JP3903165B2 - アスペルギルス・オリザによるタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）による異種タンパク生成物の分泌生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日までに、組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドまたはタンパクを生産するため数多くの方法が開発されてきた。主な興味は細菌および酵母に集中されてきたのであり、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は例えば発現および選択系に関して詳細に特徴化されているものである。
【０００３】
上記の微生物のほかに、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のような糸状菌は、詳細に特徴化されている組換えＤＮＡベクター用の宿主微生物として有望な候補であり、酵素を商業的に生産するのに広範囲に用いられている微生物である。形質転換された宿主微生物から形質転換細胞を選択できる選択マーカーが用いられる形質転換系の開発に、特に努力が集中されてきた。
【０００４】
過去数年間にアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の形質転換のための各種選択マーカーが報告され、菌の細胞分化を制御する遺伝学的および分子学的方法を研究する目的で糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの組込み形質転換の手法が近年になり開発されてきた。
【０００５】
Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａｐｙｒ−４遺伝子（Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第１１２巻、（１９８３年）、２８４〜２８９頁）、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ遺伝子（Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２０５〜２２１頁）、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，第８１巻、（１９８４年）、１４７０〜１４７４頁）およびＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子（Ｊｏｈｎ，Ｍ．Ａ．およびＰｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，第６巻、（１９８４年）３８６〜３８９頁）を含むプラスミドを用いて説明されてきた。形質転換するＤＮＡは、比較的低い頻度（典型的には１０００個未満の形質転換体／１μｇのＤＮＡ）で宿主ゲノムに組込まれることが分かった。
【０００６】
ごく最近に、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子を用いるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換が報告され（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．とＨｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第４巻、（１９８５年）、４７５〜４７９頁）、ａｍｄＳは単一の窒素源としてのアセタミド上では強力には成長できないＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換に使用される有力な選択マーカーであることが示された。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｒｇＢ遺伝子を用いるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換も、最近報告された（Ｂｕｘｔｏｎ，Ｆ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおける異種タンパクの発現のための系は、主として、この菌における遺伝子発現の制御法が十分には知られておらず且つクローニングベクター上に好適な選択可能な遺伝子マーカーが欠如していることにより、これまでは開発されなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段、発明の作用および効果】
本発明によれば、上記の形質転換技法を用いて、異種タンパクを高水準で発現させまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおける同種タンパクの産生を増進させることができる。
本明細書において用いられる「異種タンパク」という表現はＡ． ｏｒｙｚａｅによっては産生されないタンパクを意味し、一方「同種タンパク」という表現はＡ． ｏｒｙｚａｅ自体によって産生されるタンパクを意味する。
【０００９】
更に具体的には、Ａ． ｎｉｇｅｒおよびＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換に用いたマーカー遺伝子を使用することによって、所望なタンパク生成物を暗号化するＤＮＡで形質転換したＡ． ｏｒｙｚａｅ株の選択が可能である。これら前者の菌類とＡ． ｏｒｙｚａｅとの系統発生的距離（Ｒａｐｅｒ，Ｋ．Ｂ．およびＦｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｉ．，（１９６５年）Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のために、これはまったく予知されないものであった。
【００１０】
本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、具体的にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒにおけるタンパク生成物の発現に極めて効果的なプロモーターであって、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターまたは任意に上流活性化配列が先行する上記プロモーターの機能的部分として特徴化されるものを提供する。
【００１１】
使用した形質転換法は、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換法の変法（Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第１１２巻、（１９８３年）、２８４〜２８９頁、Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２０５〜２２１頁）、Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，第８１巻、（１９８４年）、１４７０〜１４７４頁）およびＡ．ｎｉｇｅｒの形質転換についてのＢｕｘｔｏｎらの方法、（Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）に類似の方法であった。本発明の方法では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅは、宿主株のゲノム中に組込むことができるが、形質転換前は宿主株に有しない選択マーカーを含むベクター系で形質転換される。
【００１２】
好ましい選択マーカーはａｒｇＢ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｎｉｇｅｒ）、ｔｒｐＣ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ａｍｄＳ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはｐｙｒ４（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）遺伝子、またはＤＨＦＲ（ジヒドロフォレートレダクターゼまたはその変異株）遺伝子である。更に好ましい選択マーカーはａｒｇＢまたはａｒｍＳ遺伝子である。野生型Ａ． ｏｒｙｚａｅ株は通常はａｒｇＢ+ である（すなわち、ａｒｇＢ遺伝子がＡ． ｏｒｙｚａｅにおいて機能的である）。
【００１３】
ａｒｇＢを選択マーカーとして選択する場合には、このマーカーに対して遺伝子に欠損を有するＡ． ｏｒｙｚａｅのａｒｇＢ変異株を宿主株として用いなければならない。Ａ． ｏｒｙｚａｅのａｒｇＢ変異株はＦ．Ｐ．Ｂｕｘｔｏｎらが報告したのと同様にして調製することができる（Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）。ａｒｇＢ変異株はオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子に欠損を有する変異株として定義される。他方、ａｍｄＳ遺伝子は、野生型Ａ． ｏｒｙｚａｅ株がこの遺伝子を含まないので、この野生株の形質転換の選択マーカーとして用いることができる。
【００１４】
遺伝子配列を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列は、典型的にはプロモーター、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルである。
当業界において周知のように上流活性化配列およびエンハンサー配列が先行することのあるプロモーターはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおいて強力な転写活性を示すことができる如何なるＤＮＡ配列であってもよく、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよび解糖酵素のような細胞外および細胞内タンパクのいずれをも暗号化する遺伝子から誘導することができる。
【００１５】
好適なプロモーターはＡ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼについての遺伝子から誘導することができる。解糖酵素の遺伝子からのプロモーターの例は、ＴＰＩ，ＡＤＨおよびＰＧＫである。
【００１６】
本発明による好ましいプロモーターは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターである。ＴＡＫＡアミラーゼは周知のα−アミラーゼ（Ｔｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，第５８巻、シリーズＢ（１９８２年）、２０８〜２１２頁）である。プロモーター領域を暗号化するＤＮＡは、ＴＡＫＡ−アミラーゼゲノム性クローンから誘導した。プロモーターおよびプロモーターの上流の領域の配列を、プレ領域およびＴＡＫＡ−アミラーゼについての構造遺伝子の５′末端と共に図１に示す。
【００１７】
実施例２に更に詳細に説明されるように、プレ領域およびプロモーターおよび上流活性化配列を含むＴＡＫＡ−アミラーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍから誘導され、ＢａｍＨＩを消化したｐＢＲ３２２に挿入されて、プラスミドｐＴＡＫＡ １７を生成した（図２を参照されたい）。ｐＴＡＫＡ １７ Ａ． ｏｒｙｚａｅから誘導されたＤＮＡは５．５kb ＢａｍＨＩ／Ｓａｕ ３ＡＩ−ＢａｍＨＩ／Ｓａｕ ３ＡＩフラグメントとして示され、プロモーターおよび上流活性化配列は位置０から始まる２．１kbフラグメントを表わす。
【００１８】
ＢｇｌII部位からのプロモーターおよび上流活性化配列の確立されたＤＮＡ配列を、図１に示す。プロモーターは、ＴＡＫＡ−アミラーゼプレ配列のＭｅｔ（１）コドンに先行するヌクレオチド−１で終了する。プレ配列を暗号化するヌクレオチド配列は６３個のヌクレオチドから構成され、成熟ＴＡＫＡ−アミラーゼはヌクレオチド６４に対応する位置から開始する。
【００１９】
ｐＴＡＫＡ １７から、プロモーターに対して上流の配列を含む全プロモーター配列またはその機能的部分は、当業者に公知の手段によって誘導することができる。プロモーター配列は、プロモーター配列を、例えば所望なタンパク生成物またはことなるプレ領域（シグナルペプチド）を暗号化する遺伝子のような他のＤＮＡとの連結を促進する特異的な制限部位を導入するために、リンカーを備えていてもよい。
【００２０】
本発明による方法では、（ＳａｌＩ部位の開始を表わす）ヌクレオチド−１１４４（図１を参照されたい）からヌクレオチド−１０の配列を、プロモーター領域の十分に機能する部分の一例として使用した。本発明のもう一つの態様では、ヌクレオチド−１１７６から−１までのヌクレオチド配列は、ｐＴＡＫＡ １７からの未だ配列されていない１．０５kbフラグメントが先行した。各種のフラグメントを使用できることは、当業者にとって明らかである。
【００２１】
本発明の一態様によれば、プロモーターおよび上流活性化配列は、図１におけるヌクレオチド−１１４４からヌクレオチド−１０の配列を表わす下記の配列または機能的に同等なヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
【００２３】
もう一つの態様によれば、プロモーターおよび上流活性化配列は、図１におけるヌクレオチド−１１７６から−１までの配列を表わす下記の配列または機能的に同等なヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
【００２５】
本発明のもう一つの見地によれば、後者の配列では、ｐＴＡＫＡ １７からの１．０５kbの配列決定されていない上流領域（図２における位置０〜１．０５）が先行してもよい。
ターミネーターおよびポリアデニル化配列はプロモーターと同じ源から誘導することができる。エンハンサー配列を構造中に挿入してもよい。
【００２６】
発現した生成物は細胞の分裂を要する細胞内に蓄積させて、生成物を単離することができる。この付加的工程を回避し且つ細胞内で発現した生成物の可能な分解量を最少限にするには、生成物を細胞から分泌するのが好ましい。この目的のため、所望な生成物の遺伝子は、発現した生成物を細胞の分泌経路内への効果的に向けるプレ領域を有する。自然に起こるシグナルまたはリーダーペプチドまたはその機能的部分あるいは分泌を行う合成配列であることができるこのプレ領域は、一般的には分泌の際に所望な生成物から開裂して、培養液から単離する準備のできた成熟生成物を残す。
【００２７】
このプレ領域は、如何なる有機物源からのものであっても分泌されるタンパクの遺伝子から誘導することができる。
本発明によれば、プレ領域はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種からのグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からのアミラーゼ遺伝子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのリパーゼまたはプロテイナーゼ遺伝子、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα−因子の遺伝子または仔牛プロキモシン遺伝子から誘導することができる。
【００２８】
更に好ましくは、プレ領域はＡ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼ、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣＩＢ１１８３７からのマルトース原性アミラーゼ、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎから誘導される。
有効なシグナル配列は、Ａ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼシグナル、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼシグナルおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼシグナルである。
ＴＡＫＡ−アミラーゼシグナルは下記の配列を有する。
【００２９】
【化１】
【００３０】
プロモーターおよびターミネーター配列に機能的に連結した所望な生成物の遺伝子は、選択マーカーを含むベクターに組込むことができ、または宿主株のゲノム中に組込むことができる別個のベクターまたはプラスミド上に置いてもよい。本明細書で用いる「ベクター系」という表現は単一ベクターまたはプラスミドまたは宿主ゲノム中に組込まれる全ＤＮＡ情報を含む２種類以上のベクターまたはプラスミドを包含する。ベクターまたはプラスミドは、線状または閉じた円形分子であってもよい。本発明の好ましい態様によれば、Ａ． ｏｒｙｚａｅは２個のベクターであって、一つは選択マーカーを含み、もう一つは宿主株に導入される残りの異種ＤＮＡから成り、プロモーター、所望な生成物および転写ターミネーターの遺伝子およびポリアデニル化配列を含むもので共形質転換される。
【００３１】
通常は、Ａ． ｏｒｙｚａｅ形質転換体は安定であり、選択マーカーの不在で培養することができる。形質転換体が不安定になる場合には、選択マーカーを用いて培養の際に選択してもよい。形質転換細胞を、次に問題のマーカーに対応する選択圧で培養する。
【００３２】
本発明はＡ． ｏｒｙｚａｅにおいて多種多様なポリペプチドまたはタンパク生成物を高収率で製造する方法を提供する。Ａ． ｏｒｙｚａｅは長年にわたり例えばＴＡＫＡ−アミラーゼ酵素およびタンパク分解酵素の生産に商業的規模で用いられてきており、従ってこの微生物の醗酵技術は十分に開発されており、この微生物は食品工業において使用されることが証明されている。
【００３３】
本発明は、原則として如何なるポリペプチドまたはタンパク生成物でも高収量での工業的生産にＡ． ｏｒｙｚａｅの使用可能性を提供する。かかる生成物の例はキモシンまたはプロキモシンおよび他のレンネット、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからの酸安定アミラーゼ、菌のリパーゼまたは原生生物のリパーゼおよび熱に安定な細菌または菌のアミラーゼである。
【００３４】
本発明をプロキモシン、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、ＴＡＫＡ−アミラーゼおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのリパーゼの生産によって説明する。これらの酵素の遺伝子は、下記に更に詳細に説明するように、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから得た。
【００３５】
【実施例】
以下の実施例において出発物質として使用したプラスミドは次の通りである。
【００３６】
【００３７】
使用した菌類は次の通りである。
【００３８】
実施例１ プロキモシン遺伝子を含むプラスミド２８５′ｐｒｏＣの調製
プレプロキモシン遺伝子を仔牛の胃のｃＤＮＡライブラリーから単離し、Ｇ−ＣテイリングによってｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入して（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１８巻、（１９７９年）、５２９４頁およびＴｒｕｅｌｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第６巻、（１９７９年）、３０６１頁）、ｐＲ２６を得た。
【００３９】
ｐＵＣ９をＳａｌＩで切断し、切断をクレノーポリメラーゼで満たし、Ｔ４リガーゼで連結した。生成するプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断して、２．７kbの大きなフラグメントをプロキモシン遺伝子のＮ末端を含むｐＲ２６からの０．４７kb ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結し、ｐＵＣ９′を作った。ｐＵＣ９′は、プロキモシン遺伝子のＮ末端にＨｉｎｄIII 部位を含む。
【００４０】
ｐＵＣ１３をＢａｍＨＩ−ＮａｒＩで切断して、ＮａｒＩ−ＸａｍＩと大きなそれぞれの小型フラグメントをプロキモシン遺伝子のＣ末端を含むｐＲ２６の０．６４kb ＸｍａＩ−ＢｃｌＩフラグメントと連結して、プラスミドｐＵＣ１３′を得た。ｐＵＣ１３′は、プロキモシン遺伝子のＣ末端にＸｂａＩ部位を含む。ｐＵＣ１３′の０．６５kb ＸｍａＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＵＣ９′の０．４６kb ＨｉｎｄIII −ＸｍａＩおよびｐ２８５の１１kb ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントと連結して、図３に示されるようにプロキモシン遺伝子を含むプラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣを生成させた。
【００４１】
実施例２ Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼＡ遺伝子のクローニング
じゃがいも澱粉上で成長させたＡ．ｏｒｙｚａｅ Ｈｗ ３２５から、Ｋａｐｌａｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第１８３巻、（１９７９年）、１８１〜１８４頁）によって、ｍＲＮＡを調製した。ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子の１０５０bpを含む部分ｃＤＮＡクローンを、ｍＲＮＡをＴＡＫＡ−アミラーゼにおけるアミノ酸２９５〜２９９についての暗号化配列に相補的な４−マー・オリゴヌクレオチド混合物
【００４２】
【化２】
【００４３】
で特異的に感作することによって得た（Ｔｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，第５８巻、シリーズＢ、（１９８２年）、２０８〜２１２頁）。クローニング法は、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｇｅｎｅ、第２５巻、（１９８３年）、２６３〜２６９頁記載の方法に準じた。ｃＤＮＡクローンの両端および中央手での配列は、ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミノ酸配列に対応する配列が存在することを示した。
【００４４】
ゲノムクローンの単離
Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｈｗ ３２５からの菌糸を収穫して、Ｂｏｅｌらの上記文献に記載のＡ． ｎｉｇｅｒについて用いた方法に従ってＤＮＡを調製するために加工した。Ｓａｕ３Ａで部分消化することによって生成した３〜１０kbの制限フラグメントを、ＢａｍＨＩで消化して、脱リン酸化したｐＢＲ３２２と連結した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
【００４５】
５０，０００個の組換体をオリゴヌクレオチドプローブＮＯＲ−１６８（上記）でスクリーニングして、７個がＴＡＫＡ−アミラーゼを暗号化するＤＮＡを含むことを見出した。一つのクローンをｍＲＮＡ開始２．１kb上流を有するプロモーター領域を更に使用するのに選択した。プラスミドｐＴＡＫＡ １７についての制限マップを図２に示す。
【００４６】
Ｅ． ｃｏｌｉ株に移したｐＴＡＫＡ １７を１９８７年２月２３日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400, Goettingenに寄託され、受託番号ＤＳＭ ４０１２を与えられた。ＤＳＭは１９７７年のブダペスト条約で認定された国際寄託当局であり、上記の条約のそれぞれ第９規則および第１１規則に従って、公衆による寄託および入手の永続性を付与している。
【００４７】
実施例３ Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーの構成
真菌類Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ（この菌種の形態学的および系統学的説明については、 Shipper, M.A.A., On the genera Rhizomucor and Parasitella, Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Science and Letters, 第１７号（１９７８年）、５３〜７１頁を参照されたい）はチーズ製造におけるミルクの凝固に広く用いられている酸プロテイナーゼ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉプロテイナーゼ、以下ＲＭＰと省略する）を分泌する。
【００４８】
Ｅ． ｃｏｌｉにおいてこのタンパクのｃＤＮＡ組換えクローンを得るために、全ＲＮＡをＢｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊ．，第３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８４年）およびＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗａｓｈ．）、第１８巻、５２９４〜５２９９，１９７９年）の方法によってホモゲナイズしたＲ． ｍｉｅｈｅｉ ｍｙｃｅｌｉｕｍから抽出した。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを、ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ（ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，第６９巻、１４０８〜１４１２頁、１９７２年）によって報告されたオリゴ（ｄＴ）−セルロース上で親和クロマトグラフィーを２サイクル行うことによって得た。
【００４９】
