ES2791891T3 - Uso de tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina en composiciones de aditivo para piensos - Google Patents

Uso de tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina en composiciones de aditivo para piensos Download PDF

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Abstract

Un método para preparar una composición de aditivo para piensos que comprende: mezclar al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen (i) (A) Prolina en P1; y (B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o (ii) (a') Prolina en P1'; y (b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; y uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol que incluye sorbitol y glicerol, trigo o un componente de trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propano diol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos y opcionalmente embalaje, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina: (a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa; (b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID Nº 29, la SEQ ID Nº 1, la SEQ ID Nº 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa; (c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID Nº 56; (d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº 56; (e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID Nº 56 en condiciones de alta rigurosidad; o (f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID Nº 56 debido a la degeneración del código genético.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina en composiciones de aditivo para piensos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina para su uso en composiciones de un aditivo para piensos y/o piensos y/o material de pienso y métodos y/o usos que abarcan el uso de las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina.
Antecedentes de la invención
Las proteasas (sinónimo de peptidasas) son enzimas que son capaces de escindir los enlaces peptídicos entre los aminoácidos en sustratos de tipo peptídico, oligopeptídico y/o proteico.
Las proteasas se agrupan en 7 familias en función de su mecanismo de reacción catalítico y los residuos de aminoácidos que forman parte del sitio activo para la catálisis. Las 4 familias principales son las serina proteasas, las ácido aspártico proteasas, las cisteína proteasas y la metaloproteasa, mientras que las treonina proteasas, las ácido glutámico proteasas y las proteasas no agrupadas constituyen las 3 familias restantes.
La especificidad del sustrato de una proteasa se define por lo general según la escisión preferente de los enlaces entre residuos de aminoácidos concretos en un sustrato. Normalmente, las posiciones de los aminoácidos en un sustrato peptídico se definen respecto a la ubicación del enlace escindible (es decir, la posición en la cual escinde la proteasa):
NH2 -....... -P3-P2-P1*P1 '-P2'-P3'....... -COOH
Ilustrado usando el péptido hipotético superior, el enlace escindible se indica con el asterisco (*) mientras los residuos de aminoácidos se representan con la letra “P”, donde los residuos N-terminales respecto al enlace escindible comienzan en P1 y aumentan el número según se alejan del enlace escindible y se acercan al terminal N. Los residuos de aminoácidos C-terminales respecto al enlace escindible comienzan en P1' y aumentan el número según se acercan al residuo C-terminal.
Por lo general, las proteasas también se pueden subdividir en dos grupos amplios en función de su especificidad por el sustrato. El primer grupo es el de las endoproteasas, que son peptidasas proteolíticas capaces de escindir enlaces peptídicos internos de un sustrato peptídico o proteico y que tienden a actuar lejos del terminal N o del terminal C. Los ejemplos de endoproteasas incluyen la tripsina, quimiotripsina y pepsina. Por el contrario, el segundo grupo de proteasas son las exopeptidasas que escinden enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos ubicados hacia el terminal C o N de un sustrato proteico o peptídico.
Ciertas enzimas del grupo de las exopeptidasas pueden tener actividad tripeptidil peptidasa. Por lo tanto, tales enzimas son capaces de escindir fragmentos de 3 aminoácidos (tripéptidos) del terminal N no sustituido de sustratos peptídicos, oligopeptídicos y/o proteicos. Es sabido que las tripeptidil peptidasas escinden secuencias tripeptídicas desde el terminal N de un sustrato, excepto los enlaces con prolina en la posición P1 y/o P1'. Como alternativa, las tripeptidil peptidasas pueden ser específicas de la prolina y únicamente ser capaces de escindir sustratos que tienen un residuo de prolina N-terminal respecto al enlace escindible (es decir, en la posición P1).
Tanto las exopeptidasas como las endoproteasas tienen muchas aplicaciones.
El aumento de la digestibilidad de las proteínas y, por lo tanto, la reducción del coste de la dieta y el aumento de la eficacia del uso de nutrientes en dietas de aves de corral y cerdos, así como dietas para animales marinos y rumiantes, es una gran área comercial. Las proteasas actuales disponibles en el mercado que se usan para los piensos son proteasas alcalinas que son activas a un pH elevado (8), lo que significa que son activas más abajo en el tracto gastrointestinal (el pH en el tracto digestivo anterior es más ácido y llega a ser cercano a neutro en la parte posterior del intestino delgado y en el intestino grueso y el ciego). Siendo activas en el tracto gastrointestinal posterior (es decir, inferior), producen oligopéptidos en el tracto gastrointestinal posterior, donde parecen aumentar las poblaciones de microbios que destacan en la utilización de proteínas fácilmente digeribles, lo que podría dar lugar a exposiciones a retos de enfermedades entéricas y a una reducción de nutrientes para el animal.
Adicionalmente, en partes posteriores del tracto gastrointestinal, la mucosa está peor protegida que en la molleja resistente, el proventrículo o el estómago y, por tanto, se daña más fácilmente causando inflamación, un fenómeno que se ha asociado al uso de proteasa en aves jóvenes.
En el documento US5821104 se describen una tripeptidil aminopeptidasa, un constructo de ADN que codifica la tripeptidil aminopeptidasa, un método de producción de tripeptidil aminopeptidasa y métodos de reducción de la producción de tripeptidil aminopeptidasa en células en las que es poco deseable la producción de tripeptidil aminopeptidasa.
Compendio de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método de preparación de una composición de un aditivo para piensos, que comprende:
(a) mezclar al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; y
uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol que incluye sorbitol y glicerol, trigo o un componente de trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propano diol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos; y
opcionalmente embalaje,
en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
En un segundo aspecto, se proporciona una composición de aditivo para piensos o un ingrediente para piensos que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas P1'; y
uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol que incluye sorbitol y glicerol, trigo o un componente de trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propano diol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en el que dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1 '; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1 '; e instrucciones para administrarlo a un animal,
en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una premezcla que comprende una composición de aditivo para piensos o un ingrediente para piensos de la invención y al menos un mineral y/o al menos una vitamina. En un quinto aspecto, se proporciona un método para preparar un pienso que comprende poner en contacto un componente alimenticio con una composición de aditivo para piensos o un ingrediente para piensos de la invención o una premezcla de la invención o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'
opcionalmente en combinación con al menos una endoproteasa, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
En un sexto aspecto, se proporciona un pienso que comprende una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos de la invención o una premezcla de la invención o que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en la que dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1' preferiblemente cuando la endoproteasa y/o la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina están inactivas (o sustancialmente inactivas) en el pienso antes de suministrar el pienso a un animal, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
Según un séptimo aspecto, se proporciona un método no terapéutico para mejorar una característica biofísica de un animal o para mejorar la digestibilidad de proteínas por parte de un animal, método que comprende administrar a un animal una composición de aditivo para piensos obtenible (por ejemplo, obtenida) mediante un método o un uso de la invención o una composición de aditivo para piensos, pienso o premezcla de la invención o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; y
opcionalmente al menos un componente para piensos y/o al menos un mineral y/o al menos una vitamina, preferiblemente en donde el método comprende administrar a un animal al menos una endoproteasa, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
En un octavo aspecto, se proporciona el uso de una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos de la invención o un pienso o premezcla de la invención o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindirse tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1 '
para mejorar la digestibilidad de proteínas por parte de un animal o para mejorar no terapéuticamente una característica biofísica de un animal, preferiblemente en donde al menos una endoproteasa se usa en combinación, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
Breve descripción de las figuras
A continuación, se describirán las realizaciones de la invención, únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a las figuras que la acompañan, en las cuales:
En la Figura 1 se muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pTTT-pyrG-TRI083.
En la Figura 2 se muestra un perfil de pH para una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina.
En la Figura 3 se muestra un gráfico en el que se muestra la actividad de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina a diversas temperaturas.
En la Figura 4 se muestra la actividad enzimática cuando se usa Alphalase® AFP (denominada AFP en la presente memoria) (una proteasa ácida) combinada con una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina con diferentes dosificaciones de cada enzima.
En la Figura 5 se muestra la capacidad de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para escindir el sustrato AAPPA con el tiempo.
En la Figura 6 se muestra la producción del producto de escisión AAP a partir de un sustrato AAPPA con el tiempo. En la Figura 7 se muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pTTT-pyrG13-TRI071. Se reemplazó la secuencia señal endógena con la secuencia señal de secreción de la proteasa fúngica ácida (AFP, por sus siglas en inglés) de Trichoderma reeseiy un intrón del gen de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA1) (véase la porción inferior de la Figura 7).
En la Figura 8 se muestra la respuesta a la dosis de Alphalase® AFP en la hidrólisis proteica de pienso de soja y maíz. La línea discontinua representa el control, en el que únicamente se usaron pepsina y pancreatina.
En la Figura 9 se muestra la dependencia del DH (siglas en inglés de grado de hidrólisis) de la composición enzimática en la muestra de pienso.
En la Figura 10 se muestra el efecto del tratamiento del pienso con Alphalase® AFP y la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en diferentes condiciones. Las barras sólidas representan el tratamiento a 40°C durante 100 min. Las barras vacías representan el tratamiento a 40°C durante 200 min.
En la Figura 11 se muestra el efecto de proteasas comerciales en comparación con una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina sobre el porcentaje de digestibilidad ileal de N.
En la Figura 12 se muestra el efecto de proteasas comerciales en comparación con una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en la digestibilidad ileal de la energía (MJ/kg).
En la Figura 13 se muestra el contenido de ATP de las células epiteliales intestinales tratadas con proteasas mezcladas directamente con medio de cultivo celular durante una hora. Barras rellenas - tratamiento por proteasa comercial 1; barras vacías - tratamiento por proteasa comercial 2; barras con bandas diagonales - tratamiento por TRI083 (TRI083 tal como se usa en la presente memoria significa una enzima que tiene la secuencia peptídica madura mostrada en la presente memoria como la SEQ ID N° 29); barras con bandas horizontales - tratamiento por la combinación de TRI083 y Alphalase® AFP (dosificaciones indicadas para cada enzima).
En la Figura 14 se muestra el contenido de ATP de las células epiteliales intestinales tratadas durante una hora con pienso digerido in vitrocon proteasas. Barras rellenas - tratamiento por proteasa comercial 1 (más control de digestión); barras vacías - tratamiento por proteasa comercial 2; barras con bandas diagonales - tratamiento por TRI083; barras con bandas horizontales - tratamiento por la combinación de TRI083 y Alphalase® AFP (dosificaciones indicadas para cada enzima).
En la Figura 15 se muestra la permeabilidad en FITC-dextrano después de cuatro horas de tratamiento. Barras rellenas - tratamiento por proteasa comercial 1; barras vacías - tratamiento por proteasa comercial 2; barras con bandas diagonales - tratamiento por TRI083; barras con bandas horizontales - tratamiento por la combinación de TRI083 y Alphalase® AFP (dosificaciones indicadas para cada enzima).
En la Figura 16 se muestran los cambios relativos en TEER para diferentes tratamientos, calculados a partir del valor antes de la aplicación de las sustancias de ensayo y después de 4 horas de aplicación. Barras rellenas - tratamiento por proteasa comercial 1; barras vacías - tratamiento por proteasa comercial 2; barras con bandas diagonales -tratamiento por TRI083; barras con bandas horizontales - tratamiento por la combinación de TRI083 y Alphalase® AFP (dosificaciones indicadas para cada enzima).
En la Figura 17 se muestran alineamientos entre varias secuencias de aminoácidos de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina. Se muestran los motivos xEANLD, y'Tzx'G y QNFSV (en recuadros).
En la Figura 18 se muestran las mejoras de la digestibilidad ileal (%) de N frente al NC (control negativo, por sus siglas en inglés) con suplementación de proteasas comerciales A B y tripeptidil peptidasa (TRI083).
En la Figura 19 se muestran las mejoras en la energía digestible ileal (MJ/kg) frente al NC con suplementación de proteasas comerciales A B y tripeptidil peptidasa (TRI083).
En la Figura 20 se muestra el efecto de la suplementación de proteasas comerciales A B y tripeptidil peptidasa (TRI083) sobre la BWG (ganancia en peso corporal, por sus siglas en inglés) de pollos de engorde.
En la Figura 21 se muestra el efecto de la suplementación de proteasas comerciales A B y tripeptidil peptidasa (TRI083) sobre el FCR (índice de transformación del alimento, por sus siglas en inglés) de pollos de engorde.
En la Figura 22 se muestra el efecto del pH sobre la actividad de TRI045 (una tripeptidil peptidasa que tiene la secuencia proteínica precursora (pre-pro) SEQ ID N° 98 y la proteína madura SEQ ID N° 99) usando AAF-pNA como sustrato (los valores son el promedio de una prueba con 0,8 pL de TRI045 (n=2).
En la Figura 23 se muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pTTT-pyrG13-TRI045.
En la Figura 24 se muestra un perfil de pH de la tripeptidil peptidasa TRI045.
Descripción detallada
Una observación fundamental de la presente invención es que una tripeptidil peptidasa puede tener actividad exopeptidasa en un sustrato que tiene prolina en P1 y/o P1' así como también cualquier otro aminoácido en P1 y/o P1'. Esto resulta sumamente sorprendente, ya que se ha documentado en la técnica que las tripeptidil peptidasas normalmente están inhibidas cuando hay una prolina en P1 o son activas cuando la prolina está en P1 pero inactivas cuando un aminoácido que no es prolina está presente en la posición P1 en el sustrato; esto se denomina a veces en la presente memoria tripeptidil peptidasa específica a la prolina. Los autores de la presente invención han demostrado, por primera vez, que una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención es muy ventajosa para su uso en piensos y materiales de pienso y confiere ventajas a un animal alimentado con la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o con una composición de un aditivo para piensos que comprende la misma.
Ventajosamente, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina mostrada para su uso en la presente invención es capaz de actuar sobre una amplia gama de sustratos peptídicos y/o proteicos y, debido a que tiene la amplia especificidad de sustrato, no se inhibe fácilmente la escisión de sustratos enriquecidos con ciertos aminoácidos (por ejemplo, prolina). El uso de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, por lo tanto, puede descomponer de forma eficaz y/o rápida los sustratos proteicos (por ejemplo, presentes en piensos y/o materiales de pienso). Esto confiere la ventaja adicional de digerir de forma eficaz y/o rápida un sustrato proteico in situ en un animal alimentado con el sustrato proteico (que esté presente, por ejemplo, en un pienso o material de pienso) que permite una captación rápida y/o eficaz de los péptidos digeridos por el animal.
En función de estos hallazgos, se proporciona un método de preparación de una composición de un aditivo para piensos, que comprende: (a) mezclar al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, que tiene predominantemente actividad exopeptidasa, donde la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen (i) (A) prolina en P1; y (B) un aminoácidos seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; o (ii) (a') prolina en P1'; y (b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'; y uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol incluyendo sorbitol y glicerol, trigo o un componente del trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos; y (b) opcionalmente envasarlos, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
La presente memoria describe una composición de un aditivo para piensos que se puede obtener (preferiblemente se obtiene) por el método de la realización anterior.
El término “mezclar”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la mezcla de uno o más ingredientes y/o enzimas, donde el o los ingredientes o la o las enzimas se añaden en cualquier orden y en cualquier combinación. Convenientemente, la mezcla se puede referir a mezclar uno o más ingredientes y/o enzimas de manera simultánea o secuencial.
En una realización, el o los ingredientes y/o la o las enzimas se pueden mezclar de manera secuencial. Preferiblemente, los uno o más ingredientes y/o enzimas se pueden mezclar de manera simultánea.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar en los métodos y/o usos o comprendida en cualquiera de los productos de la presente invención es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen prolina en P1; y un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1.
De manera alternativa o adicional, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar en los métodos y/o usos o comprendida en cualquiera de los productos de la presente invención es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen prolina en P1'; y un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'.
La expresión “tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una exopeptidasa que puede escindir tripéptidos del terminal N de un sustrato peptídico, oligopeptídico y/o proteico. Una “tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina”, es capaz de escindir enlaces peptídicos cuando la prolina está en la posición P1, así como también de escindir enlaces peptídicos cuando un aminoácido que no es prolina está en P1 y/o es capaz de escindir enlaces peptídicos cuando la prolina está en la posición P1', así como también de escindir enlaces peptídicos cuando un aminoácido que no es prolina está en la posición P1 '.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina no es una endoproteasa.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina no es una enzima que escinde tetrapéptidos del terminal N de un sustrato.
En una realización adicional, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina no es una enzima que escinde dipéptidos del terminal N de un sustrato.
En una realización adicional más, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina no es una enzima que escinde aminoácidos individuales del terminal N de un sustrato.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser capaz de escindir enlaces peptídicos cuando la prolina está en la posición P1, así como también de escindir enlaces peptídicos cuando un aminoácido que no es prolina está en P1.
En otra realización, la prolina puede ser capaz de escindir enlaces peptídicos cuando la prolina está en la posición P 1 a s í como también de escindir enlaces peptídicos cuando un aminoácido que no es prolina está en P1
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina también puede ser capaz de escindir enlaces peptídicos cuando la prolina presente en la posición P1 y/o P1' está presente en su configuración cis o trans. Convenientemente, un “aminoácido que no es prolina” puede ser un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos.
En otra realización, el “aminoácido que no es prolina” puede ser un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina.
Convenientemente, en una realización de este tipo, se pueden excluir los aminoácidos sintéticos.
Preferentemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina también puede ser capaz de escindir enlaces peptídicos cuando la prolina está presente en la posición P1 y P1'.
