PL183149B1

PL183149B1 - Sposób wytwarzania zlokalizowanych zmian gęstości barwy na powierzchni wybarwionej tkaniny celulozowej i środek celulozowy

Info

Publication number: PL183149B1
Application number: PL96325478A
Authority: PL
Inventors: Masahiro Onishi; Merete Fich; Annette Hanne Toft; Martin Schülein
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-03
Publication date: 2002-05-31
Also published as: PL325478A1; ES2200070T5; DE69628311T3; TR199800402T1; DE69628311D1; CN1163577C; JP3943132B2; EP0850295B1; JPH11513081A; ES2200070T3; EP0850295A1; DE69628311T2; WO1997009410A1; AU6785396A; MX9801735A; CN1242040A; EP0850295B2

Abstract

1. Sposób wytwarzania zlokalizowanych zmian gestosci barwy na powierzchni wy- barwionej tkaniny celulozowej, zwlaszcza barwionego indygiem drelichu, polegajacy na mieszaniu tkaniny w srodowisku wodnym, znamienny tym, ze mieszanie prowadzi sie w srodowisku wodnym o wartosci pH w zakresie 6,5-9, zawierajacym pierwszy skladnik, któ- rym jest albo (a) celulaza z rodziny 5 zdolna do hydrolizy p-nitrofenylo- ß- 1 ,4-celobiozydu, albo (b) celulaza z rodziny 7, i drugi skladnik, którym jest albo (a) srodek scierajacy mechani- cznie, albo (b) celulaza wykazujaca aktywnosc scierajaca, przy czym kazda celulaza wykazu- je co najmniej 30% swojej maksymalnej aktywnosci przy pH 7. 11. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze srodowisko wodne jest zasadniczo wolne od celulazy innej niz pierwszy i drugi skladnik. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zlokalizowanych zmian gęstości barwy na powierzchni wybarwionej tkaniny celulozowej oraz środka celulazowego do stosowania w tym sposobie.

Przy wytwarzaniu odzieży z barwionej tkaniny celulozowej, np. niebieskich dżinsów z barwionego indygiem drelichu, poddaje się drelich obróbce w celu wytworzenia wyglądu jak po „praniu z kamieniami” (zlokalizowane wytarcie wybarwienia na powierzchni drelichu). Można to osiągnąć mieszając drelich w środowisku wodnym zawierającym mechaniczny środek ścieraj ący, taki j ak pumeks, ścieraj ącą celulazę lub ich połączenie. Korzystnie j est prowadzić proces w przybliżeniu przy obojętnym pH, a więc korzystnie jest stosować celulazę o wysokiej aktywności w tym zakresie pH. W przeszłości preparaty celulazy zwykle wytwarzano przez hodowanie naturalnie występujących mikroorganizmów i takie preparaty niezmiennie stanowiły mieszaninę wielu różnych składników celulazowych. Proces wykorzystujący takie mieszane preparaty celulazy opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4832864 (Ecolab).

Szybkie postępy w technologii rekombinacji DNA umożliwiały wytwarzanie jednoskładnikowych enzymów z dużą wydajnością, a więc procesy wykorzystujące jednoskładnikowe celulozy stały się bardziej interesujące. Tak więc publikacje WO 91/17243 i WO 95/09225 (Novo Nordisk) opisująproces wykorzystujący jednoskładnikową endoglukanazę EG V o masie cząsteczkowej ~43 kD otrzymaną ze szczepu DSM 1800 Humicola insolens z optimum aktywności przy prawie obojętnym pH. Publikacja WO 94/21801 (Genencor) opisuje zastosowanie w „praniu z kamieniami” jednoskładnikowej celulazy nazywanej EG III, pochodzącej z Trichoderma longibrachiatum, o opisanym optimum działania przy pH 5,5-6,0 i zachowującej znaczącą aktywność przy zasadowym pH. Publikacja WO 95/16782 (Genencor International) proponuje stosowanie innych jednoskładnikowych celulaz pochodzących z Trichoderma w praniu z kamieniami, ale te celulazy są kwasowe i nie wykazują praktycznie żadnej aktywności przy obojętnym pH.

Ogólnym problemem w znanych sposobach prania z kamieniami jest problem wtórnego zabarwienia, to jest zjawisko, w którym barwnik już usunięty przez wytarcie osadza się na częściach tkaniny lub odzieży wygładzając żądane zmiany gęstości barwy lub przebarwiając wszelkie jasno wybarwione części odzieży.

Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że dodanie pewnego typu celulozy osłabia wtórne zabarwianie. Celulaza ta nie wykazuje sama znaczącego działania ścierającego.

Tak więc zgodny z wynalazkiem sposób wytwarzania zlokalizowanych zmian gęstości barwy na powierzchni wybarwionej tkaniny celulozowej polega na mieszaniu tkaniny w środowisku wodnym i charakteryzuje się tym, że stosuje się środowisko wodne o pH w zakresie 6,5-9 zawierające pierwszy składnik, którym jest albo (a) celulaza z rodziny 5 zdolna do hydrolizy p-nitrofenylo-b-l,4-celobiozydu, albo (b) celulaza z rodziny 7, oraz drugi składnik, którym jest albo (a) środek ścierający mechanicznie, albo (b) celulaza wykazująca aktywność ścierającą, przy czym każda celulaza wykazuje co najmniej 30% swojej maksymalnej aktywności przy pH 7.