オリゴ（ｄＴ）で感作した相補性ＤＮＡを合成して、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ，第２５巻、２６３〜２６９頁、１９８３年）が報告した方法に従って二重鎖とした。二重鎖を、Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，第３巻、１０１〜１０６頁、１９７６年）によって報告された方法によって、ｄＣＴＰおよび末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼと連結した。プラスミドｐＢＲ３２７をＰｓｔＩで線形化して、ｄＧＴＰと連結した。
【００５０】
オリゴ（ｄＣ）を連結したｄｓｃＤＮＡを、Ｐｅａｃｏｃｋらが記載した方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第６５５巻、２４３〜２５０頁、１９８１年）によってこのオリゴ（ｄＧ）を連結したベクターにアニーリングして、Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＣ１０００のｈｓｄＲ- ，Ｍ+ 誘導体（ＣａｓａｄａｂａｎとＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第１３８巻、１７９〜２０７頁、１９８０年）を形質転換して組換えクローンを生成させるのに用いた。
ＲＭＰ特異的なｃＤＮＡ組換体の同定
１６個のヘプタデカマー・オリゴデオキシリボヌクレオチド
【００５１】
【化３】
【００５２】
の混合物であって、その一つが Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Alaを暗号化する領域においてＲＭＰ ｍＲＮＡに相補的であるもの（ＢｅｃｈとＦｏｌｔｍａｎｎ，Ｎｅｔｈｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、２７５〜２８０頁、１９８１年）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製のＤＮＡ合成装置上で合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。
【００５３】
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーからの約１０，０００個のＥ． ｃｏｌｉ組換体をＷｈａｔｍａｎ ５４０濾紙に移した。コロニーを、Ｇｅｒｇｅｎらが記載した方法によってリーシスして、固定した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第７巻、２１１５〜２１３５頁、１９７９年）。フィルターを、Ｂｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊ．，第３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８４年）によって記載された方法によって32Ｐ−標識したＲＭＰ特異的ヘプタデカマー混合物と交雑した。
【００５４】
フィルターの交雑と洗浄は４０℃で行い、次いでインテンシファイヤー・スクリーンを用いて２４時間オートラジオグラフィーを行った。ミニプレプ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）プラスミドＤＮＡは、標準的な方法（ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第７巻、１５１３〜１５２３頁、１９７９年）によって交雑するコロニーから単離し、ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列をＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第６５巻、４９９〜５６０頁、１９８０年）によって確立した。
【００５５】
ｐＲＭＰ１０１６は、ｍＲＮＡの５′未翻訳末端の部分を含み、次いで６９個の酸の長いプレプロ領域と３００個のアミノ酸をＲＭＰタンパクの成熟部分に暗号化する領域中に伸びていることを示した。ｐＲＭＰ１０１６はＲＭＰ ｍＲＮＡの完全な３′末端に対応するインサートを含まなかったので、ｃＤＮＡライブラリーをクローンｐＲＭＰ１０１６からの32Ｐニックが翻訳された３′特異的制限フラグメントで再度スクリーニングすることによって、クローンｐＲＭＰ２９３１を単離した。
【００５６】
このクローンは３′未翻訳領域の部分とＲＭＰタンパクのカルボキシ末端部分を暗号化する２７０個のトリプレットを有する開放読み込み枠を含む。それ故、ｐＲＭＰ１０１６およびｐＲＭＰ２９３１は著しくオーバーラップしており、２個のクローンの結合した配列は、Ｒ． ｍｉｅｈｅｉプレプロＲＭＰ ｃＤＮＡの配列を与える。１４１６個のヌクレオチドの総ては、ｃＤＮＡクローニング法から生成するＧ：Ｃテイルの間に配列した。
【００５７】
確立したＤＮＡ配列を図４および図５に、ＲＭＰへの前駆体の推定アミノ酸配列と共に示す。第４ａおよびｂ図では、水平線はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた合成オリゴ混合物の位置を示している。矢印は、元のＲＭＰの成熟において加工が起こる位置を示している。ヌクレオチドは開始Ｍｅｔコドンにおける第一の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟ＲＭＰにおける第一の残基から番号を付けている。
【００５８】
このｃＤＮＡ配列から、ＲＭＰは６９個のアミノ酸のプロペプチドで４３０個のアミノ酸の長い前駆体として合成されると結論することができる。この前駆体における推定上のシグナルペプチダーゼ加工部位（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１３３巻、１７〜２１頁、１９８３年）は、Ａｌａ（−４８）およびＡｒｇ（−４７）の間にあると考えられ、成熟ＲＭＰはＧｌｕ−１およびＡｌａ（＋１）の間での自動タンパク分解性開裂によって生成する。ＲＭＰのｃＤＮＡで推定したアミノ酸配列は、以前報告された部分的アミノ酸配列（ＢｅｃｈとＦｏｌｔｍａｎｎ，Ｎｅｔｈ−Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、２７５〜２８０頁、１９８１年）と良好に一致している。
【００５９】
ＲＭＰ ｃＤＮＡを用いて更に構成作業を促進するため、次のようにしてクローンｐＲＭＰ２９３１において同定されたＴＡＡ停止コドンに対して３′のＢａｎＩ部位にＨｉｎｄIII リンカーを挿入した。すなわち、２５μｇ ｐＲＭＰ２９３１をＰｓｔＩで消化してＲＭＰ ｃＤＮＡを得た。このインサートを１％アガロースゲル電気泳動法で精製し、ゲルから電気溶出し、フェノールおよびクロロホルム抽出によって精製し、ＮａＣｌおよびエタノールで沈澱させた。
【００６０】
ＲＭＰの３′半分を暗号化するこのフラグメントをＢａｎＩで消化し、ＢａｎＩ付着制限部位末端を４個のｄＮＴＰとＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントとの混合物で満たした。これらの満たした末端にＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応においてＨｉｎｄIII リンカーを加えた。連結反応混合物をフェノールとクロロホルムで抽出して、ＤＮＡを４Ｍ酢酸アンモニウム／エタノールで沈澱させた。
【００６１】
精製したＤＮＡを過剰量のＨｉｎｄIII 酵素で消化して、３８０bpフラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。ＲＭＰ開放読取り枠の３′末端とＴＡＡ停止コドンを含むこのフラグメントを、ＨｉｎｄIII で消化してアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＩＣ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有寒天プレート上で選択した。
【００６２】
プラスミドＤＮＡを形質転換体から精製し、正確な組換体を制限エンドヌクレアーゼ消化とアガロースゲル電気泳動法によって同定した。かかる正確な組換体、ｐＲＭＰ３′から、２１０bp ＢｇｌII／ＨｉｎｄIII フラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって単離した。このフラグメントはアミノ酸２９７〜２９９でＢｇｌII部位からのＲＭＰ ｃＤＮＡの３′末端を含み、ＴＡＡ停止コドン中を通って、挿入されたＨｉｎｄIII リンカーまで伸びている。
【００６３】
ＲＭＰ ｃＤＮＡの５′部分は、１％アガロースゲル電気泳動法によって９９７bp ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌIIとしてｐＲＭＰから単離した。ＨｉｎｄIII 部位は、プロセグメントにおいて残基−３６，−３５に対応する位置においてＲＭＰ−ＤＮＡ中に配置されている。９９７bp５′フラグメントをＨｉｎｄIII で消化してホスファターゼ処理したｐＩＣ１９Ｒ中で２１０bp３′フラグメントに連結した。
【００６４】
この連結混合物を用いて、組換体をＥ．ｃｏｌｉから得て、３′部分に結合したＲＭＰの５′部分を有する正確なプラスミドｐＲＭＰは制限酵素分析によって同定した。ｐＲＭＰの構成を図６に示す。ｐＲＭＰはＲＭＰプレ領域およびプロセグメントの５′半分を暗号化しない。
【００６５】
実施例４ 活性ＲＭＰを分泌するように設計したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
この実施例では、プラスミドをグルコアミラーゼプロモーター、シグナルおよびターミネーター配列の制御下にＲＭＰを発現するように設計して構成した。グルコアミラーゼプロモーターおよびターミネーター配列をベクターｐＣＡＭＧ９１でクローン化したグルコアミラーゼゲノム遺伝子から誘導した。ｐＣＡＭＧ９１の構成はＢｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，第３巻、１９８４年、１５８１〜１５８５頁）によって報告されており、プラスミドｐＣＡＭＧ９１のエンドヌクレアーゼ制限マップは図７に示す。
【００６６】
ｐＣＡＭＧ９１をＳａｌＩおよびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。上記消化物から、アガロースゲル上で６９８bpフラグメントを単離した。このＳａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントはグルコアミラーゼｍＲＮＡの１４０bp ３′未翻訳部分を暗号化する領域を含む。
【００６７】
この３′フラグメントはＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＸｂａＩリンカーの添加およびＸｂａＩ制限酵素での消化の前に制限部位を「ブラント・エンド」させた。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端をＸｂａＩで線形化したｐＵＣ１３に連結してグルコアミラーゼ遺伝子ポリ（Ａ）付加領域を含むプラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍを生成させた。ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成は、図８に示す。
【００６８】
Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端は、ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍからの７００bp ＸｂａＩフラグメントとして得た。このターミネーターフラグメントを、ＸｂａＩで消化してホスファターゼ処理したｐＩＲ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉから組換体が得られ、正確なプラスミドｐＩＣＡＭＧ／ＴｅｒｍであってｐＩＣ１９Ｒの多重クローニング部位のＨｉｎｄIII 部位に面するターミネーターフラグメントの５′末端を有するものは制限酵素分析によって同定した。
【００６９】
ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成を、図８に示す。ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍから、グルコアミラーゼターミネーター（ＡＭＧターミネーター）領域を１％アガロースゲル電気泳動法によって、７５０bp ＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ制限フラグメントとして単離した。ｐＣＡＭＧ９１から、グルコアミラーゼプロモーター（ＡＭＧプロモーター）を、グルコアミラーゼシグナルペプチドを暗号化する領域、ヘキサペプチド−プロセグメントおよび３．５kb ＣｌａＩ／ＢｓｓＨIIフラグメントとしてのｐＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）と共に、１％アガロースゲル電気泳動法によって単離した。
【００７０】
合成ＢｓｓＨII／ＨｉｎｄIII リンカーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製ＤＮＡ合成装置上で合成した２種類の合成３１マー・オリゴヌクレオチドから調製した。合成リンカーは下記の構造を有する。
【００７１】
【化４】
【００７２】
このリンカーを、３．５kbグルコアミラーゼプロモーターを含むフラグメントおよび７５０bpグルコアミラーゼターミネーターを含むフラグメントとの連結反応に用いた。連結混合物を用いてＥ． ｃｏｌｉを形質転換して、正確な組換体、ｐ６７３は制限エンドヌクレアーゼ消化によって同定した。単離したｐ６７３はＨｉｎｄIII クローニングベクターであり、この中に適当なＨｉｎｄIII ｃＤＮＡフラグメントをグルコアミラーゼヘキサペプチドプロセグメントおよびグルコアミラーゼ転写ターミネーター領域の間に挿入することができる。
【００７３】
挿入したｃＤＮＡはグルコアミラーゼプロモーターによって転写制御され、翻訳された融合生成物の分泌はグルコアミラーゼシグナルペプチドとグルコアミラーゼヘキサペプチドプロセグメントとによって指示される。ｐ６７３をＨｉｎｄIII で消化して、アルカリ性ホスファターゼで処理して、ｐＲＭＰの消化物から精製した１．２kb ＨｉｎｄIII と連結した。
【００７４】
連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、ＲＭＰを発現させるために正確な位置に挿入されたＲＭＰ ｃＤＮＡを有する組換体ｐ６８６は制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離されて特徴化された。ｐ６８６は以下の構造：グルコアミラーゼシグナルペプチド、グルコアミラーゼヘキサプロペプチド、ＲＭＰからのプロペプチドのアミノ酸−４５から−１、成熟ＲＭＰの３６１個のアミノ酸を有するＲＭＰ前駆体を暗号化する。ｐ６８６の構成を、図９に示す。
【００７５】
実施例５
本発明の好ましい態様では、プレプロＲＭＰの開放読取り枠を、Ａ．ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼ遺伝子またはＡ．ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターの制御下において発現プラスミドに挿入すべきである。これを行うために、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を、次の工程によってプレプロＲＭＰのシグナルペプチドの開始メチオニンコドンの５′に挿入した。
【００７６】
ｐＲＭＰ１０１６を、ｃＤＮＡにおいてアミノ酸残基Ｓｅｒ（−６６）およびＧｌｎ（−６５）に対応する位置で切断するＤｄｅＩと、ｃＤＮＡにおいてアミノ酸残基Ｌｙｓ（−３６）およびＬｅｕ（−３５）に対応する位置で切断するＨｉｎｄIII で消化した。精製する８９bp ＤｄｅＩ／ＨｉｎｄIII フラグメントを８％ポリアクリルアミドゲル上で精製し、フェノールおよびクロロホルム抽出の後電気溶出し、エタノール沈澱した。以下の配列を有する合成ＤＮＡフラグメントは、アプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成装置上で２個のオリゴヌクレオチドとして合成した。
【００７７】
【化５】
【００７８】
このフラグメントは、開始Ｍｅｔ−コドンに対してＢａｍＨＩ付着末端５′および３′末端にＤｄｅＩ付着末端を有する。これら２個のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキナーゼ化し、互いにアニーリングして、次いでＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII で消化した。ｐＵＣ１３ベクター中でｐＲＭＰ１０１６から精製した８９bp ＤｄｅＩ／ＨｉｎｄIII ＲＭＰフラグメントに連結した。
【００７９】
連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プラスミド上で制限酵素消化によって同定した。正確な組換えプラスミドを配列して、使用したオリゴヌクレオチドの配列を証明した。かかる正確なプラスミドｐＲＭＰ５′をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII で消化して、開始Ｍｅｔコドン、ＲＭＰシグナルペプチドおよびＲＭＰプロセグメントの部分を有する１１０bp ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII フラグメント１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。
【００８０】
このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルム抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭＰ開放読み込み枠の残りおよびＡＭＧターミネーター配列をＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄIII で部分消化した後プラスミドｐ６８６から得た。これによって、１．９kbフラグメントを放出し、このフラグメントをアガロースゲル電気泳動法、電気溶出フェノールおよびクロロホルム抽出の後、エタノールで沈澱させた。この１．９kbフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１３ベクター中で、ｐＲＭ５′からの１１０bp ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII に連結した。
【００８１】
この連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プラスミド上で制限酵素消化によって同定した。かかる正確な組換体は、ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍであった。ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍの構成を図１０に示す。
【００８２】
実施例６ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターによってＡ．ｏｒｙｚａｅ中で活性ＲＭＰを分泌するように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
グルコアミラーゼプロモーターを以下のようにして単離した。２５μｇのｐＣＡＭＧ９１をＥｃｏＲＩおよびＢｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼで消化した。
この二重消化の後、２７０bp ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって単離することができた。
【００８３】
このフラグメントは、プロモーター領域の一部分、５′未翻訳領域およびグルコアミラーゼ遺伝子（ＡＭＧ遺伝子）のシグナルペプチドをカバーする。アガロースゲルからＤＮＡを電気溶出した後、フラグメントをフェノールおよびクロロホルム抽出し、次いでエタノール沈澱することによって精製した。次いで、２７０bpの長いフラグメントをＳｆａＮＩで消化した。
【００８４】
この酵素は、グルコアミラーゼ遺伝子の開始ＡＴＧメチオニンコドンに対して５′に開裂部位を有する。完全に消化した後、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）および４個のｄＮＴＰ総てで処理して、ＤＮＡ上にブラントエンドを生成させた。このＤＮＡに、ＤＮＡリガーゼを有するＢｇｌIIリンカーを加えて、ＤＮＡをＢｇｌII制限酵素の過剰量で消化した。
【００８５】
１０％ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡフラグメントを分離した後、１７５bp ＢｇｌIIフラグメントを電気溶出によって単離することができた。このフラグメントは、開始メチオニンコドンに対して５′のＳｆａＮＩ制限部位に対応する位置に挿入されたＢｇｌIIリンカーを有する。このＤＮＡ切片をＢｇｌIIで消化したアルカリホスファターゼ処理したｐＩＣ１９Ｒベクターに連結して、この連結混合物を用いてＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。
【００８６】
生成する形質転換体の中で、正確なプラスミドをミニプレププラスミド上で制限酵素消化することによって同定した。かかる正確なプラスミドｐＢ４０４．１をＮｓｉＩおよびＢｇｌIIで消化して、グルコアミラーゼ遺伝子の５′未翻訳領域をプロモーター領域の３′部分の約１００bpと共に含む０．１６bpフラグメントを放出した。このフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。
【００８７】
このフラグメントをｐＣＡＭＧ９１からのグルコアミラーゼプロモーター領域の残りの部分に結合させるため、以下の工程を行った。２５μｇのｐＣＡＭＧ９１をＢｓｓＨIIで消化した後、更にＮｄｅＩで部分的に消化した。フラグメント末端を４個総てのｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで満たした後、１．４kb ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で単離した。
【００８８】
このフラグメントは、総てのプロモーター領域を５′未翻訳領域およびシグナルペプチド暗号化領域と共に含んでいた。このフラグメントを電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって、ＤＮＡを濃縮した。ＮｓｉＩで消化した後、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で流して、１．２kb ＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメントを電気溶出によって単離した。
【００８９】
このＤＮＡは上記反応でＮｄｅＩ部位にブラントエンドを生じ、これをＮｒｕＩ−ＢｇｌIIで消化したｐＩＣ１９Ｒベクター中でのｐＢ４０１．１からの０．１６kb ＮｓｉＩ−ＢｇｌIIフラグメントに連結させた。連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。上記の正確な組換体、ｐＢ４０８．３をＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIで消化して、グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）プロモーターを１％アガロースゲル上で１．４kbフラグメントとして単離した。
【００９０】
このフラグメントを電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱した。このグルコアミラーゼプロモーターフラグメントを次に、ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクター中のｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２．０ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。
【００９１】
上記の正確な組換体の一つｐ７７８を大規模に成長させて、組換えプラスミドを単離して、プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって精製した。このプラスミドをグルコアミラーゼプロモーターおよびターミネーター配列の制御下においてＲＭＰの合成を指示する。ｐ４０８．３の構成を図１１に示し、ｐ７７８の構成を図１２に示す。
【００９２】
実施例７ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターによる活性ＲＭＰを分泌させるように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼゲノム遺伝子を含むプラスミドｐＴＡＫＡ １７（実施例２を参照されたい）５０μｇをＳａｌＩで消化した。この酵素は、成熟ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミノ酸残基２６に対応する位置においてゲノムＤＮＡでの制限部位を有する。
【００９３】
もう一つのＳａｌＩ制限部位はこの位置に対して約１３００個のヌクレオチドだけ上流の、上流プロモーター領域の５′末端に配設される。ＳａｌＩ消化の後、この１３００bpプロモーターを含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって精製し、ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。次いで、ＤＮＡをエクソヌクレアーゼIII 緩衝液中に溶解して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法に従ってエクソヌクレアーゼIII で消化した。
