JP3153234B2 - 糸状菌からの目的とするポリペプチドの分泌を増幅するｄｎａ配列、ベクター、及び融合ポリペプチド - Google Patents
糸状菌からの目的とするポリペプチドの分泌を増幅するｄｎａ配列、ベクター、及び融合ポリペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本願は、1986年７月７日出願の米国特許出願第06/82
2,224号の継続出願である1988年２月26日出願の米国特
許出願第07/163,219号の一部継続出願である。この米国
特許出願第06/882,224号は、1985年８月29日出願の米国
特許出願第06/771,374号の一部継続出願である。このう
ち、米国特許出願第06/882,224号は、既に放棄されてい
る。
2,224号の継続出願である1988年２月26日出願の米国特
許出願第07/163,219号の一部継続出願である。この米国
特許出願第06/882,224号は、1985年８月29日出願の米国
特許出願第06/771,374号の一部継続出願である。このう
ち、米国特許出願第06/882,224号は、既に放棄されてい
る。
発明の技術分野 本発明は、糸状菌からの目的とするポリペプチドの分
泌を促進することに向けられている。本発明は、目的と
するポリペプチドの生成レベル及分泌レベルを増幅する
ためのDNA配列、ベクター、融合ポリペプチド及びその
方法を開示するものである。より詳しくは、本発明は、
糸状菌からのウシのキモシンの分泌を増幅させるため
の、DNA配列、ベクター、融合ポリペプチド及びその方
法を開示するものである。
泌を促進することに向けられている。本発明は、目的と
するポリペプチドの生成レベル及分泌レベルを増幅する
ためのDNA配列、ベクター、融合ポリペプチド及びその
方法を開示するものである。より詳しくは、本発明は、
糸状菌からのウシのキモシンの分泌を増幅させるため
の、DNA配列、ベクター、融合ポリペプチド及びその方
法を開示するものである。
発明の背景 組換えDNA技術の最近の進展の一つに、β−ガラクト
シダーゼに対するカルボキシル融合体の如きバクテリア
中でのインシュリンのＡ及びＢ鎖の細胞内発現がある。
ジョーデル（Goeddel）らによるProc.Natl.Acad.Sci.US
A76、106−110（1979）；ジョンソン（Johnson）による
Science 219、632−637（1983）を参照。その後、異種
のポリペプチドを一部含有する融合ポリペプチドの発現
に関し、数例が開示されている。マーストン（Marsto
n）は、Biochem.J.240、１−12（1986）で、大腸菌によ
る異種ポリペプチドの生産をまとめている。そこに開示
されているように、数種の異種ポリペプチドが、大腸菌
内での融合ポリペプチドとして細胞内で発現されてい
る。更に、異種ポリペプチドをシグナル配列と融合させ
ることによって、その配列を有する微生物の周辺質域の
中に、該ポリペプチドが分泌されたということである。
ある場合には、バクテリアを源とする単一のシグナルと
共に発現されるとき、該異種ポリペプチドは、大腸菌か
ら培地の中に分泌される。異種タンパクが宿主バクテリ
アの完全な天然タンパクとの融合体として発現されてき
たが、その理由は、主として、該融合ポリペプチドの安
定性を向上させるため、または、精製を容易にすること
にあった。
シダーゼに対するカルボキシル融合体の如きバクテリア
中でのインシュリンのＡ及びＢ鎖の細胞内発現がある。
ジョーデル（Goeddel）らによるProc.Natl.Acad.Sci.US
A76、106−110（1979）；ジョンソン（Johnson）による
Science 219、632−637（1983）を参照。その後、異種
のポリペプチドを一部含有する融合ポリペプチドの発現
に関し、数例が開示されている。マーストン（Marsto
n）は、Biochem.J.240、１−12（1986）で、大腸菌によ
る異種ポリペプチドの生産をまとめている。そこに開示
されているように、数種の異種ポリペプチドが、大腸菌
内での融合ポリペプチドとして細胞内で発現されてい
る。更に、異種ポリペプチドをシグナル配列と融合させ
ることによって、その配列を有する微生物の周辺質域の
中に、該ポリペプチドが分泌されたということである。
ある場合には、バクテリアを源とする単一のシグナルと
共に発現されるとき、該異種ポリペプチドは、大腸菌か
ら培地の中に分泌される。異種タンパクが宿主バクテリ
アの完全な天然タンパクとの融合体として発現されてき
たが、その理由は、主として、該融合ポリペプチドの安
定性を向上させるため、または、精製を容易にすること
にあった。
例えば、スコルチゼック（Scholtissek）らは、Gene6
2、55−64（1988）で、バクテリアのβ−ガラクトシダ
ーゼ、コラーゲナーゼ認識位置及び大腸菌由来のタンパ
クに結合している１本のねじれたDNAからなるトリプロ
テインの大腸菌内での発現を報告している。この融合ポ
リペプチドのβ−ガラクトシダーゼタンパクは、APTG−
セファローズを担体とするアフィニティークロマトグラ
フィーで融合ポリペプチドを粗細胞溶解物から精製する
ために使用されたということである。大腸菌由来のタン
パクに結合している１本のねじれたDNAは、その後、コ
ラーゲナーゼ認識位置をコラーゲナーゼと反応させるこ
とによって融合ポリペプチドから単離された。同様に、
スミス（Smith）らは、Gene67、31−40（1988）で、P.
ファルシパルム（P.falciparum）の異なる抗原に対応す
る２種の異種ポリペプチドのいずれかと融合した血液凝
固因子Xaに対する認識位置とそのＣ−末端で融合してい
るグルタチオンＳ−トランスフェラーゼからなる融合ポ
リペプチドをコードするベクターのバクテリアによる発
現を報告している。もう一つの例では、グアン（Guan）
らは、Gene67、21−30（1988）で、β−ガラクトシダー
ゼまたはPst Iエンドヌクレアーゼのいずれかと融合し
たタンパクに結合しているマルトースからなる融合ポリ
ペプチド、並びに、バクテリアのphoAシグナル、タンパ
クに結合しているマルトース及びphoAタンパクからなる
融合タンパクの発現と精製について報告している。前者
の場合、該融合ポリペプチドは、架橋型アミロースを担
体とするアフィニティクロマトグラフィーによって粗バ
クテリア溶解物から抽出されたのに対し、後者において
は、該融合タンパクは、スフェロプラストの形成及び架
橋型アミロースを担体としてアフィニティクロマトグラ
フィー処理を行なったのちの周辺質域から得られた。
2、55−64（1988）で、バクテリアのβ−ガラクトシダ
ーゼ、コラーゲナーゼ認識位置及び大腸菌由来のタンパ
クに結合している１本のねじれたDNAからなるトリプロ
テインの大腸菌内での発現を報告している。この融合ポ
リペプチドのβ−ガラクトシダーゼタンパクは、APTG−
セファローズを担体とするアフィニティークロマトグラ
フィーで融合ポリペプチドを粗細胞溶解物から精製する
ために使用されたということである。大腸菌由来のタン
パクに結合している１本のねじれたDNAは、その後、コ
ラーゲナーゼ認識位置をコラーゲナーゼと反応させるこ
とによって融合ポリペプチドから単離された。同様に、
スミス（Smith）らは、Gene67、31−40（1988）で、P.
ファルシパルム（P.falciparum）の異なる抗原に対応す
る２種の異種ポリペプチドのいずれかと融合した血液凝
固因子Xaに対する認識位置とそのＣ−末端で融合してい
るグルタチオンＳ−トランスフェラーゼからなる融合ポ
リペプチドをコードするベクターのバクテリアによる発
現を報告している。もう一つの例では、グアン（Guan）
らは、Gene67、21−30（1988）で、β−ガラクトシダー
ゼまたはPst Iエンドヌクレアーゼのいずれかと融合し
たタンパクに結合しているマルトースからなる融合ポリ
ペプチド、並びに、バクテリアのphoAシグナル、タンパ
クに結合しているマルトース及びphoAタンパクからなる
融合タンパクの発現と精製について報告している。前者
の場合、該融合ポリペプチドは、架橋型アミロースを担
体とするアフィニティクロマトグラフィーによって粗バ
クテリア溶解物から抽出されたのに対し、後者において
は、該融合タンパクは、スフェロプラストの形成及び架
橋型アミロースを担体としてアフィニティクロマトグラ
フィー処理を行なったのちの周辺質域から得られた。
イースト菌での融合ポリペプチドの発現もまた報告さ
れている。例えば、カーセンス（Cousens）らは、Gene6
1、265−275（1987）で、その２つのタンパクの連結部
でメチオニン残基を有するスーパーオキシドジスムター
ゼ−ヒトプロインシュリン融合タンパクからなる融合ポ
リペプチドを開示している。スーパーオキシドジムスタ
ーゼは、細胞内タンパクであり、その融合ポリペプチド
は、不正確なジスルフィド結合を有するイースト発現宿
主内の不溶性包摂体として発現されたということであ
る。亜硫酸分解のあと、プロインシュリンは、精製さ
れ、天然系に戻され、そしてシアノーゲンブロマイドで
のメチオニン残基の分解ののちインシュリンを生成する
よう処理された。
れている。例えば、カーセンス（Cousens）らは、Gene6
1、265−275（1987）で、その２つのタンパクの連結部
でメチオニン残基を有するスーパーオキシドジスムター
ゼ−ヒトプロインシュリン融合タンパクからなる融合ポ
リペプチドを開示している。スーパーオキシドジムスタ
ーゼは、細胞内タンパクであり、その融合ポリペプチド
は、不正確なジスルフィド結合を有するイースト発現宿
主内の不溶性包摂体として発現されたということであ
る。亜硫酸分解のあと、プロインシュリンは、精製さ
れ、天然系に戻され、そしてシアノーゲンブロマイドで
のメチオニン残基の分解ののちインシュリンを生成する
よう処理された。
カーセンスらに与えられた米国特許第4,751,180号
は、興味の対象であるポリペプチドが完全に異種融合ポ
リペプチドとして発現されるとき、該興味の対象である
ポリペプチドは、イーストのような発現宿主から高収量
で得られ得ると述べている。異種ポリペプチドの一つ
は、該発現宿主内で高収量で、典型的には、該宿主によ
って生産される総タンパク量の５％より多い量で生産さ
れる。しかしながら、開示された唯一の高収量異種ポリ
ペプチドは、プロインシュリンかまたはIgF−２のいず
れかと融合した細胞内タンパクヒトスーパーオキシドジ
スムターゼのそれである。その明細書は、また、分泌リ
ーダー部及びプロセシングシグナルが、融合ポリペプチ
ドの一部として含まれ得ることを述べている。分泌物が
得られるであろうということや、もし、得られたとし
て、それが、例えば、プロインシュリンまたはインシュ
リン様成長因子（IgF−２）のような興味の対象である
ポリペプチドだけに融合した分泌リーダー配列からなる
融合体中で高収量の異種タンパクを検出する融合構造体
を使用して得られた分泌物よりも高いレベルであろうと
いうことを示唆するいかなる例も示されていない。
は、興味の対象であるポリペプチドが完全に異種融合ポ
リペプチドとして発現されるとき、該興味の対象である
ポリペプチドは、イーストのような発現宿主から高収量
で得られ得ると述べている。異種ポリペプチドの一つ
は、該発現宿主内で高収量で、典型的には、該宿主によ
って生産される総タンパク量の５％より多い量で生産さ
れる。しかしながら、開示された唯一の高収量異種ポリ
ペプチドは、プロインシュリンかまたはIgF−２のいず
れかと融合した細胞内タンパクヒトスーパーオキシドジ
スムターゼのそれである。その明細書は、また、分泌リ
ーダー部及びプロセシングシグナルが、融合ポリペプチ
ドの一部として含まれ得ることを述べている。分泌物が
得られるであろうということや、もし、得られたとし
て、それが、例えば、プロインシュリンまたはインシュ
リン様成長因子（IgF−２）のような興味の対象である
ポリペプチドだけに融合した分泌リーダー配列からなる
融合体中で高収量の異種タンパクを検出する融合構造体
を使用して得られた分泌物よりも高いレベルであろうと
いうことを示唆するいかなる例も示されていない。
異種遺伝子発現も、また、糸状菌についても報告され
ている。例えば、クリステンセン（Christensen）ら
は、Bio/Technology６、1419−1422（1988）で、糸状菌
リズムコール・メイヘイ（Rhizumuchor meihei）由来の
アスパルチルプロテインナーゼのプレープロ型を発現す
るアスペルギルス−オリザエ（A.oryzae）由来のα−ア
ミラーゼプロモーターを利用した発現ベクターを報告し
ている。アスパルギルス・オリザエで発現すると、アス
パルチルプロテインナーゼは、培地から得られた。グイ
ンネ（Gwynne）らは、Bio/Technology５、713−719（19
87）で、細菌のグルコアミラーゼシグナルまたは人工の
コンセンサスシグナル配列のいずれかでこれらの遺伝子
を発現することによって糸状菌由来のヒトインターフェ
ロン及びバクテリアのエンドグルカナーゼの発現と分泌
を報告している。
ている。例えば、クリステンセン（Christensen）ら
は、Bio/Technology６、1419−1422（1988）で、糸状菌
リズムコール・メイヘイ（Rhizumuchor meihei）由来の
アスパルチルプロテインナーゼのプレープロ型を発現す
るアスペルギルス−オリザエ（A.oryzae）由来のα−ア
ミラーゼプロモーターを利用した発現ベクターを報告し
ている。アスパルギルス・オリザエで発現すると、アス
パルチルプロテインナーゼは、培地から得られた。グイ
ンネ（Gwynne）らは、Bio/Technology５、713−719（19
87）で、細菌のグルコアミラーゼシグナルまたは人工の
コンセンサスシグナル配列のいずれかでこれらの遺伝子
を発現することによって糸状菌由来のヒトインターフェ
ロン及びバクテリアのエンドグルカナーゼの発現と分泌
を報告している。
アプシャル（Upshall）らは、Bio/Technology５、130
1−1304（1987）で、糸状菌中のｔ−PAのプレ型をコー
ドする遺伝子の発現によって、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性剤の発現及び分泌を報告している。更に、ターン
ブル（Turnbull）らは、Bio/Technology７、169−174
で、糸状菌由来のバクテリアエンターロトキシンサブユ
ニットＢを発現及び分泌するための試みを報告してい
る。しかし、分泌物は検出されなかった。
1−1304（1987）で、糸状菌中のｔ−PAのプレ型をコー
ドする遺伝子の発現によって、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性剤の発現及び分泌を報告している。更に、ターン
ブル（Turnbull）らは、Bio/Technology７、169−174
で、糸状菌由来のバクテリアエンターロトキシンサブユ
ニットＢを発現及び分泌するための試みを報告してい
る。しかし、分泌物は検出されなかった。
ウシのプロキモシンが、大腸菌、イースト菌のサッカ
ロミケス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）及
びヤローイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）内
で発現されたということであり、また、本発明者によっ
て糸状菌のアスペルギルス種（Aspergillus species）
内で発現されたことが報告されている。大腸菌内におい
て、trp E遺伝子のアミノ末端フラグメントによって置
換された最初から４つのアミノ酸残基を有するプロキモ
シンは、trpプロモーターの制御下に生産されてきたと
いうことである（ニシモリ（Nishimori）らによるGene
29,41−49（1984））。該融合タンパクは、細胞質内で
包摂体として蓄積されたが、適当な抽出条件で処理した
のち、活性化され、成熟したキモシンを生成することが
できた。
ロミケス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）及
びヤローイア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）内
で発現されたということであり、また、本発明者によっ
て糸状菌のアスペルギルス種（Aspergillus species）
内で発現されたことが報告されている。大腸菌内におい
て、trp E遺伝子のアミノ末端フラグメントによって置
換された最初から４つのアミノ酸残基を有するプロキモ
シンは、trpプロモーターの制御下に生産されてきたと
いうことである（ニシモリ（Nishimori）らによるGene
29,41−49（1984））。該融合タンパクは、細胞質内で
包摂体として蓄積されたが、適当な抽出条件で処理した
のち、活性化され、成熟したキモシンを生成することが
できた。
モイル（Moir）らは、サッカロミケス・セレビシア内
でのプロキモシンの細胞内生産を開示している〔工業微
生物学の発展（Developments in Industrial Microbiol
ogy）第26巻アンダーコフラー（Underkofler）編。工業
微生物学会（Society for Industrial Microbiolog
y）、米国バージニア州アーリントン〕。該タンパク
は、アミノ末端に接合したグリセリン酸リン酸キナー
ゼ、トリオセホスフェートアイソメラーゼ（triosephos
phate isomerase）またはガラクトキナーゼからなる多
種のセグメントで合成され、それは、同じプロモーター
からの直接の発現と比較して増殖した生産を与えた。生
成量のこの増加は、mRNAのより効率的な翻訳によるもの
であることを示唆している。モイルらは、また、インベ
ルターゼまたはα−因子の最初のほんの僅かの残基との
融合体の形で、サッカロミケス・セレビシアからのプロ
キモシンの分泌を報告している。細胞内プロキモシン
は、前配列上の付加アミノ酸であるにも拘わらず、低い
pHで活性化され、成熟したキモシンを与える。同様に、
活性化し得るプロキモシンは、そのアミノ末端に接合し
た野性アルカリ細胞外プロテアーゼの14または90残基の
いずれかと共にイースト菌ヤローイア・リポリチカから
分泌された〔フランケ（Franke）らによる「工業微生物
学の発展（Developments in Industrial Microbiolog
y）第29巻ピアース（Pierce）編。工業微生物学会（Soc
iety for Industrial Microbiology）、米国バージニア
州アーリントン〕。この報告では、該プロテアーゼのア
ミノ末端の約20％未満しか融合ポリペプチドを生成する
のに使用されておらず、融合ポリペプチドとしての発現
による明白な効果も生じていない。活性な仔牛のキモシ
ンもまた糸状菌トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma
reesei）内で生産されてきた（ハルキ（Harkki）らによ
るBio/Technology ７,596−603（1989））。セロビオハ
イドロラーゼＩ遺伝子（cbh I）プロモーター及びター
ミネーター領域が用いられ、そして、プロキモシンcDNA
と融合した異なるシグナル配列を用いて４つの相異なる
構造体が作成された。キモシンシグナル配列、cbh Iシ
グナル配列、cbh I/キモシンシグナル配列混成体または
cbh Iシグナル配列＋成熟chb Iの20アミノ酸のいずれか
がプロキモシンのアミノ末端に融合した。確認するには
不充分な数の形質転換体しか試験されなかったが、僅か
によりよい生産量が前記最後の構造体から得られた。分
泌は、使用されたベクター構造体のタイプを問わず、形
質転換体の細胞内に残存するキモシン派生物質の66％に
無効果であった。
でのプロキモシンの細胞内生産を開示している〔工業微
生物学の発展（Developments in Industrial Microbiol
ogy）第26巻アンダーコフラー（Underkofler）編。工業
微生物学会（Society for Industrial Microbiolog
y）、米国バージニア州アーリントン〕。該タンパク
は、アミノ末端に接合したグリセリン酸リン酸キナー
ゼ、トリオセホスフェートアイソメラーゼ（triosephos