Jako celulazę (a) stanowiąca pierwszy składnik można także stosować celulazę z rodziny 5 zdolny do hydrolizy celotriozy.

Środek celulazowy do stosowania w tym sposobie charakteryzuje się tym, że zawiera wyżej zdefiniowane pierwszy i drugi składnik.

Określenia stosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych mają następujące definicje.

Określenie „celulaza” oznacza enzym przyczyniający się do hydrolizy celulozy, taki jak celobiohydrolaza (Nomenklatura Enzymów E. C. 3. 2. 1. 91), endoglukanaza (dalej oznaczana skrótem „EG:”, E. C. 3. 2. 1.4) lub b-glukozydaza (E. C. 3. 2. 1. 21).

Celulazy klasyfikuje się w rodziny na podstawie podobieństw sekwencji aminokwasowej według systemu klasyfikacji opisanego u Henrissata, B. i in.: Biochem. J., (1991), 280, str. 309-16, i Henrissata, B. i in.: Biochem. J., (1993), 293, str. 781-788.

Celulazy stosowane w tym wynalazku są korzystnie jednoskładnikowe, tojest wodne środowisko stosowane w wynalazku powinno być wolne od innych składników celulazowych niż wymienione. Jednoskładnikowe enzymy można wytwarzać ekonomicznie metodą rekombinacji DNA, to jest można je wytwarzać przez klonowanie sekwencji DNA kodującej pojedynczy

183 149 składnik, następnie transformując odpowiednią komórkę gospodarza sekwencją DNA i dokonując ekspresji składnika w gospodarzu.

Tak więc sekwencję DNA kodującą użyteczną celulazę można wydzielić ogólnym sposobem obejmującym:

- klonowanie, w odpowiednie wektory, biblioteki DNA, np. z jednego z mikroorganizmów wskazanych dalej w tym opisie,

- transformowanie odpowiednich komórek gospodarza drożdżowego takimi wektorami,

- hodowanie komórek gospodarza w odpowiednich warunkach w celu uzyskania ekspresji dowolnego interesującego enzymu kodowanego klonem w bibliotece DNA,

- prowadzi się badanie przesiewowe dla wybrania pozytywnych klonów przez określenie wszelkiej aktywności celulazy enzymu wytworzonego przez takie klony, i

- wydzielanie DNA kodującego enzym z takich klonów.

Ogólny sposób ujawniono w dalszej części w publikacji WO 94/14953 (Novo Nordisk), której zawartość dołącza się jako odnośnik.

Sekwencję DNA kodującą użyteczną celulazę można na przykład wydzielić przez badanie przesiewowe biblioteki cDNA danego mikroorganizmu i wybranie klonów zapewniających ekspresję aktywności odpowiedniego enzymu (to jest aktywności celulazy).

Sekwencję DNA kodującą homologiczny enzym, tojestanalogicznąsekwencję DNA, można otrzymać z innych mikroorganizmów. Na przykład sekwencję DNA można uzyskać przez podobne selekcjonowanie biblioteki cDNA innych grzybów, takich jak szczep Aspergillus sp., w szczególności szczep A aculeatus lub A niger, szczep Trichoderma sp., w szczególności szczep T. reesei, T viride, T longibrachiatum, T harzianum lub T. koningii albo szczep Neocallimastix sp., Piromyces sp., Penicillum sp., Agaricus sp. lub Phanerochaete sp.

Alternatywnie DNA kodujący użyteczną celulozę można znanymi sposobami wydzielić z DNA z odpowiedniego źródła, takiego jak dowolny z wyżej wspomnianych organizmów, stosując syntetyczne sondy oligonukleotydowe wytworzone na bazie znanej sekwencji DNA.

Sekwencję DNA można następnie wprowadzić do rekombinowanego wektora ekspresji. Może to być dowolny wektor, który można dogodnie poddać procedurom rekombinacji DNA, a dobór wektora będzie często zależał od komórki gospodarza, do której ma być wprowadzany. Tak więc wektor może być autonomicznie replikującym wektorem, to jest wektorem występującym jako całość pozachromosomowa, której replikacjajest niezależna od replikacji chromosomów, np. plazmidem. Alternatywnie, wektor może być wektorem, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza integruje się z genomem komórki gospodarza i replikuje wraz z chromosomem(mami), z którymi się zintegrował.