【００９４】
反応を停止して、それぞれのＤＮＡ末端において約１３０bpの欠失を得た。この方法ではＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子の暗号か領域のＳａｌＩ部位からの約１３０bpの欠失は、開始メチオニンコドンの上流に多重クローニング部位リンカーを導入する機会を生じる。エクソヌクレアーゼIII で処理したＤＮＡを、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法に従ってＳ１ヌクレアーゼIII で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出した後エタノールで沈澱した。
【００９５】
Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＤＮＡを補修して連結可能なブラントエンドを得ることは、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法に従って、４個のｄＮＴＰ総てとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて行った。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、１３００bp ＳａｌＩフラグメントで切断して、２群のフラグメントを生成した。一つの群は約３８０bpの長さであり、蒸溜領域を表わしたが、他の群は６２０bpの長さであり、プロモーター領域を含んでいた。
【００９６】
ＥｃｏＲＩ消化生成物のこれらの群をアガロースゲル上で分離して、約６２０bpの長さのＤＮＡフラグメントを電気溶出して、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結混合物を用いて、競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、組換体から、ミニプレププラスミドＤＮＡを単離した。これらの欠失変異株を制限酵素消化によって特徴化して、開始メチオニンコドンに対して５′の欠失末端を有するプラスミドを同定した。
【００９７】
所望な特徴を有する数個の候補を配列させ、ＡＴＧ−メチオニンコドンにおけるＡに対して９bpを欠失した５′を有する変異株（ｐ９）を選択して、更に構成した。ｐ９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消化して、フラグメントを含む６４５bp ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターをアガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によって単離した。
【００９８】
ｐＴＡＫＡ １７をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーター上流領域を含む５１０bpフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によって単離した。これらの２個のプロモーター領域を互いに連結させ、且つＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII で消化したＩＣ１９Ｒベクターに連結させた。
【００９９】
連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、正確な組換体を、ミニプレプとして抽出されたプラスミドを制限酵素で消化することによって同定した。かかる組換体の一つｐ７１９では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターフラグメントは、多数の各種制限酵素消化液によって削除することができる１．１kbの移動可能なフラグメントとして見出されている。ｐ７１９の構成を図１３に示す。
【０１００】
ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍから、プレプロＲＭＰ開放読取り枠およびグルコアミラーゼターミネーター領域（ＡＭＧＴｅｒｍ）を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後２kbフラグメントとして単離した。このフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、次いでフェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によって精製した。
【０１０１】
Ａ． ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼからのプロモーターを、ｐ７１９をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した後に得られる１．１kbフラグメントとして単離した。このフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出、次いでエタノールでの沈澱によって精製した。１．１kbプロモーターフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクターにおいてｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２kb ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。
【０１０２】
連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する組換体から、正確な組換体を、ミニプレププラスミドを制限酵素で消化することによって同定した。かかる正確な組換体の一つｐ７７７を大規模に成長させて、組換えプラスミドを単離し、プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって精製した。ｐ７７７の構成を図１４に示す。
【０１０３】
実施例８ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターの制御下によるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼを分泌させるように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリパーゼｃＤＮＡクローンの構成および同定
特異的オリゴヌクレオチドプローブを構成させることができる情報を得るため、精製したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，第２５巻、１９７７年、１１４６〜１１５０頁）について部分配列を決定した。
【０１０４】
以下の説明では、ＲＭＬという略号をＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼについて用いた。菌糸体および低分子量物質を除去したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの培養液からの上澄液を、陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。カラムからの主要な脂肪分解性分画を、凍結乾燥する前に脱塩および限外濾過した。次いで、凍結乾燥した粉末を、親和性クロマトグラフィーに付した。
【０１０５】
カラムからの貯蔵したリパーゼ分画を脱塩して、限外濾過によって濃縮した。
次いで、この濃縮液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に付して、ＨＩＣ−精製からのリパーゼを用いてアミノ酸配列を決定した。配列の決定は、元の酵素（Ｎ−末端配列）およびリパーゼをＡｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａプロテアーゼを用いてタンパク分解性消化を行った後に得られる選択されたフラグメントの両方について行った。配列の決定は、Ｔｈｉｍ，Ｌ．ら、（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８７年、印刷中）によって報告されたのと同じ方法でGas Phase Sequencer (Applied Biosystems Model ４７０Ａ）で行った。
【０１０６】
ＲＭＬを、酵素の基質に対する比率を１：４０（モル：モル）としたことを除いてＭｏｏｄｙら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第１７２巻、１９８４年、１４２〜１４８頁）によって報告されたのと同じＡｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａプロテアーゼを用いて消化した。得られたフラグメントをＨＰＬＣによって分離して、ＵＶ吸収を２８０nmおよび２１４nmで観察した。
オリゴヌクレオチドプローブの構成のための好適なフラグメントを同定するには、これらのフラグメントはＴｒｙおよび／またはＴｙｒを含むので、２８０nmおよび２１４nmの間で高い比率を示したペプチドのみを配列した。
以下のＮ−末端配列が、元のＲＭＬを使用することによって見出された。
【０１０７】
【化６】
【０１０８】
タンパク分解性消化液から単離されたフラグメントの一つは、配列 Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Try-Asp-X-Ile-Hisを有し、このフラグメントを特異的オリゴヌクレオチドプローブの合成に用いた。
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのアスパラギン酸プロテイナーゼ（ＲＭＰ）組換体を単離するために構成された実施例３からの上記生物のｃＤＮＡライブラリーも用いてリパーゼに特異的な組換体を同定した。オリゴヌクレオチドの混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製ＤＮＡ合成装置で合成した。
【０１０９】
【化７】
【０１１０】
を有する混合物は、アミノ酸 Gly-Ala-Thr-Trp-Aspを暗号化する領域においてＲＭＬ ｍＲＮＡに相補的であった。このペンタペプチドは、精製したＲＭＬタンパクのタンパク分解性フラグメントから得られるアミノ酸配列のセグメントとして同定された（上記参照）。
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーを、ＲＭＰ特異的混合物でスクリーニングするのに記載した方法と同様にして３２Ｐ−キナーゼしたリパーゼオリゴヌクレオチド混合物でスクリーニングした。交雑およびフィルターの最初の洗浄は、４３℃で行った。オートラジオグラフィーの後、フィルターを４７℃で洗浄した。
【０１１１】
強力な交雑を示したコロニーを単離して、対応するプラスミドにおいて挿入されたｃＤＮＡを配列してＲＭＬ特異的組換体を同定した。かかる２個の組換体ｐ３５３．７およびｐ３５３．１６は、約１．２kbのインサートを有した。これらの２種類の組換体から得られるＤＮＡ配列は、シグナルペプチドの中央で開始し、ポリＡテイルにまで伸びている。
【０１１２】
この領域では、長い開放読取り枠を同定できた。２個の組換え体は、開始メチオニンコドンを有するシグナルペプチドの５′部分についての配列を含まないので、合成オリゴヌクレオチド（５８４）
5′CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3′ 584
を合成した。このオリゴヌクレオチド５８４は、ポリペプチド領域で見られるアミノ酸配列
Pro-Pro-Leu-Ile-Pro-Ser-Arg
を暗号化する領域におけるＲＭＬ ｍＲＮＡに相補的である。
【０１１３】
オリゴ５８４をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて高い比活性にまでキナーゼ処理した後、記載された方法（Ｂｏｅｌ，Ｅ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，第８０巻、２８６６〜２８６９頁、１９８３年）によって、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｍＲＮＡでのＡＭＶリバース・トランスクリプターゼとのプライマー伸長反応に用いた。プライマー伸長反応生成物を１０％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で電気泳動して、２個のｃＤＮＡ生成物を分割した。
【０１１４】
これらの２個のｃＤＮＡ、すなわち一つは１５０個のヌクレオチドの長さであり、もう一方は１６０個のヌクレオチド長さのものを、両方とも電気溶出し、ＤＮＡ配列のための化学的分解法によって配列した。両者のｃＤＮＡはプライマー領域から伸びており、開始メチオニンコドンに対して位置９のヌクレオチド５′までの読取り可能な配列を生じた。この配列は、リパーゼ組換えｃＤＮＡプラスミドから得られた配列であることを示した。
【０１１５】
２個のプライマー伸長ｃＤＮＡ生成物の長さは、リパーゼｍＲＮＡの５′末端（ＣＡＰ−部位）が図１５に示した第一のＡヌクレオチドに対して約５または１５ヌクレオチド５′に配列される。菌類からのｍＲＮＡの５′末端の位置におけるマイクロヘテロゲナイェティは、極めて一般的である。２個のクローン化したｐ３５３．７およびｐ３５３．１６から得られる配列をプライマー伸長分析からの配列と結合することにより、ＲＭＬ前駆体のアミノ酸配列を確立することができる。
【０１１６】
ＤＮＡ配列およびＲＭＬ前駆体の対応するアミノ酸配列を図１５に示す。図１５では、水平線はｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡライブラリースクリーニングに用いられた合成オリゴの位置を示している。矢印は、元のＲＭＬの成熟において加工が起こる位置を示す。ヌクレオチドは、開始Ｍｅｔコドンでの最初の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟した元のＲＭＬにおける最初の残基から番号を付ける。
【０１１７】
ＲＭＬを開始Ｍｅｔコドンから伸びている開放読み込み枠によって暗号化し、次いで停止コドンに達する前に３６３コドンを通る。この前駆体では、最初のアミノ酸残基は、典型的な疎水性シグナルペプチドから成る。ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１１３巻、１７〜２１頁、１９８３年）の生産則によれば、シグナルペプチドは、それぞれ、位置−７１および−７０でのＡｌａ−およびＶａｌ残基の間のシグナルペプチダーゼ開裂によって以下のプロペプチドから開裂する。
【０１１８】
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからの培養液の上澄みから得られる精製ＲＭＬのＮ末端アミノ酸配列分析は活性ＲＭＬ酵素のＮ末端として Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Argを同定したので、ＲＭＬ前駆体のプロペプチドは前駆体における次の７０個のアミノ酸残基から成っていた。このＮ末端Ｓｅｒ残基から始めて、成熟ＲＭＬは停止コドンに達するまでに２６９個の残基を通って伸びる。
【０１１９】
この成熟２９５００ダルトン酵素では、リパーゼ基質結合部位は、多数のリパーゼに保存されている残基Ｓｅｒ（１４４）の付近に配置される。ＲＭＬ ｍＲＮＡの３′末端では、１０４個のヌクレオチドがＴＡＡ停止コドンとポリ（Ａ）テイルとの間の未翻訳領域として配置された。このポリ（Ａ）テイルに対して２３ヌクレオチド５′では、７ＡＴ塩基対から成る反復構造が見出されたが、典型的な真核生物のポリアデニル化シグナルは同定されなかった。
【０１２０】
本発明の好ましい具体例では、ＲＭＬ ｃＤＮＡについて多くの変更を行った。これらの変更は、開放読み込み枠に対して制限エンドヌクレアーゼ部位５′および３′をクローニングおよび付加の際に、ｃＤＮＡに加えたＧ：Ｃテイルの除去を含む。多くの好都合な制限部位も、ｃＤＮＡのシグナルペプチドおよびプロペプチド領域に導入された。
ｐ３５３．１６をＦｎｕＤIIで消化して、アガロースゲル電気泳動によって８８０bp ＤＮＡフラグメント（ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末端）を単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。
【０１２１】
ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末端を次いでＳａｍＩで消化し且つアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結反応を用いて、競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製した形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。
一つのかかる好適な組換体ｐ４３５．２をＢａｎIIおよびＨｉｎｄIII で消化し、０．６９kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭＬ ｃＤＮＡのフラグメントは、３′未翻訳領域に結合したｐＵＣ１９多重クローニング部位の主要部分を有していた。
【０１２２】
ＲＭＬ ｃＤＮＡの５′末端を、合成オリゴヌクレオチドを用いて再設計して、好都合な制限部位を導入した。合成フラグメント（ＲＭＬ５′）のＤＮＡ配列を図１８に示す。導入した制限部位の位置および個々に合成したオリゴヌクレオチドの結合部位を水平線乃至垂直／水平線によって示す。精製するフラグメント（ＲＭＬ５′）を２％アガロースゲル上で１５０bpフラグメントとして精製し、電気溶出し、フェノールおよびＣＨＣｌ3 で抽出し、更に連結反応を行う前にエタノールで沈澱した。
【０１２３】
ｐ３５３．７をＢａｎＩおよびＢａｎIIで消化して、３８７bp ＲＭＬフラグメントを１０％ポリアクリルアミド電気泳動法によって精製した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出した後、エタノール沈澱をして、次いで合成ＲＭＬ５′フラグメントおよびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII で消化したｐＵＣ１３ベクターにおいてｐ４３５．２からの０．６９kb ＢａｎII／ＨｉｎｄIII フラグメントに連結した。
【０１２４】
連結反応を用いて、競合するＥ． ｃｏｌｉを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化することによって同定した。一つのかかる正確な組換体ｐＢ５４４では、合成部分を配列して予想した構造を確認した。ｐＢ５４４の構成を図１６に示す。ｐＢ５４４からプレプロＲＭＬ ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法によって、１．２kb ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
【０１２５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子からのターミネーターに基づく発現ベクターを、以下のようにして調製した。ｐ７１９（実施例７参照）刃ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した。生成する１．１kb ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって精製した。ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍ（実施例４参照）は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【０１２６】
生成する０．７５kb ＴＡＫＡ−アミラーゼターミネーターフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって精製した。フェノールおよびクロロホルム抽出の後、これらの２種類のフラグメントをエタノールで沈澱し、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結反応を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化することによって同定した。一つのかかる正確な組換体ｐ７７５をＢａｍＨＩで消化して、アルカリ性ホスファターゼで処理した。
【０１２７】
ｐＢ５４４からの１．２kb ＢａｍＨＩ ＲＭＬプレプロｃＤＮＡフラグメントをこのｐ７７５ベクターに連結して、Ｅ． ｃｏｌｉ中に形質転換した。プロモーターとターミネーターとの間で正確な位置に挿入されたＲＭＬプレプロｃＤＮＡを有する組換えｐ７８７を、Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体から抽出したミニプレププラスミド上で制限酵素による消化によって同定した。ｐ７８７プラスミドＤＮＡを大規模に成長させて、プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって精製した。ｐ７８７の構成を図１７に示す。
【０１２８】
実施例９ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの形質転換（一般的処理法）
１００mlのＹＰＤ（sherman ら、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, １９８１年）にＡ．ｏｒｙｚａｅ，ＩＦＯ ４１７７またはそのａｒｇＢ変異株の胞子を接種して、振盪しながら３７℃で約２日間培養した。ミラクロスを通して濾過することによって菌糸を回収して、０．６ＭのＭｇＳＯ4 ２００mlで洗浄した。
【０１２９】
菌糸を１５mlの１．２ＭのＭｇＳＯ4 ，１０mMのＮａＨ2 ＰＯ4 ，pH＝５．８に懸濁させた。懸濁液を氷で冷却し、ＮｏｖｏｚｙｍR ２３４、バッチ１６８７を１２０ml含む緩衝液１mlを加えた。５分後、１mlの１２mg／ml ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ２５型）を加えて、緩やかに撹拌しながら１．５〜２．５時間３７℃でインキュベーションし、顕微鏡下で検討した試料中において多数の原形質体が観察されるようになるまで継続した。
【０１３０】
懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌チューブに移して、５mlの０．６Ｍソルビトール、１００mMトリス−ＨＣｌ，pH＝７．０を積層した。
１０００ｇで１５分間遠心分離を行い、原形質体をＭｇＳＯ4 クッションの上部から収集した。２容量のＳＴＣ（１．２Ｍのソルビトール、１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH＝７．５，１０mMのＣａＣｌ2 ）を原形質体懸濁液に加えて、混合物を１０００ｇで５分間遠心分離した。原形質体ペレットを３mlのＳＴＣに再懸濁して、再度成型した。これを繰り返した。最後に、原形質体を０．２〜１mlのＳＴＣに再懸濁した。
【０１３１】
１００μｌの原形質体分散液を５〜２５μｇの適当なＤＮＡを１０μｌのＳＴＣに懸濁したものと混合した。ａｒｇＢ株からの原形質体をｐＳａｌ４３ＤＮＡ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子を担持するプラスミド）およびａｒｇＢ+ 株からの原形質体をｐ３ＳＲ２（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子を担持するプラスミド）と混合した。
【０１３２】
混合物を室温で２５分間放置した。０．２mlの６０％ＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５７６），１０mMのＣａＣｌ2 および１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH＝７．５を加えて、注意深く混合し（２回）、最後に０．８５mlの上記溶液を加えて、注意深く混合した。混合物を室温で２５分間放置し、２５００ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを再度２mlの１．２Ｍソルビトールに懸濁した。もう一回沈降させてから、原形質体を適当なプレートに塗布した。
【０１３３】
ｐＳａｌ４３で形質転換したａｒｇＢ株からの原形質体を炭素および窒素源として、それぞれグルコースおよび尿素を有し且つ浸透圧安定のために１．２Ｍソルビトールを含む最少限のプレート（Ｃｏｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に拡げた。
【０１３４】
ｐ３ＳＲ２で形質転換したａｒｇＢ+ 株からの原形質体を、１．０Ｍスクロース、pH＝７．０、窒素源として１０mMのアセタミド、およびバックグラウンド成長を抑制する２０mMのＣｓＣｌを含む最少限のプレート（Ｃｏｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に塗布した。３７℃で４〜７日間インキュベーションした後、胞子を回収して、滅菌水に懸濁し、塗布して単一コロニーとした。この処理法を繰り返して、２回の再分離の後、単一コロニーの胞子を定義した形質転換体として保存した。
【０１３５】
実施例１０ 野生型Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＴＡＫＡ−アミラーゼの発現
ｐＴＡＫＡ １７を、実施例９に記載したようにＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｍｄＳ遺伝子を含むｐ３ＳＲ２で共形質転換することによって、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ４１７７中に形質転換した。上記のように調製した原形質体を等量のｐＴＡＫＡ １７およびｐ３ＳＲ２であってそれぞれ約５μｇを用いた混合物とインキュベーションした。単一窒素源としてアセタミドを用いることができる９個の形質転換体を、２回再度単離した。