phate isomerase）またはガラクトキナーゼからなる多
種のセグメントで合成され、それは、同じプロモーター
からの直接の発現と比較して増殖した生産を与えた。生
成量のこの増加は、mRNAのより効率的な翻訳によるもの
であることを示唆している。モイルらは、また、インベ
ルターゼまたはα−因子の最初のほんの僅かの残基との
融合体の形で、サッカロミケス・セレビシアからのプロ
キモシンの分泌を報告している。細胞内プロキモシン
は、前配列上の付加アミノ酸であるにも拘わらず、低い
pHで活性化され、成熟したキモシンを与える。同様に、
活性化し得るプロキモシンは、そのアミノ末端に接合し
た野性アルカリ細胞外プロテアーゼの14または90残基の
いずれかと共にイースト菌ヤローイア・リポリチカから
分泌された〔フランケ（Franke）らによる「工業微生物
学の発展（Developments in Industrial Microbiolog
y）第29巻ピアース（Pierce）編。工業微生物学会（Soc
iety for Industrial Microbiology）、米国バージニア
州アーリントン〕。この報告では、該プロテアーゼのア
ミノ末端の約20％未満しか融合ポリペプチドを生成する
のに使用されておらず、融合ポリペプチドとしての発現
による明白な効果も生じていない。活性な仔牛のキモシ
ンもまた糸状菌トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma
reesei）内で生産されてきた（ハルキ（Harkki）らによ
るBio/Technology ７,596−603（1989））。セロビオハ
イドロラーゼＩ遺伝子（cbh I）プロモーター及びター
ミネーター領域が用いられ、そして、プロキモシンcDNA
と融合した異なるシグナル配列を用いて４つの相異なる
構造体が作成された。キモシンシグナル配列、cbh Iシ
グナル配列、cbh I/キモシンシグナル配列混成体または
cbh Iシグナル配列＋成熟chb Iの20アミノ酸のいずれか
がプロキモシンのアミノ末端に融合した。確認するには
不充分な数の形質転換体しか試験されなかったが、僅か
によりよい生産量が前記最後の構造体から得られた。分
泌は、使用されたベクター構造体のタイプを問わず、形
質転換体の細胞内に残存するキモシン派生物質の66％に
無効果であった。
glaA遺伝子は、アスペルギルス・ニガー（Aspergillu
s niger）及びアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus
awamori）の多くの菌株に高度に発現されるグルコアミ
ラーゼをコードする。glaA遺伝子のプロモーター及び分
泌シグナル配列は、本発明者ら（キュレン（Cullen）ら
によるBio/Technology ５,713−719（1987））及びEPO
公開第0215594号によって以前開示されたように、アス
ペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）中
にウシキモシンを含むアスペルギル（Aspergille）及び
アスペルギルス・アワモリ内で異種遺伝子を発現するの
に用いられてきた。後者の実験においては、グルコアミ
ラーゼ、または、キモシン分泌シグナル及びある場合に
は成熟グルコアミラーゼの最初の11コドンのいずれかの
プロキモシンcDNAを組み込んで多様な構造体が作られ
た。アスペルギルス・アワモリから得られた分泌キモシ
ンの最大量は、50ml振盪フラスコ培養で15mg/以下で
あり、pGRG3によってコードされたキモシンシグナル配
列を使用して得られた。これら従来の研究は、総プラス
ミド複写数がキモシン生成量と無関係であり、豊富なポ
リアデニレート化キモシンmRNAが生成すること、及びキ
モシンの細胞内レベルは、分泌シグナルの起源とは無関
係に、いくらかの形質転換体において高いレベルである
ということを示した。キモシン生成においては、転写
は、限定要因ではないが、分泌は非効果的であったので
あろうということを意味した。また、プロキモシンのプ
ロペプチドへのグルコアミラーゼの小さなアミノ末端セ
グメント（11アミノ酸）の付加は、成熟キモシンへの活
性化を阻害しないということは明らかであった。しかし
ながら、グルコアミラーゼの最初の11コドンと共に得ら
れた細胞外キモシンの量は、該グルコアミラーゼシグナ
ルだけを用いた場合の量よりも実質的に少なかった。
s niger）及びアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus
awamori）の多くの菌株に高度に発現されるグルコアミ
ラーゼをコードする。glaA遺伝子のプロモーター及び分
泌シグナル配列は、本発明者ら（キュレン（Cullen）ら
によるBio/Technology ５,713−719（1987））及びEPO
公開第0215594号によって以前開示されたように、アス
ペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）中
にウシキモシンを含むアスペルギル（Aspergille）及び
アスペルギルス・アワモリ内で異種遺伝子を発現するの
に用いられてきた。後者の実験においては、グルコアミ
ラーゼ、または、キモシン分泌シグナル及びある場合に
は成熟グルコアミラーゼの最初の11コドンのいずれかの
プロキモシンcDNAを組み込んで多様な構造体が作られ
た。アスペルギルス・アワモリから得られた分泌キモシ
ンの最大量は、50ml振盪フラスコ培養で15mg/以下で
あり、pGRG3によってコードされたキモシンシグナル配
列を使用して得られた。これら従来の研究は、総プラス
ミド複写数がキモシン生成量と無関係であり、豊富なポ
リアデニレート化キモシンmRNAが生成すること、及びキ
モシンの細胞内レベルは、分泌シグナルの起源とは無関
係に、いくらかの形質転換体において高いレベルである
ということを示した。キモシン生成においては、転写
は、限定要因ではないが、分泌は非効果的であったので
あろうということを意味した。また、プロキモシンのプ
ロペプチドへのグルコアミラーゼの小さなアミノ末端セ
グメント（11アミノ酸）の付加は、成熟キモシンへの活
性化を阻害しないということは明らかであった。しかし
ながら、グルコアミラーゼの最初の11コドンと共に得ら
れた細胞外キモシンの量は、該グルコアミラーゼシグナ
ルだけを用いた場合の量よりも実質的に少なかった。
従って、ここに本発明の目的は、融合DNA配列を含む
糸状菌、そのようなDNA配列を含む発現ベクター、形質
転換された糸状菌、融合ポリペプチドからの目的とする
ポリペプチドの発現と増幅した分泌を提供すること及び
そのような望ましいポリペプチドを高レベルで発現し及
び分泌するための方法を提供することにある。
糸状菌、そのようなDNA配列を含む発現ベクター、形質
転換された糸状菌、融合ポリペプチドからの目的とする
ポリペプチドの発現と増幅した分泌を提供すること及び
そのような望ましいポリペプチドを高レベルで発現し及
び分泌するための方法を提供することにある。
更に、本発明の目的は、融合DNA配列を含む糸状菌、
そのようなDNA配列を含むベクター、形質転換された糸
状菌、融合キモシンポリペプチドからのキモシンの発現
と増幅した分泌を提供すること及びキモシンを高レベル
で発現し及び分泌するための方法を提供することにあ
る。
そのようなDNA配列を含むベクター、形質転換された糸
状菌、融合キモシンポリペプチドからのキモシンの発現
と増幅した分泌を提供すること及びキモシンを高レベル
で発現し及び分泌するための方法を提供することにあ
る。
これまでに議論した引用文献は、単に本願の出願日以
前の先行技術を明らかにするために記載したものであ
る。ここに、先行発明またはより早い時期に提出した出
願を基礎とする優先権によって、かかる開示よりも本願
の時期を早める資格が本発明者らにないという認定をす
る事実は何もない。
前の先行技術を明らかにするために記載したものであ
る。ここに、先行発明またはより早い時期に提出した出
願を基礎とする優先権によって、かかる開示よりも本願
の時期を早める資格が本発明者らにないという認定をす
る事実は何もない。
発明の要旨 上記の目的に従って、本発明は融合ポリペプチドをコ
ードする新規な融合DNA配列を含むものであり、その融
合DNAは、糸状菌中で発現されたときは、融合ポリペプ
チドの発現を起こし、分泌に際しては、従来使用されて
きたDNA配列で形質転換された糸状菌からの該ポリペプ
チドの発現及び分泌と比較して、増幅したレベルで目的
とするポリペプチドの分泌を起こすものである。
ードする新規な融合DNA配列を含むものであり、その融
合DNAは、糸状菌中で発現されたときは、融合ポリペプ
チドの発現を起こし、分泌に際しては、従来使用されて
きたDNA配列で形質転換された糸状菌からの該ポリペプ
チドの発現及び分泌と比較して、増幅したレベルで目的
とするポリペプチドの分泌を起こすものである。
該融合DNA配列は、アミノ末端からカルボニル末端に
至る第１、第２、第３及び第４のアミノ酸配列を包含す
る融合ポリペプチドをコードする５′−末端の４つのDN
A配列から成る。第１のDNA配列は、第１の糸状菌中の分
泌配列としてシグナルペプチド機能をコードしている。
第２のDNA配列は、その同じ糸状菌か第２の糸状菌から
正規に分泌される分泌ポリペプチドまたはそのタンパク
をコードしている。第３のDNA配列は、開裂可能なリン
カーポリペプチドをコードし、第４のDNA配列は、目的
とするポリペプチドをコードしている。第１または第２
のいずれかの糸状菌内で、融合DNA配列が発現された場
合、それらはいずれかの糸状菌から正規に分泌された第
２のポリペプチドを含んでいない融合ポリペプチドをコ
ードしているDNA配列から発現された場合に得られる目
的とするポリペプチドに比較して、目的とするポリペプ
チドの増幅した分泌が得られるのである。
至る第１、第２、第３及び第４のアミノ酸配列を包含す
る融合ポリペプチドをコードする５′−末端の４つのDN
A配列から成る。第１のDNA配列は、第１の糸状菌中の分
泌配列としてシグナルペプチド機能をコードしている。
第２のDNA配列は、その同じ糸状菌か第２の糸状菌から
正規に分泌される分泌ポリペプチドまたはそのタンパク
をコードしている。第３のDNA配列は、開裂可能なリン
カーポリペプチドをコードし、第４のDNA配列は、目的
とするポリペプチドをコードしている。第１または第２
のいずれかの糸状菌内で、融合DNA配列が発現された場
合、それらはいずれかの糸状菌から正規に分泌された第
２のポリペプチドを含んでいない融合ポリペプチドをコ
ードしているDNA配列から発現された場合に得られる目
的とするポリペプチドに比較して、目的とするポリペプ
チドの増幅した分泌が得られるのである。
本発明は、また、上記融合DNA配列を包含する発現ベ
クター及びそのようなベクターで形質転換された糸状菌
を含むものである。本発明は、また、そのような融合DN
A配列によってコードされた融合ポリペプチドを含むも
のである。
クター及びそのようなベクターで形質転換された糸状菌
を含むものである。本発明は、また、そのような融合DN
A配列によってコードされた融合ポリペプチドを含むも
のである。
更に、本発明は、宿主糸状菌の上記発現ベクターでの
形質転換及び培地中に目的とするポリペプチドを分泌す
る宿主糸状菌の培養を含む目的とするポリペプチドの生
産方法を包含するものである。
形質転換及び培地中に目的とするポリペプチドを分泌す
る宿主糸状菌の培養を含む目的とするポリペプチドの生
産方法を包含するものである。
図面の簡単な説明 第１図は、pBRΔgam−arg構築を描いたものである。
第２図は、pBRΔgam−arg Bからの4.5kbフラグメント
で5.5kb DNA染色体フラグメントを置き換えることによ
るgla A遺伝子の破壊を描いたものである。
で5.5kb DNA染色体フラグメントを置き換えることによ
るgla A遺伝子の破壊を描いたものである。
第3A図及び第3B図は、pGRG（１−４）の構築を描いた
ものである。
ものである。
第４、4A、4B、4C及び4D図は、pGRG4を経由してpGRG1
を生成するために用いられる多種のカセット挿入物を描
いたものである。
を生成するために用いられる多種のカセット挿入物を描
いたものである。
第５、5A及び5B図は、pGAMpRの構築を描いたものであ
る。
る。
第６図は、pUCAMpR1の構築を描いたものである。
図７図は、pSG1の構築を描いたものである。
第８図は、GC12及びGCΔGAMpR菌株の形質転換体から
のDNAのサザンブロット分析を描いたものである。
のDNAのサザンブロット分析を描いたものである。
第９図は、GC12及び12grg I−1a及び12gampr4菌株か
らのRNAのノーザンブロット分析を描いたものである。
らのRNAのノーザンブロット分析を描いたものである。
第10図は、GC12及び形質転換体12grg I−1a及び12gam
pr4の菌株からのRNAの生体外翻訳の生産物を描いたもの
である。
pr4の菌株からのRNAの生体外翻訳の生産物を描いたもの
である。
第11図は、形質転換体12grg I−1a及び12gampr4の培
養上澄み液中のキモシンのウェスタン分析を描いたもの
である。
養上澄み液中のキモシンのウェスタン分析を描いたもの
である。
詳細な説明 本発明者らは、目的とするポリペプチドを糸状菌から
正規に分泌されたポリペプチドと融合することによっ
て、従来得られたレベルよりも高いレベルで目的とする
ポリペプチドを発現し分泌することができるということ
を発見した。以前、本発明者らは、特にここに参考文献
として引用している米国特許出願及びEPO公報第0215594
号に記載したように、ウシキモシンやグルコアミラーゼ
や糸状菌からのカルボキシ（＝アスパルチル）プロテア
ーゼの如き異種ポリペプチドが、アスペルギルス属（As
pergillus species）から発現されそして分泌され得る
ということを発見した。
正規に分泌されたポリペプチドと融合することによっ
て、従来得られたレベルよりも高いレベルで目的とする
ポリペプチドを発現し分泌することができるということ
を発見した。以前、本発明者らは、特にここに参考文献
として引用している米国特許出願及びEPO公報第0215594
号に記載したように、ウシキモシンやグルコアミラーゼ
や糸状菌からのカルボキシ（＝アスパルチル）プロテア
ーゼの如き異種ポリペプチドが、アスペルギルス属（As
pergillus species）から発現されそして分泌され得る
ということを発見した。
例えば、本発明者らは、以前、アスペルギルス。ニド
ゥランス（Aspergillus nidulans）由来のウシキモシン
をグルコアミラーゼシグナルとキモシンのプロー型との
融合体として発現したとき、その発現及び分泌を培地1m
l当り1.5マイクログラムに接近するレベルで達成した。
この主要な構造体をコードするベクターは、pGRG1と呼
ばれている（第３及び第4A図参照）。しかしながら、グ
ルコアミラーゼシグナルペプチドをグルコアミラーゼプ
ロペプチド及びグルコアミラーゼの最初の11のアミノ酸
と共にプロキモシンに融合した場合、分泌レベルは、従
来の構造体で得られた値の約半分、即ち、培地1ml当り
約0.75μｇに実質的に減少した。このベクターは従来、
pGRG4として規定されたものであり、第３図及び第4D図
で規定したものである。プラスミドpGRG1、pGRG3及びpG
RG4（第３図及び第4A、Ｂ、Ｃ及びＤ図参照）の全て
は、アスペルギルス・アワモリ中に形質転換されてき
た。最大量の細胞外キモシンを生産する形質転換体は、
pGRG3を用いて得られたものである。培地及び培養条件
の改良で、得られた分泌キモシンの最高レベルは、酵素
免疫学的分析法（成熟キモシンに加えて不活性キモシン
及び退化したキモシンをも検出するであろう）で測定し
た15μg/ml未満であった。
ゥランス（Aspergillus nidulans）由来のウシキモシン
をグルコアミラーゼシグナルとキモシンのプロー型との
融合体として発現したとき、その発現及び分泌を培地1m
l当り1.5マイクログラムに接近するレベルで達成した。
この主要な構造体をコードするベクターは、pGRG1と呼
ばれている（第３及び第4A図参照）。しかしながら、グ
ルコアミラーゼシグナルペプチドをグルコアミラーゼプ
ロペプチド及びグルコアミラーゼの最初の11のアミノ酸
と共にプロキモシンに融合した場合、分泌レベルは、従
来の構造体で得られた値の約半分、即ち、培地1ml当り
約0.75μｇに実質的に減少した。このベクターは従来、
pGRG4として規定されたものであり、第３図及び第4D図
で規定したものである。プラスミドpGRG1、pGRG3及びpG
RG4（第３図及び第4A、Ｂ、Ｃ及びＤ図参照）の全て
は、アスペルギルス・アワモリ中に形質転換されてき
た。最大量の細胞外キモシンを生産する形質転換体は、
pGRG3を用いて得られたものである。培地及び培養条件
の改良で、得られた分泌キモシンの最高レベルは、酵素
免疫学的分析法（成熟キモシンに加えて不活性キモシン
及び退化したキモシンをも検出するであろう）で測定し
た15μg/ml未満であった。
ここに記載した融合DNA構造体を使用することによっ
て、細胞外キモシンのめざましい増加が得られた。ある
場合には、キモシンのレベルは、従来得られたレベルの
約20倍以上である。この分泌の増加に比例して、糸状菌
発現宿主の細胞内に保持されたキモシンの量は減少し
た。従来は、生成したキモシンの50％以上、場合によっ
ては、殆ど98％もが、細胞内に保持された（表２参
照）。しかしながら、ここに本発明のDNA配列をコード
するベクターを使用した場合、発現したキモシンの30％
以下、場合によっては、１％以下が細胞内に保持される
に過ぎなかった。
て、細胞外キモシンのめざましい増加が得られた。ある
場合には、キモシンのレベルは、従来得られたレベルの
約20倍以上である。この分泌の増加に比例して、糸状菌
発現宿主の細胞内に保持されたキモシンの量は減少し
た。従来は、生成したキモシンの50％以上、場合によっ
ては、殆ど98％もが、細胞内に保持された（表２参
照）。しかしながら、ここに本発明のDNA配列をコード
するベクターを使用した場合、発現したキモシンの30％
以下、場合によっては、１％以下が細胞内に保持される
に過ぎなかった。
キモシンの分泌レベルの増加は、糸状菌によって正規
に分泌されたポリペプチドとの融合ポリペプチドとして
のプロー型内でのキモシンの発現の結果である。好まし
い態様においては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配
列を含むglaA遺伝子によってコードされるアスペルギル
ス・アワモリからのグルコアミラーゼは、プロキモシン
のアミノ−末端と融合している。グルコアミラーゼシグ
ナル配列及び成熟グルコアミラーゼペプチド配列の存在
は、培地中への融合ポリペプチドの増幅した分泌を促進
する。次いで、培地を酸性して、キモシン前配列を処理
し、プロペプチドを除去して活性キモシンを生産するこ
とによって、成熟キモシンを得る。
に分泌されたポリペプチドとの融合ポリペプチドとして
のプロー型内でのキモシンの発現の結果である。好まし
い態様においては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配
列を含むglaA遺伝子によってコードされるアスペルギル
ス・アワモリからのグルコアミラーゼは、プロキモシン
のアミノ−末端と融合している。グルコアミラーゼシグ
ナル配列及び成熟グルコアミラーゼペプチド配列の存在
は、培地中への融合ポリペプチドの増幅した分泌を促進
する。次いで、培地を酸性して、キモシン前配列を処理
し、プロペプチドを除去して活性キモシンを生産するこ
とによって、成熟キモシンを得る。
ここで用いる場合、「融合DNA配列」は、５′から
３′に至る第１、第２、第３及び第４のDNA配列を含む
ものである。「第1DNA配列」は、第１の糸状菌の分泌配
列として、シグナルペプチド機能部をコードする。かか
るシグナル配列は、ウシキモシン、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性剤、ヒトインターフェロン由来のシグナル配
列及びグインネ（Gwynne）によるスプラ（1987）によっ
て開示されたシグナル配列の如き合成コンサンセス真核