Resulta sorprendente que una tripeptidil peptidasa pueda actuar sobre un sustrato que tiene prolina en la posición P1 y/o P1'. Resulta aún más sorprendente que además de esta actividad, una tripeptidil peptidasa también pueda ser activa cuando un aminoácido que no es prolina está presente en la posición P1 y/o P1'.
Además de ser activa en cualquiera de los diversos sustratos que se han descrito anteriormente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar en la presente invención puede además tolerar la prolina en una o más posiciones seleccionadas a partir del grupo constituido por: P2, P2', P3 y P3\ Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, además de poseer las actividades descritas anteriormente, puede tolerar la prolina en la posición P2, P2', P3 y P3\
Esto resulta una ventaja, ya que permite la escisión eficaz de los sustratos peptídicos y/o proteicos que tienen tramos de prolina y permite la escisión de una amplia gama de sustratos peptídicos y/o proteicos.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener una actividad elevada sobre péptidos y/o proteínas que tienen una o más de lisina, arginina o glicina en la posición P1.
La tripeptidil peptidasa —por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en los métodos y/o usos de la presente invención— puede formularse de cualquier manera apropiada conocida en la técnica.
En algunas realizaciones, pueden mezclarse ingredientes adicionales con la tripeptidil peptidasa, tales como sales tales como Na2SO4 , maltodextrina, caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o un componente del trigo, almidón, talco, alcohol polivinílico (PVA), polioles tales como sorbitol y glicerol, benzoato, sorbato, azúcares tales como sacarosa y glucosa, propilenglicol, 1,3-propanodiol, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, acetato de sodio, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato o mezclas de los mismos.
En una realización preferida, la composición de un aditivo para piensos o la composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención comprende la tripeptidil peptidasa de acuerdo con la presente invención o el fermentado de acuerdo con la presente invención y comprende adicionalmente uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol incluyendo sorbitol y glicerol, trigo o un componente del trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos.
En una realización, la sal se selecciona a partir del grupo constituido por: Na2SO4 , NaH2 PO4 , Na2HPO4 , Na3 PO4 , (NH4)H2 PO4 , K2HPO4, KH2 PO4 , K2SO4 , KHSO4, ZnSO4 , MgSO4 , CuSO4 , Mg(NOa)2 , (NH4)2SO4 , borato de sodio, acetato de magnesio, citrato de sodio o combinaciones de los mismos.
En alguna realización, pueden mezclarse polioles con la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina. Pueden mezclarse polioles tales como glicerol y/o sorbitol en cantidades de un 5% (p/p) - 70% (p/p), preferentemente un 10-20% (p/p), preferentemente un 20-50% (p/p) y más preferentemente un 10-50% (p/p) y más preferentemente un 10-30% (p/p) significando % (p/p) el porcentaje de (poliol en peso/solución en peso). Sin entrar en consideraciones teóricas, una concentración inferior de un 10% de poliol podría contribuir a aumentar la solubilidad y la estabilidad durante el almacenamiento de la enzima. Sin embargo, muchas enzimas comerciales requieren un 30% de glicerol para mantener la enzima estable en el tiempo en la concentración de interés. Una concentración mayor de poliol al 50% podría mejorar aún más la estabilidad, pero a este nivel de poliol también el beneficio de una menor actividad hídrica es una ventaja para la conservación microbiana. En particular para enzimas alimentarias, esto puede ser muy importante a pH neutro, donde la elección de buenos conservantes está limitada.
Pueden mezclarse azúcares (en particular glucosa) con la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina. Azúcares como glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, trehalosa son todos ejemplos de sustancias que, para muchas enzimas, pueden ser una alternativa al uso de polioles. Adecuadamente, pueden usarse (particularmente la glucosa) en el intervalo de un 5% (p/p) - 50% (p/p) en solitario o en combinación con polioles.
El acetato de sodio puede mezclarse en cantidades de un 5% (p/p) - 50% (p/p), preferentemente un 8-40%, preferentemente un 8-12% (p/p), preferentemente un 10-50% y más preferentemente un 10-30% (p/p) significando %
(p/p) el porcentaje de (acetato de sodio en peso/solución en peso).
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede mezclarse con un conservante.
Adecuadamente, el conservante puede ser benzoato, tal como benzoato de sodio y/o sorbato de potasio. Estos conservantes se pueden usar normalmente en una concentración combinada de aproximadamente un 0,1-1%, convenientemente de aproximadamente un 0,2-0,5%. El benzoato de sodio es más eficaz a pH < 5,5 y el sorbato de sodio a pH < 6.
En una realización, los uno o más ingredientes (usados, por ejemplo, para la formulación de la enzima cuando se usa en los métodos y/o usos de la presente invención) pueden seleccionarse del grupo constituido por: un emulsionante de trigo, un poliol, un azúcar, una sal y un conservante.
Convenientemente, el azúcar es sorbitol.
Convenientemente, la sal es sulfato de sodio.
En una realización, los uno o más ingredientes (usados, por ejemplo, para la formulación de la enzima cuando se usa en los métodos y/o usos de la presente invención) pueden seleccionarse del grupo constituido por un emulsionante de trigo, un poliol, un sorbitol, sulfato de sodio y un conservante. Adecuadamente, los uno o más ingredientes (por ejemplo, usados para la formulación de la composición de un aditivo para piensos y/o pienso y/o material de pienso y/o premezcla) pueden seleccionarse del grupo constituido por un emulsionante de trigo, sorbitol y sulfato de sodio.
Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede mezclarse con un emulsionante de trigo.
Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede mezclarse con sorbitol.
Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede mezclarse con sulfato de sodio.
En una realización preferida, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en los métodos y/o usos de la presente invención puede formularse con un vehículo que comprende (o que consiste esencialmente en; o que consiste en) una sal, poliol incluyendo sorbitol y glicerol, trigo o un componente del trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos.
En una realización preferida, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en los métodos y/o usos de la presente invención puede formularse con un vehículo que comprende (o que consiste esencialmente en; o que consiste en) Na2SO4 , NaH2 PO4 , Na2HPO4 , Na3 PO4 , (NH4)H2PO4 , K2HPO4, KH2 PO4 , K2SO4 , KHSO4 , ZnSO4 , MgS CuSO4 , Mg(NO3)2 , (NH4)2SO4 , borato de sodio, acetato de magnesio, citrato de sodio o combinaciones de los mismos.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en los métodos y/o usos de la presente invención puede formularse con Na2SO4.
La composición de un aditivo para piensos de la presente invención comprende adecuadamente la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina formulada con un vehículo que comprende (o que consiste esencialmente en; o que consiste en) una sal, poliol incluyendo sorbitol y glicerol, trigo o un componente del trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos.
En una realización, la composición de un aditivo para piensos de la presente invención comprende adecuadamente la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina formulada con un vehículo que comprende (o que consiste esencialmente en; o que consiste en) Na2SO4, NaH2 PO4 , Na2HPO4 , Na3 PO4 , (NH4)H2 PO4 , K2HPO4, KH2 PO4 , K2SO4 , KHSO4 , ZnSO4 , MgSO4 , CuSO4 , Mg(NO3)2 , (NH4)2SO4 , borato de sodio, acetato de magnesio, citrato de sodio o combinaciones de los mismos.
En una realización, la composición de un aditivo para piensos de la presente invención comprende adecuadamente la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina formulada con Na2SO4.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en la presente invención puede ser una tripeptidil peptidasa termoestable que tolera la prolina.
El término “termoestable” significa que una enzima conserva su actividad cuando se calienta a una temperatura de hasta aproximadamente 75°C. Adecuadamente, “termoestable” puede significar que una enzima retiene su actividad cuando se calienta hasta aproximadamente 80°C, más adecuadamente hasta aproximadamente 90°C.
Ventajosamente, una tripeptidil peptidasa termoestable que tolera la prolina es menos propensa a desnaturalizarse, por ejemplo, en el tratamiento térmico del proceso de formación de gránulos del pienso y/o retendrá su actividad durante un periodo más largo de tiempo en, por ejemplo, un animal, en comparación con una variante no termoestable.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener actividad en un intervalo de aproximadamente pH 2 a aproximadamente pH 7. Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener actividad en un intervalo de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7, más adecuadamente en un intervalo de aproximadamente pH 4,5 a aproximadamente pH 6,5.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener actividad a un pH ácido (adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener actividad óptima a pH ácido). La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener actividad a un pH de menos de aproximadamente pH 6, más adecuadamente de menos de aproximadamente pH 5. Preferentemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser activa a un pH de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente un pH de 4,0, más convenientemente entre aproximadamente 3,0 y aproximadamente 3,3. En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener actividad a un pH de aproximadamente 2,5.
Ventajosamente, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene actividad a un pH ácido puede ser activa en el tracto gastrointestinal superior de un animal (por ejemplo, en la molleja, el proventrículo o el estómago) y/o puede digerir un sustrato peptídico y/o proteico en combinación con proteasas endógenas (por ejemplo, pepsina, tripsina o quimotripsina) que están presentes en el tracto gastrointestinal del animal.
Muchas prácticas de alimentación actuales conllevan administrar a los animales una proteasa alcalina activa a un pH elevado (por ejemplo, pH 8). Por lo tanto, las proteasas alcalinas son activas únicamente en la parte inferior (por ejemplo, última parte) del tracto gastrointestinal de un animal, donde el tracto gastrointestinal se vuelve más alcalino, tal como la última parte del intestino delgado y el intestino grueso y el ciego. Sin entrar en consideraciones teóricas, se cree que la producción de oligopéptidos en la última parte del tracto gastrointestinal aumenta la población de microbios que usan los oligopéptidos, lo que, a su vez, puede conllevar mayores problemas debidos a la enfermedad entérica y/o a una reducción de los nutrientes disponibles que el animal pueda captar. Además, en la última parte del tracto gastrointestinal (es decir, la inferior) la protección de la mucosa es peor que en la parte inicial (por ejemplo, la molleja, el proventrículo o el estómago) y, así, es más fácil que se produzca un daño que conlleve inflamación. Favorablemente, el uso de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina activa a un pH ácido alivia este problema, ya que es capaz de digerir su sustrato en la parte inicial del tracto gastrointestinal y de esta forma no incrementa de manera sustancial la población de microbios y/o aumenta la cantidad de nutrientes (por ejemplo, aminoácidos/péptidos) disponibles para que pueden ser captados por un animal y/o reduce la inflamación. El transportador de péptidos del pollo PEPT1 es el más altamente expresado en el duodeno en comparación con el yeyuno y el íleon (Chen et al (2009) J. Anim. Sci. 77:1277-1283, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria por referencia); por lo tanto, los autores de la presente invención han identificado que una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene actividad a un pH ácido puede facilitar la captación de péptidos por parte de un animal cuando la digestión del sustrato proteico y/o peptídico (por ejemplo, presente en un pienso y/o material de pienso) esté disponible para su captación por el animal, de forma prematura en el tracto gastrointestinal, en el duodeno. Esto contrasta con las proteasas alcalinas que no son activas de forma prematura en el tracto gastrointestinal.
En una realización, puede usarse al menos una endoproteasa en combinación con la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para cualquiera de las aplicaciones de la presente memoria. Al menos una endoproteasa también puede estar comprendida en la composición de un aditivo para piensos, material de pienso, kit o premezcla descrita en la presente memoria.
El término “endoproteasa”, tal como se usa en la presente memoria, es un sinónimo del término “endopeptidasa” y se refiere a una enzima que es una peptidasa proteolítica capaz de escindir enlaces peptídicos internos de un sustrato peptídico o proteico (por ejemplo, que no están ubicados cerca del terminal C o N del sustrato peptídico o proteico). Tales endoproteasas pueden definirse como aquellas que tienden a actuar desde el terminal N o el terminal C.
En una realización, la endoproteasa puede ser una o más seleccionadas a partir del grupo constituido por: una serina proteasa, una ácido aspártico proteasa, una cisteína proteasa, una metaloproteasa, una treonina proteasa, una ácido glutámico proteasa y una proteasa seleccionada a partir de la familia de proteasas no agrupadas.
En una realización, la endoproteasa puede ser una o más seleccionadas del grupo constituido por: una proteasa fúngica ácida, una subtilisina, una quimotripsina, una tripsina, una pepsina, papaína, bromalina, metaloendopeptidasa neutra bacteriana termoestable, metaloendopeptidasa neutra, serina proteasa alcalina, endoproteasa fúngica o del grupo de productos comerciales de proteasa Alphalase® AFP, Alphalase® FP2, Alphalase® NP.
Adecuadamente, la endoproteasa puede ser una endoproteasa ácida.
Preferiblemente, la endoproteasa puede ser una proteasa fúngica ácida.
Ventajosamente, el uso de una endoproteasa combinada con una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede aumentar la eficacia de escisión del sustrato. Sin entrar en consideraciones teóricas, se cree que una endoproteasa es capaz de escindir un sustrato peptídico y/o proteico en múltiples regiones alejadas del terminal C o N; por lo tanto, produce más extremos N-terminal que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede usar como sustrato; de esta manera aumenta favorablemente la eficacia de la reacción y/o reduce los tiempos de reacción.
El uso de una endoproteasa ácida y una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina activa a un pH ácido es sumamente favorable, ya que las dos enzimas pueden cooperar para digerir un sustrato peptídico y/o proteico en la parte inicial del tracto gastrointestinal (por ejemplo, la molleja, el proventrículo o el estómago) de un animal y pueden ser activas combinadas con otras proteasas endógenas (por ejemplo, la pepsina) presentes en el animal.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser una tripeptidil peptidasa “incorporada en el pienso” que tolera la prolina.
La expresión “incorporada en el pienso” tal como se usa en la presente memoria significa que la enzima (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina) es funcional, preferentemente funcional principalmente, más preferentemente funcional únicamente, en el tracto gastrointestinal (GIT) del animal. En otras palabras, la expresión “incorporada en el pienso” tal como se usa en la presente memoria significa que la enzima es sustancialmente inactiva (o es inactiva) en la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla antes de suministrar a un animal la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla.
La expresión “principalmente funcional” significa que la enzima actúa sobre su sustrato principalmente una vez que entra en el GIT. En otras palabras, antes de entrar en el GIT, el nivel de actividad enzimática, definida como la cantidad de escisión de sustratos peptídicos y/o proteicos en tripéptidos, es de menos de aproximadamente un 20%, adecuadamente de menos de aproximadamente un 10%, preferentemente de menos de aproximadamente un 5%, del nivel de actividad enzimática después de que entre en el GIT (particularmente, después de que entre en la molleja, el proventrículo o el estómago del animal).
Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina son activas en el duodeno y partes del tracto gastrointestinal del animal anteriores al duodeno (por ejemplo, partes del GIT que el pienso encuentra previamente en el proceso de digestión).
La expresión “únicamente funcional”, tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima es inactiva antes de entrar en el GIT y se activa tras entrar en el GIT.
El término “inactiva”, tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima no es activa. Esto puede significar que la actividad enzimática está un tanto inhibida o que la enzima está en un entorno en el cual es inactiva o que la enzima se presenta a su sustrato justo antes de alimentar al animal, de manera que no hay suficiente tiempo para que esté activa. La “inactividad” de la enzima puede ser, en cualquier caso, reversible una vez entra en el GIT de un animal.
Por lo tanto, adecuadamente la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (opcionalmente en combinación con una endoproteasa) se mezcla con la al menos una proteína o parte de la misma inmediatamente antes de suministrar a un animal la composición de un aditivo para piensos.
La expresión “sustancialmente inactiva” tal como se usa en la presente memoria significa que la enzima tiene baja actividad en comparación con su actividad una vez ha entrado en el GIT (por ejemplo, en la molleja, el proventrículo o el estómago del animal). Por ejemplo, sustancialmente inactiva puede significar que la enzima de la composición de un aditivo para piensos y/o pienso y/o material de pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla tiene menos de un 10% de su actividad en comparación con su actividad en el GIT (particularmente, en la molleja, el proventrículo o el estómago del animal).
Mantener la enzima “incorporada en el pienso” en un estado inactivo o sustancialmente inactivo en la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla puede conseguirse de varias maneras conocidas para los expertos en la técnica.
A título de ejemplo únicamente, mantener el contenido de agua (% en peso) de la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla a menos de un 15%, preferentemente menos de un 10%, es suficiente para asegurar que la enzima incorporada en el pienso sea inactiva o sustancialmente inactiva en la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla.
En una realización, la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla, mezclando posteriormente la enzima incorporada en el pienso, están (mantenidos y/o almacenados) en un estado seco o estado sustancialmente seco.
La expresión “estado seco” tal como se usa en la presente memoria significa que la enzima incorporada en el pienso y/o la composición de un aditivo para piensos contiene nada de agua o solamente una cantidad muy baja de agua. En otras palabras, la expresión “estado seco” tal como se usa en la presente memoria puede significar que la enzima incorporada en el pienso y/o la composición de un aditivo para piensos comprende menos de un 5%, preferentemente menos de un 1% de contenido de agua (% en peso).
En una realización, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina para su uso en los métodos y/o usos y/o productos de la presente invención pueden estar en un estado seco o sustancialmente seco.
En otra realización, un tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en cualquiera de los métodos y/o usos y/o productos de la invención puede mezclarse con una composición que comprende al menos una proteína o al menos una parte de una proteína, donde la composición, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o combinaciones de las mismas están en un estado seco o sustancialmente seco cuando se mezclan. Convenientemente, se puede mezclar además una endoproteasa.
La expresión “seca o en un estado sustancialmente seco”, cuando se usa en la presente memoria, significa que la composición, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, la endoproteasa o combinaciones de estas contienen únicamente una cantidad muy baja de agua. En otras palabras, la expresión “estado sustancialmente seco” tal como se usa en la presente memoria puede significar que la composición, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, la endoproteasa o combinaciones de las mismas comprenden menos de un 15%, preferentemente menos de un 10% de contenido de agua (% en peso).