【０１３６】
ＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎら、１９８１年）上で３日間成長させた後、培養液上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを、コマージー・ブリリアント・ブルーＲで染色した。最良の形質転換体は、形質転換していないＩＦＯ ４１７７の１０〜２０倍のアミラーゼを生成した。一つの形質転換体を更に研究するために選択して、２リットルＫｉｅｌｅｒ醗酵装置中で４％大豆ミール上で成長させ、成長中にグルコースを供給した。醗酵中に、培養液を激しく撹拌した。
【０１３７】
これらの条件下では、ＩＦＯ ４１７７は約１ｇ／ｌを生じ、形質転換体は酵素活性として測定したところ約１２ｇ／ｌのアミラーゼであった。酵素活性を澱粉を分解する能力として測定した（Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１６巻、１９３９年、７１２〜７２３頁）。使用した澱粉はＭｅｒｃｋ Ａｍｙｌｕｍ ｓｏｌｕｂｉｌｅｅｒｇ Ｂ．６であり、分析はpH４．７および３７℃で行った。外部からβ−アミラーゼを加えなかった。
【０１３８】
実施例１１ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＲＭＰの発現
実施例７からのｐ７７７または実施例６からのｐ７７８を、実施例９に記載の処理法によってｐ３ＳＲ２と共に共形質転換することによってＩＦＯ−４１７７中へ形質転換した。形質転換体を選択して、実施例９に記載のように再度単離した。
【０１３９】
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡを行って分析した。ｐ７７７およびｐ７７８からの形質転換体の上澄液は、ＲＭＰ抗体と反応するタンパク５０〜１５０mg／ｌを含んでいた。プロテイナーゼは、Ｒ． ｍｉｅｈｅｉで生成したプロテイナーゼと比較して過剰にグリコシル化した。２つの形状のうち、一方はプロ型であり、他方は加工された成熟プロテイナーゼであると思われた。
【０１４０】
ｐ７７８の２種類の形質転換体およびｐ７７７の３種類の形質転換体を、上記ＴＡＫＡ−アミラーゼ形質転換体と同様に醗酵装置中で成長させた。ｐ７７８の２種類の形質転換体は、Ｋｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊｏｕｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，第１８巻、１９３５年、４５９〜４６６頁）によるミルク凝固活性として測定したところ、約０．２ｇ／ｌおよび０．４ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、ｐ７７７の３種類の形質転換体は約０．５ｇ／ｌ，２．４ｇ／ｌおよび３．３ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、組換えＲＭＰの特異的活性はＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの活性と同じであると考えられた（これについては、後で確認した）。
【０１４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＤＡ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡを行ったところ、大規模で培養する場合には、１つの形状のＲＭＰのみが存在することが判った。ＲＭＰはこれらの成長条件下でも、過剰にグリコシル化した。ゲル上にみられるタンパクの量は、酵素活性から予測された量とよく相関を有した。
【０１４２】
ＲＭＰを親和性クロマトグラフィーおよび寸法排除クロマトグラフィーによって培養液の上澄みから精製した。
精製した組換えＲＭＰのＮ−末端配列を、Ｔｈｉｍら（ＴＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８７年、印刷中）によって報告されたのと同様に気相配列装置を用いて、測定した。
【０１４３】
組換えＲＭＰの２つの形状はＮ−末端における加工が不均一であることを示した。一つの形状はAla-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-のＮ−末端配列を有し、もう一方はGly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-のＮ−末端配列を有した。
Ｎ−末端でのかかる不均一加工も、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからの元のＲＭＰについて記載されている（Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．ら、Ｎｅｔｈ．Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、１９８１年、３５８〜３６０頁）。組換えＲＭＰの不均一加工は元のＲＭＰの不均一加工と良好な相関を有し、Ａ．ｏｒｙｚａｅは本発明によれば正確な領域で組換えＲＭＰを加工することができることが判った。
【０１４４】
実施例１２ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるプロキモシンの産生に就いての発現単位の構成
この構成は、Ａ．ｏｒｙｚａｅアミラーゼプロモーターの制御下でＡ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのシグナルペプチド配列がすぐ先行するプロキモシン遺伝子を含む。この構成は更に、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子とＥ．ｃｏｌｉ複製体からのターミネーターを含む。
ｐ２８５′ｐｒｏＣ（実施例１参照）からの約４３０bp ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩフラグメントおよび以下の配列
【０１４５】
【化８】
【０１４６】
を有する合成オリゴマーをＥｃｏＲＩ−ＸｍａＩ切断ｐＵＣ１９プラスミド中に挿入して、プラスミドｐＴｏＣ５０ａを生成した。
ｐＴｏＣ５０ａをＥｃｏＲＩ−ＳａｃIIで切断し、ｐＵＣ１９を含む大きなフラグメントとプロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の５′部分を単離した。このフラグメントをｐＴＡＫＡ １７からの０．６kb ＥｃｏＲＩ−ＢａｎＩフラグメントおよび以下の合成オリゴマーと連結した。
【０１４７】
【化９】
【０１４８】
形質転換の後、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子（プレＴＡＫＡ）からのシグナル配列に融合し且つ約５００bp上流のＴＡＫＡ−アミラーゼ配列が先行するプロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の５′部分を含むプラスミドｐＴｏＣ５１を単離した。ｐＴｏＣ５１の構成を図１９に示す。
【０１４９】
ｐＲ２６をＨｉｎｆＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび４個のｄＮＴＰの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、ＸｍａＩで切断した。プロキモシン遺伝子の３′末端を含む７５０bpフラグメントを単離した。このフラグメントの３′末端でのＨｉｎｄIII を挿入するために、ｐＵＣ９をＸｍａＩ／ＨｉｎｃIIで切断して、大きなフラグメントをプロキモシン遺伝子の３′末端を含む７５０bpフラグメントに連結した。
【０１５０】
ｐＴＡＫＡ １７からの５．６kb ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメントを単離して、同じプラスミドからの２．６kb ＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントおよびＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子ターミネーターおよびポリＡ部位を含むｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍ（実施例４参照）からの０．７kb ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII と連結した。生成するプラスミドはｐＴｏＣ５２として図２０に示す。
【０１５１】
ｐＴｏＣ５２をＨｉｎｄIII で切断し、ＥｃｏＲＩで部分的に切断し、６．４kbフラグメントを単離した。これをｐＴｏＣ５１からの０．９kb ＥｃｏＲＩ−ＸｍａＩフラグメントおよびプロキモシン遺伝子（′プロキモシン）の３′部分を含むｐＵＣ９′ＰＣからの０．７kb ＸｍａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントと連結した。生成するプラスミドはｐＴｏＣ５６と呼ばれ、図２０に示す。
【０１５２】
実施例１３ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるプロキモシンの発現
ｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ遺伝子）またはｐＳａｌ４３（ａｒｇＢ遺伝子）と共形質転換することによって、ｐＴｏＣ５６をＡ．ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ４１７７またはａｒｇＢ変異株に形質転換した。選択的培地で成長する形質転換体を、実施例９と同様に２回再度単離した。
【０１５３】
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄液のプロキモシン含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後Ｗｅｓｔｅｒｎブロット上でＥＬＩＳＡによって分析した。形質転換体は、上澄液中に１〜１０mg／ｌのプロキモシンの寸法免疫反応性タンパクを産生した。他の免疫反応性タンパクは上澄液中に検出されなかった。
【０１５４】
実施例１４ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＲＭＬの発現
実施例８からのｐ７８７を、実施例９に記載の方法によってｐ３ＳＲ２で共形質転換することによってＩＦＯ−４１７７中に形質転換した。形質転換体を実施例９と同様に選択して、再度単離した。
３日間成長させた形質転換体のＹＰＤ培養液からの上澄液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎブロットおよびＥＬＩＳＡを行って分析した。最良の形質転換体は、タンパク１リットル当り２mgの成熟ＲＭＬの寸法を産生した。上澄液におけるリパーゼ活性を、トリブチリンを開裂する能力として計測した（ＮＯＶＯ法ＡＦ ９５．１／３−ＧＢ）。
この測定によって上澄液に２mg／ｌの活性リパーゼが存在することが判った。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターおよび上流プロモーター領域のＤＮＡ−配列を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＡＫＡ １７のエンドヌクレアーゼ制限マップを示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣの構成を示す図である。
【図４】図４は、３文字省略によって与えられる推定アミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼのＤＮＡ配列を示す図である。
【図５】図５は図４の続きの図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＲＭＰの構成を示す図である。
【図７】図７は、プラスミドｐＣＡＭＧ９１のエンドヌクレアーゼ制限マップを示す図である。
【図８】図８はプラスミドｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドｐ６８６の構成を示す図である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍの構成を示す図である。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＢ４０８．３の構成を示す図である。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＢ７７８の構成を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＢ７１９の構成を示す図である。
【図１４】図１４は、プラスミドｐ７７７の構成を示す図である。
【図１５】図１５は、３文字省略によって与えられる推定アミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼｃＤＮＡの配列を示す図である。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＢ５４４の構成を示す図である。
【図１７】図１７は、プラスミドｐ７８７の構成を示す図である。
【図１８】図１８は、合成フラグメントＲＭＬ５′のＤＮＡ配列を示す図である。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＴｏＣ５１の構成を示す図である。
【図２０】図２０は、プラスミドｐＴｏＣ５６の構成を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明はアスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）による異種タンパク生成物の分泌生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日までに、組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドまたはタンパクを生産するため数多くの方法が開発されてきた。主な興味は細菌および酵母に集中されてきたのであり、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は例えば発現および選択系に関して詳細に特徴化されているものである。
【０００３】
上記の微生物のほかに、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のような糸状菌は、詳細に特徴化されている組換えＤＮＡベクター用の宿主微生物として有望な候補であり、酵素を商業的に生産するのに広範囲に用いられている微生物である。形質転換された宿主微生物から形質転換細胞を選択できる選択マーカーが用いられる形質転換系の開発に、特に努力が集中されてきた。
【０００４】
過去数年間にアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の形質転換のための各種選択マーカーが報告され、菌の細胞分化を制御する遺伝学的および分子学的方法を研究する目的で糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの組込み形質転換の手法が近年になり開発されてきた。
【０００５】
Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａｐｙｒ−４遺伝子（Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第１１２巻、（１９８３年）、２８４〜２８９頁）、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ遺伝子（Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２０５〜２２１頁）、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，第８１巻、（１９８４年）、１４７０〜１４７４頁）およびＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子（Ｊｏｈｎ，Ｍ．Ａ．およびＰｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，第６巻、（１９８４年）３８６〜３８９頁）を含むプラスミドを用いて説明されてきた。形質転換するＤＮＡは、比較的低い頻度（典型的には１０００個未満の形質転換体／１μｇのＤＮＡ）で宿主ゲノムに組込まれることが分かった。
【０００６】
ごく最近に、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子を用いるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換が報告され（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．とＨｙｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第４巻、（１９８５年）、４７５〜４７９頁）、ａｍｄＳは単一の窒素源としてのアセタミド上では強力には成長できないＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換に使用される有力な選択マーカーであることが示された。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｒｇＢ遺伝子を用いるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換も、最近報告された（Ｂｕｘｔｏｎ，Ｆ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおける異種タンパクの発現のための系は、主として、この菌における遺伝子発現の制御法が十分には知られておらず且つクローニングベクター上に好適な選択可能な遺伝子マーカーが欠如していることにより、これまでは開発されなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段、発明の作用および効果】
本発明によれば、上記の形質転換技法を用いて、異種タンパクを高水準で発現させまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおける同種タンパクの産生を増進させることができる。
本明細書において用いられる「異種タンパク」という表現はＡ． ｏｒｙｚａｅによっては産生されないタンパクを意味し、一方「同種タンパク」という表現はＡ． ｏｒｙｚａｅ自体によって産生されるタンパクを意味する。
【０００９】
更に具体的には、Ａ． ｎｉｇｅｒおよびＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換に用いたマーカー遺伝子を使用することによって、所望なタンパク生成物を暗号化するＤＮＡで形質転換したＡ． ｏｒｙｚａｅ株の選択が可能である。これら前者の菌類とＡ． ｏｒｙｚａｅとの系統発生的距離（Ｒａｐｅｒ，Ｋ．Ｂ．およびＦｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｉ．，（１９６５年）Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のために、これはまったく予知されないものであった。
【００１０】
本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、具体的にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒにおけるタンパク生成物の発現に極めて効果的なプロモーターであって、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターまたは任意に上流活性化配列が先行する上記プロモーターの機能的部分として特徴化されるものを提供する。
【００１１】
使用した形質転換法は、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換法の変法（Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第１１２巻、（１９８３年）、２８４〜２８９頁、Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２０５〜２２１頁）、Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，第８１巻、（１９８４年）、１４７０〜１４７４頁）およびＡ．ｎｉｇｅｒの形質転換についてのＢｕｘｔｏｎらの方法、（Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）に類似の方法であった。本発明の方法では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅは、宿主株のゲノム中に組込むことができるが、形質転換前は宿主株に有しない選択マーカーを含むベクター系で形質転換される。
【００１２】
好ましい選択マーカーはａｒｇＢ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｎｉｇｅｒ）、ｔｒｐＣ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ａｍｄＳ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはｐｙｒ４（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）遺伝子、またはＤＨＦＲ（ジヒドロフォレートレダクターゼまたはその変異株）遺伝子である。更に好ましい選択マーカーはａｒｇＢまたはａｒｍＳ遺伝子である。野生型Ａ． ｏｒｙｚａｅ株は通常はａｒｇＢ+ である（すなわち、ａｒｇＢ遺伝子がＡ． ｏｒｙｚａｅにおいて機能的である）。
【００１３】
ａｒｇＢを選択マーカーとして選択する場合には、このマーカーに対して遺伝子に欠損を有するＡ． ｏｒｙｚａｅのａｒｇＢ変異株を宿主株として用いなければならない。Ａ． ｏｒｙｚａｅのａｒｇＢ変異株はＦ．Ｐ．Ｂｕｘｔｏｎらが報告したのと同様にして調製することができる（Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）。ａｒｇＢ変異株はオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子に欠損を有する変異株として定義される。他方、ａｍｄＳ遺伝子は、野生型Ａ． ｏｒｙｚａｅ株がこの遺伝子を含まないので、この野生株の形質転換の選択マーカーとして用いることができる。
【００１４】
遺伝子配列を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列は、典型的にはプロモーター、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルである。
当業界において周知のように上流活性化配列およびエンハンサー配列が先行することのあるプロモーターはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおいて強力な転写活性を示すことができる如何なるＤＮＡ配列であってもよく、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよび解糖酵素のような細胞外および細胞内タンパクのいずれをも暗号化する遺伝子から誘導することができる。
【００１５】
好適なプロモーターはＡ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼについての遺伝子から誘導することができる。解糖酵素の遺伝子からのプロモーターの例は、ＴＰＩ，ＡＤＨおよびＰＧＫである。
【００１６】
本発明による好ましいプロモーターは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターである。ＴＡＫＡアミラーゼは周知のα−アミラーゼ（Ｔｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，第５８巻、シリーズＢ（１９８２年）、２０８〜２１２頁）である。プロモーター領域を暗号化するＤＮＡは、ＴＡＫＡ−アミラーゼゲノム性クローンから誘導した。プロモーターおよびプロモーターの上流の領域の配列を、プレ領域およびＴＡＫＡ−アミラーゼについての構造遺伝子の５′末端と共に図１に示す。
【００１７】
実施例２に更に詳細に説明されるように、プレ領域およびプロモーターおよび上流活性化配列を含むＴＡＫＡ−アミラーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍから誘導され、ＢａｍＨＩを消化したｐＢＲ３２２に挿入されて、プラスミドｐＴＡＫＡ １７を生成した（図２を参照されたい）。ｐＴＡＫＡ １７ Ａ． ｏｒｙｚａｅから誘導されたＤＮＡは５．５kb ＢａｍＨＩ／Ｓａｕ ３ＡＩ−ＢａｍＨＩ／Ｓａｕ ３ＡＩフラグメントとして示され、プロモーターおよび上流活性化配列は位置０から始まる２．１kbフラグメントを表わす。
【００１８】
ＢｇｌII部位からのプロモーターおよび上流活性化配列の確立されたＤＮＡ配列を、図１に示す。プロモーターは、ＴＡＫＡ−アミラーゼプレ配列のＭｅｔ（１）コドンに先行するヌクレオチド−１で終了する。プレ配列を暗号化するヌクレオチド配列は６３個のヌクレオチドから構成され、成熟ＴＡＫＡ−アミラーゼはヌクレオチド６４に対応する位置から開始する。
【００１９】
ｐＴＡＫＡ １７から、プロモーターに対して上流の配列を含む全プロモーター配列またはその機能的部分は、当業者に公知の手段によって誘導することができる。プロモーター配列は、プロモーター配列を、例えば所望なタンパク生成物またはことなるプレ領域（シグナルペプチド）を暗号化する遺伝子のような他のＤＮＡとの連結を促進する特異的な制限部位を導入するために、リンカーを備えていてもよい。