シグナル配列を含む真核細胞（eukaryotes）由来のシグ
ナル配列と同様に、アスペルギルス・アワモリ、アスペ
ルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ（Asperg
illus oryzae）由来のグルコアミラーゼ、α−アミラー
ゼ及びアスパルチルプロテアーゼからのシグナル配列、
トリコデルマ（Trichoderma）由来のセロビオハイドラ
ーゼＩ、セロビオハイドロラーゼII、エンドグルカナー
ゼＩ、エンドグルカナーゼIIIからのシグナル配列、ニ
ューラスパラ（Neurospora）及びヒューミコラ（Humico
la）由来のグルコアミラーゼからのシグナル配列を含
む。特に好ましいシグナル配列は、融合ポリペプチドを
発現し分泌するために使用された発現宿主によって分泌
されたポリペプチドから誘導されたシグナル配列であ
る。例えば、アスペルギルス・アワモリ由来のグルコア
ミラーゼからのシグナル配列は、アスペルギルス・アワ
モリ由来の融合ポリペプチドを発現し、分泌する場合に
選択される。ここで用いる場合、第１アミノ酸配列は、
糸状菌の中の機能部である分泌配列に対応している。か
かるアミノ酸配列は、既に規定した第1DNA配列によって
コードされる。
３′に至る第１、第２、第３及び第４のDNA配列を含む
ものである。「第1DNA配列」は、第１の糸状菌の分泌配
列として、シグナルペプチド機能部をコードする。かか
るシグナル配列は、ウシキモシン、ヒト組織プラスミノ
ーゲン活性剤、ヒトインターフェロン由来のシグナル配
列及びグインネ（Gwynne）によるスプラ（1987）によっ
て開示されたシグナル配列の如き合成コンサンセス真核
シグナル配列を含む真核細胞（eukaryotes）由来のシグ
ナル配列と同様に、アスペルギルス・アワモリ、アスペ
ルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ（Asperg
illus oryzae）由来のグルコアミラーゼ、α−アミラー
ゼ及びアスパルチルプロテアーゼからのシグナル配列、
トリコデルマ（Trichoderma）由来のセロビオハイドラ
ーゼＩ、セロビオハイドロラーゼII、エンドグルカナー
ゼＩ、エンドグルカナーゼIIIからのシグナル配列、ニ
ューラスパラ（Neurospora）及びヒューミコラ（Humico
la）由来のグルコアミラーゼからのシグナル配列を含
む。特に好ましいシグナル配列は、融合ポリペプチドを
発現し分泌するために使用された発現宿主によって分泌
されたポリペプチドから誘導されたシグナル配列であ
る。例えば、アスペルギルス・アワモリ由来のグルコア
ミラーゼからのシグナル配列は、アスペルギルス・アワ
モリ由来の融合ポリペプチドを発現し、分泌する場合に
選択される。ここで用いる場合、第１アミノ酸配列は、
糸状菌の中の機能部である分泌配列に対応している。か
かるアミノ酸配列は、既に規定した第1DNA配列によって
コードされる。
ここに用いる場合、「第2DNA配列」は、糸状菌から正
規に発現された「分泌ポリペプチド」をコードする。か
かる分泌ポリペプチドは、アスペルギルス・アワモリ、
アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリザエ
由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ及びアスパル
チルプロテアーゼ、トリコデルマ由来のセロビオハイド
ロラーゼＩ、セロビオハイドロラーゼII、エンドグルカ
ナーゼＩ及びエンドグルカナーゼIII、ニューラスパラ
種及びヒューミコラ種由来のグルコアミラーゼを含む。
第1DNA配列と同様に、好ましい分泌ポリペプチドは、糸
状菌発現宿主によって天然に分泌されたポリペプチドで
ある。従って、例えば、アスペルギルス・アワモリを用
いる場合、好ましい分泌ポリペプチドは、アスペルギラ
ス・アワモリ由来のグルコアミラーゼ及びα−アミラー
ゼであり、最も好ましくは、グルコアミラーゼである。
規に発現された「分泌ポリペプチド」をコードする。か
かる分泌ポリペプチドは、アスペルギルス・アワモリ、
アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリザエ
由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ及びアスパル
チルプロテアーゼ、トリコデルマ由来のセロビオハイド
ロラーゼＩ、セロビオハイドロラーゼII、エンドグルカ
ナーゼＩ及びエンドグルカナーゼIII、ニューラスパラ
種及びヒューミコラ種由来のグルコアミラーゼを含む。
第1DNA配列と同様に、好ましい分泌ポリペプチドは、糸
状菌発現宿主によって天然に分泌されたポリペプチドで
ある。従って、例えば、アスペルギルス・アワモリを用
いる場合、好ましい分泌ポリペプチドは、アスペルギラ
ス・アワモリ由来のグルコアミラーゼ及びα−アミラー
ゼであり、最も好ましくは、グルコアミラーゼである。
ここで用いる場合、「第3DNA配列」は、開裂可能なポ
リペプチドをコードするDNA配列を含む。かかる配列
は、ウシキモシンの前配列、サブチリシンの前配列、ヒ
ト免疫不全ウイルスプロテアーゼを含むレトロウイルス
のプロテアーゼを含むDNA配列、及びトリプシン、因子X
aコラーゲナーゼ、クロストリピン、サブチリシン、キ
モシン、イーストKEX2プロテアーゼ等によって認識され
て開裂したアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む。
例えば、マーストン（Marston）によるBiol.Chem.J.24
0,1−12（1986）を参照のこと。かかる第3DNA配列は、
またシアノゲンブロマイドによって選択的に開裂され得
るアミノ酸メチオニンをコードすることもできる。第3D
NA配列は、融合ポリペプチドの開裂を引き起こす特定の
酵素または化学試剤によって認識される必要があるアミ
ノ酸配列をコードすることだけを必要としていると理解
されるべきである。従って、例えば、キモシンまたはサ
ブチリシンの全前配列を用いる必要はない。むしろ、適
当な酵素による認識と開裂のために必要な前配列の一部
分だけが要求されるのである。
リペプチドをコードするDNA配列を含む。かかる配列
は、ウシキモシンの前配列、サブチリシンの前配列、ヒ
ト免疫不全ウイルスプロテアーゼを含むレトロウイルス
のプロテアーゼを含むDNA配列、及びトリプシン、因子X
aコラーゲナーゼ、クロストリピン、サブチリシン、キ
モシン、イーストKEX2プロテアーゼ等によって認識され
て開裂したアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む。
例えば、マーストン（Marston）によるBiol.Chem.J.24
0,1−12（1986）を参照のこと。かかる第3DNA配列は、
またシアノゲンブロマイドによって選択的に開裂され得
るアミノ酸メチオニンをコードすることもできる。第3D
NA配列は、融合ポリペプチドの開裂を引き起こす特定の
酵素または化学試剤によって認識される必要があるアミ
ノ酸配列をコードすることだけを必要としていると理解
されるべきである。従って、例えば、キモシンまたはサ
ブチリシンの全前配列を用いる必要はない。むしろ、適
当な酵素による認識と開裂のために必要な前配列の一部
分だけが要求されるのである。
ここで用いる場合、「第4DNA配列」は、「目的とする
ポリペプチド」をコードする。かかる目的とするポリペ
プチドは、ウシキモシン、ヒト組織プラスミノーゲン活
性剤等の哺乳動物酵素、ヒト成長ホルモン、ヒトインタ
ーフェロン、ヒトインターロイキンの如き哺乳動物ホル
モン、及びヒト血清アルブミンの如き哺乳動物タンパク
を含む。目的とするポリペプチドは、また、バチルス種
（Bacillus species）由来のα−アミラーゼ、シュード
モナス種（Pseudomonas species）由来のリパーゼの如
きバクテリアの酵素にも及ぶ。目的とするポリペプチド
は、更に、ファネロカエーテ（Phanerochaete）由来の
リグニンパーオキシダーゼ及びMn2+−依存パーオキシダ
ーゼ、ヒューミコラ種由来のアミラーゼ並びにミューコ
ア種（Mucor species）由来のアスパルチルプロテアー
ゼの如き菌による酵素をも含む。
ポリペプチド」をコードする。かかる目的とするポリペ
プチドは、ウシキモシン、ヒト組織プラスミノーゲン活
性剤等の哺乳動物酵素、ヒト成長ホルモン、ヒトインタ
ーフェロン、ヒトインターロイキンの如き哺乳動物ホル
モン、及びヒト血清アルブミンの如き哺乳動物タンパク
を含む。目的とするポリペプチドは、また、バチルス種
（Bacillus species）由来のα−アミラーゼ、シュード
モナス種（Pseudomonas species）由来のリパーゼの如
きバクテリアの酵素にも及ぶ。目的とするポリペプチド
は、更に、ファネロカエーテ（Phanerochaete）由来の
リグニンパーオキシダーゼ及びMn2+−依存パーオキシダ
ーゼ、ヒューミコラ種由来のアミラーゼ並びにミューコ
ア種（Mucor species）由来のアスパルチルプロテアー
ゼの如き菌による酵素をも含む。
対応する４つのアミノ酸配列をコードする上記で規定
した４つのDNA配列は、「融合DNA配列」を形成すべく結
合している。かかる融合DNA配列は、第１、第２、第３
及び第4DNA配列の順で５′−末端から３′−末端に至る
適当な読み方をする構成に組まれている。そのように組
まれているので、該DNA配列は、糸状菌、分泌ポリペプ
チドまたは糸状菌から正規に分泌されたポリペプチドの
一断片中の配列、開裂可能なリンカーポリペプチド及び
目的とするポリペプチドの如きそのアミノ−末端からシ
グナルペプチド機能部をコードする「融合ポリペプチ
ド」をコードするであろう。
した４つのDNA配列は、「融合DNA配列」を形成すべく結
合している。かかる融合DNA配列は、第１、第２、第３
及び第4DNA配列の順で５′−末端から３′−末端に至る
適当な読み方をする構成に組まれている。そのように組
まれているので、該DNA配列は、糸状菌、分泌ポリペプ
チドまたは糸状菌から正規に分泌されたポリペプチドの
一断片中の配列、開裂可能なリンカーポリペプチド及び
目的とするポリペプチドの如きそのアミノ−末端からシ
グナルペプチド機能部をコードする「融合ポリペプチ
ド」をコードするであろう。
既に示したように、第1DNA配列は、第１糸状菌中の分
泌シグナルとして、シグナルペプチド機能部をコードす
る。該シグナル配列は、糸状菌の特定の種から分泌され
たポリペプチドから誘導してもよい。これもまた既に示
したように、第2DNA配列は、第１糸状菌（これから該シ
グナルペプチドが得られたのである）または第２糸状菌
（キレ、該シグナルペプチド及び分泌ポリペプチドが異
なる糸状菌からのものであるなら、または、該シグナル
ペプチドが糸状菌以外、例えばウシ種由来のキモシンシ
グナルを起源として得られたものであるなら）のいずれ
かによって正規に分泌されたポリペプチドの全部または
一部分に対応する第２アミノ酸配列をコードする。
泌シグナルとして、シグナルペプチド機能部をコードす
る。該シグナル配列は、糸状菌の特定の種から分泌され
たポリペプチドから誘導してもよい。これもまた既に示
したように、第2DNA配列は、第１糸状菌（これから該シ
グナルペプチドが得られたのである）または第２糸状菌
（キレ、該シグナルペプチド及び分泌ポリペプチドが異
なる糸状菌からのものであるなら、または、該シグナル
ペプチドが糸状菌以外、例えばウシ種由来のキモシンシ
グナルを起源として得られたものであるなら）のいずれ
かによって正規に分泌されたポリペプチドの全部または
一部分に対応する第２アミノ酸配列をコードする。
既に示したように、分泌ポリペプチドの成熟した配列
の全部または一部分が、融合DNA配列の構築に使用され
る。本発明を実施するのに完全長の分泌ポリペプチドが
使用されるのが好ましい。しかしながら、分泌ポリペプ
チドの機能部分を用いてもよい。ここで用いているよう
に、分泌ポリペプチドの「部分」は、ここで定義した融
合ポリペプチドの他の成分と結合した場合に、該分泌ポ
リペプチドを利用していないベクターを用いたときに分
泌される目的とするポリペプチドのレベルと比較して、
目的とするポリペプチドの増加した分泌を行なう分泌ポ
リペプチドの機能部分として、機能的に定義される。従
って、第１、第２、第３及び第４のアミノ酸配列をコー
ドする融合DNA配列（その第2DNA配列は分泌ポリペプチ
ドの全部または一部分を含んでいる）の分泌レベルは、
第１、第３及び第４アミノ酸配列だけを含む（つまり、
分泌ポリペプチドまたはその一部分を欠いている）第２
融合ポリペプチドの分泌レベルと比較される。該第２融
合ポリペプチドと比較して増加した分泌を行なうことの
できる、それら分泌ポリペプチドから得られるアミノ酸
配列及びそのようなアミノ酸をコードするDNA配列は、
ここに定義した如き分泌ポリペプチドの「部分」を含
む。
の全部または一部分が、融合DNA配列の構築に使用され
る。本発明を実施するのに完全長の分泌ポリペプチドが
使用されるのが好ましい。しかしながら、分泌ポリペプ
チドの機能部分を用いてもよい。ここで用いているよう
に、分泌ポリペプチドの「部分」は、ここで定義した融
合ポリペプチドの他の成分と結合した場合に、該分泌ポ
リペプチドを利用していないベクターを用いたときに分
泌される目的とするポリペプチドのレベルと比較して、
目的とするポリペプチドの増加した分泌を行なう分泌ポ
リペプチドの機能部分として、機能的に定義される。従
って、第１、第２、第３及び第４のアミノ酸配列をコー
ドする融合DNA配列（その第2DNA配列は分泌ポリペプチ
ドの全部または一部分を含んでいる）の分泌レベルは、
第１、第３及び第４アミノ酸配列だけを含む（つまり、
分泌ポリペプチドまたはその一部分を欠いている）第２
融合ポリペプチドの分泌レベルと比較される。該第２融
合ポリペプチドと比較して増加した分泌を行なうことの
できる、それら分泌ポリペプチドから得られるアミノ酸
配列及びそのようなアミノ酸をコードするDNA配列は、
ここに定義した如き分泌ポリペプチドの「部分」を含
む。
一般に、分泌ポリペプチドのかかる部分は、該分泌ポ
リペプチドの50％を越え、好ましくは75％を越え、最も
好ましくは90％を越えて含む。かかるタンパクは、好ま
しくは、該分泌ポリペプチドのアミノ−末端部分を含
む。
リペプチドの50％を越え、好ましくは75％を越え、最も
好ましくは90％を越えて含む。かかるタンパクは、好ま
しくは、該分泌ポリペプチドのアミノ−末端部分を含
む。
本発明の「糸状菌」は、真核微生物であり、再分割真
菌門（Eumycotina）の全ての糸状型を含む。アレクソポ
ーラス（Alexopoulos）によるIntroductory Mycology、
ニューヨーク:Wiley（1962）。これら菌は、キチン、セ
ルロース及び他の複合ポリサッカライトから成る細胞壁
を有する植物性の菌糸体によって特徴付けられる。本発
明の糸状菌は、イースト菌とは、形態学的にも生理学的
にも、遺伝学的にも相違している。糸状菌による植物的
成長は、分節菌伸長によるものであり、炭素分解作用
は、空気を必須とする。これに対し、サッカロミケス・
セレビシアの如きイースト菌による植物的成長は、単細
胞葉状体の発芽によるものであり、炭素分解作用は、醗
酵によるものであろう。サッカロミケス・セレビシア
は、非常に安定な二倍体相である突起を有しているのに
反し、アスペルギリ（Aspergilli）及びニューラスパラ
のような糸状菌では、二倍体は、減数分裂の前に短時間
に存在するだけである。サッカロミケス・セレビシアは
17本の染色体を有しているのに対し、アスパルギルス・
ニドゥランスやニューラスパラ・クラッサ（Neurospora
crassa）は、それぞれ８本及び７本有しているに過ぎ
ない。サッカロミケス・セレビシアと糸状菌の相違に関
する最近の説明は、アスパルギルスとトリコデルマのイ
ントロンを処理する能力及び糸状菌の多くの転写調節部
分を認識する能力をサッカロミケス・セレビシアが欠い
ているという点を含む（イニス（Innis）らによる、Sci
ence,228,21−26（1985））。
菌門（Eumycotina）の全ての糸状型を含む。アレクソポ
ーラス（Alexopoulos）によるIntroductory Mycology、
ニューヨーク:Wiley（1962）。これら菌は、キチン、セ
ルロース及び他の複合ポリサッカライトから成る細胞壁
を有する植物性の菌糸体によって特徴付けられる。本発
明の糸状菌は、イースト菌とは、形態学的にも生理学的
にも、遺伝学的にも相違している。糸状菌による植物的
成長は、分節菌伸長によるものであり、炭素分解作用
は、空気を必須とする。これに対し、サッカロミケス・
セレビシアの如きイースト菌による植物的成長は、単細
胞葉状体の発芽によるものであり、炭素分解作用は、醗
酵によるものであろう。サッカロミケス・セレビシア
は、非常に安定な二倍体相である突起を有しているのに
反し、アスペルギリ（Aspergilli）及びニューラスパラ
のような糸状菌では、二倍体は、減数分裂の前に短時間
に存在するだけである。サッカロミケス・セレビシアは
17本の染色体を有しているのに対し、アスパルギルス・
ニドゥランスやニューラスパラ・クラッサ（Neurospora
crassa）は、それぞれ８本及び７本有しているに過ぎ
ない。サッカロミケス・セレビシアと糸状菌の相違に関
する最近の説明は、アスパルギルスとトリコデルマのイ
ントロンを処理する能力及び糸状菌の多くの転写調節部
分を認識する能力をサッカロミケス・セレビシアが欠い
ているという点を含む（イニス（Innis）らによる、Sci
ence,228,21−26（1985））。
次の属を含む多種の糸状菌を発現宿主として使用する
ことがきる。即ち、アスペルギルス、トリコデルマ、ニ
ューラスパラ、ペニシリウム（Penicillium）、セファ
ロスポリウム（Cephalosporium）、アクリヤ（Achly
a）、パダスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothi
a）、ミューコア（Mucor）、コクリオボラス（Cochliob
olus）及びピリキュラリア（Pyricularia）属である。
更に特定すると発現宿主には、アスペルギルス・ニドゥ
ランス〔イェルトン（Yelton）らによるProc.Natl.Aca
d.Sci.USA,81,1470−1474（1984）；マラネイ（Mullane
y）らによるMol.Gen.Genet.199,37−45（1985）；ジョ
ン（John）らによるEnzyme Microb.Tchnol.６,386−389
（1984）；チルバーン（Tilburn）らによる（Cene.26,2
05−221（1982）；バランス（Ballance）らによるBioch
em.Biophys.Res.Comm.112,284−289（1983）；ジョンス
トン（Johnston）らによるEMBO J.４,1307−1311（198
5）〕、アスペルギルス・ニガー〔ケリー（Kelly）らに
よるEMBO４,475−479〕、例えば、NRRL3112,ATCC22342,
ATCC44733,ATCC14331及びUVK143f菌等のアスペルギルス
・アワモリ、例えば、ATCC11490等のアスペルギルス・
オリザエ、ニューラスパラ・クラッサ〔ケース（Case）
らによるProc.Natl.Acad.Scie.USA 76,5259−5263（197
9）；ランボウィッツの米国特許第4,486,553号；キンゼ
イ（Kinsey）らによるMolecular and Cellular Biology
４,117−122（1984）；ブル（Bull）らによるNature 3
10,701−704（1984）〕，例えば、NRRL15709、ATCC1363
1,56764,56765,56466,56767等のトリコデルマ・リーゼ
イ（Trichoderma reesei）及び、例えば、ATCC32098及
び32086等のトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma virid
e）が含まれる。好ましい発現宿主は、多数の分泌アス
パルチルプロテアーゼをコードする遺伝子が削除されて
いるアスペルギルス・アワモリである。この好ましい発
現宿主の作成は、1988年７月１日に出願された米国特許