En una realización, la composición, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, la endoproteasa o combinaciones de las mismas pueden secarse antes, durante o después (preferentemente antes) de su uso en los métodos y/o usos de la invención.
En otra realización, la composición, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, la endoproteasa o combinaciones de las mismas antes o después de su uso en los métodos y/o usos de la invención comprenden menos de un 15% en peso de contenido de humedad.
En otra realización, la composición, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, la endoproteasa o combinaciones de las mismas antes o después de su uso en los métodos y/o usos de la invención comprenden menos de un 10% en peso de contenido de humedad. Adecuadamente, menos de un 5% en peso de contenido de humedad, más adecuadamente menos de un 1% en peso de contenido de humedad.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina “incorporada en el pienso”), la endoproteasa o combinaciones de las mismas pueden mantenerse en un estado inactivo o sustancialmente inactivo en la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla evitando físicamente que la enzima interactúe con su sustrato. Por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina “incorporada en el pienso”), la endoproteasa o combinaciones de las mismas pueden encapsularse antes de su uso en los métodos y/o usos de la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla de la invención.
Cuando se evita físicamente que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina “incorporada en el pienso”), la endoproteasa o combinaciones de las mismas interactúen con su sustrato en la composición de un aditivo para piensos y/o material de pienso y/o pienso y/o ingrediente para piensos y/o premezcla, entonces una vez en el GIT se elimina la barrera física permitiendo, por tanto, la interacción de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina “incorporada en el pienso”), la endoproteasa o combinaciones de las mismas con su sustrato.
A título de ejemplo únicamente, la encapsulación puede eliminarse por el paso de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina encapsulada (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina “incorporada en el pienso”), la endoproteasa o combinaciones de las mismas a través de la molleja, el proventrículo o el estómago de un animal. La molleja, el proventrículo o el estómago de un animal está a un pH muy bajo (ácido) (por ejemplo, pH 2-4). Esta acidez puede ser usada para activar las enzimas encapsuladas.
En una realización, se puede encapsular la enzima con un polímero, tal como, por ejemplo, quitina o quitosanos, gelatina, goma arábiga o cera. A título de ejemplo únicamente, el polímero puede ser una gelatina o goma arábiga como se muestra en Xue et al Food Funct. 2013, 25 de abril; 6 de febrero (epub); 4 (4) 610-7. Como alternativa, el polímero puede ser un hidrogel basado en quitosán como se muestra en Zhang et al Biomacromolecules 2011,12,2894-2901.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina “incorporada en el pienso”), la endoproteasa o combinaciones de las mismas pueden activarse suministrando la enzima a un animal.
El término “inactiva” tal como se usa en la presente memoria puede significar que la enzima se presenta a su sustrato inmediatamente antes de suministrarla al animal, de modo que no hay suficiente tiempo para activarla antes de que entre en el GIT del animal.
En una realización, la tripeptidil proteasa tolerante a la prolina para su uso en la presente invención es parte de un fermentado.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “fermentado” se refiere a la mezcla de constituyentes presentes después (por ejemplo, al final) del cultivo de una célula anfitriona, incluyendo el fermentado la tripeptidil peptidasa (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina) expresada, por ejemplo, por la célula anfitriona. El fermentado puede comprender, además de la tripeptidil peptidasa de acuerdo con la presente invención, otros componentes tales como materia particulada, sólidos, sustratos no usados durante el cultivo, desechos, medios, residuos celulares, etc. En un aspecto, las células anfitrionas (y particularmente cualquier espora) se retiran del fermentado y/o se inactivan para proporcionar un fermentado libre de células. En otras realizaciones, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para su uso en la presente invención está aislada o purificada.
Las presentes enzimas, incluidas las combinaciones de 3PP y una endoproteasa, también son útiles en un proceso de conversión del almidón, especialmente en un proceso de sacarificación y fermentación de almidón gelatinizado, crudo y/o formación de gránulos que ha experimentado licuefacción. El producto final deseado (a menudo denominado producto “final de la fermentación” o “EOF”, por sus siglas en inglés) puede ser cualquier producto que se pueda producir mediante la conversión enzimática del sustrato de tipo almidón. Por ejemplo, el producto deseado puede ser un jarabe rico en glucosa y maltosa, que se puede usar en otros procesos, tales como la preparación de jarabe de maíz rico en fructosa (HFCS, por sus siglas en inglés) o que se puede convertir en varios productos útiles diferentes, tales como intermedios del ácido ascórbico (por ejemplo, glucanato; ácido 2-ceto-L-glucónico; 5-cetogluconato; y 2,5-dicetogluconato); 1,3-propanodiol; aminoácidos (por ejemplo, tirosina, serina, lisina, ácido glutámico, glicina, fenilalanina y triptófano); ácidos orgánicos (por ejemplo, lactato, piruvato, succinato, citrato, isocitrato, gluconato, itaconato y oxaloacetato); antibióticos; antimicrobianos; enzimas; vitaminas; hormonas; etanol, butanol y otros alcoholes; glucono-delta-lactona; eritorbato de sodio; ácido graso omega-3; isopreno y otros biomateriales y agentes bioquímicos. Un experto en la técnica es consciente de que se pueden usar diversas condiciones de fermentación en la producción de estos productos EOF.
Los expertos en la técnica conocen de sobra los métodos disponibles que se pueden usar para preparar sustratos de tipo almidón para la conversión. Se pueden obtener sustratos de tipo almidón útiles a partir de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o grano integral. Más específicamente, se puede obtener el almidón granular a partir de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, triticale, sorgo bicolor, sagú, mijo, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, judías, plátano o patatas. El sustrato de tipo almidón puede ser un almidón crudo procedente de cereal integral molido, que contiene fracciones que no son almidón, por ejemplo, residuos del germen y fibras. La licuefacción por lo general conlleva la gelatinización del almidón a la vez que se añade una a-amilasa o antes de esta, aunque de manera opcional se pueden añadir enzimas adicionales que inducen la licuefacción. En algunos casos, la licuefacción del almidón se lleva a cabo a la temperatura de gelatinización o por debajo de esta; normalmente requiere clases similares de enzimas con diferentes criterios de rendimiento. El almidón licuado se puede sacarificar para obtener un jarabe con un grado bajo de polimerización (DP, por sus siglas en inglés) usando a-amilasas, de manera opcional en presencia de otras enzimas. La composición exacta de los productos de la sacarificación depende de la combinación de enzimas usada, así como también del tipo de almidón granular procesado.
Las presentes enzimas se pueden añadir durante la licuefacción y/o la sacarificación de una solución enzimática aislada, enzima granulada o seca, caldo clarificado, concentrado ultrafiltrado o caldo celular integral, de manera opcional como parte de una mezcla. Las presentes enzimas también se pueden añadir en forma de un material celular cultivado producido por células anfitrionas que expresan las enzimas. Las presentes enzimas también pueden ser secretadas en el medio de reacción por una célula anfitriona durante el proceso de fermentación o de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF, por sus siglas en inglés) de manera que se proporciona la enzima a la reacción de manera continua (véase más adelante). La célula anfitriona que produce y secreta las presentes enzimas también puede expresar una enzima adicional, tal como una glucoamilasa y/o a-amilasa. Se puede modificar la célula anfitriona para que exprese una amplia gama de diferentes enzimas sacarolíticas.
El hidrolizado de almidón soluble producido por el tratamiento con la amilasa se puede convertir en un jarabe rico en fructosa a base de almidón, tal como jarabe de maíz rico en fructosa (HFCS). Esta conversión se puede conseguir usando una glucosa-isomerasa, especialmente una glucosa-isomerasa inmovilizada sobre un soporte sólido.
El hidrolizado de almidón soluble, especialmente un jarabe rico en glucosa, se puede fermentar poniendo en contacto el hidrolizado de almidón con un organismo fermentador. Los microorganismos etanológenos incluyen la levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae y bacterias, por ejemplo Zymomonas mobilis, que expresan la alcoholdeshidrogenasa y la piruvato-descarboxilasa. Productos comerciales con levadura incluyen ETHANOL REDO (LeSaffre); THERMOSACCO (Lallemand); RED STARO (Red Star); FERMIOLO (DSM Specialties); y SUPERSTARTO (Alltech). En la técnica también existe constancia de microorganismos que producen otros EOF (tales como los mencionados anteriormente). Tal como se ha mencionado anteriormente, los procesos de sacarificación y fermentación se pueden llevar a cabo según un proceso SSF, donde el organismo fermentador expresa las presentes enzimas, de manera opcional con una o más enzimas adicionales, tales como una glucoamilasa y/o a-amilasa. La fermentación puede comprender un enriquecimiento, una purificación y una recuperación posteriores del EOF. Kits
En un aspecto, se proporciona un kit que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, que tiene predominantemente actividad exopeptidasa, donde la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; o
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'; e instrucciones para la administración de los mismos a un animal, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'.
De forma más adecuada, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen prolina en la posición P1 y en la posición P1'. Adecuadamente, el kit puede comprender adicionalmente al menos una endoproteasa.
La endoproteasa puede estar compartimentalizada por separado de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o ambas enzimas pueden estar mezcladas.
La tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina se pueden formular de cualquier manera descrita en la presente memoria o conocida por el experto en la técnica.
Adecuadamente, cuando el kit comprende una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en combinación con al menos una endoproteasa, las instrucciones pueden ser instrucciones para la coadministración de las mismas. El término “coadministración”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la administración de uno o más ingredientes y/o enzimas ya sea por separado (por ejemplo de manera secuencial) o juntos (por ejemplo de manera simultánea).
Actividad y ensayos
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar en la presente invención tiene predominantemente actividad exopeptidasa.
La expresión actividad “exopeptidasa”, según es usado en la presente memoria, significa que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de un sustrato, tal como un sustrato proteico y/o peptídico.
La expresión “que tiene predominantemente actividad exopeptidasa”, tal como se usa en la presente memoria, significa que la tripeptidil peptidasa no tiene o sustancialmente no tiene actividad endoproteasa.
La expresión “que sustancialmente no tiene actividad endoproteasa” significa que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina tiene menos de aproximadamente 100 U de actividad endoproteasa en el “Ensayo de endoproteasas” descrito en la presente memoria cuando se compara con 1000 nkat de actividad exopeptidasa en el “Ensayo de especificidad amplia de exopeptidasas (EBSA)” descrito en la presente memoria. Convenientemente, la expresión “que sustancialmente no tiene actividad endoproteasa” significa que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina tiene menos de aproximadamente 100 U de actividad endoproteasa en el “Ensayo de endoproteasas” descrito en la presente memoria cuando se compara con 1000 nkat de actividad exopeptidasa en el “Ensayo de especificidad amplia de exopeptidasas” descrito en la presente memoria.
Preferentemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener menos de aproximadamente 10 U de actividad endoproteasa en el “Ensayo de endoproteasas” descrito en la presente memoria cuando se compara con 1000 nkat de actividad exopeptidasa en el “Ensayo de especificidad amplia de exopeptidasas” descrito en la presente memoria, más preferentemente menos de aproximadamente 1 U de actividad endoproteasa en el “Ensayo de endoproteasas” descrito en la presente memoria cuando se compara con 1000 nkat de actividad exopeptidasa en el “Ensayo de Especificidad Amplia de Exopeptidasas” descrito en la presente memoria. Aún más preferentemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o la exo-tripeptidil peptidasa puede tener menos de aproximadamente 0,1 U de actividad endoproteasa en el “Ensayo de endoproteasas” descrito en la presente memoria cuando se compara con 1000 nkat de actividad exopeptidasa en el “Ensayo de especificidad amplia de exopeptidasas” descrito en la presente memoria.
“Ensayo de la endoproteasa”
Ensayo de azoscaseína para determinar la actividad endoproteasa.
Se usa una versión modificada del ensayo de endoproteasas descrito por Iversen y Jorgensen, 1995 (Biotechnology Techniques 9, 573-576). Se añade una muestra de enzima de 50 pL a 250 pL de azocaseína (0,25% p/v; de Sigma) en tampón Mcllvaine diluido 4 veces, pH 5 y se incuba durante 15 min a 40°C con agitación (800 rpm). La reacción se hace finalizar añadiendo 50 pL de ácido tricloroacético (TCA) 2 M (de Sigma Aldrich, Dinamarca) y se centrifuga durante 5 min a 20.000 g. Se añaden 65 pL de NaOH 1 M a una muestra de 195 pL del sobrenadante y se mide la absorbancia a 450 nm. Se define una unidad de actividad endoproteasa como la cantidad que genera un aumento de la absorbancia a 450 nm de 0,1 en 15 min a 40°C.
“Ensayo de exopeptidasas”
El ensayo consta de dos partes:
Parte 1 - “Ensayo de especificidad amplia de exopeptidasas” (EBSA)
Se añadieron 10 pL de la solución de péptido cromogénico (H-Ala-Ala-Ala-pNA 10 mM disuelta en sulfóxido de dimetilo (DMSO); PM (peso molecular) = 387,82; Bachem, Suiza) a 130 pl de acetato de Na (20 mM, ajustado a pH 4,0 con ácido acético) en una placa de microtitulación y se calentó durante 5 minutos a 40°C. Se añadieron 10 pL de la enzima debidamente diluida y se midió la absorción en un lector MTP (Versa max, Molecular Devices, Dinamarca) a 405 nm. Se definió un katal de actividad proteolítica como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 mol de p-nitroanilina por segundo.
Parte 2 (i) - Ensayo de Prolina P1
(a) Disolver el sustrato H-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile- Val (PM = 897,12; de Schafer-N, Copenhague en tampón Mcllvain diluido 10 veces, pH=4,5 a 1 mg/ml de concentración.
(b) Incubar 1000 pL de la solución del sustrato con 10 pg de la solución de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina a 40°C.
(c) Tomar muestras de 100 pL en siete puntos temporales (0, 30, 60, 120, 720 y 900 min), diluir con 50 pL de TFA al 5%, inactivar térmicamente (10 min a 80°C) y mantener a -20°C hasta el análisis por LC-MS.
(d) Realizar un análisis por LC-MS/MS usando un sistema de HPLC Capilar Serie 1100 de Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, California) conectado con un espectrómetro de masas híbrido LTQ Orbitrap Classic (Thermo Scientific, Bremen, Alemania).
(e) Cargar las muestras en una columna C18 Fortis™ de 50 mm con un diámetro interno de 2,1 mm y un tamaño práctico de 1,7 pm.
(f) Realizar una separación con un caudal de 200 pL/min usando un gradiente de 14 min de un 2-28% de disolvente B (H2O/CH3CN/HCOOH (50/950/0,65 v/v/v)) en la fuente lonMAX. El instrumento LTQ Orbitrap Classic se operó en un modo MS/MS dependiente de los datos.
(g) Medir las masas peptídicas con el Orbitrap (obtener barridos de MS con una resolución de 60.000 a m/z 400) y seleccionar hasta 2 de las relaciones peptídicas m/z más intensas y someter a fragmentación usando CID en la trampa lineal de iones (LTQ, por sus siglas en inglés). Permitir la exclusión dinámica con un tamaño de lista de 500 masas, duración de 40 s y una amplitud másica de exclusión de ±10 ppm respecto a las masas de la lista.
(h) Usar el programa de acceso público Skyline 1.4.0.4421 (se puede obtener de MacCoss Lab Software, Universidad de Washington, Departamento de Ciencias Genómicas, 3720 15th Ave NE Seattle, Washington, EE.UU.) para acceder a los ficheros RAW y extraer las intensidades MS1 para construir cromatogramas. Fijar el filtro precursor de importación isotópica en un recuento de tres, (M, M+1 y M+2), con una resolución de 60.000 y usar el estado de carga más intenso.
(i) Se introdujeron las secuencias peptídicas del sustrato y los productos de escisión en Skyline y se calculó la intensidad de cada muestra (0, 30, 60, 120, 720 y 900 min de hidrólisis).
(j) Se define una unidad de actividad como la cantidad de enzima que hidrolizará en este ensayo un 50% del sustrato en 720 min a la vez que libera Arg-Gly-Pro.
Parte 2 (ii) - Ensayo de Prolina P1'
(a) Disolver el péptido H-Ala-Ala-Phe-Pro-Ala-NH2 (PM = 474,5; de Schafer-N, Copenhague) en tampón McIlvain diluido 10 veces, pH=4,5 a 0,1 mg/ml de concentración.
(b) Incubar 1000 pL de la solución del sustrato con 10 pg de la solución de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina a 40°C.
(c) Tomar muestras de 100 pL en siete puntos temporales (0, 30, 60, 120, 720 y 900 min), diluir con 50 pL de TFA al 5%, inactivar térmicamente (10 min a 80°C) y mantener a -20°C hasta el análisis por LC-MS.
(d) Realizar un análisis de LC-MC/MS usando un sistema de HPLC Capilar Serie 1100 de Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, California) conectado a un espectrómetro de masas híbrido LTQ Orbitrap Classic (Thermo Scientific, Bremen, Alemania).
(e) Cargar las muestras en una columna C18 Fortis™ de 50 mm con un diámetro interno de 2,1 mm y un tamaño práctico de 1,7 pm.
(f) Realizar una separación con un caudal de 200 pL/min usando un gradiente de 14 min de un 2-28% de disolvente B (H2O/CH3CN/HCOOH (50/950/0,65 v/v/v)) en la fuente lonMAX. El instrumento LTQ Orbitrap Classic se operó en un modo MS/MS dependiente de los datos.