W wektorze sekwencja DNA kodująca celulazę powinna być operatywnie związana z odpowiednim promotorem i terminatorem sekwencji. Promotor może być dowolną sekwencją DNA wykazującą transkrypcyjną aktywność w wybranych komórkach gospodarza i może pochodzić z genów kodujących białka homologiczne lub hetero logiczne dla komórki gospodarza. Procedury stosowane do ligacji sekwencji DNA kodujących odpowiednio celulazę, promotor i terminator, i ich insercji w odpowiednie wektory, sądobrze znane specjalistom (por. np., Sambrook i in., Molecular Cłoning. A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Komórka gospodarza, którą transformuje się sekwencją DNA, jest korzystnie komórką eukariotyczną, w szczególności komórką grzyba, takiego jako drożdże lub włókienkowa komórka grzyba. W szczególności komórka może należeć do gatunku Aspergillus lub Trichoderma, najkorzystniej Aspergillus oryzae lub Aspergillus niger. Komórki grzyba mogą być transformowane w procesie obejmującym tworzenie protoplasty i transformację protoplasty, a następnie regenerację ściany komórkowej w znany sposób. Zastosowanie Aspergillus jako mikroorganizm-gospodarza opisano w europejskim opisie patentowym nr EP 23 8023 (Novo Nordisk A/S), którego zawartość dołącza się niniejszym jako odnośnik. Komórką gospodarza może także być komórka drożdży, np. szczepu Saccharomyces, w szczególności Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri lub Saccharomyces uvarum, szczepuSchizosaccharomyces sp., takiego

183 149 jak Schizosaccharomyces pombe, szczepu Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp. takiego jak Yarrowia lipolytica lub Kluyveromyces sp. takiego jak Kluyveromyces lactis.

W niniejszym kontekście określenie „homologiczna” lub „homologiczna sekwencja” ma wskazywać sekwencję aminokwasowąróżniącąsię od pokazanych na każdej z list sekwencji podanych dalej odpowiednio jedną lub kilkoma resztami aminokwasowymi. Homologiczna sekwencja może być sekwencją powstałą z modyfikacji sekwencji aminokwasowej pokazanej na tych listach, np. może obejmować substytucje jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych w jednym lub kilku różnych miejscach sekwencji aminokwasowej, delecję jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych na jednym lub obu końcach enzymu lub w jednym lub większej liczbie miejsc sekwencji aminokwasowej, lub insercję jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych w jednym lub większej liczbie miejsc w sekwencji aminokwasowej.

Jednakże, jak to wiadomo fachowcom, korzystnie zmiany aminokwasowe powinny być nieznaczne, to znaczy mogą to być konserwatywne substytucje aminokwasami nie wpływającymi znacząco na składanie lub aktywność białka, małe delecje, typowo od jednego do około 30 aminokwasów; małe amino- lub karboksyterminalne przedłużenia, takie jak resztą amino-terminalną metioniny, małym linkerem peptydowym o najwyżej około 20-25 resztach, lub małe przedłużenia ułatwiające oczyszczanie, takie jak trakt poli-histydynowy, epitop antygenowy lub domena wiążąca. Patrz ogólnie Ford i in., Protem Expression and Purification 2:95-107,1991. Przykłady konserwatywnych substytucji mieszczą się w grupie zasadowych aminokwasów (takich jak arginina, lizyna, histydyna), kwasowych aminokwasów (takich jak kwas glutaminowy i asparaginowy), polarnych aminokwasów (takich jak glutamina i asparagina), hydrofobowych aminokwasów (takich jak leucyna, izoleucyna, walina), aromatycznych aminokwasów (takich jak fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna) i małych aminokwasów (takich jak glicyna, alanina, seryna, treonina, metionina).

Dla specjalisty będzie też oczywiste, że takich substytucji można dokonywać poza regionami krytycznymi dla funkcji cząsteczki i nadal otrzymać aktywny polipeptyd. Aminokwasy istotne dla aktywności polipeptydu kodowane przez konstrukt DNA według wynalazku, a więc korzystnie nie podatne na substytucję, mogą być identyfikowane zgodnie ze znanymi procedurami, takimi j ak miej scowo ukierunkowana mutageneza lub mutageneza ze skanowaniem alaninowym (Cunningham i Wells, Science 244, 1081-1085, 1989). W tej ostatniej technice mutacje wprowadza się w każdej reszcie w cząsteczce, a powstające mutanowe cząsteczki testuje się na czynność biologiczna (to jest celulazową) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych krytycznych dla aktywności cząsteczki. Miejsca interakcji podłoże-enzym można także określić przez analizę struktury krystalicznej badanej takimi technikami jak magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia lub badanie fotopowinowactwa znaczonych substancji. Patrz np., de Vos i in., Science 255:306-312, 1992; Smith i in„ J. Mol. Biol. 224:899-904,1992; Wlodaver i in„ FEBS Lett. 309: 59-64,1992.