出願第214,237号に記載されており、これは、この明細
書に引用されている。
ことがきる。即ち、アスペルギルス、トリコデルマ、ニ
ューラスパラ、ペニシリウム（Penicillium）、セファ
ロスポリウム（Cephalosporium）、アクリヤ（Achly
a）、パダスポラ（Podospora）、エンドチア（Endothi
a）、ミューコア（Mucor）、コクリオボラス（Cochliob
olus）及びピリキュラリア（Pyricularia）属である。
更に特定すると発現宿主には、アスペルギルス・ニドゥ
ランス〔イェルトン（Yelton）らによるProc.Natl.Aca
d.Sci.USA,81,1470−1474（1984）；マラネイ（Mullane
y）らによるMol.Gen.Genet.199,37−45（1985）；ジョ
ン（John）らによるEnzyme Microb.Tchnol.６,386−389
（1984）；チルバーン（Tilburn）らによる（Cene.26,2
05−221（1982）；バランス（Ballance）らによるBioch
em.Biophys.Res.Comm.112,284−289（1983）；ジョンス
トン（Johnston）らによるEMBO J.４,1307−1311（198
5）〕、アスペルギルス・ニガー〔ケリー（Kelly）らに
よるEMBO４,475−479〕、例えば、NRRL3112,ATCC22342,
ATCC44733,ATCC14331及びUVK143f菌等のアスペルギルス
・アワモリ、例えば、ATCC11490等のアスペルギルス・
オリザエ、ニューラスパラ・クラッサ〔ケース（Case）
らによるProc.Natl.Acad.Scie.USA 76,5259−5263（197
9）；ランボウィッツの米国特許第4,486,553号；キンゼ
イ（Kinsey）らによるMolecular and Cellular Biology
４,117−122（1984）；ブル（Bull）らによるNature 3
10,701−704（1984）〕，例えば、NRRL15709、ATCC1363
1,56764,56765,56466,56767等のトリコデルマ・リーゼ
イ（Trichoderma reesei）及び、例えば、ATCC32098及
び32086等のトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma virid
e）が含まれる。好ましい発現宿主は、多数の分泌アス
パルチルプロテアーゼをコードする遺伝子が削除されて
いるアスペルギルス・アワモリである。この好ましい発
現宿主の作成は、1988年７月１日に出願された米国特許
出願第214,237号に記載されており、これは、この明細
書に引用されている。
ここで用いる場合、「プロモーター配列」とは、発現
を目的として特定の糸状菌によって認識されるDNA配列
のことである。それは、上記で定義した融合ポリペプチ
ドをコードするDNA配列に実施可能に連結されている。
かかる連結は、融合DNA配列をコードするDNA配列の翻訳
開始コドンに関して、プロモーターの位置定めを含んで
いる。該プロモーター配列は、融合DNA配列の発現を媒
介している転写及び翻訳の制御配列を含んでいる。例と
しては、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギル
ス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子〔ヌンベルグ（Nunb
erg）らによるMol.Cell.Biol.４,2306−2315（1984）；
ボエル（Boel）らによるEMBO J.３,1581−1585（198
4）〕、ニューコア・ミーヘイ（Mucor miehei）カルボ
キシルプロテアーゼ遺伝子、トリコデルマ・リーゼイヒ
ロビオハイドロラーゼＩ遺伝子〔シューメーカー（Shoe
maker）らのヨーロッパ特許出願EPO0137280A1（198
4）〕、アスペルギルス・ニドゥランスtrpC遺伝子〔イ
ェルトン（Yelton）らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA 8
1,1470−1474（1984）；マラネイ（Mullaney）らによる
Mol.Gen.Genet.199,37−45（1985）〕、アスペルギルス
・ニドゥランスalcA遺伝子〔ロッキントン（Lockingto
n）らによるGene33,137−149（1986）〕、アスペルギル
ス・ニドゥランスtpiA遺伝子〔マックナイト（McKnigh
t）らによるCell46,143−147（1986）〕、アスペルギル
ス・ニドゥランスamdS遺伝子〔ヒネス（Hynes）らによ
るMol.Cell.Biol.３,1430−1439（1983）〕由来のプロ
モーター及びSV40初期プロモーターの如きより高い真核
プロモーター〔バークレイ（Barclay）らによるMolecul
ar and Cellular Biology ３,2117−2130（1983）〕が
ある。
を目的として特定の糸状菌によって認識されるDNA配列
のことである。それは、上記で定義した融合ポリペプチ
ドをコードするDNA配列に実施可能に連結されている。
かかる連結は、融合DNA配列をコードするDNA配列の翻訳
開始コドンに関して、プロモーターの位置定めを含んで
いる。該プロモーター配列は、融合DNA配列の発現を媒
介している転写及び翻訳の制御配列を含んでいる。例と
しては、アスペルギルス・アワモリまたはアスペルギル
ス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子〔ヌンベルグ（Nunb
erg）らによるMol.Cell.Biol.４,2306−2315（1984）；
ボエル（Boel）らによるEMBO J.３,1581−1585（198
4）〕、ニューコア・ミーヘイ（Mucor miehei）カルボ
キシルプロテアーゼ遺伝子、トリコデルマ・リーゼイヒ
ロビオハイドロラーゼＩ遺伝子〔シューメーカー（Shoe
maker）らのヨーロッパ特許出願EPO0137280A1（198
4）〕、アスペルギルス・ニドゥランスtrpC遺伝子〔イ
ェルトン（Yelton）らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA 8
1,1470−1474（1984）；マラネイ（Mullaney）らによる
Mol.Gen.Genet.199,37−45（1985）〕、アスペルギルス
・ニドゥランスalcA遺伝子〔ロッキントン（Lockingto
n）らによるGene33,137−149（1986）〕、アスペルギル
ス・ニドゥランスtpiA遺伝子〔マックナイト（McKnigh
t）らによるCell46,143−147（1986）〕、アスペルギル
ス・ニドゥランスamdS遺伝子〔ヒネス（Hynes）らによ
るMol.Cell.Biol.３,1430−1439（1983）〕由来のプロ
モーター及びSV40初期プロモーターの如きより高い真核
プロモーター〔バークレイ（Barclay）らによるMolecul
ar and Cellular Biology ３,2117−2130（1983）〕が
ある。
同様に「ターミネーター配列」は、転写を終了させる
発現宿主によって認識されるDNA配列である。それは、
発現されるべき融合ポリペプチドをコードする融合DNA
の３′−末端に実施可能に連結されている。例として
は、アスペルギルス・ニドゥランスtrpC遺伝子〔イェル
トン（Yelton）らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA81,147
0−1474（1984）；マラネイ（Mullaney）らによるMol.G
en.Genet.199,37−45（1985）〕、アスペルギルス・ア
ワモリまたはアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ
遺伝子〔ヌンベルグ（Nunberg）らによるMol.Cell.Bio
l.４,2306−253（1984）；ボエル（Boel）らによるEMBO
J.３,1581−1585（1984）〕及びミューコア・ミーヘ
イカルボキシルプロテアーゼ遺伝子由来のターミネータ
ー（EPO公報第0215594号）がある。もっとも、いかなる
菌のターミネーターも本発明において機能すると思われ
る。
発現宿主によって認識されるDNA配列である。それは、
発現されるべき融合ポリペプチドをコードする融合DNA
の３′−末端に実施可能に連結されている。例として
は、アスペルギルス・ニドゥランスtrpC遺伝子〔イェル
トン（Yelton）らによるProc.Natl.Acad.Sci.USA81,147
0−1474（1984）；マラネイ（Mullaney）らによるMol.G
en.Genet.199,37−45（1985）〕、アスペルギルス・ア
ワモリまたはアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ
遺伝子〔ヌンベルグ（Nunberg）らによるMol.Cell.Bio
l.４,2306−253（1984）；ボエル（Boel）らによるEMBO
J.３,1581−1585（1984）〕及びミューコア・ミーヘ
イカルボキシルプロテアーゼ遺伝子由来のターミネータ
ー（EPO公報第0215594号）がある。もっとも、いかなる
菌のターミネーターも本発明において機能すると思われ
る。
「ポリアデニル化配列」とは、転写の際に、転写され
たmRNAにポリアデノシン残基を付加する発現宿主によっ
て認識されるDNA配列である。それは、発現されるべき
融合ポリペプチドをコードする融合DNAの３′−末端に
実施可能に連結されている。例としては、アスペルギル
ス・ニドゥランスtrpC遺伝子〔イェルトン（Yelton）ら
によるProc.Natl.Acad.Sci.USA 81,1470−1474（198
4）；マラネイ（Mullaney）らによるMol.Gen.Genet.19
9,37−45（1985）〕、アスペルギルス・アワモリまたは
アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子〔ヌン
ベルグ（Nunberg）らによるMol.Cell.Biol.４,2306−23
15（1984）；ボエル（Boel）らによるEMBO J.３,1581
−1585（1984）〕及び上記のミューコア・ミーヘイカル
ボキシルプロテアーゼ遺伝子がある。しかしながら、い
かなる菌のポリアデニル化配列も本発明において機能す
ると思われる。
たmRNAにポリアデノシン残基を付加する発現宿主によっ
て認識されるDNA配列である。それは、発現されるべき
融合ポリペプチドをコードする融合DNAの３′−末端に
実施可能に連結されている。例としては、アスペルギル
ス・ニドゥランスtrpC遺伝子〔イェルトン（Yelton）ら
によるProc.Natl.Acad.Sci.USA 81,1470−1474（198
4）；マラネイ（Mullaney）らによるMol.Gen.Genet.19
9,37−45（1985）〕、アスペルギルス・アワモリまたは
アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子〔ヌン
ベルグ（Nunberg）らによるMol.Cell.Biol.４,2306−23
15（1984）；ボエル（Boel）らによるEMBO J.３,1581
−1585（1984）〕及び上記のミューコア・ミーヘイカル
ボキシルプロテアーゼ遺伝子がある。しかしながら、い
かなる菌のポリアデニル化配列も本発明において機能す
ると思われる。
原料及び方法 一般的な方法は、以前、EPO公報第0215594号に記載し
たとおりである。
たとおりである。
菌 株 この研究で用いたアスペルギルス・アワモリは全てグ
ルコアミラーゼ過剰生産（over−producing）株（UVK14
3f）由来であり、UVK143f自体はEPO公報第0215594号に
記載のようにNRRL3112由来であった。菌株のゲノタイプ
は、株GC12（pvrG5:argB3）〔米国特許出願第214,237号
に記載したように菌株pyr4−５（GC5としても知られて
いる）由来である〕及び菌株GCΔGAM23（pyrG5;ΔglaA2
3）であった。
ルコアミラーゼ過剰生産（over−producing）株（UVK14
3f）由来であり、UVK143f自体はEPO公報第0215594号に
記載のようにNRRL3112由来であった。菌株のゲノタイプ
は、株GC12（pvrG5:argB3）〔米国特許出願第214,237号
に記載したように菌株pyr4−５（GC5としても知られて
いる）由来である〕及び菌株GCΔGAM23（pyrG5;ΔglaA2
3）であった。
菌株GCΔGMA23は、グルコアミラーゼ（glaA）遺伝子
の分裂によって株GC12から導いたものである。これは、
線状DNAフラグメントでの形質転換により行なわれた
（ミラー（Miller）らによるMol.Cell.Biol.５,1714−1
721（1985）に記載された方法と同様である）。この線
状DNAフラグメントは、いずれかの末端でglaAの側防（f
lanking）配列を有し、2.7kbのプロモーターを伴い、そ
して選別可能なマーカーとしてアスペルギルス・ニドゥ
ランスargB遺伝子によって置き換えられたglaA遺伝子の
領域をコードしている。我々がそれからこのDNAの線状
フラグメントを得たところのベクターは、次のようにし
て組み立てた（第１図）。約3.5kbの５′側防（flankin
g）DNA及びアスペルギルス・アワモリUVK143fglaA遺伝
子をコードする2kbの配列を含むDNAの5.5kb Cla Iフラ
グメントは、pBR322のCla I位置にクローン化されたも
のである。このプラスミドは、翻訳開始コドンから上流
1966bp位置から約200コドンのコード配列が続く位置ま
でに及ぶDNAの区画を除去するため制限エンドヌクレア
ーゼXho I及びBgl IIで切断した。張り出したDNA末端
は、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを使用し
てふさぎ、Bgl II開裂位置を修復するために連結し、pB
RΔGAMXBを得た。アスペルギルス・ニドゥランスargB遺
伝子を含む1.7kbのBam H Iフラグメントは、第１図に示
したベクターpBRΔgam−argB4を作るため、このBal II
の修復位置にクローン化した。このベクターは、Cla I
で切断され、形質転換体を選別するために、argB変異体
の相補体を使用して株GC12を形質転換するのに使用され
た。そのクロモソマールglaA位置でglaA側防配列及びar
gB遺伝子を含有する線状フラグメントの合成体は、サザ
ンブロット分析によって同定した。簡単に言えば、形質
転換体及び菌GC12由来のDNAは、Cla Iで消化され、アガ
ロースゲル電気泳動に付され、メンブランフィルターで
濾過し、そしてアスペルギルス・ニドゥランスglaA遺伝
子を含むDNAのラジオラベル化したフラグメントとハイ
ブリダイズした。形質転換されていないGC12DNAにおい
て、２本のバンド（5.5及び1.9kbの大きさ）が観察さ
れ、続いて、オートラジオグラフ法でクロモソマールgl
aA遺伝子が現れた（データは示されていない）。予期さ
れたglaA遺伝子の分裂による入れ替わりは、5.5kb DNA
フラグメントの4.5kbフラグメントによる変換であった
（第２図）。この変換は、形質転換された株GCΔGAM23
に生じた。グルコアミラーゼに対する特別の酵素免疫学
的分析方法により、この菌株は、検出できるレベルのグ
ルコアミラーゼを分泌しないことが確認された。
の分裂によって株GC12から導いたものである。これは、
線状DNAフラグメントでの形質転換により行なわれた
（ミラー（Miller）らによるMol.Cell.Biol.５,1714−1
721（1985）に記載された方法と同様である）。この線
状DNAフラグメントは、いずれかの末端でglaAの側防（f
lanking）配列を有し、2.7kbのプロモーターを伴い、そ
して選別可能なマーカーとしてアスペルギルス・ニドゥ
ランスargB遺伝子によって置き換えられたglaA遺伝子の
領域をコードしている。我々がそれからこのDNAの線状
フラグメントを得たところのベクターは、次のようにし
て組み立てた（第１図）。約3.5kbの５′側防（flankin
g）DNA及びアスペルギルス・アワモリUVK143fglaA遺伝
子をコードする2kbの配列を含むDNAの5.5kb Cla Iフラ
グメントは、pBR322のCla I位置にクローン化されたも
のである。このプラスミドは、翻訳開始コドンから上流
1966bp位置から約200コドンのコード配列が続く位置ま
でに及ぶDNAの区画を除去するため制限エンドヌクレア
ーゼXho I及びBgl IIで切断した。張り出したDNA末端
は、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを使用し
てふさぎ、Bgl II開裂位置を修復するために連結し、pB
RΔGAMXBを得た。アスペルギルス・ニドゥランスargB遺
伝子を含む1.7kbのBam H Iフラグメントは、第１図に示
したベクターpBRΔgam−argB4を作るため、このBal II
の修復位置にクローン化した。このベクターは、Cla I
で切断され、形質転換体を選別するために、argB変異体
の相補体を使用して株GC12を形質転換するのに使用され
た。そのクロモソマールglaA位置でglaA側防配列及びar
gB遺伝子を含有する線状フラグメントの合成体は、サザ
ンブロット分析によって同定した。簡単に言えば、形質
転換体及び菌GC12由来のDNAは、Cla Iで消化され、アガ
ロースゲル電気泳動に付され、メンブランフィルターで
濾過し、そしてアスペルギルス・ニドゥランスglaA遺伝
子を含むDNAのラジオラベル化したフラグメントとハイ
ブリダイズした。形質転換されていないGC12DNAにおい
て、２本のバンド（5.5及び1.9kbの大きさ）が観察さ
れ、続いて、オートラジオグラフ法でクロモソマールgl
aA遺伝子が現れた（データは示されていない）。予期さ
れたglaA遺伝子の分裂による入れ替わりは、5.5kb DNA
フラグメントの4.5kbフラグメントによる変換であった
（第２図）。この変換は、形質転換された株GCΔGAM23
に生じた。グルコアミラーゼに対する特別の酵素免疫学
的分析方法により、この菌株は、検出できるレベルのグ
ルコアミラーゼを分泌しないことが確認された。
培 地 アスペルギルス完全培地及び最小培地（ロウランズ
（Rowlands）らによるMol.Gen.Genet.126,201−216（19
73））が、菌のコロニーを成長させるために使用され、
2mg/mlのアルギニンまた必要とされるだけのウリジンが
供給された。２つの異なる液体培地が、振盪フラスコ中
でのキモシンの産生の研究のために使用された。SCM
は、マルトース50g/、麦芽エキス20g/、イーストエ
キス5g/、バクト−ペプトン1g/、アルギニン1g/
、ウリジン1g/、メチオニン0.5g/、ビオチン2mg/
、ストレプトマイシン50mg/、KH2PO334g/、NaNO6
6g/、MgSO4・7H2O1g/、KCl0.52g/、微量栄養元素
溶液（18）1ml/、ツィーン−80 1ml/、MazuDF60−
Ｐ消泡剤（Mazurケミカルズ社製）2ml/からなり、pH
は５であった。
（Rowlands）らによるMol.Gen.Genet.126,201−216（19
73））が、菌のコロニーを成長させるために使用され、
2mg/mlのアルギニンまた必要とされるだけのウリジンが
供給された。２つの異なる液体培地が、振盪フラスコ中
でのキモシンの産生の研究のために使用された。SCM
は、マルトース50g/、麦芽エキス20g/、イーストエ
キス5g/、バクト−ペプトン1g/、アルギニン1g/
、ウリジン1g/、メチオニン0.5g/、ビオチン2mg/
、ストレプトマイシン50mg/、KH2PO334g/、NaNO6
6g/、MgSO4・7H2O1g/、KCl0.52g/、微量栄養元素
溶液（18）1ml/、ツィーン−80 1ml/、MazuDF60−
Ｐ消泡剤（Mazurケミカルズ社製）2ml/からなり、pH