(g) Medir las masas peptídicas con el Orbitrap (obtener barridos de MS con una resolución de 60.000 a m/z 400) y seleccionar hasta 2 de las relaciones peptídicas m/z más intensas y someter a fragmentación usando CID en la trampa lineal de iones (LTQ, por sus siglas en inglés). Permitir la exclusión dinámica con un tamaño de lista de 500 masas, duración de 40 s y una amplitud másica de exclusión de ±10 ppm respecto a las masas de la lista.
(h) Usar el programa de acceso público Skyline 1.4.0.4421 (se puede obtener de MacCoss Lab Software, Universidad de Washington, Departamento de Ciencias Genómicas, 3720 15th Ave NE Seattle, Washington, EE.UU.) para acceder a los ficheros RAW y extraer las intensidades MS1 para construir cromatogramas. Fijar el filtro precursor de importación isotópica en un recuento de tres, (M, M+1 y M+2), con una resolución de 60.000 y usar el estado de carga más intenso.
(i) Se introdujeron las secuencias peptídicas del sustrato así como de los productos de escisión en Skyline y se calculó la intensidad de cada muestra.
(j) Se define una unidad de actividad como la cantidad de enzima que hidrolizará en este ensayo un 50% del sustrato en 720 min a la vez que libera Ala-Ala-Phe.
En una realización, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de al menos 50 nkat en la Parte 1 de la actividad descrita en la presente memoria y al menos 100 U de actividad en la Parte 2(i) o la Parte 2(ii) del ensayo descrito en la presente memoria por mg de proteína.
En una realización, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de entre aproximadamente 50-2000 nkat en la Parte 1 de la actividad descrita en la presente memoria y entre aproximadamente 1-500 unidades de actividad en la Parte 2(i) o la Parte 2(ii) del ensayo descrito en la presente memoria por mg de proteína. Nótese que la medición proteica se describe en el Ejemplo 2.
“Ensayo de actividad de prolina en P1 y P1'”
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa que se puede usar en la presente invención puede ser capaz de escindir sustratos que tienen prolina en la posición P1 y P1'. Esto se puede evaluar usando el ensayo descrito a continuación. En este ensayo, se examina una tripeptidil peptidasa para determinar su capacidad de hidrolizar un sustrato sintético AAPPA mediante LC-MS y por una cuantificación sin marcadores.
(a) Disolver el péptido H-AAPPA-NH2 (PM = 424,3, de Schafer-N, Copenhague) en tampón MES 20 mM, pH=4,0 (1 mg/mL).
(b) Incubar 1000 qL de la solución de H-AAPPA-NH2 con 200 qL de la solución de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (40 qg/mL) (sustrato/enzima 100:0,8) a la temperatura ambiente.
(c) Tomar muestras de 100 qL en siete puntos temporales (0, 5, 15, 60, 180, 720 y 1440 min), diluir con 50 qL de TFA al 5%, inactivar térmicamente (10 min a 80°C) y mantener a -20°C hasta el análisis por LC-MS.
(d) Realizar un análisis por Nano LC-MS/MS usando un sistema Easy LC (Thermo Scientific, Odense, Dinamarca) conectado a un espectrómetro de masas híbrido LTQ Orbitrap Classic (Thermo Scientific, Bremen, Alemania).
(e) Cargar las muestras en una columna trampa adaptada de 2 cm (100 qm d.i., 375 qm d.e., rellena de partículas de fase inversa Reprosil C18 de 5 qm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania)) conectada a una columna analítica de 10 cm (75 qm d.i., 375 qm d.e., rellena de partículas de fase inversa Reprosil C18 de 3 qm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania)) con una aguja de acero.
(f) Realizar una separación con un caudal de 300 nL/min usando un gradiente de 10 min de un 0-34% de disolvente B (H2O/CH3CN/TFE/HCOOH (100/800//100/1 v/v/v/v)) en la fuente iónica de nanoelectropulverización (Thermo Scientific, Odense, Dinamarca). Operar el instrumento LTQ Orbitrap Classic en un modo MS/MS dependiente de los datos.
(g) Medir las masas peptídicas con el Orbitrap (obtener barridos de MS con una resolución de 60.000 a m/z 400) y seleccionar hasta 2 de las relaciones peptídicas m/z más intensas y someter a fragmentación usando CID en la trampa lineal de iones (LTQ, por sus siglas en inglés). Permitir la exclusión dinámica con un tamaño de lista de 500 masas, duración de 40 s y una amplitud másica de exclusión de ±10 ppm respecto a las masas de la lista.
(h) Usar el programa de acceso público Skyline 1.4.0.4421 (se puede obtener de MacCoss Lab Software, Universidad de Washington, Departamento de Ciencias Genómicas, 372015th Ave NE Seattle, Washington, EE.UU.) para acceder a los ficheros RAW, pudiendo el programa usar las intensidades MS1 para construir cromatogramas. Fijar el filtro precursor de importación isotópica en un recuento de tres, (M, M+1 y M+2), con una resolución de 60.000 y usar el estado de carga más intenso.
(i) Se introdujeron las secuencias peptídicas del sustrato, como los productos de escisión, en Skyline y se calculó la intensidad de cada muestra.
(j) Se define una unidad de actividad como la cantidad de enzima que hidrolizará en este ensayo un 50% del sustrato en 24 h a la vez que libera AAP.
En una realización, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de al menos 50 nkat en la Parte 1 de la actividad descrita en la presente memoria y al menos una actividad de 100 U en la Parte 2(i) o la Parte 2(ii) del ensayo descrito en la presente memoria por mg de proteína.
En una realización, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de entre aproximadamente 50-2000 nkat en la Parte 1 de la actividad descrita en la presente memoria y entre aproximadamente 1-500 unidades de actividad en la Parte 2(i) o la Parte 2(ii) del ensayo descrito en la presente memoria por mg de proteína (la concentración proteica se calcula como en el Ejemplo 2).
En una realización, una tripeptidil peptida na que se puede usar en la presente invención puede tener al menos una actividad de 10 U en
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Actividad de Prolina en P1 y P1'” descrito en la pre memoria por mg de proteína.
En una realización, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de entre aproximadamente 1 U - 500 U de actividad en el “Ensayo de Actividad de Prolina en P1 y P1'” descrito en la presente memoria por mg de proteína.
Además de lo expuesto anteriormente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina también puede ser activa según la
Parte 1 del “Ensayo de Actividad de Exopeptidasas” descrito anteriormente.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar en la presente invención puede tener al menos una actividad de 10 U en el “Ensayo de Actividad de Prolina en P1 y P1'” descrito en la pre memoria y al menos 50 nkatal en la Parte 1 del “Ensayo de Actividad de Exopeptidasas” descrito en la presente memoria por mg de proteína. En otra realización, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de entre aproximadamente 1 U - 500 U de actividad en el “Ensayo de Actividad de Prolina en P1 y P1'” descrito en la presente memoria y entre aproximadamente 50 U - 2000 U katal en la Parte 1 en el “Ensayo de Actividad de Exopeptidasas” descrito en la presente memoria por mg de proteína.
Secuencias de aminoácidos y nucleótidos
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener
(por ejemplo, se obtiene) de cualquier fuente siempre que tenga la actividad descrita en la presente memoria.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Trichoderma.
Convenientemente, de Trichoderma reesei, más convenientemente, de Trichoderma reesei QM6A.
Convenientemente de Trichoderma virens, más convenientemente, de Trichoderma virens Gv29-8.
Convenientemente de Trichoderma atroviride. Más adecuadamente, de Trichoderma atroviride IMI 206040.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Aspergillus.
Convenientemente de Aspergillus fumigatus, más convenientemente de Aspergillus fumigatus CAE17675.
Convenientemente de Aspergillus kawachii, más convenientemente de Aspergillus kawachii IFO 4308.
Convenientemente de Aspergillus nidulans, más convenientemente de Aspergillus nidulans FGSC A4.
Convenientemente de Aspergillus oryzae, más convenientemente de Aspergillus oryzae RIB40.
Convenientemente de Aspergillus ruber, más convenientemente de Aspergillus ruber CBS135680.
Convenientemente de Aspergillus terreus, más convenientemente de Aspergillus terreus NIH2624.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Bipolaris, convenientemente de Bipolaris maydis, más convenientemente de Bipolaris maydis C5.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Togninia, convenientemente de Togninia minima, más convenientemente de Togninia minima UCRPA7.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Talaromyces, convenientemente de Talaromyces stipitatus, más convenientemente de Talaromyces stipitatus ATCC 10500.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Arthroderma, convenientemente de Arthroderma benhamiae, más convenientemente de Arthroderma benhamiae CBS 112371.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Magnaporthe, convenientemente de Magnaporthe oryzae, más convenientemente de Magnaporthe oryzae 70-1.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Fusarium.
Convenientemente de Fusarium oxysporum, más convenientemente de la raza 4 de Fusarium oxysporum f. sp.
cubense.
Convenientemente de Fusarium graminearum, más convenientemente de Fusarium graminearum PH-1.
En una realización adicional, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Phaeosphaeria, convenientemente de Phaeosphaeria nodorum, más convenientemente de Phaeosphaeria nodorum SN15.
En una realización adicional más, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Agaricus, convenientemente de Agaricus bisporus, más convenientemente de Agaricus bisporus var. burnettii JB137-S8.
En una realización adicional más, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Acremonium, convenientemente de Acremonium alcalophilum.
En una realización adicional más, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Sodiomyces, convenientemente de Sodiomyces alkalinus.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Penicillium.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede obtener de Penicillium digitatum, más convenientemente de Penicillium digitatum Pd1.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede obtener de Penicillium oxalicum, más convenientemente de Penicillium oxalicum 114-2.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede obtener de Penicillium roqueforti, más convenientemente de Penicillium roqueforti FM164.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede obtener de Penicillium rubens, más convenientemente de Penicillium rubens Wisconsin 54-1255.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Neosartorya.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede obtener de Neosartorya fischeri, más convenientemente de Neosartorya fischeri NRRL181.
En una realización, la tripeptidil peptidasa (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina) que se puede usar de acuerdo con la presente invención no se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) de Aspergillus niger.
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Descrita en la presente memoria, la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede:
(a) comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas;
(b) comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas;
(c) estar codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 71, SEQ ID N° 72, SEQ ID N° 73, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 77, SEQ ID N° 78, SEQ ID N° 79, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 87, SEQ ID N° 88, SEQ ID N° 89, SEQ ID N° 90, SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 92, SEQ ID N° 93, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97;
(d) estar codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 71, SEQ ID N° 72, SEQ ID N° 73, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 77, SEQ ID N° 78, SEQ ID N° 79, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 87, SEQ ID N° 88, SEQ ID N° 89, SEQ ID N° 90, SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 92, SEQ ID N° 93, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97;
(e) estar codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida con la SEC ID N° 56, la SEC ID N° 57, la SEC ID N° 58, la SEC ID N° 59, la SEC ID N° 60, la SEC ID N° 61, la SEC ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 71, SEQ ID N° 72, SEQ ID N° 73, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 77, SEQ ID N° 78, SEQ ID N° 79, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 87, SEQ ID N° 88, SEQ ID N° 89, SEQ ID N° 90, SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 92, SEQ ID N° 93, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97 bajo condiciones de rigurosidad media; o
(f) estar codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 65, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 67, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 69, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 71, SEQ ID N° 72, SEQ ID N° 73, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 77, SEQ ID N° 78, SEQ ID N° 79, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 85, SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 87, SEQ ID N° 88, SEQ ID N° 89, SEQ ID N° 90, SEQ ID N° 91, SEQ ID N° 92, SEQ ID N° 93, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97 debido a la degeneración del código genético.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede expresar como una secuencia polipeptídica que experimenta una modificación adicional postranscripcional y/o postraduccional.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 98 o un fragmento funcional de las mismas.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina comprende un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la s Eq ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 98 o un fragmento funcional de las mismas.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 98 o un fragmento funcional de las mismas.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina comprende un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la s Eq ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 98 o un fragmento funcional de las mismas.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser una tripeptidil peptidasa “madura” tolerante a la prolina que ha experimentado una modificación postranscripcional y/o postraduccional (por ejemplo, escisión postraduccional). Convenientemente, una modificación de este tipo puede conllevar la activación de la enzima.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina comprende un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la s Eq ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, s Eq ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N253, SEQ ID N254, SEQ ID N255, SEQ ID N299 o un fragmento funcional de las mismas.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender la secuencia de aminoácidos SEQ ID N229, SEQ ID N230, SEQ ID N231, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N2 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
Se describe en el presente documento la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina comprende un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la s Eq ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, s Eq ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N2 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La expresión “fragmento funcional” es una porción de una secuencia de aminoácidos que conserva su actividad enzimática de peptidasa. Por lo tanto, un fragmento funcional de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es una porción de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa, donde la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'. Como alternativa o de manera adicional, un fragmento funcional de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es una porción de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa y que es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen prolina en P1 y P1'.
La “porción” es cualquier porción que conserva la actividad tal como se ha definido anteriormente; convenientemente, una porción puede tener una longitud de al menos 50 aminoácidos, más convenientemente de al menos 100. En otras realizaciones, la porción puede tener una longitud de aproximadamente 150 o aproximadamente 200 aminoácidos.
En una realización, el fragmento funcional puede ser una porción de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina tras la modificación postranscripcional y/o postraduccional (por ejemplo, escisión). Convenientemente, el fragmento funcional puede comprender una secuencia tal como se muestra en: SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N2 39, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N243, SEQ ID N244, SEQ ID N245, SEQ ID N246, SEQ ID N247, SEQ ID N248, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N253, SEQ ID N254, SEQ ID N255 o SEQ ID NO: 98.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 1 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 1 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 3 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 3 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 4 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 4 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 5 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 5 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 6 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 6 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 7 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 7 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 8 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 8 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 9 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 9 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 10 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 10 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 11 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 11 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 12 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 12 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 13 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 13 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 14 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 14 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 15 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 15 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 16 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 16 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 17 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 17 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 18 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 18 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 19 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 19 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 20 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 20 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 21 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 21 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 22 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 22 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 23 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 23 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 24 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 24 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 25 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 25 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 26 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 26 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 27 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 27 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 28 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 28 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 29 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 29 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 30 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 30 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 31 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 31 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 32 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 32 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 33 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 33 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 34 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 34 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 35 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 35 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 36 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 36 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 37 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 37 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 38 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 38 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 39 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 39 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 40 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 40 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 41 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 41 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 42 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 42 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 43 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 43 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 44 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 44 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 45 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 45 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 46 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 46 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 47 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 47 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 48 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 48 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 49 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 49 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 50 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 50 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 51 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 51 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 52 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 52 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 53 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 53 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 54 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 54 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 55 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 55 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 98 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 98 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de la SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 80% de identidad con las SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, s E Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 85% de identidad con las SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, s E Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 27, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33, SEQ ID N° 34, SEQ ID N° 35, SEQ ID N° 36, SEQ ID N° 37, SEQ ID N° 38, SEQ ID N° 39, SEQ ID N° 40, SEQ ID N° 41, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 43, SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 45, SEQ ID N° 46, SEQ ID N° 47, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 50, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 52, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 90% de identidad con las SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, s E Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N°6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N221, SEQ ID N222, SEQ ID N223, SEQ ID N224, SEQ ID N225, SEQ ID N226, SEQ ID N227, SEQ ID N2 28, SEQ ID N230, SEQ ID N231, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N243, SEQ ID N244, SEQ ID N245, SEQ ID N246, SEQ ID N247, SEQ ID N248, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 95% de identidad con las SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, s E Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N25, SEQ ID N26, SEQ ID N27, SEQ ID N28, SEQ ID N29, SEQ ID N210, SEQ ID N211, SEQ ID N212, SEQ ID N213, SEQ ID N214, SEQ ID N215, SEQ ID N216, SEQ ID N217, SEQ ID N218, SEQ ID N219, SEQ ID N220, SEQ ID N221, SEQ ID N222, SEQ ID N223, SEQ ID N224, SEQ ID N225, SEQ ID N226, SEQ ID N227, SEQ ID N2 28, SEQ ID N230, SEQ ID N231, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N243, SEQ ID N244, SEQ ID N245, SEQ ID N246, SEQ ID N247, SEQ ID N248, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 97% de identidad con las SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, s E Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N25, SEQ ID N26, SEQ ID N27, SEQ ID N28, SEQ ID N29, SEQ ID N210, SEQ ID N211, SEQ ID N212, SEQ ID N213, SEQ ID N214, SEQ ID N215, SEQ ID N216, SEQ ID N217, SEQ ID N218, SEQ ID N219, SEQ ID N220, SEQ ID N221, SEQ ID N222, SEQ ID N223, SEQ ID N224, SEQ ID N225, SEQ ID N226, SEQ ID N227, SEQ ID N2 28, SEQ ID N230, SEQ ID N231, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N243, SEQ ID N244, SEQ ID N245, SEQ ID N246, SEQ ID N247, SEQ ID N248, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido que tiene al menos un 99% de identidad con las SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, s E Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N25, SEQ ID N26, SEQ ID N27, SEQ ID N28, SEQ ID N29, SEQ ID N210, SEQ ID N211, SEQ ID N212, SEQ ID N213, SEQ ID N214, SEQ ID N215, SEQ ID N216, SEQ ID N217, SEQ ID N218, SEQ ID N219, SEQ ID N220, SEQ ID N221, SEQ ID N222, SEQ ID N223, SEQ ID N224, SEQ ID N225, SEQ ID N226, SEQ ID N227, SEQ ID N2 28, SEQ ID N230, SEQ ID N231, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N243, SEQ ID N244, SEQ ID N245, SEQ ID N246, SEQ ID N247, SEQ ID N248, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 54, SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 99 o un fragmento funcional de las mismas.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender un aminoácido seleccionado entre una o más del grupo constituido por: la s E q ID N° 29, SEQ i D N° 1, S e Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N24, SEQ ID N25, SEQ ID N26, SEQ ID N27, SEQ ID N28, SEQ ID N29, SEQ ID N210, SEQ ID N211, SEQ ID N212, SEQ ID N213, SEQ ID N214, SEQ ID N215, SEQ ID N216, SEQ ID N217, SEQ ID N218, SEQ ID N219, SEQ ID N220, SEQ ID N221, SEQ ID N222, SEQ ID N223, SEQ ID N224, SEQ ID N225, SEQ ID N226, SEQ ID N2 27, SEQ ID N228, SEQ ID N230, SEQ ID N231, SEQ ID N232, SEQ ID N233, SEQ ID N234, SEQ ID N235, SEQ ID N236, SEQ ID N237, SEQ ID N238, SEQ ID N239, SEQ ID N240, SEQ ID N241, SEQ ID N242, SEQ ID N243, SEQ ID N244, SEQ ID N245, SEQ ID N246, SEQ ID N247, SEQ ID N248, SEQ ID N249, SEQ ID N250, SEQ ID N251, SEQ ID N252, SEQ ID N253, SEQ ID N254, SEQ ID N255, SEQ ID N298 y SEQ ID N299.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de una más del grupo constituido por: SEQ ID N° 1, S e Q ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 98, y SEQ ID N° 99 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, adecuadamente, una secuencia que tiene al menos un 80% con la misma o al menos un 90% con la misma.