Modyfikację sekwencji aminokwasowej można dogodnie przeprowadzić przez modyfikację sekwencji DNA kodującej enzym, np. metodą miej scowo ukierunkowanej lub przypadkowej mutagenezy lub ich połączeniem, zgodnie z dobrze znanymi procedurami. Alternatywnie homologiczna sekwencja może być sekwencją enzymu pochodzącego z innego źródła niż celulazy odpowiadające sekwencjom aminokwasowym pokazanym na poszczególnych listach sekwencji poniżej. Tak więc „homolog” może np. oznaczać polipeptyd kodowany DNA hybrydyzującym z tą samą sondą, co DNA kodujący celulazę z rzeczoną sekwencją aminokwasową w pewnych konkretnych warunkach (takich jak moczenie w 5 x SSC i wstępna hybrydyzacja przez godzinę w temperaturze 40°C w roztworze 20% formamidu, pięciokrotne działanie roztworem Denhardta, 50 mM fosforanu sodu, pH 6,8, i 50 mg denaturowanego sonikowanego DNA grasicy cielęcej, a następnie hybrydyzacja w tym samym roztworze uzupełnionym 100 mM ATP przez 18 godzin w temperaturze 40°C). Homologiczna sekwencja będzie normalnie wykazywała stopień homologii (w kategoriach identyczności) co najmniej 50%, taki jak stopień homologii odpowiednio co najmniej 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% lub nawet 95% z sekwencjami aminokwasów pokazanych na listach sekwencji poniżej.

183 149

Homologię tę określa się jako stopień identyczności pomiędzy dwoma sekwencjami wskazujący na pochodzenie pierwszej sekwencji od drugiej. Homologię można dogodnie określić przy pomocy znanych programów komputerowych, takich jak GAP znajdujący się w pakiecie programów GCG (Needleman, S. B. i Wunsch, C.D., Journal ofMolecularBiology, 48: 443-453, 1970).

Sposób według wynalazku można stosować wobec dowolnego typu barwionych tkanin celulozowych, gdy pożądane jest wytworzenie zlokalizowanych zmian gęstości barwy na powierzchni. Przykładem o szczególnym znaczeniu przemysłowym jest drelich, szczególnie barwiony indygiem drelich do stosowania w niebieskich dżinsach itp.

Tkaninę można potraktować w stadium nie zszytej tkaniny lub uszytej odzieży wytworzonej z takiej tkaniny. Szczególnie interesujące jest zastosowanie sposobu według wynalazku wobec nowej, czystej tkaniny lub odzieży.

Pierwszy składnik jest celulazą z rodziny 5 lub 7, która wykazuje co najmniej 30% swojej optymalnej aktywności przy pH 7. Jest on obecny w ilości skutecznie zapobiegającej wtórnemu zabarwianiu, zazwyczaj 0,05-5 mg/1 (jako czyste białko enzymatyczne), a szczególnie 0,1-0,5 mg/1, co zazwyczaj odpowiada aktywności 10-1000 ECU/1, szczególnie 100-1000 ECU/1, względnie aktywności 0,5-100 ECU/g tkaniny.

Celulaza z rodziny 5 stosowana zgodnie z wynalazkiem może hydrolizować celotriozę i/łub p-nitrofenylo-b-l,4-celobiozyd (PNP-Cel); celulaza może działać pośrednio na celotriozę, hydrolizując jąz wytworzeniem celobiozy bez tworzenia glukozy. Zdolność celulazy do hydrolizo wania PNP-Cel można określić w próbie opisanej poniżej, a celulaza jest uznawana za spełniającą ten warunek, jeśli próba ta daje wynik powyżej 0,1 μΜ PNP na minutę na ECU.

Celulaza z rodziny 5 korzystnie nie ma żadnej domeny wiążącej celulozę. Celulaza z rodzi ny 5 może być zasadową celulazą(np. endoglukanazą) pochodzącąz bakteryjnego szczepu takiego jak Bacillus lub Clostridium.

Jedna taka celulaza z rodziny 5 jest endoglukanazą ze szczepu Bacillus KSM-64 (FERM BP-2886). Celulazę i jej sekwencję aminokwasową opisano w japońskim opisie patentowym nr JP-A 4-190793 (Kao) i Sumitomo i in., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (6), 872-877 (1992).

Inną celulazą z rodziny 5 jest endoglukanaza ze szczepu KSM-635 (FERM BP-1485). Celulazę i jej sekwencję aminokwasową opisano w japońskim opisie patentowym nr JP-A 1-281090 (Kao), opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US 4945053 i Y. Ozaki i in., Journal of General Microbiology, 1990, tom 136, str. 1973-1979. Wykazuje ona aktywność wobec PNP-Cel 0,18 μΜ PNP/min/ECU w powyższej próbie.

Trzecią celulaząz rodziny 5 jest endoglukanaza ze szczepu 1139. Celulazę i jej sekwencję aminokwasową opisano w Fukumori F. i in., J. Gen. MicrobioL, 132:2329-2335 (1986) i w japońskim opisie patentowym nr JP-A 62-232386 (Riken).

Czwartącelulaząz rodziny 5 jest endoglukanaza Endo 3 A z Bacillus lautus NCIMB 40250 opisana w publikacji WO 91/10732 (Novo Nordisk). Opisana tam sekwencja aminokwasów okazała się później niepoprawna, a poprawną sekwencję pokazano jako SEKW NR ID.: 1. Celulaza wykazuje aktywność wobec PNP-Cel 0,44 μΜ PNP/min/ECU.

Piątą celulazą z rodziny 5 jest celulaza z Bacillus sp. NCIMB 40482 mająca pozorną masę cząsteczkową około 45 kD, opisana w publikacji WO 94/01532 (Novo Nordisk). Jej aktywność wobec PNP-Cel wynosi 0,22 μΜ PNP/min/ECU.

