生了pGBFin17(参见图6)。在pGBFin17中，类似地除去残留的EcoRI位点(在EcoRI消化后，用T4DNA聚合酶填充末端和回连)产生了质粒pGBFin18(参见图7)。将含有EcoRI和XhoI限制位点和(在一起退火后)含有PacI和AscI的粘端的两个引物退火。以这样的方式构建引物，即，将退火的引物克隆进入PacI-和AscI-消化的pGBFin18时在cDNA的克隆位点没有产生(外部)ATC。所以，通过在PacI-和AscI-消化的pGBFin18中克隆所述的退火引物，产生了具有EcoRI-Xhoi粘端的cDNA的克隆位点。将这样获得的质粒命名为pGBFin22(参见图8)。6．2利用载体pGBFin22表达植酸酶
6．2．a基本原理
在pGBFin22载体中，以如实施例4中已经对pGBFin11载体叙述的相似方式插入测试基因(如植酸酶)。对得到的载体pGBFin25的功能性已经测试了植酸酶的生产。
6．2．b构建植酸酶表达载体，pGBFin25
利用EcoRI消化pGBFin13释放植酸酶基因。将这一编码植酸酶的EcoRI基因片段克隆进pGBFin22。在利用准确定向的植酸酶基因鉴定了克隆后，将这一克隆命名为pGBFin25。
6．2．c利用pGBFin25转化黑曲霉和分析pGBFin25转化体
利用pGBFin25转化黑曲霉并随后分别如实施例1和4中已经对pGBFin5和pGBFin13转化体所述分析转化体。结果与对pGBFin13转化体已经表明的相似，证明了pGBFin22载体在表达克隆中的可应用性。
实施例7
7．1构建可用于HindIII-XhoI介导的cDNA克隆的整合表达载体，pGBFin23
7．1．a基本原理
在获得迄今所述的这套整合表达克隆载体之后，我们认识到得到可以用于克隆具有HindIII5’粘端的cDNA的表达克隆载体可能是有用的。这是从能够利用为了其它目的已经构建的具有HindIII-Xho粘端的cDNA库和由于在这一方法中不必对葡糖淀粉酶启动子进行改变的事实出发的。
7．1．b构建可用于HindIII-XhoI介导的cDNA克隆的植酸酶表达载体，pGBFIN13
在pGBFin17中，除去的残留的HindIII位点(HindIII消化，然后用T4 DNA聚合酶填充末端和回链)产生了质粒pGBFin19(参见图9)。将含有HindIII和XhoI限制位点和(在一起退火后)含有连接Pac和AscI的粘端的两个引物退火。以在将退火的引物克隆进PacI-和AscI-消化的pGBFin19后，在cDNA的克隆位点没有产生(外部)ATG的方式构建引物。所以，通过在PacI-和AscI-消化的pGBFin19中克隆所述的退火引物，产生了具有HindIII-XhoI粘端的cDNA的克隆位点。将这样得到的质粒命名为pGBFin23(参见图10)。7．2利用载体pGBFin23表达植酸酶
7．2．a基本原理
在pGBFin23载体中，与在实施例4中对pGBFin11载体已经叙述的相似方式插入测试基因(例如，植酸酶)。已经测试了得到的载体pGBFin26的植酸酶生产证明它的功能。7．2．b构建植酸酶表达载体，pGBFin26
在这一实施例中，利用含有HindIII位点的5’oligo和含有XhoI位点的3’oligo对植酸酶基因进行PCR。在利用HindIII和XhoI消化时，直接将这一片段克隆进pGBFin23，所以产生了pGBFin26。在分离许多含有植酸酶基因的克隆后，为了检测推断的PCR错误的导入，将植酸酶插入片段测序。最后，选择准确的pGBFin26质粒(在编码蛋白质序列中没有改变)，用于转化和随后分析。
7．2．c利用pGBFin26转化黑曲霉和分析pGBFin26转化体
利用pGBFin26转化黑曲霉，随后分别如实施例1，4和6中对pGBFin5，pGBFin13和pGBFin25转化体已经叙述的那样分析转化体。结果与pGBFin13转化体已经表明的相似，证明pGBFin23载体可用于表达克隆目的。
实施例8
8．1构建适用于cDNA表达克隆的基于AMA1的质粒表达载体(pGBFin6和pGBFin15)
8．1．a基本原理
在另一个实施例中，在另外含有所谓的AMA1序列的质粒中利用了驱动克隆cDNA和选择标记高表达的功能。结果产生了在曲霉中自主维持的表达克隆质粒。在这种类型的表达克隆载体中，将利用基于AMA1类型的载体获得的高效转化频率和驱动克隆的cDNA的高表达的功能结合起来。构建了在用于曲霉中的转化体的选择的选择标记基因方面不同，都是为基于AMA1的表达克隆系统设计的两个表达载体。
8．1．b构建pGBFin6载体
利用HindIII将pTZamdSX-2(参见图2)线性化，然后，将来自构巢曲霉的5.2kb的HindIII AMA1片段(如  Aleksenko  和Clutterbuck，1998所述)克隆在其中，产生中间产物质粒pAMAamdS。接着，利用KnpI和BglII消化pAMAamdS，分离含有约9kb的AMA1的片段。在利用KnpI和BglII消化pGBFin2载体(参见图2)后，分离了含有5.2kb的葡糖淀粉酶启动子的片段。将源于pGBFin2的5.2kb的片段克隆进来自pAMAamdS的9kb片段，产生基于AMA1和基于乙酰胺选择的表达克隆质粒pGBFin6(参见图11)。8．1．c构建pGBFin15载体
利用XhoI消化pGBFin6，分离含有葡糖淀粉酶启动子的片段。接着，在PCR反应中利用含有由构巢曲霉gpdA启动子驱动且由trpC终止子终止的功能性ble基因(编码腐草霉素抗性)的pAN8-1质粒(参见图12)作为模板。以产生含有截短的(但功能完全)gpdA启动子，ble基因和截短的(但功能完全)另外在片断两个末端含有功能性XhoI位点的trpC终止子的片段的方式设计PCR引物。另外，5’引物含有HindIII位点，该位点是进一步的克隆步骤所必须的(如pGBFin15的构建中所述)。在XhoI消化约1.9kb的PCR产物后，将它克隆进以前从pGBFin2 分离的XhoI片段中。通过限制分析检测得到的质粒(pGBFin14；参见图13)的准确定向和通过测序检测得到的质粒的PCR错误。利用HindIII将pGBFin14线性化，然后插入5.2kb的AMA1HindIII片段，得到质粒pGBFin15(参见图14)。8．2在基于AMA1的载体中表达植酸酶