は５であった。
大豆培地は、マルトース150g/、大豆粉または溶解
性豆乳粉末60g/、クエン酸ソーダ70g/、（NH4）2SO
415g/、NaH2PO41g/、MgSO41g/、ツィーン−80 1
mg/、MazuDF60−Ｐ消泡剤2ml/，アルギニン1g/、
ウリジン1g/、ストレプトマイシン50mg/を含み、pH
は6.2であった。
性豆乳粉末60g/、クエン酸ソーダ70g/、（NH4）2SO
415g/、NaH2PO41g/、MgSO41g/、ツィーン−80 1
mg/、MazuDF60−Ｐ消泡剤2ml/，アルギニン1g/、
ウリジン1g/、ストレプトマイシン50mg/を含み、pH
は6.2であった。
菌の形質転換 プロトプラストの調製に際して0.7M KClを使用した
こととPEG溶液を添加したことを除いては、以前、カレ
ン（Cullen）らによるBio/Technogoly ５,369−376（19
87）に記載された方法と同様にしてポリエチレングリコ
ール（PEG）を媒体とした形質転換を実施した。更に、P
EG処理の前にオーリントリカルボン酸（10μg/ml）を最
終プロトプラスト洗浄物に加えた。我々は、このヌクレ
アーゼ禁止剤がアスペルギルス・アワモリの形質転換頻
度を２〜５倍増加するが、プロトプラストの生育力には
殆ど影響しないことを認めた（データは示していな
い）。
こととPEG溶液を添加したことを除いては、以前、カレ
ン（Cullen）らによるBio/Technogoly ５,369−376（19
87）に記載された方法と同様にしてポリエチレングリコ
ール（PEG）を媒体とした形質転換を実施した。更に、P
EG処理の前にオーリントリカルボン酸（10μg/ml）を最
終プロトプラスト洗浄物に加えた。我々は、このヌクレ
アーゼ禁止剤がアスペルギルス・アワモリの形質転換頻
度を２〜５倍増加するが、プロトプラストの生育力には
殆ど影響しないことを認めた（データは示していな
い）。
ワード（Ward）らによるCurr.Genet.14,37−42（198
8）に記載の方法と同様に、エレクトロポレーション法
による形質転換を実施した。簡単に言えば、洗浄したプ
ロトプラストをエレクトロポレーション緩衝液（7mMリ
ン酸ソーダ、pH7.2、1mM MgSO4、1.4Mソルビトール）に
懸濁し、DNAを加え、そして、バイオ−ラッド（Bio−Ra
d）遺伝子パルス発生装置の25μFDコンデンサーで2,125
V/cmのパルスを与えた。
8）に記載の方法と同様に、エレクトロポレーション法
による形質転換を実施した。簡単に言えば、洗浄したプ
ロトプラストをエレクトロポレーション緩衝液（7mMリ
ン酸ソーダ、pH7.2、1mM MgSO4、1.4Mソルビトール）に
懸濁し、DNAを加え、そして、バイオ−ラッド（Bio−Ra
d）遺伝子パルス発生装置の25μFDコンデンサーで2,125
V/cmのパルスを与えた。
これらいずれかの形質転換方法に続いて、1.2Mソルビ
トールを含みウリジンを含まない固形化したアスペルギ
ルス最小培地上にプロトプラストを敷いた。
トールを含みウリジンを含まない固形化したアスペルギ
ルス最小培地上にプロトプラストを敷いた。
DNA及びRNAの処理 プラスミド単離、制限酵素処理、DNAのライゲーショ
ン、DNAフラグメントの単離、DNAの脱リン、ニック（ni
ck）翻訳及びサザン分析（マニアチス（Maniatis）らに
よるMolecular Cloning,A Laboratory Manual（198
2），コールド・スプリング・ハーバー研究所、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）は標準法に
従った。菌のDNAは、従来開示された方法（カレン（Cul
len）らによるBio/Technology ５,369−376（1982））
と同様にして単離した。
ン、DNAフラグメントの単離、DNAの脱リン、ニック（ni
ck）翻訳及びサザン分析（マニアチス（Maniatis）らに
よるMolecular Cloning,A Laboratory Manual（198
2），コールド・スプリング・ハーバー研究所、コール
ド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）は標準法に
従った。菌のDNAは、従来開示された方法（カレン（Cul
len）らによるBio/Technology ５,369−376（1982））
と同様にして単離した。
総RNAは、菌（24）から抽出し、ポリ（Ａ）+RNAをオ
リゴ（dT）カラム上でマニアチルの標準操作（スプラ
（1982））に従って選別した。RNAをホルムアルデヒド
−アガロースゲルで電気泳動（Id）し、ノーザン分析を
するため、メンブランフィルターにブロットした。
リゴ（dT）カラム上でマニアチルの標準操作（スプラ
（1982））に従って選別した。RNAをホルムアルデヒド
−アガロースゲルで電気泳動（Id）し、ノーザン分析を
するため、メンブランフィルターにブロットした。
生体外翻訳 ウサギ網赤血球溶解物（ベゼスダ（Bethesda）リサー
チ研究所、ガイゼルスベルグ、MD）を使用して、アスペ
ルギルス・アワモリ由来のポリ（Ａ）+RNAの生体外翻訳
を行なった。各60μ反応液は、以下の成分を含む。即
ち、2.6μの2M酢酸カリウム（pH7.2）、３μの20mM
酢酸マグネシウム（pH7.2）、10μ（100μCi）の35S
−システイン（アメルスハム（Amersham）、アーリント
ンハイツ（Arlington Heights）,IL）、20μの反応緩
衝液（ベゼスダリサーチ研究所、カタログNo.8112）,40
μのウサギ網赤血球溶解物（ベゼスダリサーチ研究
所、カタログNo.8111）、36.8μの水及びRNA（約10μ
ｇ）。反応液を30℃で60分間インキュベートし、次い
で、氷上に移して、反応を停止した。冷トリクロロ酢酸
（10％v/v）で沈殿させて、35S−システインの取込み量
を測定した。
チ研究所、ガイゼルスベルグ、MD）を使用して、アスペ
ルギルス・アワモリ由来のポリ（Ａ）+RNAの生体外翻訳
を行なった。各60μ反応液は、以下の成分を含む。即
ち、2.6μの2M酢酸カリウム（pH7.2）、３μの20mM
酢酸マグネシウム（pH7.2）、10μ（100μCi）の35S
−システイン（アメルスハム（Amersham）、アーリント
ンハイツ（Arlington Heights）,IL）、20μの反応緩
衝液（ベゼスダリサーチ研究所、カタログNo.8112）,40
μのウサギ網赤血球溶解物（ベゼスダリサーチ研究
所、カタログNo.8111）、36.8μの水及びRNA（約10μ
ｇ）。反応液を30℃で60分間インキュベートし、次い
で、氷上に移して、反応を停止した。冷トリクロロ酢酸
（10％v/v）で沈殿させて、35S−システインの取込み量
を測定した。
以下の方法により、ラジオラベル化したキモシンポリ
ペプチドの免疫学的沈澱法を行なった。即ち、50μの
35S−ラベル化した生体外翻訳反応液を等容量の２×NET
S緩衝液（１×NETS緩衝液は、150mM NaCl、5mM EDTA,
50mMトリス−HCl、0.05％トリトンＸ−100及び0.25％ゼ
ラチンを含み、pH7.4である）と混合した。タンパクＡ
と明確に結合していないタンパクを除去するため、20μ
のパンソルビン〔スタフィラコックス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）細胞と結合しているタンパ
クＡ、カルビオケム（Calbiochem）、ラ・ジョラ（La J
olla）,CA〕を加え、混合し、室温で30分間インキュベ
ートした。従来は、該パンソルビン細胞を１×NETSで２
回洗浄し、その元の容量で懸濁したのである（10％懸濁
液）。インキュベートしたのち、該混合液を遠心分離
し、上澄み液を清浄な試験管にとった。次に、30μの
キモシン抗体（アフィニティクロマトグラフィーで精製
し、１×NETS中で最終濃度を430μg/mlに調節した）を
加え、該混合液を室温で２時間インキュベートした。イ
ンキュベートに続いて、洗浄したパンソルビン細胞50μ
を加えた。該懸濁液を完全に混合して室温で１時間イ
ンキュベートした。そののち、この混合液を遠心分離
し、得られたペレットを１×NETS中で３回洗浄した。最
後に、このペレットを25μの水で再懸濁し、サンプル
と等容量の緩衝液（１％SDS、25mMグリシン、192mMトリ
ス、pH8.3、50％サッカロース、50mMβ−メルカプトエ
タノール）に混合し、そして95℃で５分間加熱してから
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。
ペプチドの免疫学的沈澱法を行なった。即ち、50μの
35S−ラベル化した生体外翻訳反応液を等容量の２×NET
S緩衝液（１×NETS緩衝液は、150mM NaCl、5mM EDTA,
50mMトリス−HCl、0.05％トリトンＸ−100及び0.25％ゼ
ラチンを含み、pH7.4である）と混合した。タンパクＡ
と明確に結合していないタンパクを除去するため、20μ
のパンソルビン〔スタフィラコックス・アウレウス
（Staphylococcus aureus）細胞と結合しているタンパ
クＡ、カルビオケム（Calbiochem）、ラ・ジョラ（La J
olla）,CA〕を加え、混合し、室温で30分間インキュベ
ートした。従来は、該パンソルビン細胞を１×NETSで２
回洗浄し、その元の容量で懸濁したのである（10％懸濁
液）。インキュベートしたのち、該混合液を遠心分離
し、上澄み液を清浄な試験管にとった。次に、30μの
キモシン抗体（アフィニティクロマトグラフィーで精製
し、１×NETS中で最終濃度を430μg/mlに調節した）を
加え、該混合液を室温で２時間インキュベートした。イ
ンキュベートに続いて、洗浄したパンソルビン細胞50μ
を加えた。該懸濁液を完全に混合して室温で１時間イ
ンキュベートした。そののち、この混合液を遠心分離
し、得られたペレットを１×NETS中で３回洗浄した。最
後に、このペレットを25μの水で再懸濁し、サンプル
と等容量の緩衝液（１％SDS、25mMグリシン、192mMトリ
ス、pH8.3、50％サッカロース、50mMβ−メルカプトエ
タノール）に混合し、そして95℃で５分間加熱してから
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。
形質転換体によるキモシンの生産 259ml振盪フラスコに50mlのSCMまたは大豆培地を加
え、新鮮な細胞懸濁液を接種し、37℃で培養した。得ら
れたサンプルは、ウサギ、抗−キモシン抗体及び真正な
仔牛キモシン（クリスハンセン研究所、デンマーク）を
スタンダードに使用して、酵素免疫学的測定方法「EIA
法」（エングバール（Engvall）によるMethods Enzymol
70,419−439（1980））によりキモシンの量を測定し
た。
え、新鮮な細胞懸濁液を接種し、37℃で培養した。得ら
れたサンプルは、ウサギ、抗−キモシン抗体及び真正な
仔牛キモシン（クリスハンセン研究所、デンマーク）を
スタンダードに使用して、酵素免疫学的測定方法「EIA
法」（エングバール（Engvall）によるMethods Enzymol
70,419−439（1980））によりキモシンの量を測定し
た。
キモシン活性の測定は、マイクロタイタープレートで
行ない、凝乳により堆積物の増加に基づいた。25μの
サンプルを10mMのリン酸ソーダで希釈し、pH6.0の基質
（１％スキムミルク、40mM CaCl2及び50mM酢酸ソーダ、
pH6.0）150μを加えた。37℃で15分間インキュベート
したのち、堆積物の量を690nmで読みとった。真正な仔
牛キモシンをスタンダードとして使用した。
行ない、凝乳により堆積物の増加に基づいた。25μの
サンプルを10mMのリン酸ソーダで希釈し、pH6.0の基質
（１％スキムミルク、40mM CaCl2及び50mM酢酸ソーダ、
pH6.0）150μを加えた。37℃で15分間インキュベート
したのち、堆積物の量を690nmで読みとった。真正な仔
牛キモシンをスタンダードとして使用した。
細胞内のキモシンの濃度を決定するために、50mlの培
養物から採取し、水で完全に洗浄し、凍結乾燥して、モ
ルタル及び乳棒で砂を加えて粉砕した。50mlの抽出用緩
衝液（50mMリン酸ソーダpH5.5、0.5M NaCl、1mMのフッ
化フェニルメチルスルホニル、0.1mMペプスタチン）を
加え、完全に混合した。抽出物のサンプルに1M NaOHを
加えて50mM NaOHに調整し、37℃で30分間インキュベー
トし、最後に遠心分離して（13,000×ｇ）、細胞の破壊
屑を除去した。上澄み液中のキモシン濃度は、EIA法に
より測定した。
養物から採取し、水で完全に洗浄し、凍結乾燥して、モ
ルタル及び乳棒で砂を加えて粉砕した。50mlの抽出用緩
衝液（50mMリン酸ソーダpH5.5、0.5M NaCl、1mMのフッ
化フェニルメチルスルホニル、0.1mMペプスタチン）を
加え、完全に混合した。抽出物のサンプルに1M NaOHを
加えて50mM NaOHに調整し、37℃で30分間インキュベー
トし、最後に遠心分離して（13,000×ｇ）、細胞の破壊
屑を除去した。上澄み液中のキモシン濃度は、EIA法に
より測定した。
ウェスタン分析を行なうために、SDS−ポリアクリル
アミドゲルでサンプルを電気泳動に付し、標準法（トウ
ビン（Towbin）らによるProc.Natl.Accad.Sci.USA 76,4
350−4354（1979））によりメンブランフィルターに吸
取った。吸取ったものは、次いで、ウサギ抗−キモシン
及び、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）抱
合ヤギ抗−ウサギIgGで処理された。そして、H2O2及び
４−クロロ−１−ナフトールでインキュベートすること
により、HRP発色を行なった。
アミドゲルでサンプルを電気泳動に付し、標準法（トウ
ビン（Towbin）らによるProc.Natl.Accad.Sci.USA 76,4
350−4354（1979））によりメンブランフィルターに吸
取った。吸取ったものは、次いで、ウサギ抗−キモシン
及び、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）抱
合ヤギ抗−ウサギIgGで処理された。そして、H2O2及び
４−クロロ−１−ナフトールでインキュベートすること
により、HRP発色を行なった。
実施例 １ アスペルギルス・アワモリからの増幅したキモシン分泌 pGAMpRの構築 キモシン発現ベクターpGRG1及びpGRG3の構築は、かつ
て、カレンらによるBio/Technology ５,369−376（198
7）及びEPO公報0215594号で開示されている。それら
は、アスペルギルス・ニガーglaAプロモーター及びター
ミネーター、グルコアミラーゼまたはキモシン分泌シグ
ナルのいずれか、及びプロキモシンB cDNAコード配列を
含む発現カセットからなる。このカセットは、pBR325、
ノウロスポラ・クラッサpyr4遺伝子及びアスペルギルス
・ニドゥランスから単離したans1配列からなるpDJB3
（バランスらによるGene36,321−331（1985））中に存
在しており、アスペルギルス・ニドゥランス中に高い形
質転換頻度を与えている（第３図）。pGRG1からpGRG4を
それぞれ生産するのに使用されているカセット挿入物を
描いている第4A図から第4D図を参照のこと。
て、カレンらによるBio/Technology ５,369−376（198
7）及びEPO公報0215594号で開示されている。それら
は、アスペルギルス・ニガーglaAプロモーター及びター
ミネーター、グルコアミラーゼまたはキモシン分泌シグ
ナルのいずれか、及びプロキモシンB cDNAコード配列を
含む発現カセットからなる。このカセットは、pBR325、
ノウロスポラ・クラッサpyr4遺伝子及びアスペルギルス
・ニドゥランスから単離したans1配列からなるpDJB3
（バランスらによるGene36,321−331（1985））中に存
在しており、アスペルギルス・ニドゥランス中に高い形
質転換頻度を与えている（第３図）。pGRG1からpGRG4を
それぞれ生産するのに使用されているカセット挿入物を
描いている第4A図から第4D図を参照のこと。
ベクターpGAMpRは、アスペルギルス・アワモリglaA遺
伝子の最後のコドンとその骨格内で融合したプロキモシ
ンBcDNA配列を含有した。このベクターの構造は、第5A
図及び第5B図に略図で示されている。簡単に言えば、合
成オリゴヌクレオチド（最後の10コドンがグルコアミラ
ーゼをコードしており、最初の６コドンがプロキモシン
をコードしている54bp Sal I−BamH Iフラグメント）
は、M13ベクター中でクローン化され、そのヌクレオチ
ド配列が確認されたのである。我々は、同じM13ベクタ
ー内に、第７番目のコドンで開始する配列をコードする
プロキモシンの５′部分を含むpR1（カレンのスプラ及
びEPO公報第0215594号）由来の235bp BamH I−Asp718フ
ラグメントを挿入した。得られたベクター（M13mp19GAM
3′−５′PRと称する）から、28bp Sal I−Asp718フラ
グメントが単離され、５′側防DNAの領域プラス0.5kb及
びpBR322レプリコンを含むMlu I−Asp718ベクターフラ
グメントをコードするアスペルギルス・アワモリのグル
コアミラーゼの大半；プロキモシンの３′部分；及びア
スペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼプロモータ
ー領域の1.4kbセグメント（Xho I−Mlu I）、を含む2.3
kb Sal I−Mlu Iフラグメントとの３部分ライゲーショ
ンに使用した。このライゲーションで得られたプラスミ
ド（pBR−GAMpR）をCla Iで消化して、ニューラスパラ
・クラッサ（ブクストン（Buxton）らによるMol.Gen.Ge
net.190,403−405（1983））由来のpry4遺伝子をコード
する2.1kb Cal Iフラグメントでライゲーションし、最
終のベクターpGAMpR（第5A図及び第5B図）を誘導した。
伝子の最後のコドンとその骨格内で融合したプロキモシ
ンBcDNA配列を含有した。このベクターの構造は、第5A
図及び第5B図に略図で示されている。簡単に言えば、合
成オリゴヌクレオチド（最後の10コドンがグルコアミラ
ーゼをコードしており、最初の６コドンがプロキモシン
をコードしている54bp Sal I−BamH Iフラグメント）
は、M13ベクター中でクローン化され、そのヌクレオチ
ド配列が確認されたのである。我々は、同じM13ベクタ
ー内に、第７番目のコドンで開始する配列をコードする
プロキモシンの５′部分を含むpR1（カレンのスプラ及
びEPO公報第0215594号）由来の235bp BamH I−Asp718フ
ラグメントを挿入した。得られたベクター（M13mp19GAM
3′−５′PRと称する）から、28bp Sal I−Asp718フラ
グメントが単離され、５′側防DNAの領域プラス0.5kb及
びpBR322レプリコンを含むMlu I−Asp718ベクターフラ
グメントをコードするアスペルギルス・アワモリのグル
コアミラーゼの大半；プロキモシンの３′部分；及びア
スペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼプロモータ
ー領域の1.4kbセグメント（Xho I−Mlu I）、を含む2.3
kb Sal I−Mlu Iフラグメントとの３部分ライゲーショ
ンに使用した。このライゲーションで得られたプラスミ
ド（pBR−GAMpR）をCla Iで消化して、ニューラスパラ
・クラッサ（ブクストン（Buxton）らによるMol.Gen.Ge
net.190,403−405（1983））由来のpry4遺伝子をコード
する2.1kb Cal Iフラグメントでライゲーションし、最
終のベクターpGAMpR（第5A図及び第5B図）を誘導した。
キモシン生産レベル PEGまたはエレクトロポレーションを使用して、菌株G
C12及びGCΔGAM23のプロトプラストをプラスミドpGRG1,
pGRG3及びpGAMpR（第3,4A,4C,5A及び5B図）で形質転換
した。これらプラスミドは、全て、アスペルギルス・ア