Szóstącelulaząz rodziny 5 jest endoglukanaza A z Clostridium cellulolyticum opisana w E. Faure i in., Gene, 84 (1), 39-46 (1989) i Fierobe H-P i in., J. Bacteriol., 173 (24), 7956-7962 (1991).

Celulaza z rodziny 7 do stosowania zgodnie z wynalazkiem może pochodzić ze szczepu grzybów i może zazwyczaj hydrolizować celotriozę bezpośrednio na celobiozę i glukozę, oraz może hydrolizować PNP-Cel, jak to określono np. w próbie opisanej dalej.

Celulaza z rodziny 7 może pochodzić ze szczepu Humicola, korzystnie H. insolens. Przykładem jest endoglukanaza EG I pochodząca z H insolens szczep DSM 1800, opisana w publikacji WO 91/17244 (Novo Nordisk). Dojrzała celulaza ma sekwencję 415 aminokwasów po

183 149 kazanąw pozycjach 21 -435 z fig. 14 i wykazuje specyficzną aktywność 200 ECU/mg (w oparciu o czyste białko enzymu). Tę celulazę można następnie obciąć na końcu C o 18 aminokwasów do długości co najmniej 397 aminokwasów. Przykładowo celulazę można obciąć do 402,406,408 lub 412 aminokwasów. Innym przykładem jest jej wariant nazywany endoglukanaząEG I* opisany w publikacj i WO 95/24471 (Novo Nordisk) i mający sekwencję 402 aminokwasów pokaząnych na fig. 3 tego opisu.

Alternatywnie celulaza z rodziny 7 może pochodzić ze szczepu Myceliophthora, korzystnie M. thermophila, najkorzystniej szczepu CBS 117.65. Przykładem jest endoglukanaza opisana w publikacji WO 95/24471 (Novo Nordisk) obejmująca aminokwasy 21-420 i ewentualnie także aminokwasy 1-20 i/lub 421-456 sekwencji pokazanej na fig. 6 tego opisu.

W innej alternatywie, celulaza z rodziny 7 może pochodzić ze szczepu Fusarium, korzystnie E ozysporum. Przykładem jest endoglukanaza pochodząca z E oxysporum opisana w publikacji WO 91/17244 (Novo Nordisk) i w Sheppard, P. O. i in., Gene, 150:163-167,1994. Poprawną sekwencję aminokwasowądaje ostatni odnośnik. Ta celulaza ma specyficzną aktywność 350 ECU/mg.

Drugi składnik jest środkiem ścierającym mechanicznie i/lub ścierającącelulazą. Korzystna odmiana wynalazku wykorzystuje jako drugi składnik połączenie środka ścierającego mechanicznie i ścierającej celulazy.

Przykładami mechanicznymi środków ścierających jest pumeks, spęczany ciepłem perlit i elementy ścierające (np. kulki ścierające).

Ścierającą celulazą jest celulaza wywierająca ścierającą lub rozjaśniającą kolor aktywność, np. jak opisano w europejskim opisie patentowym nr EP 220016 (Novo Nordisk A/S), wykazująca co najmniej 30% swojej optymalnej aktywności przy pH 7. Może ona być celulazą z rodziny 12 lub 45 mającą domenę wiążącą celulozę.

Celulaza z rodziny 45 do stosowania zgodnie z wynalazkiem może pochodzić ze szczepu Humicola, korzystnie H. insolens. Przykładem jest endoglukanaza nazwana EG V, pochodząca z H. insolens szczep DSM 1800 o masie cząsteczkowej około ~ 43 KD. Celulazę i jej sekwencję aminokwasową opisano w publikacji WO 91/17243 (Novo Nordisk). Ma ona specyficzną aktywność 430 ECU/mg.

Celulaza z rodziny 12 do stosowania zgodnie z wynalazkiem może pochodzić ze szczepu Trichoderma, korzystnie T. longibrachiatum. Przykładem jest endoglukanaza EG III opisana w publikacji WO 94/21801 (Genencor) mająca sekwencję aminokwasowąpokazanąwtym opisie.

Drugi składnik jest obecny w ilości ścierające skutecznej z wytworzeniem zlokalizowanych zmian gęstości barwy. Jeśli drugi składnik jest ścierającącelulazą, jest on zazwyczaj obecny w ilości 0,05-5 mg/1 (jako czyste białko enzymatyczne), szczególnie 0,1-0,5 mg/1; zazwyczaj odpowiadając aktywności 10-1000 ECU/1, szczególnie 100-1000 ECU/1; lub aktywności 0,1-100 ECU/g tkaniny, szczególnie 0,5-10 ECU/g.

Sposób według wynalazku można prowadzić w znanych warunkach w pralce zwykle stosowanej do prania z kamieniami (np. pralka-ekstraktor). Typowymi warunkami są temperatura 40-60°C i stosunek tkanina:płyn od 1:3 do 1:20 w ciągu od 15 minut do 2 godzin. Ewentualnie można stosować znane dodatki, np. bufor, środek powierzchniowo czynny (anionowy i/lub niejonowy) i/lub polimer (taki jak PWP, poliakrylan i poliakrylamid).