8．2．a基本原理
与对整合表达载体已经叙述的相似，测试基于AMA1的表达构建体的植酸酶的表达。再次，以实施例1对pGBFin5载体已经叙述的相似的方式插入测试基因(例如，植酸酶)。测试得到的载体的植酸酶生产，证明基于AMA1的表达载体的功能性和可应用性。
8.2.b构建pGBFin7和pGBFin16
通过利用PacI和AscI双重消化将pGBFin6和pGBFin15载体线性化。接着，利用PacI和AscI消化pGBFin5质粒释放编码植酸酶基因的片段(具有PacI和AscI粘端)。将这一植酸酶片段直接克隆进消化的pGBFin6和pGBFin15载体分别产生pGBFin7和pGBFin16。
8．2．c利用pGBFin7和pGBFin16转化黑曲霉
根据在前面的实施例中叙述和进一步在材料和方法中详细叙述的方法，将pGBFin17和pGBFin16转化入黑曲霉。在含有乙酰胺作为唯一氮源的培养基上选择pGBFin7转化体，而在含有腐草霉素的培养基上选择pGBFin16转化体。两个质粒堵都证明与整合类型的表达载体相比转化频率显著提高；基于AMA1的质粒的转化频率高达每微克质粒105个转化体。在选择培养基上再划线单个菌落纯化阳性转化体，最后保存。8．2．d分析pGBFin16转化体中的植酸酶的表达
在纯化后，将20个任意选定的pGBFin16转化体在使用与对整合载体已经叙述的相同的培养基(在这一情况下补充了腐草霉素)的摇瓶中发酵。测试发酵样品的植酸酶生产，证明在所有情况下(除了一个)植酸酶生产水平的范围是约40单位/毫升到60单位/毫升。在一个特定的情况下，表达水平是117单位/毫升，这可能是将pGBFin16质粒整合进基因组(参见实施例1；1．2．d．的评论)的结果。
这些结果证明如这一实施例所述的基于AMA1的质粒可以用于在曲霉中直接表达克隆。由于利用了能够驱动克隆cDNA生产的高水平表达的glaA功能，虽然表达水平与在高表达基因座整合后的表达相比减少了，这样的表达仍然足够高了，能够有效地在含有AMA1的表达文库中筛选，特别是当考虑了明显增加的转化频率时。基于AMA1的载体的另一个优点是与整合质粒相比，从丝状真菌表达宿主回收(再分离)这些质粒的过程简化了。在这一方面，利用从正在讨论的宿主中分离的总DNA直接转化大肠杆菌就能满足。
                   序列表〈110〉Gist-brocades B.V.〈120〉在丝状真菌中表达筛选〈130〉2865-p〈140〉〈141〉〈160〉22〈170〉Patentln Ver.2.0〈210〉1〈211〉52〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5288〈400〉1tagtacgtag cgcccacaat caatccattt cgctatagtt aaaggatgcg ga          52〈210〉2〈211〉33〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5289〈400〉2gatcaggatc tccggatcaa tactccggcg tat                               33〈210〉3〈211〉33〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5290〈400〉3atacgccgga ctattcatcc ggagatcctg atc 33〈210〉4〈211〉84〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5291〈400〉4cggaaagctt cactgacgta accaggaccc ggcggcttat ccatcatggg aaacaacacc 60tacaaatccg ccacaatact ctcg 84〈210〉5〈211〉45〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5292〈400〉5gcaatcctcg aggtcccacc ggcaaacatc tgcccataga agaac 45〈210〉6〈211〉88〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5293〈400〉6agtgaagctt tccgtggtac taagagagag gttactcacc gatggagccg tattcgccct 60caagcaccgc gtgaccccac tattcgac 88〈210〉7〈211〉46〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5358〈400〉7aatttgcgcc cgcccgctcg agcggggaat tcccggtacg tacgca 46〈210〉8〈211〉46〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5359〈400〉8agcttgcgta cgtaccggga attccccgct cgagcgggcg gccgca 46〈210〉9〈211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5361〈400〉9ccaggacgcg gccgcttatc catcatggga    30〈210〉10〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸  5361〈400〉10tagtacgtac aatcaatcca tttcgctat 29〈210〉11〈211〉44〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸  5367〈400〉11cccaagcttg cggccgcgtc ctggttacgt cagtgatgtt tccg 44〈210〉12〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    5454〈400〉12tccgcatgcc agaaagagtc accgg 25〈210〉13〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸 5456〈400〉13gcatccatcg gccaccgtca ttgga 25〈210〉14〈211〉39〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    6856〈400〉14cggcagagta ggtgatagcg ttagaagaac cagtggtcc    39〈210〉15〈211〉33〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸 6963〈400〉15acggaattca agctagatgc taagcgatat tgc 33〈210〉16〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸 6964〈400〉16ttaattaact cataggcatc atgggcgtc 29〈210〉17〈211〉32〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸   6965〈400〉17ggcgcgccga gtgtgattgt ttaaagggtg at 32〈210〉18〈211〉32〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸    6967〈400〉18atcatcggcg cgcctttttt tttttttttt tt 32〈210〉19〈211〉35〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸  7423〈400〉19ggaattctcg aggccgcaag ctcagcgtcc aattc 35〈210〉20〈211〉35〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸7424〈400〉20ggaattctcg agcacgcatg ggttgagtgg tatgg 35〈210〉21〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸   7676〈400〉21taggccatat gggccat 17〈210〉22〈211〉15〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸  7677〈400〉22ggcccatatg gccta

Claims (14)

1．分离编码具有需要的特性的蛋白质的DNA序列的方法，所述的方法包括步骤：
(a)从怀疑能够生产一个或多个具有需要的特性的蛋白质的生物体，在适当的克隆载体中制备DNA文库，
(b)利用DNA文库转化丝状真菌宿主细胞，
(c)在允许DNA文库中DNA序列的表达的条件下培养(b)中获得的转化宿主细胞，和
(d)通过分析(c)中产生的蛋白质来筛选表达具有需要的特性的蛋白质的转化宿主细胞的克隆。
2．根据权利要求1所述的方法，其中克隆载体含有与丝状真菌宿主细胞基因组中的预定靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段。
3．根据权利要求2所述的方法，其中预定的靶基因座含有高表达基因。
4．根据权利要求2或3所述的方法，其中丝状真菌宿主细胞含有一个以上拷贝的预定靶基因座。
5．根据权利要求1所述的方法，其中克隆载体是能够在丝状真菌宿主细胞中自主维持的载体。
6．根据权利要求5所述的方法，其中能够自主维持的载体是含有AMA1序列的载体。
7．根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中编码具有需要的特性的蛋白质的DNA序列是从源于高表达丝状真菌基因的启动子表达的。
8．根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中丝状真菌宿主细胞是曲霉属或木霉属的种的细胞。
9．根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中丝状真菌宿主细胞是选自构巢曲霉，米曲霉，酱油曲霉，黑曲霉组的种和Trichoderma reesei的种。
10．根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中怀疑能够生产一个或多个具有需要的特性的蛋白质的生物体是真核生物。
11．根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中真核生物是真菌，优选地是丝状真菌。
12．根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中具有需要特性的蛋白质是酶。
13．在适当的宿主细胞中生产具有需要特性的蛋白质的方法，所述的方法包括下列步骤：利用编码具有需要特性的蛋白质的DNA序列转化宿主细胞，所述的DNA序列已经通过权利要求1-12任一项的方法分离了，在允许编码蛋白质的DNA序列的表达的条件下培养转化了的宿主细胞，以及回收蛋白质。
14．生产具有需要的特性的蛋白质的方法，所述的方法包括下列步骤：在允许编码蛋白质的DNA序列的表达的条件下培养转化了的宿主细胞，以及回收蛋白质，因此所述的转化了的宿主细胞是如权利要求1-12任一项的方法获得的表达具有需要特性的蛋白质的克隆。
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