ワモリのpyrG変異体を相補することのできるニューラス
パラ・クラッサpyr4遺伝子を包含するので、形質転換体
の選別が可能である。ナンバー12で始まる称呼を有する
形質転換体は、菌株GC12に含まれ、23で始まるものは、
GCΔGAM23に含まれる。形質転換に使用されたプラスミ
ドの名称は、該呼称の中に含まれている。続いて、形質
転換体からの精製細胞を50mlのSCM中に接種し、４日間
培養した。個々の形質転換体について複数の培養を行な
わなかったので、異なる成長速度を修正するための試み
もしなかった。培養上澄み液及び菌糸体の細胞内抽出物
について免疫学的分析を行なった（表１）。不溶性の細
胞屑からキモシンを放出させるため、細胞内抽出物のNa
OHでの処理が必要であった。しかしながら、この処理
は、同時に、EIAで使用する標準サンプル中の検出可能
なキモシンの量を約25％だけ減少させることがわかっ
た。従って、表１中に記載した細胞内キモシンの値は、
見積り値である。
C12及びGCΔGAM23のプロトプラストをプラスミドpGRG1,
pGRG3及びpGAMpR（第3,4A,4C,5A及び5B図）で形質転換
した。これらプラスミドは、全て、アスペルギルス・ア
ワモリのpyrG変異体を相補することのできるニューラス
パラ・クラッサpyr4遺伝子を包含するので、形質転換体
の選別が可能である。ナンバー12で始まる称呼を有する
形質転換体は、菌株GC12に含まれ、23で始まるものは、
GCΔGAM23に含まれる。形質転換に使用されたプラスミ
ドの名称は、該呼称の中に含まれている。続いて、形質
転換体からの精製細胞を50mlのSCM中に接種し、４日間
培養した。個々の形質転換体について複数の培養を行な
わなかったので、異なる成長速度を修正するための試み
もしなかった。培養上澄み液及び菌糸体の細胞内抽出物
について免疫学的分析を行なった（表１）。不溶性の細
胞屑からキモシンを放出させるため、細胞内抽出物のNa
OHでの処理が必要であった。しかしながら、この処理
は、同時に、EIAで使用する標準サンプル中の検出可能
なキモシンの量を約25％だけ減少させることがわかっ
た。従って、表１中に記載した細胞内キモシンの値は、
見積り値である。
グルコアミラーゼへの融合なしにプレプロキモシンを
合成することを期待したが、pGRG1またはpGRG3形質転換
体のいずれも3.7μg/mlより高い分泌キモシンのレベル
を与えなかった。かつて、特に言及されたように、GC5
を使用すると（米国特許出願第214,237号参照）、pGRG1
及びpGRG3形質転換体の多くは、生成したキモシン総量
の75％より多い量をその細胞内に保持して、キモシンを
高レベルで有した。これに対し、いくつかのpGAMpR形質
転換体は、比較的高レベルのキモシンを分泌し、大多数
の場合、キモシンの細胞内レベルは、分泌キモシン総量
よりはるかに低かった。今日では、大豆培地中で、より
高い発現レベルを得ることができ、これは、多分、天然
の分泌アスパルチルプロテアーゼの活性を抑制すること
ができるこの培地の高pHに関連しているということが特
に言及された。更なる研究のため、最も高効率な生産菌
株として、菌株12grg1−1a,12gampr4及び23gampr46（表
１には示していない）を選択した。これら菌株を６日
間、50ml大豆粉培地で培養した３つの培養物により生産
された細胞内及び細胞外キモシンのレベルをEIA及び活
性測定法により測定した。更に、培養液の上澄み液グル
コアミラーゼ濃度をEIAにより測定した（表II）。
合成することを期待したが、pGRG1またはpGRG3形質転換
体のいずれも3.7μg/mlより高い分泌キモシンのレベル
を与えなかった。かつて、特に言及されたように、GC5
を使用すると（米国特許出願第214,237号参照）、pGRG1
及びpGRG3形質転換体の多くは、生成したキモシン総量
の75％より多い量をその細胞内に保持して、キモシンを
高レベルで有した。これに対し、いくつかのpGAMpR形質
転換体は、比較的高レベルのキモシンを分泌し、大多数
の場合、キモシンの細胞内レベルは、分泌キモシン総量
よりはるかに低かった。今日では、大豆培地中で、より
高い発現レベルを得ることができ、これは、多分、天然
の分泌アスパルチルプロテアーゼの活性を抑制すること
ができるこの培地の高pHに関連しているということが特
に言及された。更なる研究のため、最も高効率な生産菌
株として、菌株12grg1−1a,12gampr4及び23gampr46（表
１には示していない）を選択した。これら菌株を６日
間、50ml大豆粉培地で培養した３つの培養物により生産
された細胞内及び細胞外キモシンのレベルをEIA及び活
性測定法により測定した。更に、培養液の上澄み液グル
コアミラーゼ濃度をEIAにより測定した（表II）。
全ての場合において、EIAによって検出された分泌キ
モシンの量は、活性測定法により検出された量よりも大
きかった。このことは、不活性なまたは分解したキモシ
ン分子の存在を反映しているかも知れない。この結果
は、融タンパクとしてキモシンを発現する形質転換体に
よって生産された分泌キモシンの高いレベルを明確とし
た。12grg1−1aでは約８μg/mlであるのに対して、形質
転換体12gampr4では、約140μg/mlの活性キモシンが培
養菌1mlにつき分泌した。
モシンの量は、活性測定法により検出された量よりも大
きかった。このことは、不活性なまたは分解したキモシ
ン分子の存在を反映しているかも知れない。この結果
は、融タンパクとしてキモシンを発現する形質転換体に
よって生産された分泌キモシンの高いレベルを明確とし
た。12grg1−1aでは約８μg/mlであるのに対して、形質
転換体12gampr4では、約140μg/mlの活性キモシンが培
養菌1mlにつき分泌した。
形質転換体23gampr46（天然glaA遺伝子が除かれてい
る）によって生産されたグルコアミラーゼだけが、グル
コアミラーゼ−キモシン融合タンパクの一部としてのも
のであろう。グルコアミラーゼの２つの型の大きさ（MW
61,000とMW71,000）は、キモシン（MW37,000）の大きさ
の約２倍であるから、分泌されるグルコアミラーゼの重
量をキモシンの２倍と考えるであろう。実際は、培養培
地中のキモシンに対するグルコアミラーゼの測定比は、
3:1にかなり近かった。この食い違いは、分析法の不正
確さによるのか、または、キモシンの分解が起こってい
ることを示すものなのかも知れない。形質転換体12grg1
−1aでは、天然のグルコアミラーゼだけが生成するのに
対し、12grmpr4では、天然のグルコアミラーゼとキモシ
ンと組み合わさったグルコアミラーゼの両方が分泌され
るであろう。おもしろいことに、23gampr46では、12grg
1−1aで生成する天然のグルコアミラーゼと殆ど同量の
再結合体グルコアミラーゼが生成した。12grg1−1aによ
って生成したキモシンの総量の高パーセント（32％）の
キモシンが細胞内に保持されたが、このことは、SCM培
地でみられた細胞内蓄積のめざましさには到底及ばな
い。
る）によって生産されたグルコアミラーゼだけが、グル
コアミラーゼ−キモシン融合タンパクの一部としてのも
のであろう。グルコアミラーゼの２つの型の大きさ（MW
61,000とMW71,000）は、キモシン（MW37,000）の大きさ
の約２倍であるから、分泌されるグルコアミラーゼの重
量をキモシンの２倍と考えるであろう。実際は、培養培
地中のキモシンに対するグルコアミラーゼの測定比は、
3:1にかなり近かった。この食い違いは、分析法の不正
確さによるのか、または、キモシンの分解が起こってい
ることを示すものなのかも知れない。形質転換体12grg1
−1aでは、天然のグルコアミラーゼだけが生成するのに
対し、12grmpr4では、天然のグルコアミラーゼとキモシ
ンと組み合わさったグルコアミラーゼの両方が分泌され
るであろう。おもしろいことに、23gampr46では、12grg
1−1aで生成する天然のグルコアミラーゼと殆ど同量の
再結合体グルコアミラーゼが生成した。12grg1−1aによ
って生成したキモシンの総量の高パーセント（32％）の
キモシンが細胞内に保持されたが、このことは、SCM培
地でみられた細胞内蓄積のめざましさには到底及ばな
い。
サザンブロット分析 菌株GC12及びGCΔGAM23から、及び形質転換体12gampr
2、12gampr3、12gampr4、23gampr1及び23gampr46からDN
Aを抽出し、Xho I及びHind IIIで消化し、電気泳動に付
した。メンブランフィルター上に吸取ったあと、ラジオ
ラベル化されたpGAMpR（第８図）でDNAをバイブリダイ
ズした。菌株GC12で、天然glaA遺伝子を示す１本のバン
ドが認められた（第８図、レーンａ）。菌株GCΔGAM23
においては、遺伝子組み換えを原因として、この位置に
より小さな大きさのglaAフラグメントがみられた（第８
図、レーンｅ）。プラスミドpGAMpRも、また、該ゲル上
に泳動され、Xho I及びHind IIIで消化して得られたフ
ラグメントの大きさを示した（第８図、レーンｈ）。pG
AMpRから由来した追加のバンドが、形質転換体中に見ら
れた。12gampr4及び23gampr1のパターンは、glaA遺伝子
座位からはなれた単一サイトにおけるpGAMpRの2,3のタ
ンデムコピーを統合したものと一致していた（第８図、
レーンｄ及びｆ）。これら形質転換体でのプラスミド複
写の数は、キモシン生産力において大きな差があるにも
かかわらず、類似しているように思われる。タンダムプ
ラスミド統合は、おそらく、より大量のプラスミドを発
生してきたとはいえ、再配列体も、また、形質転換体12
gampr2,12gampr3及び23gampr46に含まれていた（第８
図、レーンｂ、ｃ及びｇ）。
2、12gampr3、12gampr4、23gampr1及び23gampr46からDN
Aを抽出し、Xho I及びHind IIIで消化し、電気泳動に付
した。メンブランフィルター上に吸取ったあと、ラジオ
ラベル化されたpGAMpR（第８図）でDNAをバイブリダイ
ズした。菌株GC12で、天然glaA遺伝子を示す１本のバン
ドが認められた（第８図、レーンａ）。菌株GCΔGAM23
においては、遺伝子組み換えを原因として、この位置に
より小さな大きさのglaAフラグメントがみられた（第８
図、レーンｅ）。プラスミドpGAMpRも、また、該ゲル上
に泳動され、Xho I及びHind IIIで消化して得られたフ
ラグメントの大きさを示した（第８図、レーンｈ）。pG
AMpRから由来した追加のバンドが、形質転換体中に見ら
れた。12gampr4及び23gampr1のパターンは、glaA遺伝子
座位からはなれた単一サイトにおけるpGAMpRの2,3のタ
ンデムコピーを統合したものと一致していた（第８図、
レーンｄ及びｆ）。これら形質転換体でのプラスミド複
写の数は、キモシン生産力において大きな差があるにも
かかわらず、類似しているように思われる。タンダムプ
ラスミド統合は、おそらく、より大量のプラスミドを発
生してきたとはいえ、再配列体も、また、形質転換体12
gampr2,12gampr3及び23gampr46に含まれていた（第８
図、レーンｂ、ｃ及びｇ）。
ノーザン分析 菌株GC12、12grg1−1a及び12gampr4から総RNAを抽出
し、電気泳動に付し、メンブメンフィルターに吸取っ
た。次いで、そのRNAを２つのラジオラベル化されたDNA
プローブで同時にハイブリダイズした。これらのプロー
ブのうちの１つは、相違するRNAサンプルの等量がゲル
に負荷されたこと、及びいずれのサンプルも過剰に劣化
していないことを立証する内部コントロールとして作用
するように、アスペルギルス・ニガー・オリック（oli
c）遺伝子（ワード（Ward）らによるCurr.Genet.14,37
−42（1988））を含む5kb EcoR Iフラグメントであっ
た。第２のプローブは、キモシンをコードする配列の約
850bpのKpn I−Bcl Iフラグメントであった。約1kbの該
オリックmRNAバンドに加えて、キモシンmRNAを示す1.4k
bのバンドが形質転換体12grg1−1aに認められた（第９
図、レーｂ）。キモシン生産レベルがグルコアミラーゼ
生産よりも極めて低いが、この形質転換体中には、豊富
なキモシン−特定メーセージー（chymosin−specific m
essage）が存在していることは、明らかであった（この
菌株は、約0.8gm/のグルコアミラーゼを分泌すること
ができる）。融合グルコアミラーゼ−キモシンメッセー
ジ（3.4kb）を予期する大きさのmRNA種が、菌株12gampr
4にみられた（第９図、レーンｃ）。たとえ、形質転換
体12gampr4のキモシン生産が非常に多いとはいえ、この
融合mRNA種は、形質転換体12grg1−1aに存在するキモシ
ン−特定mRNAより豊富ではないと思われる。菌株GC12に
は、該オリックmRNAだけが観察された（第９図、レーン
ａ）。
し、電気泳動に付し、メンブメンフィルターに吸取っ
た。次いで、そのRNAを２つのラジオラベル化されたDNA
プローブで同時にハイブリダイズした。これらのプロー
ブのうちの１つは、相違するRNAサンプルの等量がゲル
に負荷されたこと、及びいずれのサンプルも過剰に劣化
していないことを立証する内部コントロールとして作用
するように、アスペルギルス・ニガー・オリック（oli
c）遺伝子（ワード（Ward）らによるCurr.Genet.14,37
−42（1988））を含む5kb EcoR Iフラグメントであっ
た。第２のプローブは、キモシンをコードする配列の約
850bpのKpn I−Bcl Iフラグメントであった。約1kbの該
オリックmRNAバンドに加えて、キモシンmRNAを示す1.4k
bのバンドが形質転換体12grg1−1aに認められた（第９
図、レーｂ）。キモシン生産レベルがグルコアミラーゼ
生産よりも極めて低いが、この形質転換体中には、豊富
なキモシン−特定メーセージー（chymosin−specific m
essage）が存在していることは、明らかであった（この
菌株は、約0.8gm/のグルコアミラーゼを分泌すること
ができる）。融合グルコアミラーゼ−キモシンメッセー
ジ（3.4kb）を予期する大きさのmRNA種が、菌株12gampr
4にみられた（第９図、レーンｃ）。たとえ、形質転換
体12gampr4のキモシン生産が非常に多いとはいえ、この
融合mRNA種は、形質転換体12grg1−1aに存在するキモシ
ン−特定mRNAより豊富ではないと思われる。菌株GC12に
は、該オリックmRNAだけが観察された（第９図、レーン
ａ）。
生体外翻訳 形質転換体12gampr4、23gampr46及び12grg1−1aの培
養菌から単離したポリアデニレート化RNAサンプルを市
販のウサギ−網赤血球中で、イン・ビトロ翻訳系を用い
て翻訳した。キモシンを翻訳生産物から免疫学的に沈澱
させ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、
そして、オートラジオグラフ法によって視覚で確認でき
るようにした（第10図）。MW37,000とMW42,000のタンパ
クを示す２つの別個のバンドが、プレプロキモシン（MW
42,000）のみを生産することが期待される12grg1−1a
（第10図、レーンｂ）由来のmRNAについて観察された。
該翻訳反応が行なわれるpHでは、自動触媒プロセシング
が開始されることは期待できないが、この低い分子量の
方は、成熟キモシンであるかも知れない。12gampr4（第
10図、レーンａ）及び23gampr46のmRNAサンプルで、２
つの高分子量種が、抗−キモシン抗体で析出した。これ
らは、プロキモシンと、２つの型のグルコアミラーゼの
うちのいずれかを含量する完全長融合タンパク（100,00
0及び110,000MW）と期待される程度の大きさであった。
生体外翻訳システムに、GC12RNA（第10図、レーンｃ）
が添加されるか、または、RNA（第10図、レーンｄ）が
添加されないなら、キモシンは免疫学的方法で沈殿でき
なかった。
養菌から単離したポリアデニレート化RNAサンプルを市
販のウサギ−網赤血球中で、イン・ビトロ翻訳系を用い
て翻訳した。キモシンを翻訳生産物から免疫学的に沈澱
させ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、
そして、オートラジオグラフ法によって視覚で確認でき
るようにした（第10図）。MW37,000とMW42,000のタンパ
クを示す２つの別個のバンドが、プレプロキモシン（MW
42,000）のみを生産することが期待される12grg1−1a
（第10図、レーンｂ）由来のmRNAについて観察された。
該翻訳反応が行なわれるpHでは、自動触媒プロセシング
が開始されることは期待できないが、この低い分子量の
方は、成熟キモシンであるかも知れない。12gampr4（第
10図、レーンａ）及び23gampr46のmRNAサンプルで、２
つの高分子量種が、抗−キモシン抗体で析出した。これ
らは、プロキモシンと、２つの型のグルコアミラーゼの
うちのいずれかを含量する完全長融合タンパク（100,00
0及び110,000MW）と期待される程度の大きさであった。
生体外翻訳システムに、GC12RNA（第10図、レーンｃ）
が添加されるか、または、RNA（第10図、レーンｄ）が
添加されないなら、キモシンは免疫学的方法で沈殿でき
なかった。
ウェスタン分析 菌接種後の種々の時点で、形質転換体12gampr4、23ga
mpr46及び12grg1−1aの50ml SCMまたは大豆培地の培養
物から、上澄み液を採取した。サンプルをSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分別し、メンブラン
フィルターに吸取り、そしてキモシン特定抗体で検査し
た（第11図）。菌株GC12からの培養上澄み液には、キモ
シンが認められなかった（第11図、レーンｂ）。真正な
ウシキモシンについてもゲルに泳動した（第11図、レー
ンａとｉ）。２日間及びそれ以上培養したSCM培養物か
らのサンプルの全てに、真正ウシキモシン（37,000MW）
と同じ大きさのバンドが認められた。12gampr4（第11
図、レーンｇ）及び23gampr46の大豆培地培養菌におい
て、２日間及び３日間の時点で、完全長グルコアミラー
ゼ−キモシン融合タンパクと期待される程度の大きさ
（100,000MW）の追加のハンドがはっきりと現れた。も
っとも、これは、よりあとの時点で縮小した。大豆培地
での２日間の時点における12grg1−1a培養物からのサン
プルに存在する主要なキモシン−特定バンドは、プロキ
モシンについて予測された大きさであった（第11図、レ
ーンｄ）。大豆培地は、pH6.2に緩衝されたのに対し、S
CM培地は、pH5に緩衝された。より高いpHでは、プロキ
モシンの活性化は、遅くなると予期される。
mpr46及び12grg1−1aの50ml SCMまたは大豆培地の培養
物から、上澄み液を採取した。サンプルをSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分別し、メンブラン
フィルターに吸取り、そしてキモシン特定抗体で検査し
た（第11図）。菌株GC12からの培養上澄み液には、キモ
シンが認められなかった（第11図、レーンｂ）。真正な
ウシキモシンについてもゲルに泳動した（第11図、レー
ンａとｉ）。２日間及びそれ以上培養したSCM培養物か
らのサンプルの全てに、真正ウシキモシン（37,000MW）
と同じ大きさのバンドが認められた。12gampr4（第11
図、レーンｇ）及び23gampr46の大豆培地培養菌におい
て、２日間及び３日間の時点で、完全長グルコアミラー
ゼ−キモシン融合タンパクと期待される程度の大きさ
（100,000MW）の追加のハンドがはっきりと現れた。も
っとも、これは、よりあとの時点で縮小した。大豆培地
での２日間の時点における12grg1−1a培養物からのサン
プルに存在する主要なキモシン−特定バンドは、プロキ
モシンについて予測された大きさであった（第11図、レ
ーンｄ）。大豆培地は、pH6.2に緩衝されたのに対し、S
CM培地は、pH5に緩衝された。より高いpHでは、プロキ
モシンの活性化は、遅くなると予期される。
２日間または３日間の時点での大豆培地培養物からの
サンプルのpHは、室温で30分間、pH2と低くなった。そ
の後、ウェスタン分析のためにSDSポリアクリルアミド