Puede ser adecuado que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, pueda comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 30 y SEQ ID N° 31, o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, adecuadamente, una secuencia que tiene al menos un 80% con la misma o al menos un 90% con la misma.
Puede ser adecuado que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, pueda comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID N° 98 y la SEQ ID N° 99, o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, adecuadamente, una secuencia que tiene al menos un 80% con la misma o al menos un 90% con la misma.
Convenientemente, estas secuencias de aminoácidos concretas pueden ser especialmente adecuadas para escindir sustratos peptídicos y/o proteicos enriquecidos en lisina, arginina y/o glicina. Especialmente cuando la lisina, la arginina y/o la glicina están presentes en la posición P1.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de una más del grupo constituido por: SEQ ID N° 1, SeQ ID N° 2, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 32, SEQ ID N° 33 y SEQ ID N° 34, o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, adecuadamente, una secuencia que tiene al menos un 80% con la misma o al menos un 90% con la misma.
Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede tener la secuencia SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o SEQ ID N229.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender una o más secuencias motivo seleccionadas a partir del grupo constituido por xEANLD, y'Tzx'G y QNFSV.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender xEANLD.
x puede ser uno o más aminoácidos seleccionados a partir del grupo constituido por G, T, S y V.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender y'Tzx'G.
y' puede ser uno o más aminoácidos seleccionados a partir del grupo constituido por I, L y V.
z puede ser uno o más aminoácidos seleccionados a partir del grupo constituido por S y T.
x' puede ser uno o más aminoácidos seleccionados a partir del grupo constituido por I y V.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender la secuencia motivo QNFSV.
En una realización adicional, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender las secuencias motivo xEANLD e y'Tzx'G o xEANLD y QNFSV.
En una realización adicional más, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender las secuencias motivo y'Tzx'G y QNFSV.
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede comprender las secuencias motivo xEANLD, y'Tzx'G y QNFSV.
Uno o más de los motivos están presentes en las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina que se pueden usar en la presente invención. La Figura 17 indica la posición de estos motivos.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID N° 56, SEQ i D N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N261, SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N264, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N2 68, SEQ ID N269, SEQ ID N270, SEQ ID N271, SEQ ID N272, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N280, SEQ ID N296, SEQ ID N297 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma, adecuadamente, una secuencia que tiene al menos un 80% con la misma o al menos un 90% con la misma.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N258, SEQ ID N2 SEC ID N.259, SEC ID N.260, SEQ ID N261, SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N264, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N268, SEQ ID N269, SEQ ID N270, SEQ ID N271, SEQ ID N2 72, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97, más preferiblemente al menos 99% de identidad con la SEQ ID N° 56, SEQ ID N257, SEQ ID N258, SEQ ID N259, SEQ ID N260, SEQ ID N261, SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N264, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N268, SEQ ID N269, SEQ ID N270, SEQ ID N271, SEQ ID N272, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N2 80, SEQ ID N296 o SEQ ID N297.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, S e Q ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N260, SEQ ID N261, SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N264, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N268, SEQ ID N269, SEQ ID N270, SEQ ID N271, SEQ ID N272, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N280, SEQ ID N296 o SEQ ID N297 en condiciones de rigurosidad media. Adecuadamente, una secuencia de nucleótidos que hibrida con la SEQ ID N° 56, la SEQ ID N° 57, la SEQ ID N258, la SEQ ID N259, la SEQ ID N260, la SEQ ID N261, la SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N2 64, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N268, SEQ ID N269, SEQ ID N270, SEQ ID N271, SEQ ID N272, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97 en condiciones de alta rigurosidad.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, descrita en la presente memoria, puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 58, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 60, SEQ ID N261, SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N264, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N2 68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71, SEQ ID No. 72, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N280, SEQ ID N296 o SEQ ID N297 debido a la degeneración del código genético.
La secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento, que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada como la SEQ ID N256, SEQ ID N257, SEQ ID N258, SEQ ID N259, SEQ ID N260, SEQ ID N261, SEQ ID N262, SEQ ID N263, SEQ ID N264, SEQ ID N265, SEQ ID N266, SEQ ID N267, SEQ ID N268, SEQ ID N269, SEQ ID N270, SEQ ID N271, SEQ ID N272, SEQ ID N273, SEQ ID N274, SEQ ID N275, SEQ ID N276, SEQ ID N277, SEQ ID N278, SEQ ID N279, SEQ ID N280, SEQ ID N281, SEQ ID N282, SEQ ID N283, SEQ ID N284, SEQ ID N2 85, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N° 93, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96 o SEQ ID N° 97, puede ser una secuencia de ADN, ADNc, ADN sintético y/o ARN.
Preferentemente, la secuencia es una secuencia de ADN, más preferentemente una secuencia de ADNc que codifica la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de la presente invención.
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos que se puede usar en la presente invención está preferentemente en una forma aislada. El término “aislado” significa que la secuencia está al menos sustancialmente exenta de al menos otro componente distinto con el que normalmente se asocia la secuencia en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. La secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos que se puede usar en la presente invención se puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente exenta de uno o más contaminantes con los cuales de otro modo la sustancia podría estar asociada. Así pues, por ejemplo, puede estar sustancialmente exenta de una o más moléculas de ácido nucleico y/o polipéptidos potencialmente contaminantes.
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos que se puede usar en la presente invención está preferentemente en forma purificada. El término “purificado” significa que un componente concreto está presente a un nivel elevado. De manera deseable, el componente es el componente predominante presente en una composición. Preferentemente, está presente a un nivel de al menos aproximadamente un 90% o de al menos aproximadamente un 95% o de al menos aproximadamente un 98%, determinándose dicho nivel en función de peso seco con respecto a peso seco de la composición total que se está considerando.
Enzimas
En una realización, la enzima que se puede usar en la presente invención puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 1, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID N° 1. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 1.
En una realización, la enzima que se puede usar en la presente invención puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 2, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID N° 2. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 2.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 3, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 3. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 3.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 4, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 4. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 4.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 5, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 5. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 5.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 6, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 6. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 6.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 7, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 7. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 7.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 8, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 8. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 8.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 9, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 9. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 9.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 10, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 10. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 10.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 11, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 11. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 11.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 12, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 12. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 12.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 13, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 13. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 13.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 14, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 14. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 14.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 15, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 15. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 15.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 16, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 16. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 16.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 17, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 17. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 17.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 18, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 18.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 18.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 19, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 19. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 19.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 20, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 20. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 20.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 21, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 21. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 21.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 22, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 22. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 22.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 23, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 23. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 23.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 24, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 24. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 24.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 25, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 25. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 25.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 26, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 26. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 26.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 27, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 27. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 27.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 28, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 28. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 28.
En una realización, la enzima que se puede usar en la presente invención puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 29, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID N° 29. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 29.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 30, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 30. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 30.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 31, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 31. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 31.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 32, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 32. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 32.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 33, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 33. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 33.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 34, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 34. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 34.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 35, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 35. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 35.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 36, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 36. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 36.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 37, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 37. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 37.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 38, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 38. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 38.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 39, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 39. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 39.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 40, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 40. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 40.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 41, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 41. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 41.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 42, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 42. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 42.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 43, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 43. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 43.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 44, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 44. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 44.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 45, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 45. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 45.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 46, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 46. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 46.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 47, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 47. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 47.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 48, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 48. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 48.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 49, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 49. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 49.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 50, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 50. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 50.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 51, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 51. Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 51.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 52, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 52.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 52.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 53, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 53.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 53.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 54, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 54.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 54.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 55, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 55.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 55.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 98, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 98.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 98.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa que comprende la SEQ ID N° 99, un fragmento funcional de la misma o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la SEQ ID N° 99.
Adecuadamente, la enzima puede tener al menos un 80%, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N° 99.
En una realización, la enzima que se puede usar en la presente invención puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 56 o una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con esta. Adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 57 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 58 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 59 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 60 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 61 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 62 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 63 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 64 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 65 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 66 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 67 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 68 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 69 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 70 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 71 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 72 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 73 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 74 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 75 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 76 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 77 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 78 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 79 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 80 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 81 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 82 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 83 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 84 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 85 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 86 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 87 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 88 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 89 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 90 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 91 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 92 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 93 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 94 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 95 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 96 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
La enzima descrita en la presente memoria puede ser una tripeptidil peptidasa codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada como la SEQ ID N° 97 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Adecuadamente, al menos un 80% de identidad, adecuadamente, al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 95%, preferentemente al menos un 97%, adecuadamente, al menos un 99% de identidad con la misma.
Secuencia de nucleótidos
La presente memoria divulga el uso de secuencias de nucleótidos que codifican proteínas que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria.
La expresión “secuencia de nucleótidos”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o una secuencia de polinucleótidos y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de la misma (tales como porciones de la misma). La secuencia de nucleótidos puede tener un origen genómico, sintético o recombinante y puede ser monocatenaria o bicatenaria, sea la hebra codificante o no codificante.
La expresión “secuencia de nucleótidos” respecto a la presente invención incluye el ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferentemente, significa ADN, más preferentemente una secuencia de ADNc codificante de la presente invención.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos no incluye la secuencia de nucleótidos nativa cuando se encuentra en su entorno natural y cuando está ligada a su(s) secuencia(s) asociada(s) de manera natural que también está(n) en su entorno natural. Para facilitar la referencia, se denominará esta realización preferida la “secuencia de nucleótidos no nativa”. En este respecto, la expresión “secuencia de nucleótidos nativa” se refiere a una secuencia de nucleótidos completa que está en su entorno natural y que está ligada operativamente a un promotor completo con el cual está asociada normalmente, promotor que también está en su entorno natural. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos puede aislarse y/o purificarse después de la expresión de una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo. Sin embargo, preferentemente la secuencia de aminoácidos puede ser expresada por una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo pero donde la secuencia de nucleótidos no está controlada por el promotor con el cual se asocia normalmente en ese organismo.
Habitualmente, la secuencia de nucleótidos se prepara usando técnicas recombinantes de ADN (es decir, ADN recombinante). Sin embargo, en una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos se podría sintetizar, en su totalidad o en parte, usando métodos químicos muy conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et a l, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
Preparación de la secuencia de nucleótidos
Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene las propiedades específicas definidas en la presente memoria, o una proteína que es adecuada para su modificación se puede identificar y/o aislar y/o purificar de cualquier célula u organismo que produzca la proteína. En la técnica se conocen en profundidad varios métodos para identificar y/o aislar y/o purificar las secuencias de nucleótidos. A título de ejemplo, se pueden usar técnicas de amplificación por PCR para preparar una cantidad mayor de una secuencia una vez que se haya identificado y/o aislado y/o purificado una secuencia adecuada.
A título de ejemplo adicional, se puede construir una colección de ADN genómico y/o ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la enzima. Si se conoce la secuencia de aminoácidos de la enzima, se pueden sintetizar sondas oligonucleotídicas marcadas y usarlas para identificar clones que codifican la enzima a partir de la colección genómica preparada a partir del organismo. Como alternativa, se podría usar una sonda oligonucleotídica marcada que contenga secuencias homólogas a otro gen conocido de la enzima para identificar clones que codifican la enzima. En el último caso, se usan condiciones de hibridación y lavado de rigurosidad baja.
Como alternativa, se podrían identificar los clones que codifican la enzima insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando bacterias negativas para la enzima con la colección de ADN genómico resultante y después sembrando las bacterias transformadas en placas de agar que contiene un sustrato para la enzima (es decir, maltosa) para que de esta manera sea posible identificar los clones que expresan la enzima.
En una alternativa adicional más, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima se puede preparar de manera sintética mediante métodos estándar consolidados; por ejemplo, el método de la fosforamidita descrito por Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, pp. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, pp. 801-805. En el método de la fosforamidita, se sintetizan los oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, se purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores apropiados.
La secuencia de nucleótidos puede tener un origen genómico y sintético mixto, un origen sintético y de ADNc mixto o un origen genómico y de ADNc mixto, preparada ligando fragmentos con un origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado) de acuerdo con las técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde a diversas partes de la secuencia de nucleótidos completa. La secuencia de ADN también puede prepararse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.683.202 o en Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pp. 487-491).
Secuencias de aminoácidos
En la presente memoria también se divulga el uso de secuencias de aminoácidos de enzimas que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria.
La expresión “secuencia de aminoácidos”, tal como se usa en la presente memoria, es un sinónimo del término “polipéptido” y/o del término “proteína”. En algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es un sinónimo del término “péptido”. En algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es un sinónimo del término “enzima”.
La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada o se puede obtener de manera sintética o se puede preparar mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.
La proteína se puede usar junto con otras proteínas, especialmente enzimas. Por lo tanto, la presente divulgación también abarca una combinación de proteínas en la que la combinación comprende la proteína/enzima de la presente divulgación y otra proteína/enzima que puede ser otra proteína/enzima de acuerdo con la presente divulgación. Este aspecto se analiza en una sección posterior. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos no es un enzima nativa. En este sentido, la expresión “enzima nativa” se refiere a una enzima completa que está en su entorno nativo y cuando ha sido expresada por su secuencia de nucleótidos nativa.
Aislada
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos o enzima de acuerdo con la presente invención está preferentemente en una forma aislada. El término “aislado” significa que la secuencia o enzima o ácido nucleico está al menos sustancialmente exento de al menos otro componente distinto con el que normalmente se asocia la secuencia, enzima o ácido nucleico en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. La secuencia, enzima o ácido nucleico de la presente invención se puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente exenta de uno o más contaminantes con los cuales de otro modo la sustancia podría estar asociada. Así pues, por ejemplo, puede estar sustancialmente exenta de una o más moléculas de ácido nucleico y/o polipéptidos potencialmente contaminantes.
Purificada
En un aspecto, la secuencia, enzima o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está preferentemente en una forma purificada. El término “purificado” significa que el componente concreto está presente con un nivel elevado. De manera deseable, el componente es el componente predominante presente en una composición. Preferentemente, está presente con un nivel de al menos aproximadamente un 80%, estando el nivel determinado en función de peso seco con respecto a peso seco de la composición total que se está considerando. Convenientemente, puede estar presente con un nivel de al menos aproximadamente un 90% o de al menos aproximadamente un 95 o de al menos aproximadamente un 98%, estando el nivel determinado en función de peso seco con respecto a peso seco de la composición total que se está considerando.
Identidad de secuencias u homología de secuencias
La presente invención también engloba el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencias u homología de secuencias con la secuencia o las secuencias de aminoácidos de un polipéptido que tienen las propiedades específicas definidas en la presente memoria o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de este tipo (denominadas en lo sucesivo en la presente memoria “secuencia(s) homóloga(s)”). En la presente memoria, el término “homólogo” se refiere a una entidad que tiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos de interés y las secuencias de nucleótidos de interés. En la presente memoria, el término “homología” puede equivaler a “identidad”.
La secuencia de aminoácidos y/o la secuencia de nucleótidos homóloga debe proporcionar y/o codificar un polipéptido que conserve la actividad funcional y/o potencie la actividad de la enzima.
En el presente contexto, se entiende que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que puede ser al menos un 85 o un 90% idéntica, preferentemente al menos un 95 o un 98% idéntica a la secuencia de interés. Por ejemplo, normalmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos de interés. Aunque también puede considerarse la homología en cuanto a la similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en cuanto a la identidad de secuencias.
En una realización, se entiende que una secuencia homologa incluye una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que tiene una o varias adiciones, deleciones y/o sustituciones con respecto a la secuencia de interés.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos se representa en la presente memoria o a una proteína derivada de esta proteína (precursora) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos, o más aminoácidos, tal como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora y que tiene la actividad de la proteína precursora.
Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos se determina a lo largo de al menos 20 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 30 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 40 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 50 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 60 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 100 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 200 aminoácidos contiguos.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una secuencia (o gen) de ácido nucleico que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos se representa en la presente memoria o que codifica una proteína derivada de esta proteína (precursora) por sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos, o más aminoácidos, tal como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora y que tiene la actividad de la proteína precursora.
En el presente contexto, se entiende que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos un 85 o un 90% idéntica, preferentemente al menos un 95 o un 98% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente divulgación (la secuencia de interés). Normalmente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etc. que la secuencia de interés. Aunque también puede considerarse la homología en cuanto a la similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en cuanto a la identidad de secuencias.