Próba aktywności celulazy

Endo-aktywność celulazy określa się metodą obniżania lepkości CMC (karboksy-metyloceluloza) w wiskozymetrze wibracyjnym. 1 ECU (jednostka endo-celulazowa) oznacza aktywność powodującą 10-krotną redukcję lepkości przy inkubacji z 1 ml roztworu 34,0 g/1 CMC (nazwa handlowa Aąualon 7LFD) w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,5), 40°C przez 30 minut.

Próba hydrolizy PNP-Cel

Zdolność celulazy do hydrolizowania p-nitrofenylo-b-1,4-celobiozydu (PNP-Cel) określa się przez bezpośrednie wykrywanie w procesie o kinetycznie ustalonym stanie żółtego wybarwienia produktu, p-nitrofenolu (PNP), przez absorpcję przy 405 nm. Warunki próby to 37°C, pH 7,5 (0,1 M bufor fosforanowy). Szybkość hydrolizy (w mikromolach PNP na minutę) porównuje się z aktywnościącelulazy (ECU), a wynik wyraża się jako liczbę mikromoli PNP na minutę na ECU.

183 149

Przykład 1

Barwiony indy giem drelich potraktowano wraz z próbkami białej tkaniny bawełnianej różnymi połączeniami celulazy, jak poniżej:

pH 7 (bufor fosforanowy w wodzie z kranu)

Temperatura 55°C

Sprzęt aparat Launderometer (pojemniki 150 ml)

Składnik 1 EG I pochodząca z Humicola insolens DSM 1800 0-2,3

ECU/ml, jak podano poniżej

Składnik 2 EG V pochodząca z Humicola insolens DSM 1800 0 lub 0,27 ECU/ml

Drelich 5 g/pojemnik

Biała bawełna 2 próbki/pojemnik

Czas 2 godziny

Po obróbce starte kłaczki zebrano i dokonano pomiarów oceniających ścierające działanie celulaz. Zmierzono zanieczyszczenie białych próbek po obróbce (D R przy 680 nm, względem wyników doświadczenia bez celulazy) i przyjęto za miarę wtórnego zabarwiania. Wyniki:

	Składnik 1 ECU/ml	Składnik 2 ECU/ml	Ścieranie (mg startych kłaczków)	Zmniejszenie wtórnego zabarwienia (D R)
Odnośnik	0	0	-	0
0	0,27	33	-3,8
Wynalazek	0,115	0,27	42	-0,7
0,23	0,27	36	3,0
1,15	0,27	38	8,2
	2,3	0,27	62	10,4

Dobre ścieranie uzyskano ze składnikiem celulazowym 2. Dodawanie składnika celulazowego 1 znacznie zredukowało wtórne zabarwienie.

Przykład 2

Następujące celulazy testowano w tych samych warunkach jak w przykładzie 1:

Składnik 1 EG I lub EG I* pochodząca z Humicola insolens DSM 1800,0,0,67 lub 1,33 ECU/ml

Składnik 2 EG V pochodząca z Humicola insolens DSM 1800, 0,7 ECU/ml

Ścieranie oceniano mierząc ilość startych kłaczków po każdej obróbce. Stwierdzono dobre ścieranie w każdym doświadczeniu, ze słabym wzrostem po dodaniu EG I lub EG I*.

Hamowanie wtórnego zabarwiania określono ze wzrostu absorbancji przesączu przy 680 nm i ze wzrostu zabarwiania białej tkaniny przy 420 nm. Wyniki pokazały, że praktycznie takie samo hamowanie wtórnego zabarwiania uzyskano z EG I i EG I*.

Przykład 3

W pierwszym etapie wytworzono niebiesko zabarwioną ciecz z drelichu wytrząsając 12 kawałków (5x5 cm) niebieskiego drelichu z 800 ml buforu fosforanowego (pH 7,0) i 0,8 ml niejonowego środka powierzchniowo czynnego w temperaturze 50°C przez 30 minut, a następnie odsączając.

W drugim etapie 5 kawałków białej bawełny trzymano w 200 ml niebieskiej cieczy w temperaturze 50°C przez 30 minut w obecności 0-100 ECU/1 celulazy. Badaną celulazą była mieszanina EG I pochodzących z Humicola insolens DSM 1800 obciętych do 406, 408 i 412 aminokwasów.

183 149

Po przepłukaniu i osuszeniu określono hamowanie wtórnego zabarwiania ze wzrostu jasności (L*) białych próbek mierzonych urządzeniem Dr. Lange Micro Color Data Station. Wyniki (średnia dla 5 próbek):

ECU/1	Średnia jasność (L*)
0	83,42
1	84,02
10	86,16
100	92,58

Wyniki pokazują, że EG I skutecznie redukuje wtórne zabarwienie białej bawełny przez niebieski drelich.

Przykład 4

Zasadową celulazę Bacillus z rodziny 5 według wynalazku testowano w taki sam sposób jak w przykładzie 3. Wyniki były następujące:

ECU/1	Średnia jasność (L*)
0	82,52
90	83,82

Wyniki pokazują, że ta celulaza także skutecznie redukuje wtórne zabarwianie.