ゲル上にサンプルを負荷する前に、pHは急速にpH6以上
に上昇した。この処理は、12gampr4（第11図、レーン
ｈ）または23gampr46からの高分子量バンドの損失、ま
たは12grg1−1a（第11図、レーンｅ）からのプロキモシ
ンの損失を導き、おそらく全形質転換体におけるプソイ
ドキモシンであろうが、成熟キモシンよりわずかに大き
いタンパク種の蓄積を導いた。キモシン−特定バンドの
大きさにおけるこれらの変化は、もし、アスパルチルプ
ロテアーゼ禁止剤ヘプスタチン（マルシニスツイン（Ma
rciniszyn）らによるJ.Biol.Chem.251,7095−7102（197
6））は、低pH処理の間、0.1mMの濃度で含まれていたな
ら、禁止できた。12grg1−1a及び23gampr46を２日間大
豆培地で培養した培養物からのサンプルについて、活性
分析法により測定されたキモシンの濃度は、pH2で処理
する前で、それぞれ、0.7及び3.2μg/mlであった。続く
処理で、これらの値は、それぞれ3.6及び17.5μg/mlに
上昇し、いずれも約５倍の増加があった。
サンプルのpHは、室温で30分間、pH2と低くなった。そ
の後、ウェスタン分析のためにSDSポリアクリルアミド
ゲル上にサンプルを負荷する前に、pHは急速にpH6以上
に上昇した。この処理は、12gampr4（第11図、レーン
ｈ）または23gampr46からの高分子量バンドの損失、ま
たは12grg1−1a（第11図、レーンｅ）からのプロキモシ
ンの損失を導き、おそらく全形質転換体におけるプソイ
ドキモシンであろうが、成熟キモシンよりわずかに大き
いタンパク種の蓄積を導いた。キモシン−特定バンドの
大きさにおけるこれらの変化は、もし、アスパルチルプ
ロテアーゼ禁止剤ヘプスタチン（マルシニスツイン（Ma
rciniszyn）らによるJ.Biol.Chem.251,7095−7102（197
6））は、低pH処理の間、0.1mMの濃度で含まれていたな
ら、禁止できた。12grg1−1a及び23gampr46を２日間大
豆培地で培養した培養物からのサンプルについて、活性
分析法により測定されたキモシンの濃度は、pH2で処理
する前で、それぞれ、0.7及び3.2μg/mlであった。続く
処理で、これらの値は、それぞれ3.6及び17.5μg/mlに
上昇し、いずれも約５倍の増加があった。
表Ｉ及びIIから分かるように、アスペルギルス・アワ
モリにおける分泌キモシンの生成量は、プロキモシンが
グルコアミラーゼのカルボキシル末端との融合体として
合成されているなら、グルコアミラーゼシグナルペプチ
ドを利用したglaAプロモーターからの直接の発現と比較
して大きく増加している。プロキモシンと比較して増加
した融合タンパクの分泌効率は、より高い発現レベルの
少なくとも一部の説明になると思われる。このことは、
pGAMpR形質転換体と比較して、pGRG1及びpGRG3形質転換
体いおいてその細胞内にみられるキモシンの割合の高さ
から明らかである。標品ウシキモシンもアスペルギルス
・アワモリの中で生産されたキモシンの大多数もグルコ
キシレート化されていない。アスペルギルス・ニガー中
でＯ−連結炭化水素により幅広く修飾されたグルコアミ
ラーゼへのプロキモシンの接合（パザー（Pazur）らに
よるJ.Protein Chem.６,517−527（1987））は、アスペ
ルギルス分泌通路を通るより効率的な経路で可能であろ
う。
モリにおける分泌キモシンの生成量は、プロキモシンが
グルコアミラーゼのカルボキシル末端との融合体として
合成されているなら、グルコアミラーゼシグナルペプチ
ドを利用したglaAプロモーターからの直接の発現と比較
して大きく増加している。プロキモシンと比較して増加
した融合タンパクの分泌効率は、より高い発現レベルの
少なくとも一部の説明になると思われる。このことは、
pGAMpR形質転換体と比較して、pGRG1及びpGRG3形質転換
体いおいてその細胞内にみられるキモシンの割合の高さ
から明らかである。標品ウシキモシンもアスペルギルス
・アワモリの中で生産されたキモシンの大多数もグルコ
キシレート化されていない。アスペルギルス・ニガー中
でＯ−連結炭化水素により幅広く修飾されたグルコアミ
ラーゼへのプロキモシンの接合（パザー（Pazur）らに
よるJ.Protein Chem.６,517−527（1987））は、アスペ
ルギルス分泌通路を通るより効率的な経路で可能であろ
う。
プラスミドpGRG1及びpGRG3の両者は、直接のキモシン
発現に、アスペルギルス・ニガーglaAプロモーターを用
いるのに対し、アスペルギルス・アワモリglaAプロモー
ターは、pGAMpR中に存在している。これらプラスミドの
間には、pGRG1及びpGRG3上のans1配列の包含の如き、更
なる差異がある。種々のプラスミドの統合は、おそらく
天然のglaA位置と相同関係になかった。結果として、統
合されたプラスミドのクロモソマール位置は、各々の形
質転換体において多分相異していたであろう。これら全
ての相違は、生成したキモシンの総量（細胞内＋細胞
外）を比較すること、及び融合タンパクとしての直接の
発現か生産かの区別だけがある細胞の内側と外側の分布
について、これが各形質転換体間で同様であるのかどう
かを決定することを困難にしている。ノーザン分析は、
キモシン生成量の比較を確かなものにしており、キモシ
ン−特定mRNAの定常状態レベルが、形質転換体12grg1−
1aにおいては、12gampr4ににおけるよりも高いことを示
唆した。
発現に、アスペルギルス・ニガーglaAプロモーターを用
いるのに対し、アスペルギルス・アワモリglaAプロモー
ターは、pGAMpR中に存在している。これらプラスミドの
間には、pGRG1及びpGRG3上のans1配列の包含の如き、更
なる差異がある。種々のプラスミドの統合は、おそらく
天然のglaA位置と相同関係になかった。結果として、統
合されたプラスミドのクロモソマール位置は、各々の形
質転換体において多分相異していたであろう。これら全
ての相違は、生成したキモシンの総量（細胞内＋細胞
外）を比較すること、及び融合タンパクとしての直接の
発現か生産かの区別だけがある細胞の内側と外側の分布
について、これが各形質転換体間で同様であるのかどう
かを決定することを困難にしている。ノーザン分析は、
キモシン生成量の比較を確かなものにしており、キモシ
ン−特定mRNAの定常状態レベルが、形質転換体12grg1−
1aにおいては、12gampr4ににおけるよりも高いことを示
唆した。
大豆培地において形質転換体12grg1−1a、12gampr4及
び23gampr46が産生したキモシンの総量の分析から、直
接発現形質転換体中で産生されるキモシンの総量は融合
蛋白質としてキモシン発現形質転換体中で産生されるキ
モシンの総量よりもはるかに少ないことがわかった。こ
のことは、分泌効率の向上が、グルコアミラーゼに融合
したキモシンの発現の唯一の利点ではないかも知れない
ことを示唆するものであろう。グリコアミラーゼ−キモ
シン融合mRNAの翻訳が、非翻訳リーダー配列及び分泌シ
グナル配列のみがglaA遺伝子から誘導されたプロキモシ
ンmRNAの翻訳よりも、より効率的であった可能性があ
る。しかしながら、抽出が完全ではないかも知れず、か
つキモシンを遊離するのに必要とされるNaOH処理がEIA
による検出を低下させるかも知れないので、細胞間のキ
モシンのレベルについての正確な値を得ることが困難で
あろう。又、細胞間に蓄積されるキモシンは、抽出前に
本来的に存在するプロテアーゼにより分解されるかも知
れない。従って、細胞間キモシン濃度について得られた
値は、いつでも実際よりは少い値となっているであろ
う。
び23gampr46が産生したキモシンの総量の分析から、直
接発現形質転換体中で産生されるキモシンの総量は融合
蛋白質としてキモシン発現形質転換体中で産生されるキ
モシンの総量よりもはるかに少ないことがわかった。こ
のことは、分泌効率の向上が、グルコアミラーゼに融合
したキモシンの発現の唯一の利点ではないかも知れない
ことを示唆するものであろう。グリコアミラーゼ−キモ
シン融合mRNAの翻訳が、非翻訳リーダー配列及び分泌シ
グナル配列のみがglaA遺伝子から誘導されたプロキモシ
ンmRNAの翻訳よりも、より効率的であった可能性があ
る。しかしながら、抽出が完全ではないかも知れず、か
つキモシンを遊離するのに必要とされるNaOH処理がEIA
による検出を低下させるかも知れないので、細胞間のキ
モシンのレベルについての正確な値を得ることが困難で
あろう。又、細胞間に蓄積されるキモシンは、抽出前に
本来的に存在するプロテアーゼにより分解されるかも知
れない。従って、細胞間キモシン濃度について得られた
値は、いつでも実際よりは少い値となっているであろ
う。
pH6の大豆粉培地において、若い培養物からのサンプ
ルを用いる場合には、いくつかの成熟キモシンが観察さ
れたが、グルコアミラーゼ−プロキモシン融合蛋白質の
大部分が、そのまま培地に分泌されたことが明白であっ
た。このような条件下では、直接発現形質転換体12grg1
−1aからのサンプルのウエスタン分析により検出された
唯一の形がプロキモシンであった。これに反し、成熟キ
モシンのみが、pH5のSCMにおいて形質転換体の培養物中
に検出された。これらの結果から、グルコアミラーゼ−
キモシン融合蛋白質からのキモシンの遊離は低いpHで起
りやすく、プロキモシンの天然自動触媒活性化機構を伴
うかも知れないことが示唆された。融合蛋白質の損失及
び活性キモシン濃度の増加は、サンプルのpHを２に低下
させることにより簡単に誘発させることができた。仮り
にプロセッシングがキモシンの活性に依存するならば、
予想されるように、これらの条件下で融合蛋白質から遊
離したキモシンの少くともいくらかは、シュードキモシ
ン（pseudochymosin）の形であろう。多分、適当な条件
下では、これは、結局、さらにプロセッシングされて成
熟キモシンになるであろう。pH2で融合蛋白質をプロセ
ッシングすることは、ペプスタチンにより抑制された
が、このことはアスパルチル（aspartyl）プロテアーゼ
活性を必要とすることを示唆するものである。この活性
は、キモシン自体又は天然アスペルギルス・アワモリ
（A.awamori）プロテアーゼによって供給できた。主要
な分泌アスパルチルプロテアーゼ、アスペルギロペプシ
ン−Ａをコードする遺伝子を除いた（米国特許出願No.2
14,237参照）アワモリ（A.awamori）株を構築した。こ
の株中に残存する細胞外の蛋白質加水分解活性は低いレ
ベルであるが、この活性は、ペプスタチンによって影響
されない。このアスペルギロペプシン除去株におけるグ
ルコアミラーゼ−キモシン融合体のプロセッシングは、
形質転換体12gampr4及び23gampr46について上述したプ
ロセッシングとは区別し得ない（データ示さず）。この
ことは、さらに、融合蛋白質のプロセッシングを引き起
すペプスタチン抑制活性が実際にはキモシン自体の活性
であることを示している。
ルを用いる場合には、いくつかの成熟キモシンが観察さ
れたが、グルコアミラーゼ−プロキモシン融合蛋白質の
大部分が、そのまま培地に分泌されたことが明白であっ
た。このような条件下では、直接発現形質転換体12grg1
−1aからのサンプルのウエスタン分析により検出された
唯一の形がプロキモシンであった。これに反し、成熟キ
モシンのみが、pH5のSCMにおいて形質転換体の培養物中
に検出された。これらの結果から、グルコアミラーゼ−
キモシン融合蛋白質からのキモシンの遊離は低いpHで起
りやすく、プロキモシンの天然自動触媒活性化機構を伴
うかも知れないことが示唆された。融合蛋白質の損失及
び活性キモシン濃度の増加は、サンプルのpHを２に低下
させることにより簡単に誘発させることができた。仮り
にプロセッシングがキモシンの活性に依存するならば、
予想されるように、これらの条件下で融合蛋白質から遊
離したキモシンの少くともいくらかは、シュードキモシ
ン（pseudochymosin）の形であろう。多分、適当な条件
下では、これは、結局、さらにプロセッシングされて成
熟キモシンになるであろう。pH2で融合蛋白質をプロセ
ッシングすることは、ペプスタチンにより抑制された
が、このことはアスパルチル（aspartyl）プロテアーゼ
活性を必要とすることを示唆するものである。この活性
は、キモシン自体又は天然アスペルギルス・アワモリ
（A.awamori）プロテアーゼによって供給できた。主要
な分泌アスパルチルプロテアーゼ、アスペルギロペプシ
ン−Ａをコードする遺伝子を除いた（米国特許出願No.2
14,237参照）アワモリ（A.awamori）株を構築した。こ
の株中に残存する細胞外の蛋白質加水分解活性は低いレ
ベルであるが、この活性は、ペプスタチンによって影響
されない。このアスペルギロペプシン除去株におけるグ
ルコアミラーゼ−キモシン融合体のプロセッシングは、
形質転換体12gampr4及び23gampr46について上述したプ
ロセッシングとは区別し得ない（データ示さず）。この
ことは、さらに、融合蛋白質のプロセッシングを引き起
すペプスタチン抑制活性が実際にはキモシン自体の活性
であることを示している。
pGAMpR形質転換体から得られた成熟キモシンのアミノ
末端配列から、正しいプロセッシングが生じたことが確
認された（結果を示さず）。アミノ酸組成分析、比活性
測定、オクテルロニー平板法及びチーズ形成試験を含む
他の試験によって、これらの形質転換体で産生されたキ
モシンが真正なものであることが確認された。
末端配列から、正しいプロセッシングが生じたことが確
認された（結果を示さず）。アミノ酸組成分析、比活性
測定、オクテルロニー平板法及びチーズ形成試験を含む
他の試験によって、これらの形質転換体で産生されたキ
モシンが真正なものであることが確認された。
実施例２ アワモリ（A.awamori）α−アミラーゼを含む融合ポリ
ペプチドからのキモシンの分泌 pAMpR I及びaAMpR IIの構築 アスペルギルス アワモリ（Aspergillus awamori）
株UVK143fは、２つのほぼ等しいα−アミラーゼ遺伝子
（amyAとamyB）を有しており、両方ともクローニングさ
れ、そのうちの１つの配列が決定された（コールマン
（Korman.D.R.）（1988）、“アスペルギルス オリザ
エ（Aspergillus oryzae）とアスペルギルス アワモリ
（Aspergillus awamori）のα−アミラーゼ遺伝子のク
ローニングと特徴づけ、"MA.thesis、サンフランシスコ
州立大学）。次いで、第２の遺伝子の配列も決定され
た。前記amyA遺伝子は、21個のアミノ酸からなるアミノ
末端シグナル配列を含む496個のアミノ酸をコードす
る。２つの遺伝子のそれぞれの配列は同等であり、配列
５′から翻訳開始コドンまでの200bpを含み、８つのイ
ントロン配列とその位置についても同じであり、全配列
についても最終の２つ又は３つのカルボキシル末端アミ
ノ酸配列を除き同じである（amyA中のチロシン及びグリ
シンについてのコドンが、amyBでは３つのセリンコドン
で置換されている。）。ベクターpUCAMpR IとpUCAMpR I
Iは、pGAMpRと同様のプロキモシンＢ発現カセットを含
んでいるが、但しプロモーター、A.awamori amyA又はam
yB遺伝子のすべてをコードする配列、amyAターミネータ
ー及びポリアデニル化配列がglaA遺伝子の対応する部分
を置きかえている。
ペプチドからのキモシンの分泌 pAMpR I及びaAMpR IIの構築 アスペルギルス アワモリ（Aspergillus awamori）
株UVK143fは、２つのほぼ等しいα−アミラーゼ遺伝子
（amyAとamyB）を有しており、両方ともクローニングさ
れ、そのうちの１つの配列が決定された（コールマン
（Korman.D.R.）（1988）、“アスペルギルス オリザ
エ（Aspergillus oryzae）とアスペルギルス アワモリ
（Aspergillus awamori）のα−アミラーゼ遺伝子のク
ローニングと特徴づけ、"MA.thesis、サンフランシスコ
州立大学）。次いで、第２の遺伝子の配列も決定され
た。前記amyA遺伝子は、21個のアミノ酸からなるアミノ
末端シグナル配列を含む496個のアミノ酸をコードす
る。２つの遺伝子のそれぞれの配列は同等であり、配列
５′から翻訳開始コドンまでの200bpを含み、８つのイ
ントロン配列とその位置についても同じであり、全配列
についても最終の２つ又は３つのカルボキシル末端アミ
ノ酸配列を除き同じである（amyA中のチロシン及びグリ
シンについてのコドンが、amyBでは３つのセリンコドン
で置換されている。）。ベクターpUCAMpR IとpUCAMpR I
Iは、pGAMpRと同様のプロキモシンＢ発現カセットを含
んでいるが、但しプロモーター、A.awamori amyA又はam
yB遺伝子のすべてをコードする配列、amyAターミネータ
ー及びポリアデニル化配列がglaA遺伝子の対応する部分
を置きかえている。
PUCAMpR Iの構築を第６図に示す。簡単に説明する
と、α−アミラーゼ（AmyAバージョン）の最後の５つの
アミノ酸及びプロキモシンの最初の６つのアミノ酸をコ
ードする合成オリゴヌクレオチドを用いて、正確に、か
つフレーム中で、７番目のコドンから開始するプロキモ
シンＢコード配列領域をコードするBamH I−Asp718フラ
グメントを、プロモーター領域（翻訳開始コドンの617b
p5′まで）及び翻訳停止コドンの前の６番目のコドンま
でのamyAのすべての配列をコードするBgl II−Hind III
とリンクさせた（pUCAMYint＃２）。キモシンコード配
列の残りの部分を、GRG1タイプ発現カセットから得たAs
p718−Xba Iフラグメントとして加えて、pUCAMYint＃３
を得た（つまり、翻訳停止コドン後のXba Iサイト11bp
はpGRG1の構築の間に導入されたエンジニアサイトであ
る。）。突然変異生成に向けられたサイトを用いてXba
Iサイト11bpをamyA遺伝子の翻訳停止コドンの後に導入
したので、この遺伝子からのターミネーター及びポリア
デニル化領域（581bp）は、すみやかに、pUCAMYint＃３
のプロキモシン配列の後に置くことができ、これにより
pUCAMpR Iが得られた。ベクターpUCAMpR IIは、amyAプ
ロモーターがamyB遺伝子の対応する領域で置換されてい
ることを除き、本質的に同じである。
と、α−アミラーゼ（AmyAバージョン）の最後の５つの
アミノ酸及びプロキモシンの最初の６つのアミノ酸をコ
ードする合成オリゴヌクレオチドを用いて、正確に、か
つフレーム中で、７番目のコドンから開始するプロキモ
シンＢコード配列領域をコードするBamH I−Asp718フラ
グメントを、プロモーター領域（翻訳開始コドンの617b
p5′まで）及び翻訳停止コドンの前の６番目のコドンま
でのamyAのすべての配列をコードするBgl II−Hind III
とリンクさせた（pUCAMYint＃２）。キモシンコード配
列の残りの部分を、GRG1タイプ発現カセットから得たAs
p718−Xba Iフラグメントとして加えて、pUCAMYint＃３
を得た（つまり、翻訳停止コドン後のXba Iサイト11bp
はpGRG1の構築の間に導入されたエンジニアサイトであ
る。）。突然変異生成に向けられたサイトを用いてXba
Iサイト11bpをamyA遺伝子の翻訳停止コドンの後に導入
したので、この遺伝子からのターミネーター及びポリア
デニル化領域（581bp）は、すみやかに、pUCAMYint＃３
のプロキモシン配列の後に置くことができ、これにより
pUCAMpR Iが得られた。ベクターpUCAMpR IIは、amyAプ
ロモーターがamyB遺伝子の対応する領域で置換されてい
ることを除き、本質的に同じである。
キモシンの分泌 プラスミドpUCAMpR I及びpUCAMpR IIは、糸状菌に形
質転換するための選択マーカーとして使用できる遺伝子
を含んでいない。従って、選択マーカーを含む第２のプ
ラスミドを用いた共形質転換によりA.awomori中にこれ
らのプラスミドを導入することが必要であった。よっ
て、pUCAMpR I又はpUCAMpR IIの約10μｇをpBH2の約２
μｇと混合し（2.4kbのBamH I−Hind IIIフラグメント
を有するpUC18は、アスペルギルス ニガー（Aspergill
us niger）pyrG遺伝子を含む）、これを用い、かつ形質