Las comparaciones de homología se pueden llevar a cabo de forma visual o, más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias que se pueden adquirir fácilmente. Estos programas informáticos comercializados pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias.
Se puede calcular el porcentaje de homología a lo largo de secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoácido en una secuencia con el correspondiente aminoácido en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineamiento “sin huecos”. Normalmente, tales alineamientos sin huecos se llevan a cabo únicamente a lo largo de un número relativamente corto de residuos.
Aunque este es un método muy simple y coherente, con él no se puede tener en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción provocará que los siguientes residuos de aminoácidos no estén alineados, lo que potencialmente resultará en una gran reducción en el porcentaje de homología cuando se lleva a cabo un alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos con las que se tengan en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación global de la homología. Esto se logra insertando “huecos” en el alineamiento secuencial para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, con estos métodos más complejos se asignan “penalizaciones por hueco” a cada hueco que se produce en el alineamiento, de manera que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento secuencial con el menor número de huecos posible (que refleja una relación mayor entre las dos secuencias comparadas) conseguirá una puntuación mayor que otro con muchos huecos. Normalmente se usan “costes de hueco afín” que asignan un coste relativamente elevado a la existencia de un hueco y una penalización menor para cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos usado más comúnmente. Obviamente, las penalizaciones elevadas por hueco producirán alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se emplea tal soporte lógico para las comparaciones de secuencias. Por lo tanto, el cálculo del porcentaje máximo de homología o porcentaje de identidad requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo que tenga en cuenta las penalizaciones por el hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo tal alineamiento es el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Ejemplos de soporte lógico que pueden realizar comparaciones de secuencia incluyen, sin limitación, el paquete BLAST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a ed. -capítulo 18), BLAST 2 (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y AlignX, por ejemplo. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para búsquedas con y sin conexión a Internet (véase Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60), tal como, por ejemplo, en la herramienta de búsqueda GenomeQuest (www.genomequest.com).
Aunque el porcentaje de homología final se puede medir según la identidad, el propio proceso de alineamiento normalmente no se basa en una comparación de los pares en un sentido de todo o nada. En su lugar, por lo general se usa una matriz de puntuación de la similitud graduada que asigna puntuaciones a cada comparación de pares en función de la similitud química o de la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo usada normalmente es la matriz BLOSUM62 (la matriz por defecto para el paquete de programas BLAST). Por lo general, los programas Vector NTI usan los valores públicos por defecto o la tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (véase el manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto para el paquete Vector NTI.
Como alternativa, el porcentaje de homologías puede calcularse usando la característica de alineamiento múltiple en Vector NTI (Invitrogen Corp.), basadas en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
Una vez que el soporte lógico ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el porcentaje de homología, preferentemente el porcentaje de identidad de secuencias. El soporte lógico realiza esto habitualmente como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
En el supuesto caso de que se usasen penalizaciones por hueco al determinar la identidad de secuencias, entonces preferentemente se usan los siguientes parámetros para el alineamiento de pares:
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En una realización, se puede usar CLUSTAL con la del conjunto de la penalización por hueco y la extensión del hueco tal como se ha definido anteriormente.
Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina a lo largo de al menos 20 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 30 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 40 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 50 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 60 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 100 nucleótidos contiguos.
Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina a lo largo de al menos 100 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 200 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 300 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 400 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 500 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 600 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 700 nucleótidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 800 nucleótidos contiguos.
Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se puede determinar a lo largo de la secuencia completa.
Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia proteica (de aminoácidos) se determina a lo largo de al menos 100 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 200 aminoácidos contiguos, preferentemente a lo largo de al menos 300 aminoácidos contiguos.
Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de aminoácidos o proteica se puede determinar a lo largo de la secuencia completa descrita en la presente memoria.
La expresión “secuencia de búsqueda”, en el presente contexto, se refiere a una secuencia homóloga o a una secuencia exógena, la cual se alinea con la secuencia en cuestión con el fin de determinar si se encuentra dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, tal secuencia de búsqueda puede ser, por ejemplo, una secuencia de la técnica anterior o una secuencia de un tercero.
En una realización preferida, las secuencias se alinean con un programa de alineamiento global y la identidad de secuencias se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa divididas por la longitud de la secuencia en cuestión.
En una realización, el grado de identidad de secuencias entre una secuencia de búsqueda y una secuencia en cuestión se determina 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineamiento adecuado usando la matriz de puntuación por defecto y la penalización por hueco por defecto, 2) identificando el número de coincidencias exactas, produciéndose una coincidencia exacta cuando el programa de alineamiento ha identificado un aminoácido o nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición determinada en el alineamiento y 3) dividiendo el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia en cuestión.
En una realización preferida adicional más, el programa de alineamiento global se selecciona a partir del grupo constituido por CLUSTAL y BLAST (preferentemente BLAST) y la identidad de secuencias se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la longitud de la secuencia en cuestión.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que produzcan un cambio silencioso y den como resultado una sustancia equivalente desde el punto de vista funcional. Pueden efectuarse sustituciones deliberadas de aminoácidos en función de la similitud de la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobia, la hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos, siempre que se mantenga la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos funcionales polares sin carga que tienen valores de hidrofilia similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Pueden efectuarse sustituciones conservadoras según, por ejemplo, la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden ser sustituidos entre sí.
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La presente divulgación también engloba la sustitución homóloga (los términos “sustitución” y “reemplazo” se usan ambos en la presente memoria para referirse al intercambio de un residuo de aminoácido existente por un residuo alternativo) que pueda producirse; es decir, una sustitución de similar por similar, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. También puede producirse una sustitución no homóloga, es decir, de una clase de residuo a otra o, como alternativa, que implique la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como la ornitina (en lo sucesivo en la presente memoria denominada Z), el ácido diaminobutírico ornitina (en lo sucesivo en la presente memoria denominada B), norleucina ornitina (en lo sucesivo en la presente memoria denominada O), piridilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
También pueden efectuarse sustituciones con aminoácidos sintéticos (por ejemplo, aminoácidos no naturales) que incluyen: aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos*, N-alquilaminoácidos*, ácido láctico*, derivados con haluro de aminoácidos naturales tales como la trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alilglicina*, p-alanina*, ácido L-a-aminobutírico*, ácido L-Y-aminobutírico*, ácido L-a-aminoisobutírico*, ácido L-saminocaproico#, ácido 7-aminoheptanoico*, L-metioninasulfona#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metílicos de la fenilalanina (Phe) tales como la 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metilo)*, L-Phe (4-isopropilo)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)*, ácido L-diaminopropiónico# y L-Phe (4-bencilo)*. A efectos del análisis anterior (respecto a la sustitución homóloga o no homóloga) se ha usado la notación * para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado, mientras que se ha usado # para indicar la naturaleza hidrófila del derivado; #* indica características anfipáticas.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que se pueden insertar entre dos residuos de aminoácidos cualesquiera de la secuencia, incluidos grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo, además de espaciadores de aminoácidos tales como residuos de glicina o p-alanina. Una forma adicional de variación que conlleva la presencia de uno o más residuos de aminoácidos en forma peptoide es muy conocida por los expertos en la técnica. Para evitar dudas, se usa “la forma peptoide” para referirse a los residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente del a-carbono está en el átomo de nitrógeno del residuo en lugar del a­ carbono. En la técnica existe constancia de procesos para preparar péptidos en forma peptoide; por ejemplo, Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
Las secuencias de nucleótidos pueden incluir en ellas nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica existe constancia de varios tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos. Estas incluyen los esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Se debe sobreentender que las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria se pueden modificar mediante cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones se pueden llevar a cabo con el fin de mejorar la actividad in vivo o la vida útil de las secuencias de nucleótidos de la presente divulgación. La presente divulgación también engloba el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias mostradas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de las mismas, entonces se puede usar esa secuencia como una sonda para identificar secuencias codificantes similares en otros organismos, etc.
Se pueden obtener de varias maneras polinucleótidos que no son homólogos en un 100% a las secuencias de la presente divulgación. Por ejemplo, se pueden obtener otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria examinando colecciones de ADN obtenidas a partir de un conjunto de individuos, por ejemplo, individuos de poblaciones diferentes. Además, se pueden obtener otros homólogos, y tales homólogos y fragmentos de los mismos por lo general serán capaces de hibridarse de manera selectiva con las secuencias mostradas en la lista de secuencias de la presente memoria. Se pueden obtener tales secuencias examinando colecciones de ADNc obtenidas de o colecciones de ADN genómico de otras especies animales y examinando tales colecciones con sondas que comprenden la totalidad o parte de cualquiera de las secuencias en las listas de secuencias adjuntas en condiciones de rigurosidad entre media y alta. Se aplican consideraciones similares a la obtención de homólogos de la especie y variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos o polipeptídicas de la divulgación.
También se pueden obtener variantes y homólogos de la cepa/especie usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados para seleccionar como diana secuencias dentro de las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente divulgación. Se pueden predecir las secuencias conservadas, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias variantes/homólogos. Se pueden realizar los alineamientos de secuencias usando soporte lógico informático conocido en la técnica. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.
Los cebadores usados en la PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán con condiciones de rigurosidad menor que las usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencias únicos contra secuencias conocidas.
Como alternativa, se pueden obtener tales polinucleótidos mediante mutagénesis de secuencias caracterizadas dirigida al sitio. Esto puede resultar útil cuando, por ejemplo, se requieren cambios en la secuencia de codones silenciosos para optimizar las preferencias de codones para una célula anfitriona concreta en la que se están expresando las secuencias polinucleotídicas. Puede ser que se quiera introducir otros cambios en la secuencia con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
Se pueden usar polinucleótidos (secuencias nucleotídicas) según la invención para producir un cebador; por ejemplo, un cebador para la PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador de revelado mediante medios tradicionales usando marcadores radioactivos o no radioactivos o se pueden clonar los polinucleótidos en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán una longitud de al menos 15, preferentemente al menos 20, por ejemplo, al menos 25, 30 o 40 nucleótidos, y también están englobados por la expresión polinucleótidos de la invención tal como se usa en la presente memoria.
Los polinucleótidos tales como polinucleótidos de ADN y sondas se pueden producir de manera recombinante, sintética o por cualquier medio del que dispongan los expertos en la técnica. También se pueden clonar mediante técnicas estándar.
Por lo general, se producirán los cebadores por medios sintéticos que conllevan una producción en etapas de un nucleótido de cada vez de la secuencia de ácido nucleico deseada. En la especialidad se puede disponer fácilmente de técnicas para lograr esto usando técnicas automatizadas.
Los polinucleótidos más largos por lo general se producirán usando medios recombinantes; por ejemplo, usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores se pueden diseñar para que contengan sitios de reconocimiento adecuados para las enzimas de restricción, de manera que el ADN amplificado se pueda clonar en un vector de clonación adecuado.
Hibridación
La presente divulgación también engloba secuencias que son complementarias de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria o secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias descritas en la presente memoria o con secuencias que son complementarias de las mismas.
El término “hibridación”, tal como se usa en la presente memoria, incluye “el proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria mediante el emparejamiento de bases”, así como también el proceso de amplificación que se lleva a cabo en tecnologías con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La presente divulgación también engloba el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con las secuencias que son complementarias a las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas.
El término “variante” también engloba secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria.
Preferentemente, el término “variante” engloba secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridarse en condiciones de rigurosidad media (por ejemplo, 50°C y 0,2xSSC {1 xSSC = NaCl 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}) a las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria.
Más preferentemente, el término “variante” engloba secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridarse en condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo, 65°C y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}) a las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria.
La presente divulgación también se refiere a secuencias de nucleótidos que se pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (incluidas las secuencias complementarias a las que se presentan en la presente memoria).
La presente divulgación también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias que se pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (incluidas las secuencias complementarias a las que se presentan en la presente memoria).
En la presente memoria también se da a conocer el uso de secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en la presente memoria en condiciones de rigurosidad entre intermedia y máxima.
En un aspecto preferido, las secuencias de nucleótidos se pueden hibridar con la secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria, o la complementaria de la misma, en condiciones de rigurosidad media (por ejemplo, 50°C y 0,2xSSC {1 xSSC = NaCl 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}).
En un aspecto más preferido, las secuencias de nucleótidos se pueden hibridar con la secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria, o la complementaria de la misma, en condiciones de rigurosidad alta (por ejemplo, 65°C y 0,1xSSC {1 xSSC = NaCl 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}).
Preferentemente, la hibridación se analiza en todas las secuencias descritas en la presente memoria.
Evolución molecular
A título de ejemplo no limitante, es posible producir numerosas mutaciones dirigidas al sitio o aleatorias en una secuencia de nucleótidos, ya sea in vivo o in vitro y cribar posteriormente para seleccionar la funcionalidad mejorada del polipéptido codificado por diversos medios.
Además, las variantes con mutaciones o naturales de una secuencia de polinucleótidos se pueden recombinar con la forma natural u otras mutaciones o variantes naturales para producir nuevas variantes. También se puede realizar un cribado con estas nuevas variantes para seleccionar la funcionalidad mejorada del polipéptido codificado. La producción de nuevas variantes preferidas se puede lograr mediante diversos métodos muy consolidados en la técnica, por ejemplo, la mutagénesis con umbral de error (WO 92/18645), la mutagénesis aleatoria mediada por oligonucleótidos (US 5.723.323), el reordenamiento de ADN (US 5.605.793) o el ensamblaje génico exomediado WO00/58517. La aplicación de estos y similares métodos aleatorios de evolución molecular dirigida permite identificar y seleccionar variantes de las enzimas divulgadas en la presente memoria que tienen las características preferidas sin ningún conocimiento previo de la estructura o la función proteica y permite la producción de mutaciones o variantes imprevisibles pero beneficiosas. Existen numerosos ejemplos de la aplicación de la evolución molecular en la técnica para optimizar o alterar la actividad enzimática; tales ejemplos incluyen, sin carácter limitante, uno o más de los siguientes: expresión y/o actividad optimizada en una célula anfitriona o in vitro, mayor actividad enzimática, especificidad alterada del sustrato y/o del producto, mayor o menor estabilidad enzimática o estructural, actividad/especificidad enzimática alterada en condiciones ambientales preferidas; por ejemplo, la temperatura, el pH o el sustrato.
Mutagénesis dirigida al sitio
Una vez que se ha aislado una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, o se ha identificado una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína putativa, puede que se quiera mutar la secuencia con el fin de preparar una proteína de la presente invención.
Se pueden introducir las mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados.
Se describe un método adecuado en Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, pp. 646-649). Se describe otro método de introducción de mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican enzimas en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151).
Recombinante
En un aspecto, la secuencia que se puede usar en la presente invención es una secuencia recombinante (es decir, una secuencia que se ha preparado usando técnicas de ADN recombinante).
Estas técnicas de ADN recombinante se encuentran en las competencias de un experto en la técnica. Las técnicas se explican en la bibliografía; por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sintética
En un aspecto la secuencia que se puede usar en la presente invención es una secuencia sintética (es decir una secuencia que se ha preparado mediante síntesis in vitro química o enzimática). Esta incluye, sin carácter limitante, secuencias producidas con un uso de codones óptimo para su expresión en organismos anfitriones, tales como las levaduras metilótrofas Pichia y Hansenula.
Expresión de enzimas
La secuencia de nucleótidos que se puede usar en la presente invención se puede incorporar en un vector replicable recombinante. El vector se puede usar para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de proteína/enzima, en una célula anfitriona compatible y/o a partir de esta. La expresión se puede controlar usando secuencias de control; por ejemplo, secuencias reguladoras.
La proteína producida por una célula recombinante anfitriona que expresa la secuencia de nucleótidos se puede secretar o puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Las secuencias codificantes se pueden diseñar con secuencias señal que dirijan la secreción de las secuencias codificantes de la sustancia a través de una membrana celular procariota o eucariota concreta.
Vector de expresión
La expresión “vector de expresión” se refiere a un constructo capaz de una expresión in vivo o in vitro.
En una realización, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina que se pueden usar en la presente invención pueden estar codificadas por un vector. En otras palabras, el vector puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina.
Preferentemente, el vector de expresión es incorporado al genoma de un organismo anfitrión adecuado. El término “incorporado” abarca preferentemente la incorporación estable en el genoma. La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar presente en un vector en el cual la secuencia de nucleótidos se une operativamente a secuencias reguladoras que hacen posible que un organismo anfitrión adecuado exprese la secuencia de nucleótidos.
Los vectores que se pueden usar en la presente invención se pueden usar para transformar una célula anfitriona adecuada, tal como se describe posteriormente, para hacer posible la expresión de un polipéptido para su uso en la presente invención.
La elección del vector, por ejemplo, un vector de tipo plásmido, cósmido o fago a menudo dependerá de la célula anfitriona en la cual haya de ser introducido.
Los vectores que se puede usar en la presente invención pueden contener uno o más marcadores génicos seleccionables (tales como un gen que confiere resistencia a antibióticos; por ejemplo, resistencia a la ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina). Como alternativa, se puede conseguir la selección mediante una cotransformación (tal como se describe en el documento WO91/17243).
Se pueden usar vectores in vitro, por ejemplo, para producir ARN o se pueden usar para transfectar, transformar, transducir o infectar una célula anfitriona.
En la presente memoria se proporciona un método para generar secuencias de nucleótidos para ser usado en la presente invención introduciendo una secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula anfitriona compatible y cultivando la célula anfitriona en condiciones que ocasionan la replicación del vector.
El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permita que el vector se replique en la célula anfitriona en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
Optimización de codones
La secuencia de nucleótidos y/o el vector que codifica la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina pueden tener los codones optimizados para la expresión en un organismo anfitrión concreto.