Przykład 5 kawałki (5x5 cm) odklejonego niebieskiego drelichu i 8 kawałków (5x5 cm) białej merceryzowanej bawełny mieszano w 400 ml 50 mM bufora fosforanowego (pH 7,0) zawierającego celulazę z rodziny 5 lub 7 wraz z celulazą z rodziny 45 według wynalazku (200 ECU/1 każdej celulazy). Po 30 minutach tkaniny przepłukano pod bieżącą wodąz kranu i osuszono na powietrzu.

Celulaza z rodziny 5 była zasadową celulazą Bacillus. Celulaza z rodziny 7 była EG I pochodzącą z Humicola insolens obciętą do 408 aminokwasów. Celulaza z rodziny 45 była EG V pochodząca z Humicola insolens DSM 1800.

Zmierzono jasność (L*) dwu tkanin i absorbancję przy 680 nm supematanta. Wyniki:

Rodzina celulazy		Jasność (L*)		Aso
Pierwszy składnik	Drugi składnik	Marceryzowana bawełna	Drelich
1	2
brak	rodzina 45	84,8	22,83	0,132
rodzina 7	rodzina 45	86,3	23,55	0,212
rodzina 5	rodzina 45	86,2	23,50	0,238

Wyniki dla merceryzowanej bawełny wykazują zwiększoną jasność, to jest zmniejszone wtórne zabarwianie, dzięki dodawaniu drugiego składnika celulazowego według wynalazku.

Wyniki pokazujątakże zwiększonąjasność, to jest zmniejszone wtórne zabarwianie, niebieskiego drelichu. Ogląd wykazał, że drelich potraktowany według wynalazku miał wyraźniejsze zlokalizowane zmiany natężenia barwy, co jest pożądane.

Dane absorbancji supematanta pokazują, że więcej pigmentu pozostało w cieczy po obróbce.

183 149

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Novo Nordisk A/S (B) ULICA: Novo Alle (C) MIASTO: Bagsvaerd (E) KRAJ: Dania (F) KOD POCZTOWY: DK-2880 (G) TELEFON: +45-4444-8888 (H) TELEFAX: +45-4449-3256 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Zapobieganie wtórnemu zabarwianiu przy praniu z kamieniami (iii) LICZBA SEKWENCJI: 1 (iv) POSTAĆ KOMPUTEROWA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release 1.0, wersja 1.30 (EPO) (2) INFORMACJA O SEKW. NR ID.: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)DłUGOŚĆ: 551 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NIĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Bacillus lautus (B) SZCZEP: NCIMB 40250 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 1:

183 149

Ala Pro Ala Val Pro Phe Gly Gin 15

Val Gly Gin Ser Gly Gin Ala Val 20

Gly Leu Gin Trp Tyr Gly Asn Phe 3540

Met Arg Asp Asn Trp Gly Ile Asn 5055

Ala Glu Asp Gly Tyr Ile Thr Asp 6570

Glu Ala Val Gin Ala Ser Ile Asp 85

Trp His Ile Leu Ser Asp Gly Asn

100

Lys Ala Phe Phe Gin Glu Met Ala 115120

Val Ile Tyr Glu Ile Ala Asn Glu 130135

Asp Val Lys Ser Tyr Ala Glu Glu 145150

Asp Pro Asp Gly Val Val Ile Val 165

Ile His Leu Ala Ala Asp Asn Pro

180

Ala Leu His Phe Tyr Ser Gly Thr 195200

Ile Thr Tyr Ala Met Asn Lys Gly 210215

Gly Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn 225230

Leu Lys Val Gin Gly Asn Gin Leu

1015

Gin Leu Val Gly Met Ser Ser His

2530

Val Asn Lys Ser Ser Leu Gin Trp

Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr

Pro Ser Val Lys Asn Lys Val Lys

7580

Leu Gly Leu Tyr Val Ile Ile Asp

9095

Pro Asn Thr Tyr Lys Ala Gin Ser

105110

Thr Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn

125

Pro Asn Gly Asn Val Ser Trp Ala

140

Val Ile Thr Ala Ile Arg Ala Ile

155160

Gly Ser Pro Thr Trp Ser Gin Asp

170175

Val Ser His Ser Asn Val Met Tyr

185190

His Gly Gin Phe Leu Arg Asp Arg

205

Ala Ala Ile Phe Val Thr Glu Trp

220

Gly Gly Pro Tyr Phe Pro Gin Ser

235 240

183 149

Lys Glu Trp Ile Asp Phe Leu Asn

245

Trp Ser Leu Ala Asp Lys Val Glu

260

Ala Ser Pro Thr Gly Gly Trp Thr

275280

Lys Trp Val Arg Asp Gin Ile Arg

290295

Asn Pro Thr Ala Pro Ala Ala Pro

305310

Asn Ala Gin Val Ser Leu Thr Trp

325

Tyr Thr Val Lys Arg Ala Thr Thr

340

Ala Thr Gly Val Thr Ala Thr Ser

355360

Gly Thr Thr Tyr Tyr Tyr Val Val

370375

Ser Ala Asn Ser Ala Gin Ala Ser

385390

Ser Thr Gly Asn Leu Val Val Gin

405

Thr Asp Asn Gin Met Lys Pro Ser

420

Thr Pro Val Asn Leu Ser Gly Leu

435440

Asp Gly Thr Ala Asp Met Ser Ala

450455

Ala Ser Asn Val Ser Ala Ala Phe

465 470

Ala Arg Lys Ile Ser Trp Val Asn

250255

Thr Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly

265270

Asp Ala Gin Leu Ser Glu Ser Gly

285

Gin Ala Thr Gly Gly Gly Ser Gly

300

Thr Asn Leu Ser Ala Thr Ala Gly

315320

Asn Ala Val Ser Gly Ala Thr Ser

330335

Ser Gly Gly Pro Tyr Thr Asn Val

345350

Tyr Thr Asn Thr Gly Leu Thr Asn

365

Ser Ala Ser Asn Ser Ala Gly Ser

380

Ala Thr Pro Ala Ser Gly Gly Ala

395400

Tyr Lys Val Gly Asp Thr Ser Ala

410415

Phe Asn Ile Lys Asn Asn Gly Thr

425430

Lys Leu Arg Tyr Tyr Phe Thr Lys

445

Ser Phe Asp Trp Ala Gin Ile Gly

460

Ala Asn Phe Thr Gly Ser Asn Thr

475 480

Asp Thr Tyr Val Glu Leu Ser Phe Ser

485

Ala Gly Gly Gin Thr Gly Asp Ile Gin

500505

Trp Ser Asn Phe Asn Glu Ala Asn Asp

515520

Thr Ala Tyr Ala Asp Trp Asn Arg Val

530535

Leu Val Trp Gly Thr Thr Pro

545550

Ala Gly Ser Gly Ser Ile Pro

490 495

Leu Arg Met Tyr Lys Thr Asp

510

Tyr Ser Tyr Asp Gly Ala Lys

525

Thr Leu His Gin Asn Gly Thr

540

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania zlokalizowanych zmian gęstości barwy na powierzchni wybarwionej tkaniny celulozowej, zwłaszcza barwionego indygiem drelichu, polegający na mieszaniu tkaniny w środowisku wodnym, znamienny tym, że mieszanie prowadzi się w środowisku wodnym o wartości pH w zakresie 6,5-9, zawierającym pierwszy składnik, którym jest albo (a) celulaza z rodziny 5 zdolna do hydrolizy p-nitrofenylo-β-1,4-celobiozydu, albo (b) celulaza z rodziny 7, i drugi składnik, którym jest albo (a) środek ścierający mechanicznie, albo (b) celulaza wykazująca aktywność ścierającą, przy czym każda celulaza wykazuje co najmniej 30% swojej maksymalnej aktywności przy pH 7.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszym składnikiem jest celulaza z rodziny 5 bez domeny wiążącej celulozę, pochodząca ze szczepu bakteiyjnego, korzystnie szczepu Bacillus.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się celulazę z rodziny 5 pochodzącą ze szczepu Bacillus wybranego z grupy obejmującej Bacillus sp. KSM-G4, 1139 i KSM-635 lub celulazę wykazującą co najmniej 60% homologii z taką celulazą.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się celulazę z rodziny 5 pochodzącą ze szczepu Bacillus wybranego z grupy obejmującej Bacillus sp. NCIMB 40482 i Bacillus lautus NCIMB 40250 lub celulazę wykazującąco najmniej 60% homologii z takącelulozą.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako pierwszy składniki stosuje się celulazę z rodziny 7 pochodzącą ze szczepu grzybów, korzystnie szczepu Humicola, a najkorzystniej H. insolens.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako celulazę z rodziny 7 stosuje się endoglukanazę EG I pochodzącą ze szczepu//, insolens DSM 1800 lub celulazę wykazującąco najmniej 60% homologii z EG I.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwszy składnik stosuje się w ilości 0,1-0,5 mg/1 lub w stężeniu 100-1000 ECU/1.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugi składnik stosuje się środek ścierający mechanicznie i ścierającą celulazę.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugi składnik stosuje się celulazę z rodziny 45 zawierającą domeny wiążące celulozę, pochodzącą ze szczepu grzybów, korzystnie szczepu Humicola, a najkorzystniej H. insolens.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako celulazę z rodziny 45 stosuje się endoglukanazę EG V pochodzącą ze szczepu H. insolens DSM 1800 lub celulazę wykazującą co najmniej 60% homologii z EG V.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środowisko wodne jest zasadniczo wolne od celulazy innej niż pierwszy i drugi składnik.
12. Środek celulazowy, znamienny tym, że zawiera pierwszy składnik, którym jest albo (a) celulaza z rodziny 5 zdolna do hydrolizy p-nitrofenylo-β-1,4-celobiozydu, albo (b) celulaza z rodziny 7, i drugi składnik, którym jest albo (a) środek ścierający mechanicznie, albo (b) celulaza wykazująca aktywność ścierającą, przy czym każda celulaza wykazuje co najmniej 30% swojej maksymalnej aktywności przy pH 7.

183 149