【００２０】
本発明による方法では、（ＳａｌＩ部位の開始を表わす）ヌクレオチド−１１４４（図１を参照されたい）からヌクレオチド−１０の配列を、プロモーター領域の十分に機能する部分の一例として使用した。本発明のもう一つの態様では、ヌクレオチド−１１７６から−１までのヌクレオチド配列は、ｐＴＡＫＡ １７からの未だ配列されていない１．０５kbフラグメントが先行した。各種のフラグメントを使用できることは、当業者にとって明らかである。
【００２１】
本発明の一態様によれば、プロモーターおよび上流活性化配列は、図１におけるヌクレオチド−１１４４からヌクレオチド−１０の配列を表わす下記の配列または機能的に同等なヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
もう一つの態様によれば、プロモーターおよび上流活性化配列は、図１におけるヌクレオチド−１１７６から−１までの配列を表わす下記の配列または機能的に同等なヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
本発明のもう一つの見地によれば、後者の配列では、ｐＴＡＫＡ １７からの１．０５kbの配列決定されていない上流領域（図２における位置０〜１．０５）が先行してもよい。
ターミネーターおよびポリアデニル化配列はプロモーターと同じ源から誘導することができる。エンハンサー配列を構造中に挿入してもよい。
【００２６】
発現した生成物は細胞の分裂を要する細胞内に蓄積させて、生成物を単離することができる。この付加的工程を回避し且つ細胞内で発現した生成物の可能な分解量を最少限にするには、生成物を細胞から分泌するのが好ましい。この目的のため、所望な生成物の遺伝子は、発現した生成物を細胞の分泌経路内への効果的に向けるプレ領域を有する。自然に起こるシグナルまたはリーダーペプチドまたはその機能的部分あるいは分泌を行う合成配列であることができるこのプレ領域は、一般的には分泌の際に所望な生成物から開裂して、培養液から単離する準備のできた成熟生成物を残す。
【００２７】
このプレ領域は、如何なる有機物源からのものであっても分泌されるタンパクの遺伝子から誘導することができる。
本発明によれば、プレ領域はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種からのグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からのアミラーゼ遺伝子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのリパーゼまたはプロテイナーゼ遺伝子、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα−因子の遺伝子または仔牛プロキモシン遺伝子から誘導することができる。
【００２８】
更に好ましくは、プレ領域はＡ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼ、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣＩＢ１１８３７からのマルトース原性アミラーゼ、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎから誘導される。
有効なシグナル配列は、Ａ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼシグナル、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼシグナルおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼシグナルである。
ＴＡＫＡ−アミラーゼシグナルは下記の配列を有する。
【００２９】
【化１】
プロモーターおよびターミネーター配列に機能的に連結した所望な生成物の遺伝子は、選択マーカーを含むベクターに組込むことができ、または宿主株のゲノム中に組込むことができる別個のベクターまたはプラスミド上に置いてもよい。本明細書で用いる「ベクター系」という表現は単一ベクターまたはプラスミドまたは宿主ゲノム中に組込まれる全ＤＮＡ情報を含む２種類以上のベクターまたはプラスミドを包含する。ベクターまたはプラスミドは、線状または閉じた円形分子であってもよい。本発明の好ましい態様によれば、Ａ． ｏｒｙｚａｅは２個のベクターであって、一つは選択マーカーを含み、もう一つは宿主株に導入される残りの異種ＤＮＡから成り、プロモーター、所望な生成物および転写ターミネーターの遺伝子およびポリアデニル化配列を含むもので共形質転換される。
【００３１】
通常は、Ａ． ｏｒｙｚａｅ形質転換体は安定であり、選択マーカーの不在で培養することができる。形質転換体が不安定になる場合には、選択マーカーを用いて培養の際に選択してもよい。形質転換細胞を、次に問題のマーカーに対応する選択圧で培養する。
【００３２】
本発明はＡ． ｏｒｙｚａｅにおいて多種多様なポリペプチドまたはタンパク生成物を高収率で製造する方法を提供する。Ａ． ｏｒｙｚａｅは長年にわたり例えばＴＡＫＡ−アミラーゼ酵素およびタンパク分解酵素の生産に商業的規模で用いられてきており、従ってこの微生物の醗酵技術は十分に開発されており、この微生物は食品工業において使用されることが証明されている。
【００３３】
本発明は、原則として如何なるポリペプチドまたはタンパク生成物でも高収量での工業的生産にＡ． ｏｒｙｚａｅの使用可能性を提供する。かかる生成物の例はキモシンまたはプロキモシンおよび他のレンネット、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓからの酸安定アミラーゼ、菌のリパーゼまたは原生生物のリパーゼおよび熱に安定な細菌または菌のアミラーゼである。
【００３４】
本発明をプロキモシン、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、ＴＡＫＡ−アミラーゼおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのリパーゼの生産によって説明する。これらの酵素の遺伝子は、下記に更に詳細に説明するように、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから得た。
【００３５】
【実施例】
以下の実施例において出発物質として使用したプラスミドは次の通りである。
使用した菌類は次の通りである。
実施例１ プロキモシン遺伝子を含むプラスミド２８５′ｐｒｏＣの調製
プレプロキモシン遺伝子を仔牛の胃のｃＤＮＡライブラリーから単離し、Ｇ−ＣテイリングによってｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位に挿入して（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１８巻、（１９７９年）、５２９４頁およびＴｒｕｅｌｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第６巻、（１９７９年）、３０６１頁）、ｐＲ２６を得た。
【００３９】
ｐＵＣ９をＳａｌＩで切断し、切断をクレノーポリメラーゼで満たし、Ｔ４リガーゼで連結した。生成するプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断して、２．７kbの大きなフラグメントをプロキモシン遺伝子のＮ末端を含むｐＲ２６からの０．４７kb ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結し、ｐＵＣ９′を作った。ｐＵＣ９′は、プロキモシン遺伝子のＮ末端にＨｉｎｄIII 部位を含む。
【００４０】
ｐＵＣ１３をＢａｍＨＩ−ＮａｒＩで切断して、ＮａｒＩ−ＸａｍＩと大きなそれぞれの小型フラグメントをプロキモシン遺伝子のＣ末端を含むｐＲ２６の０．６４kb ＸｍａＩ−ＢｃｌＩフラグメントと連結して、プラスミドｐＵＣ１３′を得た。ｐＵＣ１３′は、プロキモシン遺伝子のＣ末端にＸｂａＩ部位を含む。ｐＵＣ１３′の０．６５kb ＸｍａＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＵＣ９′の０．４６kb ＨｉｎｄIII −ＸｍａＩおよびｐ２８５の１１kb ＸｂａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントと連結して、図３に示されるようにプロキモシン遺伝子を含むプラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣを生成させた。
【００４１】
実施例２ Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼＡ遺伝子のクローニング
じゃがいも澱粉上で成長させたＡ．ｏｒｙｚａｅ Ｈｗ ３２５から、Ｋａｐｌａｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，第１８３巻、（１９７９年）、１８１〜１８４頁）によって、ｍＲＮＡを調製した。ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子の１０５０bpを含む部分ｃＤＮＡクローンを、ｍＲＮＡをＴＡＫＡ−アミラーゼにおけるアミノ酸２９５〜２９９についての暗号化配列に相補的な４−マー・オリゴヌクレオチド混合物
【００４２】
【化２】
で特異的に感作することによって得た（Ｔｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，第５８巻、シリーズＢ、（１９８２年）、２０８〜２１２頁）。クローニング法は、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｇｅｎｅ、第２５巻、（１９８３年）、２６３〜２６９頁記載の方法に準じた。ｃＤＮＡクローンの両端および中央手での配列は、ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミノ酸配列に対応する配列が存在することを示した。
【００４４】
ゲノムクローンの単離
Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｈｗ ３２５からの菌糸を収穫して、Ｂｏｅｌらの上記文献に記載のＡ． ｎｉｇｅｒについて用いた方法に従ってＤＮＡを調製するために加工した。Ｓａｕ３Ａで部分消化することによって生成した３〜１０kbの制限フラグメントを、ＢａｍＨＩで消化して、脱リン酸化したｐＢＲ３２２と連結した（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
【００４５】
５０，０００個の組換体をオリゴヌクレオチドプローブＮＯＲ−１６８（上記）でスクリーニングして、７個がＴＡＫＡ−アミラーゼを暗号化するＤＮＡを含むことを見出した。一つのクローンをｍＲＮＡ開始２．１kb上流を有するプロモーター領域を更に使用するのに選択した。プラスミドｐＴＡＫＡ １７についての制限マップを図２に示す。
【００４６】
Ｅ． ｃｏｌｉ株に移したｐＴＡＫＡ １７を１９８７年２月２３日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400, Goettingenに寄託され、受託番号ＤＳＭ ４０１２を与えられた。ＤＳＭは１９７７年のブダペスト条約で認定された国際寄託当局であり、上記の条約のそれぞれ第９規則および第１１規則に従って、公衆による寄託および入手の永続性を付与している。
【００４７】
実施例３ Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーの構成
真菌類Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ（この菌種の形態学的および系統学的説明については、 Shipper, M.A.A., On the genera Rhizomucor and Parasitella, Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Science and Letters, 第１７号（１９７８年）、５３〜７１頁を参照されたい）はチーズ製造におけるミルクの凝固に広く用いられている酸プロテイナーゼ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉプロテイナーゼ、以下ＲＭＰと省略する）を分泌する。
【００４８】
Ｅ． ｃｏｌｉにおいてこのタンパクのｃＤＮＡ組換えクローンを得るために、全ＲＮＡをＢｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊ．，第３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８４年）およびＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗａｓｈ．）、第１８巻、５２９４〜５２９９，１９７９年）の方法によってホモゲナイズしたＲ． ｍｉｅｈｅｉ ｍｙｃｅｌｉｕｍから抽出した。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを、ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ（ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，第６９巻、１４０８〜１４１２頁、１９７２年）によって報告されたオリゴ（ｄＴ）−セルロース上で親和クロマトグラフィーを２サイクル行うことによって得た。
【００４９】
オリゴ（ｄＴ）で感作した相補性ＤＮＡを合成して、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ，第２５巻、２６３〜２６９頁、１９８３年）が報告した方法に従って二重鎖とした。二重鎖を、Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，第３巻、１０１〜１０６頁、１９７６年）によって報告された方法によって、ｄＣＴＰおよび末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼと連結した。プラスミドｐＢＲ３２７をＰｓｔＩで線形化して、ｄＧＴＰと連結した。
【００５０】
オリゴ（ｄＣ）を連結したｄｓｃＤＮＡを、Ｐｅａｃｏｃｋらが記載した方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第６５５巻、２４３〜２５０頁、１９８１年）によってこのオリゴ（ｄＧ）を連結したベクターにアニーリングして、Ｅ． ｃｏｌｉ ＭＣ１０００のｈｓｄＲ- ，Ｍ+ 誘導体（ＣａｓａｄａｂａｎとＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第１３８巻、１７９〜２０７頁、１９８０年）を形質転換して組換えクローンを生成させるのに用いた。
ＲＭＰ特異的なｃＤＮＡ組換体の同定
１６個のヘプタデカマー・オリゴデオキシリボヌクレオチド
【００５１】
【化３】
の混合物であって、その一つが Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Alaを暗号化する領域においてＲＭＰ ｍＲＮＡに相補的であるもの（ＢｅｃｈとＦｏｌｔｍａｎｎ，Ｎｅｔｈｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、２７５〜２８０頁、１９８１年）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製のＤＮＡ合成装置上で合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。
【００５３】
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーからの約１０，０００個のＥ． ｃｏｌｉ組換体をＷｈａｔｍａｎ ５４０濾紙に移した。コロニーを、Ｇｅｒｇｅｎらが記載した方法によってリーシスして、固定した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第７巻、２１１５〜２１３５頁、１９７９年）。フィルターを、Ｂｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊ．，第３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８４年）によって記載された方法によって32Ｐ−標識したＲＭＰ特異的ヘプタデカマー混合物と交雑した。
【００５４】
フィルターの交雑と洗浄は４０℃で行い、次いでインテンシファイヤー・スクリーンを用いて２４時間オートラジオグラフィーを行った。ミニプレプ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）プラスミドＤＮＡは、標準的な方法（ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第７巻、１５１３〜１５２３頁、１９７９年）によって交雑するコロニーから単離し、ｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列をＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第６５巻、４９９〜５６０頁、１９８０年）によって確立した。
【００５５】
ｐＲＭＰ１０１６は、ｍＲＮＡの５′未翻訳末端の部分を含み、次いで６９個の酸の長いプレプロ領域と３００個のアミノ酸をＲＭＰタンパクの成熟部分に暗号化する領域中に伸びていることを示した。ｐＲＭＰ１０１６はＲＭＰ ｍＲＮＡの完全な３′末端に対応するインサートを含まなかったので、ｃＤＮＡライブラリーをクローンｐＲＭＰ１０１６からの32Ｐニックが翻訳された３′特異的制限フラグメントで再度スクリーニングすることによって、クローンｐＲＭＰ２９３１を単離した。
【００５６】
このクローンは３′未翻訳領域の部分とＲＭＰタンパクのカルボキシ末端部分を暗号化する２７０個のトリプレットを有する開放読み込み枠を含む。それ故、ｐＲＭＰ１０１６およびｐＲＭＰ２９３１は著しくオーバーラップしており、２個のクローンの結合した配列は、Ｒ． ｍｉｅｈｅｉプレプロＲＭＰ ｃＤＮＡの配列を与える。１４１６個のヌクレオチドの総ては、ｃＤＮＡクローニング法から生成するＧ：Ｃテイルの間に配列した。
【００５７】
確立したＤＮＡ配列を図４および図５に、ＲＭＰへの前駆体の推定アミノ酸配列と共に示す。第４ａおよびｂ図では、水平線はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた合成オリゴ混合物の位置を示している。矢印は、元のＲＭＰの成熟において加工が起こる位置を示している。ヌクレオチドは開始Ｍｅｔコドンにおける第一の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟ＲＭＰにおける第一の残基から番号を付けている。
【００５８】
このｃＤＮＡ配列から、ＲＭＰは６９個のアミノ酸のプロペプチドで４３０個のアミノ酸の長い前駆体として合成されると結論することができる。この前駆体における推定上のシグナルペプチダーゼ加工部位（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１３３巻、１７〜２１頁、１９８３年）は、Ａｌａ（−４８）およびＡｒｇ（−４７）の間にあると考えられ、成熟ＲＭＰはＧｌｕ−１およびＡｌａ（＋１）の間での自動タンパク分解性開裂によって生成する。ＲＭＰのｃＤＮＡで推定したアミノ酸配列は、以前報告された部分的アミノ酸配列（ＢｅｃｈとＦｏｌｔｍａｎｎ，Ｎｅｔｈ−Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、２７５〜２８０頁、１９８１年）と良好に一致している。
【００５９】
ＲＭＰ ｃＤＮＡを用いて更に構成作業を促進するため、次のようにしてクローンｐＲＭＰ２９３１において同定されたＴＡＡ停止コドンに対して３′のＢａｎＩ部位にＨｉｎｄIII リンカーを挿入した。すなわち、２５μｇ ｐＲＭＰ２９３１をＰｓｔＩで消化してＲＭＰ ｃＤＮＡを得た。このインサートを１％アガロースゲル電気泳動法で精製し、ゲルから電気溶出し、フェノールおよびクロロホルム抽出によって精製し、ＮａＣｌおよびエタノールで沈澱させた。
【００６０】
ＲＭＰの３′半分を暗号化するこのフラグメントをＢａｎＩで消化し、ＢａｎＩ付着制限部位末端を４個のｄＮＴＰとＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントとの混合物で満たした。これらの満たした末端にＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応においてＨｉｎｄIII リンカーを加えた。連結反応混合物をフェノールとクロロホルムで抽出して、ＤＮＡを４Ｍ酢酸アンモニウム／エタノールで沈澱させた。
【００６１】
精製したＤＮＡを過剰量のＨｉｎｄIII 酵素で消化して、３８０bpフラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。ＲＭＰ開放読取り枠の３′末端とＴＡＡ停止コドンを含むこのフラグメントを、ＨｉｎｄIII で消化してアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＩＣ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有寒天プレート上で選択した。
【００６２】
プラスミドＤＮＡを形質転換体から精製し、正確な組換体を制限エンドヌクレアーゼ消化とアガロースゲル電気泳動法によって同定した。かかる正確な組換体、ｐＲＭＰ３′から、２１０bp ＢｇｌII／ＨｉｎｄIII フラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって単離した。このフラグメントはアミノ酸２９７〜２９９でＢｇｌII部位からのＲＭＰ ｃＤＮＡの３′末端を含み、ＴＡＡ停止コドン中を通って、挿入されたＨｉｎｄIII リンカーまで伸びている。
【００６３】
ＲＭＰ ｃＤＮＡの５′部分は、１％アガロースゲル電気泳動法によって９９７bp ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌIIとしてｐＲＭＰから単離した。ＨｉｎｄIII 部位は、プロセグメントにおいて残基−３６，−３５に対応する位置においてＲＭＰ−ＤＮＡ中に配置されている。９９７bp５′フラグメントをＨｉｎｄIII で消化してホスファターゼ処理したｐＩＣ１９Ｒ中で２１０bp３′フラグメントに連結した。
【００６４】
この連結混合物を用いて、組換体をＥ．ｃｏｌｉから得て、３′部分に結合したＲＭＰの５′部分を有する正確なプラスミドｐＲＭＰは制限酵素分析によって同定した。ｐＲＭＰの構成を図６に示す。ｐＲＭＰはＲＭＰプレ領域およびプロセグメントの５′半分を暗号化しない。
【００６５】
実施例４ 活性ＲＭＰを分泌するように設計したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
この実施例では、プラスミドをグルコアミラーゼプロモーター、シグナルおよびターミネーター配列の制御下にＲＭＰを発現するように設計して構成した。グルコアミラーゼプロモーターおよびターミネーター配列をベクターｐＣＡＭＧ９１でクローン化したグルコアミラーゼゲノム遺伝子から誘導した。ｐＣＡＭＧ９１の構成はＢｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，第３巻、１９８４年、１５８１〜１５８５頁）によって報告されており、プラスミドｐＣＡＭＧ９１のエンドヌクレアーゼ制限マップは図７に示す。
【００６６】
ｐＣＡＭＧ９１をＳａｌＩおよびＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。上記消化物から、アガロースゲル上で６９８bpフラグメントを単離した。このＳａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントはグルコアミラーゼｍＲＮＡの１４０bp ３′未翻訳部分を暗号化する領域を含む。
【００６７】
この３′フラグメントはＴ４−ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＸｂａＩリンカーの添加およびＸｂａＩ制限酵素での消化の前に制限部位を「ブラント・エンド」させた。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端をＸｂａＩで線形化したｐＵＣ１３に連結してグルコアミラーゼ遺伝子ポリ（Ａ）付加領域を含むプラスミドｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍを生成させた。ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成は、図８に示す。
【００６８】
Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端は、ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍからの７００bp ＸｂａＩフラグメントとして得た。このターミネーターフラグメントを、ＸｂａＩで消化してホスファターゼ処理したｐＩＲ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉから組換体が得られ、正確なプラスミドｐＩＣＡＭＧ／ＴｅｒｍであってｐＩＣ１９Ｒの多重クローニング部位のＨｉｎｄIII 部位に面するターミネーターフラグメントの５′末端を有するものは制限酵素分析によって同定した。
【００６９】
ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成を、図８に示す。ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍから、グルコアミラーゼターミネーター（ＡＭＧターミネーター）領域を１％アガロースゲル電気泳動法によって、７５０bp ＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ制限フラグメントとして単離した。ｐＣＡＭＧ９１から、グルコアミラーゼプロモーター（ＡＭＧプロモーター）を、グルコアミラーゼシグナルペプチドを暗号化する領域、ヘキサペプチド−プロセグメントおよび３．５kb ＣｌａＩ／ＢｓｓＨIIフラグメントとしてのｐＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）と共に、１％アガロースゲル電気泳動法によって単離した。
【００７０】
合成ＢｓｓＨII／ＨｉｎｄIII リンカーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製ＤＮＡ合成装置上で合成した２種類の合成３１マー・オリゴヌクレオチドから調製した。合成リンカーは下記の構造を有する。
【００７１】
【化４】
このリンカーを、３．５kbグルコアミラーゼプロモーターを含むフラグメントおよび７５０bpグルコアミラーゼターミネーターを含むフラグメントとの連結反応に用いた。連結混合物を用いてＥ． ｃｏｌｉを形質転換して、正確な組換体、ｐ６７３は制限エンドヌクレアーゼ消化によって同定した。単離したｐ６７３はＨｉｎｄIII クローニングベクターであり、この中に適当なＨｉｎｄIII ｃＤＮＡフラグメントをグルコアミラーゼヘキサペプチドプロセグメントおよびグルコアミラーゼ転写ターミネーター領域の間に挿入することができる。
【００７３】
挿入したｃＤＮＡはグルコアミラーゼプロモーターによって転写制御され、翻訳された融合生成物の分泌はグルコアミラーゼシグナルペプチドとグルコアミラーゼヘキサペプチドプロセグメントとによって指示される。ｐ６７３をＨｉｎｄIII で消化して、アルカリ性ホスファターゼで処理して、ｐＲＭＰの消化物から精製した１．２kb ＨｉｎｄIII と連結した。
【００７４】
連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、ＲＭＰを発現させるために正確な位置に挿入されたＲＭＰ ｃＤＮＡを有する組換体ｐ６８６は制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離されて特徴化された。ｐ６８６は以下の構造：グルコアミラーゼシグナルペプチド、グルコアミラーゼヘキサプロペプチド、ＲＭＰからのプロペプチドのアミノ酸−４５から−１、成熟ＲＭＰの３６１個のアミノ酸を有するＲＭＰ前駆体を暗号化する。ｐ６８６の構成を、図９に示す。
【００７５】
実施例５
本発明の好ましい態様では、プレプロＲＭＰの開放読取り枠を、Ａ．ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼ遺伝子またはＡ．ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターの制御下において発現プラスミドに挿入すべきである。これを行うために、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を、次の工程によってプレプロＲＭＰのシグナルペプチドの開始メチオニンコドンの５′に挿入した。
【００７６】
ｐＲＭＰ１０１６を、ｃＤＮＡにおいてアミノ酸残基Ｓｅｒ（−６６）およびＧｌｎ（−６５）に対応する位置で切断するＤｄｅＩと、ｃＤＮＡにおいてアミノ酸残基Ｌｙｓ（−３６）およびＬｅｕ（−３５）に対応する位置で切断するＨｉｎｄIII で消化した。精製する８９bp ＤｄｅＩ／ＨｉｎｄIII フラグメントを８％ポリアクリルアミドゲル上で精製し、フェノールおよびクロロホルム抽出の後電気溶出し、エタノール沈澱した。以下の配列を有する合成ＤＮＡフラグメントは、アプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成装置上で２個のオリゴヌクレオチドとして合成した。
【００７７】
【化５】
このフラグメントは、開始Ｍｅｔ−コドンに対してＢａｍＨＩ付着末端５′および３′末端にＤｄｅＩ付着末端を有する。これら２個のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキナーゼ化し、互いにアニーリングして、次いでＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII で消化した。ｐＵＣ１３ベクター中でｐＲＭＰ１０１６から精製した８９bp ＤｄｅＩ／ＨｉｎｄIII ＲＭＰフラグメントに連結した。
【００７９】
連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プラスミド上で制限酵素消化によって同定した。正確な組換えプラスミドを配列して、使用したオリゴヌクレオチドの配列を証明した。かかる正確なプラスミドｐＲＭＰ５′をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII で消化して、開始Ｍｅｔコドン、ＲＭＰシグナルペプチドおよびＲＭＰプロセグメントの部分を有する１１０bp ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII フラグメント１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。
【００８０】
このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルム抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭＰ開放読み込み枠の残りおよびＡＭＧターミネーター配列をＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄIII で部分消化した後プラスミドｐ６８６から得た。これによって、１．９kbフラグメントを放出し、このフラグメントをアガロースゲル電気泳動法、電気溶出フェノールおよびクロロホルム抽出の後、エタノールで沈澱させた。この１．９kbフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１３ベクター中で、ｐＲＭ５′からの１１０bp ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII に連結した。
【００８１】
この連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プラスミド上で制限酵素消化によって同定した。かかる正確な組換体は、ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍであった。ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍの構成を図１０に示す。
【００８２】
実施例６ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターによってＡ．ｏｒｙｚａｅ中で活性ＲＭＰを分泌するように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
グルコアミラーゼプロモーターを以下のようにして単離した。２５μｇのｐＣＡＭＧ９１をＥｃｏＲＩおよびＢｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼで消化した。
この二重消化の後、２７０bp ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって単離することができた。
【００８３】
このフラグメントは、プロモーター領域の一部分、５′未翻訳領域およびグルコアミラーゼ遺伝子（ＡＭＧ遺伝子）のシグナルペプチドをカバーする。アガロースゲルからＤＮＡを電気溶出した後、フラグメントをフェノールおよびクロロホルム抽出し、次いでエタノール沈澱することによって精製した。次いで、２７０bpの長いフラグメントをＳｆａＮＩで消化した。
【００８４】
この酵素は、グルコアミラーゼ遺伝子の開始ＡＴＧメチオニンコドンに対して５′に開裂部位を有する。完全に消化した後、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）および４個のｄＮＴＰ総てで処理して、ＤＮＡ上にブラントエンドを生成させた。このＤＮＡに、ＤＮＡリガーゼを有するＢｇｌIIリンカーを加えて、ＤＮＡをＢｇｌII制限酵素の過剰量で消化した。
【００８５】
１０％ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡフラグメントを分離した後、１７５bp ＢｇｌIIフラグメントを電気溶出によって単離することができた。このフラグメントは、開始メチオニンコドンに対して５′のＳｆａＮＩ制限部位に対応する位置に挿入されたＢｇｌIIリンカーを有する。このＤＮＡ切片をＢｇｌIIで消化したアルカリホスファターゼ処理したｐＩＣ１９Ｒベクターに連結して、この連結混合物を用いてＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。
【００８６】
生成する形質転換体の中で、正確なプラスミドをミニプレププラスミド上で制限酵素消化することによって同定した。かかる正確なプラスミドｐＢ４０４．１をＮｓｉＩおよびＢｇｌIIで消化して、グルコアミラーゼ遺伝子の５′未翻訳領域をプロモーター領域の３′部分の約１００bpと共に含む０．１６bpフラグメントを放出した。このフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。
【００８７】
このフラグメントをｐＣＡＭＧ９１からのグルコアミラーゼプロモーター領域の残りの部分に結合させるため、以下の工程を行った。２５μｇのｐＣＡＭＧ９１をＢｓｓＨIIで消化した後、更にＮｄｅＩで部分的に消化した。フラグメント末端を４個総てのｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで満たした後、１．４kb ＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で単離した。
【００８８】
このフラグメントは、総てのプロモーター領域を５′未翻訳領域およびシグナルペプチド暗号化領域と共に含んでいた。このフラグメントを電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって、ＤＮＡを濃縮した。ＮｓｉＩで消化した後、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で流して、１．２kb ＮｄｅＩ−ＮｓｉＩフラグメントを電気溶出によって単離した。
【００８９】
このＤＮＡは上記反応でＮｄｅＩ部位にブラントエンドを生じ、これをＮｒｕＩ−ＢｇｌIIで消化したｐＩＣ１９Ｒベクター中でのｐＢ４０１．１からの０．１６kb ＮｓｉＩ−ＢｇｌIIフラグメントに連結させた。連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。上記の正確な組換体、ｐＢ４０８．３をＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIで消化して、グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）プロモーターを１％アガロースゲル上で１．４kbフラグメントとして単離した。
【００９０】
このフラグメントを電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱した。このグルコアミラーゼプロモーターフラグメントを次に、ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクター中のｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２．０ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。
【００９１】
上記の正確な組換体の一つｐ７７８を大規模に成長させて、組換えプラスミドを単離して、プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって精製した。このプラスミドをグルコアミラーゼプロモーターおよびターミネーター配列の制御下においてＲＭＰの合成を指示する。ｐ４０８．３の構成を図１１に示し、ｐ７７８の構成を図１２に示す。
【００９２】
実施例７ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターによる活性ＲＭＰを分泌させるように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼゲノム遺伝子を含むプラスミドｐＴＡＫＡ １７（実施例２を参照されたい）５０μｇをＳａｌＩで消化した。この酵素は、成熟ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミノ酸残基２６に対応する位置においてゲノムＤＮＡでの制限部位を有する。
【００９３】
もう一つのＳａｌＩ制限部位はこの位置に対して約１３００個のヌクレオチドだけ上流の、上流プロモーター領域の５′末端に配設される。ＳａｌＩ消化の後、この１３００bpプロモーターを含むフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって精製し、ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。次いで、ＤＮＡをエクソヌクレアーゼIII 緩衝液中に溶解して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法に従ってエクソヌクレアーゼIII で消化した。
【００９４】
反応を停止して、それぞれのＤＮＡ末端において約１３０bpの欠失を得た。この方法ではＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子の暗号か領域のＳａｌＩ部位からの約１３０bpの欠失は、開始メチオニンコドンの上流に多重クローニング部位リンカーを導入する機会を生じる。エクソヌクレアーゼIII で処理したＤＮＡを、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法に従ってＳ１ヌクレアーゼIII で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出した後エタノールで沈澱した。
【００９５】
Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＤＮＡを補修して連結可能なブラントエンドを得ることは、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４年）の方法に従って、４個のｄＮＴＰ総てとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて行った。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、１３００bp ＳａｌＩフラグメントで切断して、２群のフラグメントを生成した。一つの群は約３８０bpの長さであり、蒸溜領域を表わしたが、他の群は６２０bpの長さであり、プロモーター領域を含んでいた。
【００９６】
ＥｃｏＲＩ消化生成物のこれらの群をアガロースゲル上で分離して、約６２０bpの長さのＤＮＡフラグメントを電気溶出して、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結混合物を用いて、競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、組換体から、ミニプレププラスミドＤＮＡを単離した。これらの欠失変異株を制限酵素消化によって特徴化して、開始メチオニンコドンに対して５′の欠失末端を有するプラスミドを同定した。
【００９７】
所望な特徴を有する数個の候補を配列させ、ＡＴＧ−メチオニンコドンにおけるＡに対して９bpを欠失した５′を有する変異株（ｐ９）を選択して、更に構成した。ｐ９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消化して、フラグメントを含む６４５bp ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターをアガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によって単離した。
【００９８】
ｐＴＡＫＡ １７をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーター上流領域を含む５１０bpフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によって単離した。これらの２個のプロモーター領域を互いに連結させ、且つＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII で消化したＩＣ１９Ｒベクターに連結させた。
【００９９】
連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、正確な組換体を、ミニプレプとして抽出されたプラスミドを制限酵素で消化することによって同定した。かかる組換体の一つｐ７１９では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターフラグメントは、多数の各種制限酵素消化液によって削除することができる１．１kbの移動可能なフラグメントとして見出されている。ｐ７１９の構成を図１３に示す。
【０１００】
ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍから、プレプロＲＭＰ開放読取り枠およびグルコアミラーゼターミネーター領域（ＡＭＧＴｅｒｍ）を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後２kbフラグメントとして単離した。このフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、次いでフェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈澱によって精製した。
【０１０１】
Ａ． ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼからのプロモーターを、ｐ７１９をＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した後に得られる１．１kbフラグメントとして単離した。このフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出、次いでエタノールでの沈澱によって精製した。１．１kbプロモーターフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクターにおいてｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２kb ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。
【０１０２】
連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する組換体から、正確な組換体を、ミニプレププラスミドを制限酵素で消化することによって同定した。かかる正確な組換体の一つｐ７７７を大規模に成長させて、組換えプラスミドを単離し、プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって精製した。ｐ７７７の構成を図１４に示す。
【０１０３】
実施例８ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターの制御下によるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼを分泌させるように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリパーゼｃＤＮＡクローンの構成および同定
特異的オリゴヌクレオチドプローブを構成させることができる情報を得るため、精製したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，第２５巻、１９７７年、１１４６〜１１５０頁）について部分配列を決定した。
【０１０４】
以下の説明では、ＲＭＬという略号をＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼについて用いた。菌糸体および低分子量物質を除去したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの培養液からの上澄液を、陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。カラムからの主要な脂肪分解性分画を、凍結乾燥する前に脱塩および限外濾過した。次いで、凍結乾燥した粉末を、親和性クロマトグラフィーに付した。
【０１０５】
カラムからの貯蔵したリパーゼ分画を脱塩して、限外濾過によって濃縮した。
次いで、この濃縮液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に付して、ＨＩＣ−精製からのリパーゼを用いてアミノ酸配列を決定した。配列の決定は、元の酵素（Ｎ−末端配列）およびリパーゼをＡｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａプロテアーゼを用いてタンパク分解性消化を行った後に得られる選択されたフラグメントの両方について行った。配列の決定は、Ｔｈｉｍ，Ｌ．ら、（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９８７年、印刷中）によって報告されたのと同じ方法でGas Phase Sequencer (Applied Biosystems Model ４７０Ａ）で行った。
【０１０６】
ＲＭＬを、酵素の基質に対する比率を１：４０（モル：モル）としたことを除いてＭｏｏｄｙら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第１７２巻、１９８４年、１４２〜１４８頁）によって報告されたのと同じＡｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａプロテアーゼを用いて消化した。得られたフラグメントをＨＰＬＣによって分離して、ＵＶ吸収を２８０nmおよび２１４nmで観察した。
オリゴヌクレオチドプローブの構成のための好適なフラグメントを同定するには、これらのフラグメントはＴｒｙおよび／またはＴｙｒを含むので、２８０nmおよび２１４nmの間で高い比率を示したペプチドのみを配列した。
以下のＮ−末端配列が、元のＲＭＬを使用することによって見出された。
【０１０７】
【化６】
タンパク分解性消化液から単離されたフラグメントの一つは、配列 Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Try-Asp-X-Ile-Hisを有し、このフラグメントを特異的オリゴヌクレオチドプローブの合成に用いた。
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのアスパラギン酸プロテイナーゼ（ＲＭＰ）組換体を単離するために構成された実施例３からの上記生物のｃＤＮＡライブラリーも用いてリパーゼに特異的な組換体を同定した。オリゴヌクレオチドの混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製ＤＮＡ合成装置で合成した。
【０１０９】
【化７】
を有する混合物は、アミノ酸 Gly-Ala-Thr-Trp-Aspを暗号化する領域においてＲＭＬ ｍＲＮＡに相補的であった。このペンタペプチドは、精製したＲＭＬタンパクのタンパク分解性フラグメントから得られるアミノ酸配列のセグメントとして同定された（上記参照）。
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーを、ＲＭＰ特異的混合物でスクリーニングするのに記載した方法と同様にして３２Ｐ−キナーゼしたリパーゼオリゴヌクレオチド混合物でスクリーニングした。交雑およびフィルターの最初の洗浄は、４３℃で行った。オートラジオグラフィーの後、フィルターを４７℃で洗浄した。
【０１１１】
強力な交雑を示したコロニーを単離して、対応するプラスミドにおいて挿入されたｃＤＮＡを配列してＲＭＬ特異的組換体を同定した。かかる２個の組換体ｐ３５３．７およびｐ３５３．１６は、約１．２kbのインサートを有した。これらの２種類の組換体から得られるＤＮＡ配列は、シグナルペプチドの中央で開始し、ポリＡテイルにまで伸びている。
【０１１２】
この領域では、長い開放読取り枠を同定できた。２個の組換え体は、開始メチオニンコドンを有するシグナルペプチドの５′部分についての配列を含まないので、合成オリゴヌクレオチド（５８４）
5′CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3′ 584
を合成した。このオリゴヌクレオチド５８４は、ポリペプチド領域で見られるアミノ酸配列
Pro-Pro-Leu-Ile-Pro-Ser-Arg
を暗号化する領域におけるＲＭＬ ｍＲＮＡに相補的である。
【０１１３】
オリゴ５８４をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて高い比活性にまでキナーゼ処理した後、記載された方法（Ｂｏｅｌ，Ｅ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，第８０巻、２８６６〜２８６９頁、１９８３年）によって、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｍＲＮＡでのＡＭＶリバース・トランスクリプターゼとのプライマー伸長反応に用いた。プライマー伸長反応生成物を１０％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で電気泳動して、２個のｃＤＮＡ生成物を分割した。
【０１１４】