La secuencia de nucleótidos y/o el vector que codifica la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina pueden tener los codones optimizados para la expresión en una célula procariota o eucariota. Convenientemente, la secuencia de nucleótidos y/o el vector que codifica la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina pueden tener los codones optimizados para la expresión en un organismo anfitrión fúngico (por ejemplo, Trichoderma, preferentemente Trichoderma reesei).
La optimización de codones se refiere a un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para una expresión potenciada en una célula anfitriona de interés, remplazando al menos un codón (por ejemplo, al menos aproximadamente más de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 60, 70, 80 o 100 codones) de la secuencia nativa con codones que se usan más frecuentemente en los genes de la célula anfitriona, manteniendo al mismo tiempo la secuencia nativa de aminoácidos. Diversas especies muestran un sesgo particular hacia ciertos codones de un aminoácido concreto. El sesgo de codones (diferencias en el uso de codones entre los organismos) a menudo se correlaciona con la eficacia de traducción del ARN mensajero (ARNm), la cual, a su vez, se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se están traduciendo y de la disponibilidad de moléculas de ARN de transferencia (ARNt) concretas. Por lo general, la predominancia de los ARNt seleccionados en una célula refleja los codones usados con mayor frecuencia en la síntesis de péptidos.
En consecuencia, se pueden modificar los genes para una expresión génica óptima en un organismo dado en función de la optimización de los codones. Una secuencia de nucleótidos y/o un vector que ha experimentado esta modificación se puede denominar, por lo tanto, una secuencia de nucleótidos y/o un vector con “codones optimizados”.
Hay fácilmente disponibles tablas de uso de codones, por ejemplo, en la “Base de Datos de Uso de Codones” y estas tablas se pueden adaptar de varias maneras. Véase Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). También están disponibles algoritmos informáticos para optimizar los codones de una secuencia particular para su expresión en una célula anfitriona particular, tales como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, Pensilvania). En algunas realizaciones, uno o más codones (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, o más, o todos los codones) en una secuencia que codifica una tripeptidil peptidasa y/o una endoproteasa tolerantes a la prolina para su uso en la presente invención corresponden al codón más frecuentemente usado para un aminoácido particular.
En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene los codones optimizados para la expresión en Trichoderma reesei.
La secuencia optimizada de codones descrita en la presente memoria puede comprender una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID N281, SEQ ID N282, SEQ ID N283, SEQ ID N284, SEQ ID N285, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N293, SEQ ID N2 94, SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 97 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con las mismas. Convenientemente, una secuencia que tiene al menos un 80% con las mismas o al menos un 90% con las mismas.
La secuencia optimizada de codones descrita en la presente memoria puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 83, SEQ ID N284, SEQ ID N285, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N2 91, SEQ ID N° 92, SEQ ID N° 93, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95, más preferentemente al menos un 99% de identidad con la SEQ ID N281, SEQ ID N282, SEQ ID N283, SEQ ID N284, SEQ ID N285, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N293, SEQ ID N294, SEQ ID N295 o SEQ ID N297.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina descrita en la presente memoria puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEQ ID N281, SEQ ID N282, SEQ ID N283, SEQ ID N284, SEQ ID N285, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N293, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95 o SEQ ID N° 97 en condiciones de rigurosidad media. Convenientemente, una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEQ ID N281, SEQ ID N282, SEQ ID N283, SEQ ID N284, SEQ ID N285, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N293, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95 o SEQ ID N° 97 en condiciones de rigurosidad alta.
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina descrita en la presente memoria puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de SEQ ID N281, SEQ ID N282, SEQ ID N283, SEQ ID N284, SEQ ID N285, SEQ ID N2 86, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N293, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 95 o SEQ ID N° 97 debido a la degeneración del código genético.
En la presente memoria se describe un vector (por ejemplo, un plásmido) que comprende una o más de las secuencias seleccionadas del grupo constituido por: SEC ID N° 81, SEC ID N° 82, SEC ID N° 83, SEC ID N° 84, SEC ID N° 85, SEQ ID N286, SEQ ID N287, SEQ ID N288, SEQ ID N289, SEQ ID N290, SEQ ID N291, SEQ ID N292, SEQ ID N2 93, SEQ ID N294, SEQ ID N295 o SEQ ID N297.
Secuencias reguladoras
En algunas aplicaciones, la secuencia de nucleótidos que se puede usar en la presente invención está unida operativamente a una secuencia reguladora que es capaz de permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, mediante la célula anfitriona elegida. A título de ejemplo, la presente divulgación, engloba un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención ligada operativamente a tal secuencia reguladora; es decir, el vector es un vector de expresión.
La expresión “ligada operativamente” se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de su manera prevista. Una secuencia reguladora “ligada operativamente” a una secuencia codificante está ligada de tal forma que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control.
La expresión “secuencias reguladoras” incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.
El término “promotor” se usa en el sentido habitual en la técnica; por ejemplo, un sitio de unión de la ARN-polimerasa. La expresión potenciada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima para su uso en la presente invención también se pude lograr mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas; por ejemplo, regiones promotoras, líder de secreción y de terminación.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención se une operativamente a al menos un promotor.
Se pueden usar otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido para su uso en la presente invención. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un anfitrión bacteriano, fúngico o de tipo levadura son muy conocidos en la técnica.
El promotor puede incluir además características que garanticen o aumenten la expresión en un anfitrión adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser regiones conservadas tales como una caja de Pribnow o una caja TATA. Constructos
El término “constructo” (que es sinónimo de términos tales como “conjugado”, “casete” e “híbrido”) incluye una secuencia de nucleótidos que se puede usar de acuerdo con la presente invención unida directa o indirectamente a un promotor.
Un ejemplo de una unión indirecta consiste en situar un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia de tipo intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, en medio entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es válido para el término “fusionado” con relación a la presente invención que incluye la unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no engloban la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada normalmente con el promotor génico natural y cuando ambos están en su entorno natural.
El constructo puede incluso contener o expresar un marcador, que permite la selección del constructo genético. Para algunas aplicaciones, preferentemente el constructo de la presente invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida operativamente a un promotor.
Células anfitrionas
La expresión “célula anfitriona”, con relación a la presente invención, incluye cualquier célula que comprenda ya sea la secuencia de nucleótidos o un vector de expresión según se ha descrito anteriormente y que se usa en la producción recombinante de una proteína que tenga las propiedades específicas según se definen en la presente memoria. Por lo tanto, en la presente invención se describen células anfitrionas transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos que expresa la proteína para su uso en la presente invención. Las células se elegirán para que sean compatibles con el vector mencionado y pueden ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo, bacterianas), fúngicas, de levaduras o vegetales.
Las especies bacterianas grampositivas o gramnegativas son ejemplos de organismos anfitriones bacterianos adecuados.
Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la presente invención, y/o de la conveniencia de procesar adicionalmente la proteína expresada, se pueden preferir anfitriones eucariotas tales como levaduras u otros hongos. Por lo general, se prefieren las células de tipo levadura a las células fúngicas debido a que son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son secretadas de manera deficiente por la célula de levadura o en algunos casos no son procesadas de manera adecuada (por ejemplo, hiperglucosilación en la levadura). En estos casos, se debería seleccionar un organismo anfitrión fúngico diferente.
El uso de células anfitrionas adecuadas (tales como células anfitrionas fúngicas, de levaduras y vegetales) puede permitir modificaciones postraduccionales (por ejemplo, la miristoilación, glucosilación, truncamiento, lipidación y fosforilación de la tirosina, la serina o la treonina) según se necesiten para conferir una actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinante para su uso en la presente invención. La célula anfitriona puede ser una cepa deficiente en proteasa o sin proteasa. Esta puede ser, por ejemplo, la cepa de Aspergillus oryzae JaL 125 deficiente en proteasa en la que se ha eliminado el gen de la proteasa alcalina denominado “alp”. Esta cepa se describe en el documento WO97/35956.
Convenientemente, la célula anfitriona puede ser una célula anfitriona de Trichoderma, preferentemente una célula anfitriona de Trichoderma reesei. En otras realizaciones, la célula anfitriona puede ser cualquier miembro que pertenezca a los géneros Escherichia, Bacillus, Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Humicola y similares.
Organismo
El término “organismo”, con relación a la presente invención, incluye cualquier organismo que pudiera comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de acuerdo con la presente invención y/o los productos obtenidos a partir del mismo y/o en el que un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención cuando está presente en el organismo.
Los organismos adecuados pueden incluir una procariota, un hongo, una levadura o una planta.
La expresión “organismo transgénico”, con relación a la presente invención, incluye cualquier organismo que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de acuerdo con la presente invención y/o los productos obtenidos a partir del mismo y/o en el que un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención en el organismo. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora al genoma del organismo.
La expresión “organismo transgénico” no engloba las secuencias de nucleótidos codificantes nativas en su entorno natural cuando están controladas por su promotor nativo que también está en su entorno natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico descrito en la presente memoria incluye un organismo que comprende una combinación cualquiera o cualquier combinación de: la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido descrito en la presente invención, constructos descritos en la presente memoria, vectores descritos en la presente memoria, plásmidos descritos en la presente memoria, células descritas en la presente memoria, tejidos descritos en la presente memoria o los productos de los mismos.
Por ejemplo, el organismo transgénico también puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido descrito en la presente invención controlada por un promotor heterólogo.
Transformación de células/organismos anfitriones
Tal como se ha indicado anteriormente, el organismo anfitrión puede ser un organismo procariota o eucariota. Ejemplos de anfitriones procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus spp, incluyendo Bacillus subtilis y B. licheniformis.
Los contenidos sobre la transformación de anfitriones procariotas están bien documentados en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un anfitrión procariota, entonces puede ser necesario modificar convenientemente la secuencia de nucleótidos antes de la transformación, por ejemplo, eliminando intrones.
Las células fúngicas filamentosas se pueden transformar usando diversos métodos conocidos en la técnica, tales como un proceso que conlleva la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular de una manera conocida. En el documento EP 0 238 023 se describe el uso de Aspergillus como microorganismo anfitrión.
Otro organismo anfitrión puede ser una planta. Se puede consultar una reseña de las técnicas generales usadas para transformar plantas en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, marzo/abril de 1994 17-27). Se puede consultar una descripción adicional sobre la transformación de plantas en el documento EP-A-0449375.
En las siguientes secciones se presentan descripciones generales de la transformación de hongos, levaduras y plantas.
Hongos transformados
Un organismo anfitrión puede ser un hongo, tal como un moho. Los ejemplos de tales anfitriones adecuados incluyen cualquier miembro que pertenezca a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y similares.
En una realización, el organismo anfitrión puede ser un hongo filamentoso.
La transformación de hongos filamentosos se analiza en el documento US-A-5741665 que afirma que las técnicas estándar para transformar hongos filamentosos y cultivar los hongos son muy conocidas en la técnica. Se puede consultar una reseña en profundidad de las técnicas aplicadas a N. crassa, por ejemplo, en Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Descripciones adicionales que también se pueden usar en la transformación de hongos filamentosos son objeto de una reseña en el documento US-A-5674707.
Además, la expresión génica en los hongos filamentosos se explica en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol mayo de 2002; 20(5):200-6, Archer y Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
La presente memoria describe la producción de hongos filamentosos transgénicos de acuerdo con la presente invención preparados mediante el uso de estas técnicas estándar.
El organismo anfitrión descrito en la presente memoria es un organismo anfitrión de Trichoderma, por ejemplo, un organismo anfitrión de Trichoderma reesei.
El organismo anfitrión descrito en la presente memoria puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger. También puede prepararse un Aspergillus transgénico de acuerdo con la presente invención siguiendo, por ejemplo, los contenidos de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation, en: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666).
Levaduras transformadas
El organismo transgénico descrito en la presente memoria puede ser una levadura.
Se proporciona una reseña de los principios de la expresión de genes heterólogos en levaduras en, por ejemplo, Methods Mol Biol (1995), 49:341 -54, y Curr Opin Biotechnol (1997) oct;8(5):554-60.
A este respecto, la levadura —tal como la especie Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (véase FEMS Microbiol Rev (200024(1):45-66))— puede usarse como vehículo para la expresión de genes heterólogos.
E Hinchcliffe E Kenny (1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, editores, 2a edición, Academic Press Ltd.) proporcionan una reseña de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos génicos.
Para transformar levaduras se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, puede prepararse una Saccharomyces transgénica siguiendo los contenidos de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
Las células de levadura transformadas se pueden seleccionar usando diversos marcadores selectivos, tales como marcadores auxótrofos y marcadores dominantes de resistencia a antibióticos.
Cultivo y producción
Las células anfitrionas transformadas con la secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria se pueden cultivar en condiciones propicias para producir el polipéptido codificado y que faciliten la recuperación del polipéptido a partir de las células y/o del medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula anfitriona en cuestión y conseguir la expresión del polipéptido.
La proteína producida por una célula recombinante puede estar expuesta en la superficie de la célula.
La proteína puede ser secretada por las células anfitrionas y, convenientemente, podrá recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos muy conocidos.
Secreción
A menudo, resulta deseable que el anfitrión de expresión secrete la proteína en el medio de cultivo a partir del cual se puede recuperar la proteína con más facilidad. La secuencia líder de secreción descrita en la presente memoria se puede seleccionar en función del anfitrión de expresión deseado. También se pueden usar secuencias señal híbridas en el contexto de la presente invención.
Ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heterólogas son aquellas que se originan en el gen de la amioglucosidasa (AG) fúngico (glaA - las dos versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, Aspergillus), el gen del factor a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la a-amilasa (Bacillus).
A título de ejemplo, en Methods Enzymol (1990) 182:132-43 se reseña la secreción de proteínas heterólogas en E. coli.
Modificaciones postranscripcionales y postraduccionales
Convenientemente, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina que se puede usar en la presente invención pueden estar codificadas por cualquiera de las secuencias de nucleótidos que se muestran en la presente memoria. Dependiendo de la célula anfitriona usada se podrán realizar modificaciones postranscripcionales y/o postraduccionales. Se contempla que las enzimas (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina) que se pueden utilizar en los presentes métodos y/o usos engloban enzimas (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina) que han experimentado modificación postranscripcional y/o postraduccional.
Un ejemplo no limitante de una modificación postranscripcional y/o postraduccional es el “corte” o “escisión” de un polipéptido (por ejemplo, de la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina).
En algunas realizaciones, se puede cortar o escindir el polipéptido (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa de la presente invención, por ejemplo, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina). Esto puede dar como resultado la conversión de la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina de un estado inactivo o sustancialmente inactivo a un estado activo (es decir, capaz de realizar la actividad descrita en la presente memoria).
La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser un propéptido que experimenta una modificación postraduccional adicional para convertirse en un polipéptido maduro, es decir, un polipéptido que tiene la actividad tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina.
Únicamente a título de ejemplo, la SEQ ID N° 1 es la misma que la SEQ ID N° 29 excepto en que la SEQ ID N° 1 ha experimentado una modificación postraduccional y/o postranscripcional que ha eliminado algunos aminoácidos, más específicamente 197 aminoácidos del terminal N. Por lo tanto, el polipéptido que se muestra en la presente memoria como la SEQ ID N° 1 en algunas circunstancias (es decir, en algunas células anfitrionas) podría considerarse como un propéptido, que se procesa adicionalmente mediante una modificación postraduccional y/o postranscripcional para obtener un péptido maduro (SEQ ID N° 29). Las modificaciones exactas —por ejemplo, el sitio o los sitios de escisión, en lo que se refiere a la modificación postraduccional y/o postranscripcional— pueden variar ligeramente dependiendo de la especie anfitriona. En algunas especies anfitrionas puede no haber modificación postraduccional y/o postranscripcional; así pues, el propéptido sería equivalente al péptido maduro (es decir, un polipéptido que tiene la actividad tripeptidil peptidasa de la presente invención). Sin entrar en consideraciones teóricas, el sitio o los sitios de escisión pueden estar desplazados unos pocos residuos (por ejemplo, 1, 2 o 3 residuos) en cualquier dirección en comparación con el sitio de escisión mostrado por referencia respecto a la SEQ ID N° 29 en comparación con la SEQ ID N° 1. En otras palabras, en lugar de la escisión en la posición 197 (R), por ejemplo, la escisión podría producirse, por ejemplo, en la posición 196-A, 195-A, 194-A, 198Q, 199E o 200P. Además o como alternativa, la escisión puede dar como resultado la eliminación de aproximadamente 197 aminoácidos; en algunas realizaciones, la escisión puede dar como resultado la eliminación de entre 194 y 200 residuos.
Otros ejemplos de modificaciones postranscripcionales y/o postraduccionales incluyen, sin carácter limitante, la miristoilación, la glucosilación, el truncamiento, la lipidación y la fosforilación de la tirosina, serina o treonina. El experto comprenderá que el tipo de modificaciones postranscripcionales y/o postraduccionales que se pueden producir en una proteína (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina) puede depender del organismo anfitrión en el que se expresa la proteína (por ejemplo, la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina).
Detección
En la técnica existe constancia de diversos protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos incluyen el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación y que se pueden usar en diversos ensayos con ácidos nucleicos y aminoácidos.
Varias empresas, tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, Nueva Jersey), Promega (Madison, Wisconsin), y US Biochemical Corp (Cleveland, Ohio) suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos.
Moléculas indicadoras o marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromógenos, así como también sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que muestran el uso de los marcadores incluyen US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 y US-A-4.366.241.
También se pueden producir inmunoglobulina recombinantes tal como se muestra en el documento US-A-4.816.567.
Proteínas de fusión
La secuencia de aminoácidos que se puede usar de acuerdo con la presente invención se puede producir como una proteína de fusión, por ejemplo, para facilitar la extracción y la purificación. Ejemplos de las parejas de la proteína de fusión incluyen la glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o de activación transcripcional) y (p-galactosidasa). También puede resultar conveniente incluir un sitio de escisión proteolítico entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia proteica de interés para permitir la eliminación de secuencias de la proteína de fusión.