転換体の選択システムとしてこの株におけるpyrGの突然
変異の相補性を利用してΔAP3株（米国特許出願No.214,
237に記載）を形質転換した。この方法で得た形質転換
体は、両方のプラスミドを含むべきである。個々の形質
転換体を24穴のマイクロタイタープレート中、1mlの液
体培地で培養し、培養上清についてキモシンの活性を調
べた。活性のある分泌キモシンを多量に産生した形質転
換体を、次いで、次の分析を行うために、50mlの振とう
フラスコ培養において、大豆粉培地を用いて成長させ
た。ΔAP3株の形質転換体により産生された多量のキモ
シンは、形質転換のためにpUCAMpR I又はpUCAMpR IIが
用いられたかにかかわらず同等であった。観察された最
大生産量はキモシン70〜80μg/mlであった。この値は、
α−アミラーゼコード配列を含まないで、プレプロキモ
シンがα−アミラーゼプロモーターに直接融合した場合
に予想される生産量よりも高いものであった。特別な染
色のために抗キモシン抗体を用いた培養上清のウエスタ
ンノムノブロッティング分析の結果から、pGANpR形質転
換体なので、融合蛋白質は１つのコドンを示すことに加
えて、成熟キモシンのサイズ（37,000MW）を示すことが
わかった。この融合蛋白質は、α−アミラーゼ／プロキ
モシン融合ポリペプチドの全長についての期待されたサ
イズ（91,000MW）を有し、このことは特別の染色のため
の抗−α−アミラーゼ抗体を用いて同定することができ
た。成熟キモシンは、グルコアミラーゼ／プロキモシン
融合蛋白質について観察されたのと同様に、低pHでα−
アミラーゼ／プロキモシン融合蛋白質から放出された。
質転換するための選択マーカーとして使用できる遺伝子
を含んでいない。従って、選択マーカーを含む第２のプ
ラスミドを用いた共形質転換によりA.awomori中にこれ
らのプラスミドを導入することが必要であった。よっ
て、pUCAMpR I又はpUCAMpR IIの約10μｇをpBH2の約２
μｇと混合し（2.4kbのBamH I−Hind IIIフラグメント
を有するpUC18は、アスペルギルス ニガー（Aspergill
us niger）pyrG遺伝子を含む）、これを用い、かつ形質
転換体の選択システムとしてこの株におけるpyrGの突然
変異の相補性を利用してΔAP3株（米国特許出願No.214,
237に記載）を形質転換した。この方法で得た形質転換
体は、両方のプラスミドを含むべきである。個々の形質
転換体を24穴のマイクロタイタープレート中、1mlの液
体培地で培養し、培養上清についてキモシンの活性を調
べた。活性のある分泌キモシンを多量に産生した形質転
換体を、次いで、次の分析を行うために、50mlの振とう
フラスコ培養において、大豆粉培地を用いて成長させ
た。ΔAP3株の形質転換体により産生された多量のキモ
シンは、形質転換のためにpUCAMpR I又はpUCAMpR IIが
用いられたかにかかわらず同等であった。観察された最
大生産量はキモシン70〜80μg/mlであった。この値は、
α−アミラーゼコード配列を含まないで、プレプロキモ
シンがα−アミラーゼプロモーターに直接融合した場合
に予想される生産量よりも高いものであった。特別な染
色のために抗キモシン抗体を用いた培養上清のウエスタ
ンノムノブロッティング分析の結果から、pGANpR形質転
換体なので、融合蛋白質は１つのコドンを示すことに加
えて、成熟キモシンのサイズ（37,000MW）を示すことが
わかった。この融合蛋白質は、α−アミラーゼ／プロキ
モシン融合ポリペプチドの全長についての期待されたサ
イズ（91,000MW）を有し、このことは特別の染色のため
の抗−α−アミラーゼ抗体を用いて同定することができ
た。成熟キモシンは、グルコアミラーゼ／プロキモシン
融合蛋白質について観察されたのと同様に、低pHでα−
アミラーゼ／プロキモシン融合蛋白質から放出された。
実施例３ pSG1の構築 グルコアミラーゼポリペプチド配列の非常に小さい部
分をプロキモシンのアミノ末端に融合させることによっ
て、キモシンの産生と分泌が増強されるか否かを調べる
ために、ベクターpSG1を構築した（第７図）。このプラ
スミドの構築の出発点は、pGRG4（EPO公開0215594）の
それと等しいXho I/Hind IIIグルコアミラーゼ／キモシ
ン発現カセット（プロモーター、コード配列及びターミ
ネーター領域）を含むベクター（pUCAagrg4）を用いた
ことにあるが、ただし、ここでは、Aspergillus awamor
i UVK143f glaAプロモーター、シグナル配列、プロ配列
及び成熟コード配列の最初の11個のコドンで、A.niger
glaA遺伝子の対応領域を置換した。この発現カセットを
pUC18のHind IIIとSal Iサイトの間に挿入した（ヤニッ
シュペロンら（Yanish−Peron et al.）1985、Gene 33
103−119）。pUCAagrg4から、A.awamoriUVK143f glaA
プロモーター、シグナル配列、プロ配列、成熟グルコア
ミラーゼコード配列の最初の11個のコドン及びプロキモ
シンコード配列のアミノ末端部分を含む2.3kb AsP 718
フラグメントを単離した。このフラグメントをpUC18のA
sp718リストリクションサイトにクローンニングしてpUC
grg 4x/kを得た。A.awamori遺伝子のコード配列（プロ
配列内から成熟コード配列を通り、約半分のところま
で）からの1kb BssH IIフラグメントを、pUCgrg 4x/kの
glaAプロ配列領域内のユニークBssH IIサイトに挿入し
てpUCgrg 4x/k＋Ｂを得た。最後に、pUCレプリコ、キモ
シンコード配列の３′末端、A.niger glaAポリアデニル
化及びターミナル領域を含むより大きなAsp718フラグメ
ントをpUCAagrg4から単離し、これをpUCgrg 4x/k＋Ｂか
らの大きなAsp718フラグメントと結合し、pSG1を得た。
転写と翻訳の結果として産生されると予期されるグルコ
アミラーゼ／プロキモシンポリペプチドは、グルコアミ
ラーゼシグナル配列、グルコアミラーゼプロ配列、成熟
グルコアミラーゼの１〜297のアミノ酸及びこれにすぐ
続いている成熟グルコアミラーゼの１〜11のアミノ酸及
びカルボキシ末端のプロキモシンから構成されているは
ずである。
分をプロキモシンのアミノ末端に融合させることによっ
て、キモシンの産生と分泌が増強されるか否かを調べる
ために、ベクターpSG1を構築した（第７図）。このプラ
スミドの構築の出発点は、pGRG4（EPO公開0215594）の
それと等しいXho I/Hind IIIグルコアミラーゼ／キモシ
ン発現カセット（プロモーター、コード配列及びターミ
ネーター領域）を含むベクター（pUCAagrg4）を用いた
ことにあるが、ただし、ここでは、Aspergillus awamor
i UVK143f glaAプロモーター、シグナル配列、プロ配列
及び成熟コード配列の最初の11個のコドンで、A.niger
glaA遺伝子の対応領域を置換した。この発現カセットを
pUC18のHind IIIとSal Iサイトの間に挿入した（ヤニッ
シュペロンら（Yanish−Peron et al.）1985、Gene 33
103−119）。pUCAagrg4から、A.awamoriUVK143f glaA
プロモーター、シグナル配列、プロ配列、成熟グルコア
ミラーゼコード配列の最初の11個のコドン及びプロキモ
シンコード配列のアミノ末端部分を含む2.3kb AsP 718
フラグメントを単離した。このフラグメントをpUC18のA
sp718リストリクションサイトにクローンニングしてpUC
grg 4x/kを得た。A.awamori遺伝子のコード配列（プロ
配列内から成熟コード配列を通り、約半分のところま
で）からの1kb BssH IIフラグメントを、pUCgrg 4x/kの
glaAプロ配列領域内のユニークBssH IIサイトに挿入し
てpUCgrg 4x/k＋Ｂを得た。最後に、pUCレプリコ、キモ
シンコード配列の３′末端、A.niger glaAポリアデニル
化及びターミナル領域を含むより大きなAsp718フラグメ
ントをpUCAagrg4から単離し、これをpUCgrg 4x/k＋Ｂか
らの大きなAsp718フラグメントと結合し、pSG1を得た。
転写と翻訳の結果として産生されると予期されるグルコ
アミラーゼ／プロキモシンポリペプチドは、グルコアミ
ラーゼシグナル配列、グルコアミラーゼプロ配列、成熟
グルコアミラーゼの１〜297のアミノ酸及びこれにすぐ
続いている成熟グルコアミラーゼの１〜11のアミノ酸及
びカルボキシ末端のプロキモシンから構成されているは
ずである。
pBH2を用いた共形質転換実験においてpSG1を用いた
が、活性キモシンを産生する形質転換体を同定できなか
った。この理由は不明確であり、この状況を明確にする
ためにはさらに実験を進めている。これは、このプラス
ミドによってコードされたグルコアミラーゼ／プロキモ
シン融合ポリペプチドは効率的に分泌されないか、又は
成熟した活性キモシンが融合ポリペプチドから放出され
ないことによるかも知れない。しかしながら、プラスミ
ドが予想通り構築されなかったか、グルコアミラーゼ／
キモシンコード配列の転写又は翻訳が有効ではなかった
とも考えられる。
が、活性キモシンを産生する形質転換体を同定できなか
った。この理由は不明確であり、この状況を明確にする
ためにはさらに実験を進めている。これは、このプラス
ミドによってコードされたグルコアミラーゼ／プロキモ
シン融合ポリペプチドは効率的に分泌されないか、又は
成熟した活性キモシンが融合ポリペプチドから放出され
ないことによるかも知れない。しかしながら、プラスミ
ドが予想通り構築されなかったか、グルコアミラーゼ／
キモシンコード配列の転写又は翻訳が有効ではなかった
とも考えられる。
上記実施例は単なる例として示したものであり、請求
の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
本発明の好ましい態様を記載したが、この開示内容に
対して当業者は種々の変更を行うことができ、このよう
な変更も本発明の範囲内に入ることが明らかであろう。
対して当業者は種々の変更を行うことができ、このよう
な変更も本発明の範囲内に入ることが明らかであろう。
すべての文献は、本明細書中に参照として加えられ
る。
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:665） (56)参考文献 特開 昭62−175183（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−44890（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−501331（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開310137（ＥＰ，Ａ １) ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ｖｏ ｌ．５（1987）ｐ．369−376 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/90 C07K 19/00 C12N 1/15 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (27)
- 【請求項１】融合ポリペプチドをコードする塩基配列を
有するDNAであって、前記塩基配列の５′−末端から第
１、第２、第３及び第４塩基配列が、前記融合ポリペプ
チドのアミノ末端からカルボキシ末端へ向かって、対応
する第１、第２、第３及び第４アミノ酸配列をコードす
ること、前記第１塩基配列が第１糸状菌の分泌配列とし
て、シグナルペプチド機能をコードすること、前記第２
塩基配列が前記第１糸状菌または第２糸状菌から正規に
分泌された分泌ポリペプチドまたはその一部分をコード
すること、前記第３塩基配列が開裂できるリンカーポリ
ペプチドをコードし、かつ、前記第４塩基配列が目的と
するポリペプチドをコードすることを含み、ここに、前
記第１または前記第２糸状菌における前記融合ポリペプ
チドをコードする塩基配列を有するDNAの発現が、前記
第１、第３及び第４塩基配列のみを含む第２融合塩基配
列によってコードされた第２融合ポリペプチドとして発
現されたときの前記第１または前記第２糸状菌由来の前
記目的とするポリペプチドの分泌と比較して、前記目的
とするポリペプチドの増幅した分泌をもたらす前記DN
A。 - 【請求項２】前記第１塩基配列が、アスペルギルス種由
来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びアスパル
チルプロテアーゼからのシグナルペプチド、ウシキモシ
ン及びヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター由来の
シグナルペプチド並びにトリコデルマセロビオハイドロ
ラーゼＩ及びII由来のシグナルペプチドからなる群から
選ばれたシグナルペプチドまたはその一部分をコードす
る、請求項１記載のDNA。 - 【請求項３】前記第１塩基配列が、アスペルギルス・ア
ワモリグルコアミラーゼ由来のシグナルペプチドをコー
ドする、請求項１記載のDNA。 - 【請求項４】前記第２塩基配列が、アスペルギルス種由
来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びアスパル
チルスプロテアーゼ、並びにトリコデルマセロビオハイ
ドロラーゼＩ及びIIからなる群から選ばれた分泌ポリペ
プチドをコードする、請求項１記載のDNA。 - 【請求項５】前記第２塩基配列が、アスペルギルス・ア
ワモリ由来のグルコアミラーゼをコードする、請求項１
記載のDNA。 - 【請求項６】前記第３塩基配列が、キモシン由来の前配
列、サブチリシンの前配列、及びトリプシン因子Xa、コ
ラーゲナーゼ、クロストリパイン、サブチリシン及びキ
モシンによって認識される配列からなる群から選ばれた
開裂できるリンカーポリペプチドをコードする、請求項
１記載のDNA。 - 【請求項７】前記第３塩基配列が、キモシンの前配列ま
たはその一部をコードする、請求項１記載のDNA。 - 【請求項８】前記第４塩基配列が、酵素、タンパク質ホ
ルモン及び血清タンパクからなる群から選ばれた目的と
するポリペプチドをコードする、請求項１記載のDNA。 - 【請求項９】前記第４塩基配列が、ウシキモシンをコー
ドする、請求項１記載のDNA。 - 【請求項１０】前記第１塩基配列が、アスペルギルス・
アワモリグルコアミラーゼ由来のシグナルペプチドをコ
ードし、前記第２配列がアスペルギルス・アワモリグル
コアミラーゼ由来のグルコアミラーゼをコードし、前記
第３配列がキモシンの前配列をコードし、そして、前記
第４配列がキモシンをコードする、請求項１記載のDN
A。 - 【請求項１１】請求項１記載のDNAの塩基配列の５′末
端に実施可能に結合したプロモーター及び転写及び翻訳
開始配列を含む前記宿主糸状菌によって機能的に認識さ
れる調節配列をコードする塩基配列を有するDNA及び転
写停止配列及び請求項１のDNAの塩基配列の３′末端に
実施可能に結合したポリアデニル化配列を含む宿主糸状
菌の形質転換のための発現ベクター。 - 【請求項１２】前記シグナルペプチド及び前記分泌ポリ
ペプチドをそれぞれコードする前記第１及び前記第２塩
基配列が、前記宿主糸状菌と同属の糸状菌から選ばれ
る、請求項11記載の発現ベクター。 - 【請求項１３】前記属が、アスペルギルス属、トリコデ
ルマ属、ニューラスパラ属、ペニシリウム属、セファロ
スポリウム属、パダスポラ属、エンドチア属、ミューコ
ア属、コクリオボラス属、ピリキュラリア属、アクリヤ
属及びヒューミコラ属からなる群から選ばれたものであ
る、請求項11記載の発現ベクター。 - 【請求項１４】前記属がアスペルギルス属である、請求
項13記載の発現ベクター。 - 【請求項１５】前記シグナルペプチド及び前記分泌ペプ
チドをそれぞれコードする前記第１及び前記第２塩基配
列が前記宿主糸状菌由来のものである、請求項11記載の
発現ベクター。 - 【請求項１６】請求項11〜15記載の発現ベクターの群か
ら選ばれた発現ベクターを含む糸状菌。 - 【請求項１７】アミノ末端からカルボキシ末端に向かっ
て第１、第２、第３及び第４アミノ酸配列を含み、前記
第１アミノ酸配列が第１糸状菌の分泌配列としてシグナ
ルペプチド機能を含み、前記第２アミノ酸配列が前記第
１糸状菌または第２糸状菌から正規に分泌された分泌ポ
リペプチドまたはその一部分を含み、前記第３アミノ酸
配列が開裂できるリンカーポリペプチドを含み、かつ、
前記第４アミノ酸配列が目的とするポリペプチドを含
み、ここで、前記第１または前記第２糸状菌の前記融合
ポリペプチドをコードする塩基配列を有するDNAの発現
が、前記第１、第３及び第４アミノ酸配列を含む第２融
合ポリペプチドをコードする塩基配列を有する第2DNAか
ら発現されたときの前記第１または前記第２糸状菌由来
の前記目的とするポリペプチドの分泌と比較して、前記
目的とするポリペプチドの増幅した分泌をもたらす融合
ポリペプチド。 - 【請求項１８】前記第１アミノ酸配列が、アスペルギル
ス種由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びア
スパルチルプロテアーゼからのシグナルペプチド、ウシ
キモシン及びヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
由来のシグナルペプチド並びにトリコデルマセロビオハ
イドロラーゼＩ及びII由来のシグナルペプチドからなる
群から選ばれたシグナルペプチドまたはその一部分を含
む、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項１９】前記第１アミノ酸配列が、アスペルギル
ス・アワモリグルコアミラーゼ由来のシグナルペプチド
である、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２０】前記第２アミノ酸配列が、アスペルギル
ス種由来のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びア
スパルチルプロテアーゼ並びにトリコデルマセロビオハ
イドロラーゼＩ及びIIからなる群から選ばれたものであ
る、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２１】前記第２アミノ酸がアスペルギルス・ア
ワモリ由来のグルコアミラーゼである、請求項17記載の
融合ポリペプチド。 - 【請求項２２】前記開裂できるリンカーポリペプチド
が、サブチリシンの前配列、及びトリプシン因子Xa、コ
ラーゲナーゼ、クロストリパイン、サブチリシン及びキ
モシンによって認識される配列からなる群から選ばれた
ものである、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２３】前記第３アミノ酸配列が、キモシンの前
配列である、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２４】前記第４アミノ酸配列が、酵素、タンパ
ク質ホルモン及び血清タンパクからなる群から選ばれた
ものである、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２５】前記第４アミノ酸配列がキモシンであ
る、請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２６】前記第１アミノ酸配列がアスペルギルス
・アワモリグルコアミラーゼのシグナルペプチドであ
り、前記第３アミノ酸配列がキモシンの前配列であり、
そして、前記第４アミノ酸配列がウシキモシンである、
請求項17記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項２７】目的とするポリペプチドを製造する方法
であって、請求項１記載のDNAの塩基配列によってコー
ドされる目的とするポリペプチドの分泌を起こす前記DN
Aの発現を可能にする条件で、前記DNAを含む発現ベクタ
ーで宿主糸状菌を形質転換することを含む方法。
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