これらの２個のｃＤＮＡ、すなわち一つは１５０個のヌクレオチドの長さであり、もう一方は１６０個のヌクレオチド長さのものを、両方とも電気溶出し、ＤＮＡ配列のための化学的分解法によって配列した。両者のｃＤＮＡはプライマー領域から伸びており、開始メチオニンコドンに対して位置９のヌクレオチド５′までの読取り可能な配列を生じた。この配列は、リパーゼ組換えｃＤＮＡプラスミドから得られた配列であることを示した。
【０１１５】
２個のプライマー伸長ｃＤＮＡ生成物の長さは、リパーゼｍＲＮＡの５′末端（ＣＡＰ−部位）が図１５に示した第一のＡヌクレオチドに対して約５または１５ヌクレオチド５′に配列される。菌類からのｍＲＮＡの５′末端の位置におけるマイクロヘテロゲナイェティは、極めて一般的である。２個のクローン化したｐ３５３．７およびｐ３５３．１６から得られる配列をプライマー伸長分析からの配列と結合することにより、ＲＭＬ前駆体のアミノ酸配列を確立することができる。
【０１１６】
ＤＮＡ配列およびＲＭＬ前駆体の対応するアミノ酸配列を図１５に示す。図１５では、水平線はｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡライブラリースクリーニングに用いられた合成オリゴの位置を示している。矢印は、元のＲＭＬの成熟において加工が起こる位置を示す。ヌクレオチドは、開始Ｍｅｔコドンでの最初の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟した元のＲＭＬにおける最初の残基から番号を付ける。
【０１１７】
ＲＭＬを開始Ｍｅｔコドンから伸びている開放読み込み枠によって暗号化し、次いで停止コドンに達する前に３６３コドンを通る。この前駆体では、最初のアミノ酸残基は、典型的な疎水性シグナルペプチドから成る。ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１１３巻、１７〜２１頁、１９８３年）の生産則によれば、シグナルペプチドは、それぞれ、位置−７１および−７０でのＡｌａ−およびＶａｌ残基の間のシグナルペプチダーゼ開裂によって以下のプロペプチドから開裂する。
【０１１８】
Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからの培養液の上澄みから得られる精製ＲＭＬのＮ末端アミノ酸配列分析は活性ＲＭＬ酵素のＮ末端として Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Argを同定したので、ＲＭＬ前駆体のプロペプチドは前駆体における次の７０個のアミノ酸残基から成っていた。このＮ末端Ｓｅｒ残基から始めて、成熟ＲＭＬは停止コドンに達するまでに２６９個の残基を通って伸びる。
【０１１９】
この成熟２９５００ダルトン酵素では、リパーゼ基質結合部位は、多数のリパーゼに保存されている残基Ｓｅｒ（１４４）の付近に配置される。ＲＭＬ ｍＲＮＡの３′末端では、１０４個のヌクレオチドがＴＡＡ停止コドンとポリ（Ａ）テイルとの間の未翻訳領域として配置された。このポリ（Ａ）テイルに対して２３ヌクレオチド５′では、７ＡＴ塩基対から成る反復構造が見出されたが、典型的な真核生物のポリアデニル化シグナルは同定されなかった。
【０１２０】
本発明の好ましい具体例では、ＲＭＬ ｃＤＮＡについて多くの変更を行った。これらの変更は、開放読み込み枠に対して制限エンドヌクレアーゼ部位５′および３′をクローニングおよび付加の際に、ｃＤＮＡに加えたＧ：Ｃテイルの除去を含む。多くの好都合な制限部位も、ｃＤＮＡのシグナルペプチドおよびプロペプチド領域に導入された。
ｐ３５３．１６をＦｎｕＤIIで消化して、アガロースゲル電気泳動によって８８０bp ＤＮＡフラグメント（ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末端）を単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。
【０１２１】
ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末端を次いでＳａｍＩで消化し且つアルカリ性ホスファターゼで処理したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結反応を用いて、競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製した形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。
一つのかかる好適な組換体ｐ４３５．２をＢａｎIIおよびＨｉｎｄIII で消化し、０．６９kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭＬ ｃＤＮＡのフラグメントは、３′未翻訳領域に結合したｐＵＣ１９多重クローニング部位の主要部分を有していた。
【０１２２】
ＲＭＬ ｃＤＮＡの５′末端を、合成オリゴヌクレオチドを用いて再設計して、好都合な制限部位を導入した。合成フラグメント（ＲＭＬ５′）のＤＮＡ配列を図１８に示す。導入した制限部位の位置および個々に合成したオリゴヌクレオチドの結合部位を水平線乃至垂直／水平線によって示す。精製するフラグメント（ＲＭＬ５′）を２％アガロースゲル上で１５０bpフラグメントとして精製し、電気溶出し、フェノールおよびＣＨＣｌ3 で抽出し、更に連結反応を行う前にエタノールで沈澱した。
【０１２３】
ｐ３５３．７をＢａｎＩおよびＢａｎIIで消化して、３８７bp ＲＭＬフラグメントを１０％ポリアクリルアミド電気泳動法によって精製した。このフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルムで抽出した後、エタノール沈澱をして、次いで合成ＲＭＬ５′フラグメントおよびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII で消化したｐＵＣ１３ベクターにおいてｐ４３５．２からの０．６９kb ＢａｎII／ＨｉｎｄIII フラグメントに連結した。
【０１２４】
連結反応を用いて、競合するＥ． ｃｏｌｉを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化することによって同定した。一つのかかる正確な組換体ｐＢ５４４では、合成部分を配列して予想した構造を確認した。ｐＢ５４４の構成を図１６に示す。ｐＢ５４４からプレプロＲＭＬ ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法によって、１．２kb ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
【０１２５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子からのターミネーターに基づく発現ベクターを、以下のようにして調製した。ｐ７１９（実施例７参照）刃ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した。生成する１．１kb ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって精製した。ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍ（実施例４参照）は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【０１２６】
生成する０．７５kb ＴＡＫＡ−アミラーゼターミネーターフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によって精製した。フェノールおよびクロロホルム抽出の後、これらの２種類のフラグメントをエタノールで沈澱し、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結反応を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化することによって同定した。一つのかかる正確な組換体ｐ７７５をＢａｍＨＩで消化して、アルカリ性ホスファターゼで処理した。
【０１２７】
ｐＢ５４４からの１．２kb ＢａｍＨＩ ＲＭＬプレプロｃＤＮＡフラグメントをこのｐ７７５ベクターに連結して、Ｅ． ｃｏｌｉ中に形質転換した。プロモーターとターミネーターとの間で正確な位置に挿入されたＲＭＬプレプロｃＤＮＡを有する組換えｐ７８７を、Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体から抽出したミニプレププラスミド上で制限酵素による消化によって同定した。ｐ７８７プラスミドＤＮＡを大規模に成長させて、プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって精製した。ｐ７８７の構成を図１７に示す。
【０１２８】
実施例９ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの形質転換（一般的処理法）
１００mlのＹＰＤ（sherman ら、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, １９８１年）にＡ．ｏｒｙｚａｅ，ＩＦＯ ４１７７またはそのａｒｇＢ変異株の胞子を接種して、振盪しながら３７℃で約２日間培養した。ミラクロスを通して濾過することによって菌糸を回収して、０．６ＭのＭｇＳＯ4 ２００mlで洗浄した。
【０１２９】
菌糸を１５mlの１．２ＭのＭｇＳＯ4 ，１０mMのＮａＨ2 ＰＯ4 ，pH＝５．８に懸濁させた。懸濁液を氷で冷却し、ＮｏｖｏｚｙｍR ２３４、バッチ１６８７を１２０ml含む緩衝液１mlを加えた。５分後、１mlの１２mg／ml ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ２５型）を加えて、緩やかに撹拌しながら１．５〜２．５時間３７℃でインキュベーションし、顕微鏡下で検討した試料中において多数の原形質体が観察されるようになるまで継続した。
【０１３０】
懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を無菌チューブに移して、５mlの０．６Ｍソルビトール、１００mMトリス−ＨＣｌ，pH＝７．０を積層した。
１０００ｇで１５分間遠心分離を行い、原形質体をＭｇＳＯ4 クッションの上部から収集した。２容量のＳＴＣ（１．２Ｍのソルビトール、１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH＝７．５，１０mMのＣａＣｌ2 ）を原形質体懸濁液に加えて、混合物を１０００ｇで５分間遠心分離した。原形質体ペレットを３mlのＳＴＣに再懸濁して、再度成型した。これを繰り返した。最後に、原形質体を０．２〜１mlのＳＴＣに再懸濁した。
【０１３１】
１００μｌの原形質体分散液を５〜２５μｇの適当なＤＮＡを１０μｌのＳＴＣに懸濁したものと混合した。ａｒｇＢ株からの原形質体をｐＳａｌ４３ＤＮＡ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子を担持するプラスミド）およびａｒｇＢ+ 株からの原形質体をｐ３ＳＲ２（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子を担持するプラスミド）と混合した。
【０１３２】
混合物を室温で２５分間放置した。０．２mlの６０％ＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５７６），１０mMのＣａＣｌ2 および１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH＝７．５を加えて、注意深く混合し（２回）、最後に０．８５mlの上記溶液を加えて、注意深く混合した。混合物を室温で２５分間放置し、２５００ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを再度２mlの１．２Ｍソルビトールに懸濁した。もう一回沈降させてから、原形質体を適当なプレートに塗布した。
【０１３３】
ｐＳａｌ４３で形質転換したａｒｇＢ株からの原形質体を炭素および窒素源として、それぞれグルコースおよび尿素を有し且つ浸透圧安定のために１．２Ｍソルビトールを含む最少限のプレート（Ｃｏｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に拡げた。
【０１３４】
ｐ３ＳＲ２で形質転換したａｒｇＢ+ 株からの原形質体を、１．０Ｍスクロース、pH＝７．０、窒素源として１０mMのアセタミド、およびバックグラウンド成長を抑制する２０mMのＣｓＣｌを含む最少限のプレート（Ｃｏｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に塗布した。３７℃で４〜７日間インキュベーションした後、胞子を回収して、滅菌水に懸濁し、塗布して単一コロニーとした。この処理法を繰り返して、２回の再分離の後、単一コロニーの胞子を定義した形質転換体として保存した。
【０１３５】
実施例１０ 野生型Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＴＡＫＡ−アミラーゼの発現
ｐＴＡＫＡ １７を、実施例９に記載したようにＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｍｄＳ遺伝子を含むｐ３ＳＲ２で共形質転換することによって、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ４１７７中に形質転換した。上記のように調製した原形質体を等量のｐＴＡＫＡ １７およびｐ３ＳＲ２であってそれぞれ約５μｇを用いた混合物とインキュベーションした。単一窒素源としてアセタミドを用いることができる９個の形質転換体を、２回再度単離した。
【０１３６】
ＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎら、１９８１年）上で３日間成長させた後、培養液上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルを、コマージー・ブリリアント・ブルーＲで染色した。最良の形質転換体は、形質転換していないＩＦＯ ４１７７の１０〜２０倍のアミラーゼを生成した。一つの形質転換体を更に研究するために選択して、２リットルＫｉｅｌｅｒ醗酵装置中で４％大豆ミール上で成長させ、成長中にグルコースを供給した。醗酵中に、培養液を激しく撹拌した。
【０１３７】
これらの条件下では、ＩＦＯ ４１７７は約１ｇ／ｌを生じ、形質転換体は酵素活性として測定したところ約１２ｇ／ｌのアミラーゼであった。酵素活性を澱粉を分解する能力として測定した（Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１６巻、１９３９年、７１２〜７２３頁）。使用した澱粉はＭｅｒｃｋ Ａｍｙｌｕｍ ｓｏｌｕｂｉｌｅｅｒｇ Ｂ．６であり、分析はpH４．７および３７℃で行った。外部からβ−アミラーゼを加えなかった。
【０１３８】
実施例１１ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＲＭＰの発現
実施例７からのｐ７７７または実施例６からのｐ７７８を、実施例９に記載の処理法によってｐ３ＳＲ２と共に共形質転換することによってＩＦＯ−４１７７中へ形質転換した。形質転換体を選択して、実施例９に記載のように再度単離した。
【０１３９】
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡを行って分析した。ｐ７７７およびｐ７７８からの形質転換体の上澄液は、ＲＭＰ抗体と反応するタンパク５０〜１５０mg／ｌを含んでいた。プロテイナーゼは、Ｒ． ｍｉｅｈｅｉで生成したプロテイナーゼと比較して過剰にグリコシル化した。２つの形状のうち、一方はプロ型であり、他方は加工された成熟プロテイナーゼであると思われた。
【０１４０】
ｐ７７８の２種類の形質転換体およびｐ７７７の３種類の形質転換体を、上記ＴＡＫＡ−アミラーゼ形質転換体と同様に醗酵装置中で成長させた。ｐ７７８の２種類の形質転換体は、Ｋｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉｔｚ，Ｍ．，Ｊｏｕｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，第１８巻、１９３５年、４５９〜４６６頁）によるミルク凝固活性として測定したところ、約０．２ｇ／ｌおよび０．４ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、ｐ７７７の３種類の形質転換体は約０．５ｇ／ｌ，２．４ｇ／ｌおよび３．３ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、組換えＲＭＰの特異的活性はＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの活性と同じであると考えられた（これについては、後で確認した）。
【０１４１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＤＡ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡを行ったところ、大規模で培養する場合には、１つの形状のＲＭＰのみが存在することが判った。ＲＭＰはこれらの成長条件下でも、過剰にグリコシル化した。ゲル上にみられるタンパクの量は、酵素活性から予測された量とよく相関を有した。
【０１４２】
ＲＭＰを親和性クロマトグラフィーおよび寸法排除クロマトグラフィーによって培養液の上澄みから精製した。
精製した組換えＲＭＰのＮ−末端配列を、Ｔｈｉｍら（ＴＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８７年、印刷中）によって報告されたのと同様に気相配列装置を用いて、測定した。
【０１４３】
組換えＲＭＰの２つの形状はＮ−末端における加工が不均一であることを示した。一つの形状はAla-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-のＮ−末端配列を有し、もう一方はGly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-のＮ−末端配列を有した。
Ｎ−末端でのかかる不均一加工も、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからの元のＲＭＰについて記載されている（Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．ら、Ｎｅｔｈ．Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、１９８１年、３５８〜３６０頁）。組換えＲＭＰの不均一加工は元のＲＭＰの不均一加工と良好な相関を有し、Ａ．ｏｒｙｚａｅは本発明によれば正確な領域で組換えＲＭＰを加工することができることが判った。
【０１４４】
実施例１２ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるプロキモシンの産生に就いての発現単位の構成
この構成は、Ａ．ｏｒｙｚａｅアミラーゼプロモーターの制御下でＡ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのシグナルペプチド配列がすぐ先行するプロキモシン遺伝子を含む。この構成は更に、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子とＥ．ｃｏｌｉ複製体からのターミネーターを含む。
ｐ２８５′ｐｒｏＣ（実施例１参照）からの約４３０bp ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩフラグメントおよび以下の配列
【０１４５】
【化８】
を有する合成オリゴマーをＥｃｏＲＩ−ＸｍａＩ切断ｐＵＣ１９プラスミド中に挿入して、プラスミドｐＴｏＣ５０ａを生成した。
ｐＴｏＣ５０ａをＥｃｏＲＩ−ＳａｃIIで切断し、ｐＵＣ１９を含む大きなフラグメントとプロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の５′部分を単離した。このフラグメントをｐＴＡＫＡ １７からの０．６kb ＥｃｏＲＩ−ＢａｎＩフラグメントおよび以下の合成オリゴマーと連結した。
【０１４７】
【化９】
形質転換の後、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子（プレＴＡＫＡ）からのシグナル配列に融合し且つ約５００bp上流のＴＡＫＡ−アミラーゼ配列が先行するプロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の５′部分を含むプラスミドｐＴｏＣ５１を単離した。ｐＴｏＣ５１の構成を図１９に示す。
【０１４９】
ｐＲ２６をＨｉｎｆＩで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび４個のｄＮＴＰの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、ＸｍａＩで切断した。プロキモシン遺伝子の３′末端を含む７５０bpフラグメントを単離した。このフラグメントの３′末端でのＨｉｎｄIII を挿入するために、ｐＵＣ９をＸｍａＩ／ＨｉｎｃIIで切断して、大きなフラグメントをプロキモシン遺伝子の３′末端を含む７５０bpフラグメントに連結した。
【０１５０】
ｐＴＡＫＡ １７からの５．６kb ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメントを単離して、同じプラスミドからの２．６kb ＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントおよびＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子ターミネーターおよびポリＡ部位を含むｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍ（実施例４参照）からの０．７kb ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII と連結した。生成するプラスミドはｐＴｏＣ５２として図２０に示す。
【０１５１】
ｐＴｏＣ５２をＨｉｎｄIII で切断し、ＥｃｏＲＩで部分的に切断し、６．４kbフラグメントを単離した。これをｐＴｏＣ５１からの０．９kb ＥｃｏＲＩ−ＸｍａＩフラグメントおよびプロキモシン遺伝子（′プロキモシン）の３′部分を含むｐＵＣ９′ＰＣからの０．７kb ＸｍａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントと連結した。生成するプラスミドはｐＴｏＣ５６と呼ばれ、図２０に示す。
【０１５２】
実施例１３ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるプロキモシンの発現
ｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ遺伝子）またはｐＳａｌ４３（ａｒｇＢ遺伝子）と共形質転換することによって、ｐＴｏＣ５６をＡ．ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ４１７７またはａｒｇＢ変異株に形質転換した。選択的培地で成長する形質転換体を、実施例９と同様に２回再度単離した。
【０１５３】
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄液のプロキモシン含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後Ｗｅｓｔｅｒｎブロット上でＥＬＩＳＡによって分析した。形質転換体は、上澄液中に１〜１０mg／ｌのプロキモシンの寸法免疫反応性タンパクを産生した。他の免疫反応性タンパクは上澄液中に検出されなかった。
【０１５４】
実施例１４ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＲＭＬの発現
実施例８からのｐ７８７を、実施例９に記載の方法によってｐ３ＳＲ２で共形質転換することによってＩＦＯ−４１７７中に形質転換した。形質転換体を実施例９と同様に選択して、再度単離した。
３日間成長させた形質転換体のＹＰＤ培養液からの上澄液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎブロットおよびＥＬＩＳＡを行って分析した。最良の形質転換体は、タンパク１リットル当り２mgの成熟ＲＭＬの寸法を産生した。上澄液におけるリパーゼ活性を、トリブチリンを開裂する能力として計測した（ＮＯＶＯ法ＡＦ ９５．１／３−ＧＢ）。
この測定によって上澄液に２mg／ｌの活性リパーゼが存在することが判った。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターおよび上流プロモーター領域のＤＮＡ−配列を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＡＫＡ １７のエンドヌクレアーゼ制限マップを示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣの構成を示す図である。
【図４】図４は、３文字省略によって与えられる推定アミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼのＤＮＡ配列を示す図である。
【図５】図５は図４の続きの図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＲＭＰの構成を示す図である。
【図７】図７は、プラスミドｐＣＡＭＧ９１のエンドヌクレアーゼ制限マップを示す図である。
【図８】図８はプラスミドｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドｐ６８６の構成を示す図である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍの構成を示す図である。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＢ４０８．３の構成を示す図である。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＢ７７８の構成を示す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＢ７１９の構成を示す図である。
【図１４】図１４は、プラスミドｐ７７７の構成を示す図である。
【図１５】図１５は、３文字省略によって与えられる推定アミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼｃＤＮＡの配列を示す図である。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＢ５４４の構成を示す図である。
【図１７】図１７は、プラスミドｐ７８７の構成を示す図である。
【図１８】図１８は、合成フラグメントＲＭＬ５′のＤＮＡ配列を示す図である。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＴｏＣ５１の構成を示す図である。
【図２０】図２０は、プラスミドｐＴｏＣ５６の構成を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）による異種タンパク生成物の発現および分泌のための宿主とベクターとの組合せ物であって、
（１）アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）宿主のゲノム中に１個以上のコピーを組込み可能であり、かつ、アスペルギルス・オリザ（ Aspergillus oryzae ）由来の TAKAアミラーゼ遺伝子からのプロモーター又はアスペルギルス．ニガー（ Aspergillus niger ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA 配列と形質転換細胞の選択に好適なマーカーと培養基への発現生成物の分泌を提供するためのプレ配列と所望のタンパク生成物を暗号化するDNA 配列とを含んで成る組換えDNA クローニングベクター系；並びに
（２）選定された選択マーカーについての機能的遺伝子を有しないアスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）；
を組合せて成り、前記組換えDNA クローニングベクター系で形質転換して得られる宿主を適当な培養基中で培養した場合に、前記タンパク生成物を分泌せしめることができる組合せ物。
【請求項２】 前記遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA 配列が、プロモーター、転写開始部位、並びに転写ターミネーターおよびポリアデニル化機能を有する、特許請求の範囲第１項記載の組合せ物。
【請求項３】 前記プロモーターに対して、上流活性化配列が先行する、特許請求の範囲第２項記載の組合せ物。
【請求項４】 前記選択マーカーが、アスペルギルス・ニドランス（A nidulans）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)argB、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans)trpC 、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans)amdS、ニューロスポラ・クラザーエ（Neurospora crassae)Pyr4 またはDHFRに由来する、特許請求の範囲第１項記載の組合せ物。
【請求項５】 前記選択マーカーがアスペルギルス．ニドランス（Aspergillus nidulans）もしくはアスペルギルス．ニガー（Aspergillus niger ）に由来するArgB遺伝子またはＡ．ニドランス（Aspergillus nidulans）に由来するamdS遺伝子である、特許請求の範囲第４項記載の組合せ物。
【請求項６】 前記プロモーターおよび上流活性化配列が、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae)TAKA アミラーゼ、またはアスペルギルス．ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼの遺伝子に由来する、特許請求の範囲第３項記載の組合せ物。
【請求項７】 前記プロモーターが、アスペルギルス・オリザAspergillus oryzae TAKA アミラーゼプロモーターである、特許請求の範囲第６項記載の組合せ物。
【請求項８】 前記プロモーターおよび上流活性化配列が、以下の配列：
GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC
CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT
ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA
AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC
TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT
TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA
GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG
CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA
GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG
TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT
AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT
TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT
CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA
TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA
GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT
CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC
AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG
CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA
TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA
GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT
CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA
AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC
ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG
を有するか、あるいは上記ヌクレオチド配列の一部であって上記プロモーター及び上流活性化配列の生物学的機能を維持しているものを有する、特許請求の範囲第７項記載の組合せ物。
【請求項９】 前記プロモーターおよび上流活性化配列が、以下の配列：
AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA
CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC
CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA
GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG
ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA
GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC
CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA
CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC
CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA
ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG
GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT
AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG
GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG
GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA
ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC
AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT
CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC
GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC
AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA
AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC
TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC
CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA
TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG
AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT
を有するか、あるいは上記ヌクレオチド配列の一部であって上記プロモーター及び上流活性化配列の生物学的機能を維持しているものを有する、特許請求の範囲第７項記載の組合せ物。
【請求項１０】 特許請求の範囲第９項記載の配列に対して、プラスミドpTAKA 17における位置0 〜1.05の1.05kbの配列決定されていない上流領域が先行する、特許請求の範囲第９項記載の組合せ物。
【請求項１１】 前記プレ領域が、アスペルギルス（Aspergillus）の種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バシラス（Bacillus）の種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・マイヘイ（Rhizomucor miehei）からのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビゼ（Sacchromyces cerevisiae）からのα−因子の遺伝子または仔牛のプロキモシン遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１項記載の組合せ物。
【請求項１２】 前記プレ領域が、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae)TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の酸に安定なα−アミラーゼ、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、α−アミラーゼ、バシラス（Bacillus)NCIB 11837 マルトース生成アミラーゼ、バシラス・ステロサーフィラス（Bacillus stearothermophilus）α−アミラーゼまたはバシラス・リケニホルミス・ズブチリシン（Bacillus licheniformis subtilisin）の遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１１項記載の組合せ物。
【請求項１３】 前記プレ領域が、以下の配列：
ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCT
MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaProAlaLeuAla
を有するTAKA−アミラーゼプレ領域である、特許請求の範囲第１２項記載の組合せ物。
【請求項１４】 前記ベクター系が２個のベクターを含んで成り、一方が選択マーカーを有し、他方は遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA 配列と所望のタンパク生成物を暗号化するDNA 配列を有する、特許請求の範囲第１項記載の組合せ物。
【請求項１５】 アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）による真菌類タンパク生成物の発現および分泌のための、請求項１に記載の宿主とベクターとの組合せ物であって、
（１）アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）宿主のゲノム中に１個以上のコピーを組込み可能であり、かつ、アスペルギルス・オリザ（ Aspergillus oryzae ）由来の TAKAアミラーゼ遺伝子からのプロモーター又はアスペルギルス．ニガー（ Aspergillus niger ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子からのプロモーターを含んでなる遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA 配列と形質転換細胞の選択に好適なマーカーと培養基への発現生成物の分泌を提供するためのプレ領域と所望のタンパク生成物を暗号化するDNA 配列とを含んで成る組換えDNA クローニングベクター系；
（２）並びに選定された選択マーカーについての機能的遺伝子を有しないアスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）；
を組合せて成り、前記組換えDNA クローニングベクター系で形質転換して得られる宿主を適当な培養基中で培養した場合に、前記真菌類タンパク生成物を分泌せしめることができる組合せ物。
【請求項１６】 前記遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA 配列が、プロモーター、転写開始部位、並びに転写ターミネーターおよびポリアデニル化機能を有する、特許請求の範囲第１５項記載の組合せ物。
【請求項１７】 前記プロモーターに対して、上流活性化配列が先行する、特許請求の範囲第１５項記載の組合せ物。
【請求項１８】 前記選択マーカーが、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）もしくはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)argB 、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans)trpC 、アスペルギルス.ニドランス（Aspergillus nidulans)amdS 、ニューロスポラ・クラザーエ（Neurospola crassae)Pyr4 またはDHFRに由来する、特許請求の範囲第１５項記載の組合せ物。
【請求項１９】 前記選択マーカーが、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に由来するArgB遺伝子またはアスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）に由来するamdS遺伝子である、特許請求の範囲第１８項記載の組合せ物。
【請求項２０】 前記プロモーターおよび上流活性化配列が、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae)TAKA アミラーゼ、またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）グルコアミラーゼの遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１７項記載の組合せ物。
【請求項２１】 前記プロモーターが、Aspergillus oryzae TAKA アミラーゼプロモーターである、特許請求の範囲第２０項記載の組合せ物。
【請求項２２】 前記プロモーターおよび上流活性化配列が、以下の配列：
GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC
CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT
ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA
AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC
TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT
TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA
GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG
CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA
GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG
TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT
AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT
TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT
CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA
TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA
GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT
CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC
AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG
CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA
TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA
GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT
CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA
AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC
ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG
を有するか、あるいは上記ヌクレオチド配列の一部であって上記プロモーター及び上流活性化配列の生物学的機能を維持しているものを有する、特許請求の範囲第２１項記載の組合せ物。
【請求項２３】 プロモーターおよび上流活性化配列が以下の配列
AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA
CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC
CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA
GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG
ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA
GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC
CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA
CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC
CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA
ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG
GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT
AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG
GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG
GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA
ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC
AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT
CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC
GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC
AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA
AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC
TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC
CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA
TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG
AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT
を有するか、あるいは上記ヌクレオチド配列の一部であって上記プロモーター及び上流活性化配列の生物学的機能を維持しているものを有する、特許請求の範囲第２１項記載の組合せ物。
【請求項２４】 特許請求の範囲第２３項記載の配列に対して、プラスミドpTAKA 17における位置0 〜1.05の1.05kbの配列決定されていない上流領域が先行する、特許請求の範囲第２３項記載の組合せ物。
【請求項２５】 前記プレ領域が、アスペルギルス（Aspergillus）の種からのグルコアミラーゼもしくはアミラーゼ遺伝子、バシラス（Bacillus）の種からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコール・マイヘイ（Rhizomucor miehei）からのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロミセス・セレビゼ（Saccharomyces cerevisiae）からのα−因子の遺伝子または仔牛のプロキモシン遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１５項記載の組合せ物。
【請求項２６】 前記プレ領域が、アスペルギルス．オリザ（Aspergillus oryzae)TAKA アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の酸に安定なα−アミラーゼ、バシルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、α−アミラーゼ、バシラス（Bacillus)NCIB 11837 マルトース生成アミラーゼ、バシラス・ステロサーフィラス（Bacullus stearothermophilus）α−アミラーゼ、またはＢ．リケニホルミス・ズブチリシン（Bacillus licheniformis subtilisin）の遺伝子に由来する、特許請求の範囲第２５項記載の組合せ物。
【請求項２７】 前記プレ領域が、以下の配列：
ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCT
MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaProAlaLeuAla
を有するTAKA−アミラーゼプレ領域である、特許請求の範囲第２６項記載の組合せ物。
【請求項２８】 前記ベクター系が、２個のベクターを含んで成り、一方が選択マーカーを有し、他方は遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA 配列と所望のタンパク生成物を暗号化するDNA 配列を有する、特許請求の範囲第１５項記載の組合せ物。
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