Preferentemente, la proteína de fusión no dificultará la actividad de la secuencia proteica.
Los sistemas de expresión de fusión génica en E. coli se han reseñado en Curr Opin Biotechnol (1995) 6(5):501-6.
En otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos puede estar ligada a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para realizar un cribado de colecciones de péptidos para identificar agentes capaces de afectar a la actividad de la sustancia, puede resultar útil codificar una sustancia quimérica que expresa un epítopo heterólogo que es reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente.
Técnicas generales de metodología de ADN recombinante
La presente invención emplea, a no ser que se indique algo distinto, técnicas tradicionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología que están comprendidas en las competencias de una persona con un dominio normal de la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; y, D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Cada uno de estos textos generales está incorporado a la presente memoria por referencia.
Dosificaciones
La tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina para su uso en los métodos y/o los usos de la presente invención pueden dosificarse en cualquier cantidad adecuada.
En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede administrar en una cantidad de aproximadamente 0,01 mg -100 mg; 0,5 mg -100 mg; 1 mg -50 mg; 5 mg -100 mg; 5 mg - 20 mg, 10 mg-100 mg; 0,05 mg - 50 mg; o 0,10 mg -10 mg de enzima por kg de composición de un aditivo para piensos. En ciertas realizaciones, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede dosificarse en una cantidad de aproximadamente 0,01 g a 1000 g de enzima por kg de composición de un aditivo para piensos, tal como de 0,1 g a 500 g, tal como de 0,5 g a 700 g, tal como en una cantidad de aproximadamente 0,01 g - 200 g, 0,01 g -100 g; 0,5 g -100 g; 1 g - 50 g; 5 g -100 g; 5 g - 20 g, 5 g - 15 g, 10 g -100 g; 0,05 g - 50 g; o 0,10 g -10 g de enzima por kg de composición de un aditivo para piensos.
En una realización preferida, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede administrar en una cantidad de aproximadamente 5 mg - 20 mg de enzima por kg de composición de un aditivo para piensos.
La cantidad exacta dependerá del tipo particular de la composición empleada y de la actividad proteasa específica por mg de proteína.
En otra realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede dosificarse en una cantidad de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 kg de enzima por kg de pienso y/o material de pienso y/o premezcla. Adecuadamente, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede dosificarse de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 250 g por kg de pienso y/o material de pienso y/o premezcla. Preferentemente, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 g (más preferentemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g) por kg de pienso y/o material de pienso y/o premezcla.
La endoproteasa puede dosificarse en una cantidad de menos de aproximadamente 6,0 g de enzima por tonelada métrica (MT) de pienso.
Adecuadamente, la endoproteasa puede dosificarse en una cantidad de menos de aproximadamente 4,0 g de enzima por MT, adecuadamente de menos de aproximadamente 2,0 g de enzima por MT.
En otra realización, la endoproteasa puede dosificarse entre aproximadamente 0,5 g y aproximadamente 5,0 g de enzima por MT de pienso. Adecuadamente, la endoproteasa puede dosificarse entre aproximadamente 0,5 g y aproximadamente 3,0 g de enzima por MT de pienso. Más adecuadamente, la endoproteasa puede dosificarse de aproximadamente 1,0 g a aproximadamente 2,0 g de enzima por MT de pienso.
En una realización, la aminopeptidasa puede dosificarse en una cantidad entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 2 g de enzima por kg de sustrato proteico y/o composición de un aditivo para piensos. Adecuadamente, la aminopeptidasa puede dosificarse en una cantidad entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 g de enzima por kg de sustrato proteico y/o composición de un aditivo para piensos. Más adecuadamente, en una cantidad entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 1,5 g de enzima por kg de sustrato proteico y/o composición de un aditivo para piensos.
Animal
El término “animal”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un animal al que se le ha administrado o se le va a administrar una composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención o un material de pienso que comprende la composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención.
Preferentemente, el animal es un mamífero, un animal rumiante, un animal monogástrico, un pez o un crustáceo, incluidos, por ejemplo, el ganado o un animal domesticado (por ejemplo, una mascota).
En una realización, el “animal” es ganado.
El término “ganado”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier animal de granja. Preferentemente, el ganado es uno o más de: vacas o toros (incluidos los terneros), cerdos (incluidos los lechones, puercos, cerdos de engorde, cerdas), aves de corral (incluidos los pollos de engorde, pollos, gallinas ponedoras y pavos), aves, peces (incluidos los peces de agua dulce tales como el salmón, el bacalao, la trucha y la carpa, por ejemplo, la carpa koi, y peces de agua salada tales como la lubina), crustáceos (tales como los camarones, los mejillones y vieiras), caballos (incluidos los caballos de carreras) y ovejas (incluidos los corderos).
En otra realización, el “animal” es un animal domesticado o mascota o un animal mantenido en un entorno de zoológico.
La expresión “animal domesticado o mascota o animal mantenido en un entorno de zoológico”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier animal relevante, incluidos cánidos (por ejemplo, perros), félidos (por ejemplo, gatos), roedores (por ejemplo, cobayas, ratas y ratones), aves, peces (incluidos peces de agua dulce y peces de agua salada) y caballos.
En una realización, el animal es un animal monogástrico. En una realización preferida, el animal monogástrico puede ser un ave de corral o un cerdo (o una combinación de los mismos).
En otra realización, el animal es un animal rumiante.
No se pretende que el término animal se refiera a un ser humano.
Embalaje
En una realización, la composición de un aditivo para piensos y/o premezcla y/o pienso o material de pienso de acuerdo con la presente invención se envasa.
En una realización preferida, la composición de un aditivo para piensos y/o premezcla y/o pienso o material de pienso se envasa en una bolsa, tal como una bolsa de papel.
En una realización alternativa, la composición de un aditivo para piensos y/o premezcla y/o pienso o material de pienso puede precintarse en un envase. Se puede usar cualquier envase adecuado.
Piensos
La composición de un aditivo para piensos de la presente invención se puede usar como un pienso o en la preparación de este.
El término “pienso” se usa indistintamente en la presente memoria con “material de pienso”.
El pienso se puede encontrar en forma de solución o como un sólido, dependiendo del uso y/o del modo de aplicación y/o del modo de administración.
Cuando se usa como pienso, tal como un pienso funcional, o en la preparación del mismo, la composición de la presente invención se puede usar conjuntamente con uno o más de los siguientes: un vehículo nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable o un ingrediente nutricionalmente activo.
En una realización preferida, la composición de un aditivo para piensos de la presente invención se mezcla con un componente de piensos para formar un material de pienso.
La expresión “componente de piensos”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a todo el material de pienso o una parte del mismo. La parte del material de pienso puede significar un constituyente del material de pienso o más de un constituyente del material de pienso; por ejemplo, 2 o 3 o 4. En una realización, la expresión “componente de piensos” engloba una premezcla o los constituyentes de la premezcla.
En una realización, una composición de un aditivo para piensos que comprende una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina y uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: un emulsionante de trigo, un poliol, un azúcar, una sal y un conservante (opcionalmente en combinación con una endoproteasa) se pueden mezclar con al menos una proteína, o una porción de la misma, que es una proteína animal o una proteína vegetal (por ejemplo, seleccionada entre una o más de una gliadina, una p-caseína, una p-lactoglobulina o un fragmento inmunógeno de una gliadina, una p-caseína, una p- lactoglobulina, glicinina, p-conglicinina, cruciferina, napina, colágeno, proteína del suero lácteo, proteína o harina de pescado, proteína o harina de carne, incluyendo harina de carne y hueso, proteína o harina de plumas, proteína de huevo, proteína de soja o proteína de cereales), comprendida preferentemente en el maíz, harina de soja, granos secos de maíz con solubles de destilería (DDGS), trigo, proteínas del trigo incluyendo el gluten, subproductos del trigo, salvado de trigo, subproductos del maíz, incluyendo la harina de gluten de maíz, cebada, avena, centeno, triticale, soja con toda la grasa, harinas de subproductos de origen animal, una proteína soluble en alcohol (preferentemente una zeína (por ejemplo, un maíz con zeína de maíz) y/o una kafirina (por ejemplo, del sorgo)), una proteína de semillas oleosas (preferentemente de proteínas de semillas de soja, proteínas de las semillas de girasol, proteínas de colza, proteínas de semillas de canola o combinaciones de las mismas) o una combinación de los mismos.
Preferentemente, el pienso puede ser un forraje, o una premezcla del mismo, un pienso compuesto, o una premezcla del mismo. En una realización, la composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención se puede mezclar con un pienso compuesto, un componente del pienso compuesto o con una premezcla de un pienso compuesto o con un forraje, un componente del forraje o una premezcla de un forraje.
El término forraje, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier alimento que se proporciona a un animal (en lugar del caso en el que el animal busca la comida por sí mismo). El forraje engloba plantas que se han cortado.
El término forraje incluye heno, paja, ensilado, piensos comprimidos y granulados, aceites y raciones mixtas y también legumbres y cereales germinados.
Se puede obtener el forraje a partir de una o más de las plantas seleccionadas entre: alfalfa (Medicago sativa), cebada, Lotus corniculatus, plantas del género Brassica, Brassica olerácea var. Acephala, col rizada, colza (canola), nabo sueco (colinabo), nabo, trébol, trébol alsike, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco, pasto, Arrhenatherum elatius, Festuca, grama común, Bromus tectorum, Danthonia decumbens, poa (a partir prados cubiertos con pastos mezclados de manera natural, Dactylis, Lolium, Phleum pratense, maíz, mijo, avena, sorgo, soja, árboles (ramas de la poda de copa para obtener heno de árboles), trigo y legumbres.
La expresión “pienso compuesto” se refiere a un pienso comercial en forma de harina, gránulos, frutos secos, torta o desmigado. Se pueden mezclar varios compuestos procedentes de diversas materias primas y aditivos. Estas mezclas se formulan de acuerdo con los requisitos específicos de cada animal diana.
Los piensos compuestos pueden ser piensos completos que proporcionan todos los nutrientes requeridos a diario, concentrados que proporcionan una parte de la ración (proteína, energía) o complementos que únicamente proporcionan micronutrientes adicionales, tales como los minerales y las vitaminas.
Los principales ingredientes usados en los piensos compuestos son los piensos en granos que incluyen el maíz, trigo, centeno, maíz, soja, sorgo, avena y cebada.
Convenientemente, una premezcla mencionada en la presente memoria puede ser una composición compuesta de microingredientes tales como vitaminas, minerales, conservantes químicos, antibióticos, productos de fermentación y otros ingredientes esenciales. Las premezclas son habitualmente composiciones adecuadas para su mezcla en raciones comerciales.
Las vitaminas para su uso en la presente invención pueden incluir vitamina A, vitamina D3, vitamina E, vitamina K3, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B12, niacina, ácido pantoténico o mezclas de los mismos.
Cualquier material de pienso de la presente invención puede comprender uno o más materiales de tipo pienso seleccionados a partir del grupo constituido por a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo, trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes tales como el maíz o el sorgo; b) subproductos de origen vegetal, tales como granos secos con solubles de destilería (DDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cascarilla de arroz, cascarilla de avena, nueces de palma, pulpa de cítricos, fibra de maíz, harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de afrecho, pienso de gluten de maíz, harina de gluten, moyuelos de trigo, harinilla de trigo o combinaciones de los mismos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuate, altramuz, guisantes, habas, algodón, canola (colza), harina de pescado, proteína plasmática seca, harina de carne y hueso, proteína de patata, suero lácteo, copra, ajonjolí; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes de origen vegetal y animal; e) minerales y vitaminas.
Un material de pienso de la presente invención puede contener al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50% o al menos un 60% en peso de harina de maíz y soja o maíz y soja con toda la grasa o harina de trigo o harina de girasol.
Además o como alternativa, un material de pienso de la presente invención puede comprender al menos un material de tipo pienso rico en fibra y/o al menos un subproducto del material o materiales de tipo pienso ricos en fibra para proporcionar un material de pienso rico en fibra. Los ejemplos de materiales de tipo pienso ricos en fibra incluyen: trigo, cebada, centeno, avena, subproductos vegetales (por ejemplo, cereales) tales como granos secos con solubles de destilería (DDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, moyuelos del trigo, salvado de arroz, cascarilla de arroz, cascarilla de avena, nueces de palma, pulpa de cítricos, fibra de maíz, harina de germen de maíz, salvado de maíz, pienso de afrecho, pienso de gluten de maíz, harina de gluten, moyuelos de trigo, harinilla de trigo o combinaciones de los mismos. Algunas fuentes de proteínas también se pueden considerar ricas en fibra: proteínas obtenidas a partir de fuentes tales como el girasol, el altramuz, las habas y el algodón.
En la presente invención, el pienso puede ser uno más de los siguientes: un pienso compuesto y premezcla, incluidos gránulos, frutos secos o torta (para el ganado); un cultivo o residuo de cultivo: maíz, soja, sorgo, avena, cebada, rastrojos de maíz, copra, paja, tamo, residuos de la remolacha azucarera; harina de pescado; pasto recién cortado y otras plantas forrajeras; harina de carne y hueso; melaza; torta oleaginosa y torta prensada; oligosacáridos; plantas forrajeras conservadas: heno y ensilado; algas; semillas y cereales, ya sean enteros o preparados por triturado, molienda, etc.; legumbres y cereales germinados; extracto de levadura.
El término “pienso” en la presente invención también engloba en algunas realizaciones alimento para mascotas. Un alimento para mascotas es un material de origen vegetal o animal destinado para el consumo por parte de mascotas, tal como un alimento para perros o un alimento para gatos. El alimento para mascotas, tal como alimento para perros y gatos, puede presentarse tanto en forma seca como pienso para perros o en forma húmeda enlatada. El alimento para gatos puede contener el aminoácido taurina.
El término “pienso” en la presente invención también engloba en algunas realizaciones alimento para peces. Normalmente, un alimento para peces contiene macronutrientes, oligoelementos y vitaminas necesarias para mantener sanos a peces en cautividad. La comida para peces puede presentarse en forma de copos, gránulos o comprimidos. Las formas granuladas, algunas de las cuales se hunden rápidamente, se usan a menudo para los peces grandes y las especies que buscan el alimento en el fondo. Algunos alimentos para peces también contienen aditivos, tales como beta caroteno u hormonas sexuales, para potenciar artificialmente el color de los peces ornamentales.
El término “pienso” en la presente invención también engloba en algunas realizaciones alimento para aves. El alimento para aves incluye el alimento que se usa tanto en los comederos para aves como para alimentar a mascotas que son aves. Normalmente, el alimento para aves comprende diversas semillas, pero también engloba sebo (grasa de vaca o de cordero).
La expresión “poner en contacto”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la aplicación directa o indirecta de la composición de la presente invención al producto (por ejemplo, el pienso). Ejemplos de los métodos de aplicación que se pueden usar incluyen, sin carácter limitante, tratar el producto en un material que comprende la composición de un aditivo para piensos, aplicación directa mezclando la composición de un aditivo para piensos con el producto, pulverizar la composición de un aditivo para piensos sobre la superficie del producto o sumergir el producto en un preparado de la composición de un aditivo para piensos.
En una realización, la composición de un aditivo para piensos de la presente invención se mezcla preferentemente con el producto (por ejemplo, el material de pienso). Como alternativa, la composición de un aditivo para piensos puede incluirse en la emulsión o ingredientes crudos de un material de pienso.
Para algunas aplicaciones, es importante que la composición esté accesible sobre o para la superficie de un producto que se va a tratar/ver afectado. Esto permite que la composición confiera una o más de las siguientes características favorables: la característica biofísica se selecciona del grupo constituido por uno o más de los siguientes: rendimiento del animal, rendimiento de crecimiento de un animal, índice de transformación del alimento (FCR, por sus siglas en inglés), capacidad de digerir una materia prima (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, incluyendo la digestibilidad del almidón, la grasa, las proteínas, la fibra), digestibilidad de nitrógeno (por ejemplo, digestibilidad ileal de nitrógeno) y energía digestible (por ejemplo, energía digestible ileal), retención de nitrógeno, rendimiento de la canal, tasa de crecimiento, ganancia en peso, peso corporal, masa, eficiencia del pienso, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño del huevo, peso del huevo, masa del huevo, tasa de puesta de huevos, ganancia en masa magra, porcentaje de ceniza ósea, miligramos de ceniza ósea, porcentaje de tocino dorsal, producción de leche, porcentaje de materia grasa láctea, rendimiento reproductivo como el tamaño de la camada, la capacidad de supervivencia de la camada, porcentaje de eclosión y el impacto ambiental; por ejemplo, producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.
Las composiciones de un aditivo para piensos de la presente invención se pueden aplicar para intercalar, recubrir y/o impregnar un producto (por ejemplo, un material de pienso o ingredientes crudos de un material de pienso) con una cantidad controlada de enzima(s).
Preferentemente, la composición de un aditivo para piensos de la presente invención será termoestable frente al tratamiento térmico hasta aproximadamente 70°C, hasta aproximadamente 85°C o hasta aproximadamente 95°C. El tratamiento térmico se puede realizar durante hasta aproximadamente 1 minuto, hasta aproximadamente 5 minutos, hasta aproximadamente 10 minutos, hasta aproximadamente 30 minutos, hasta aproximadamente 60 minutos. El término termoestable significa que al menos aproximadamente un 75% de los componentes enzimáticos que estaban presentes/eran activos en el aditivo antes de calentar hasta la temperatura especificada siguen estando presentes/siendo activos después de que enfríe hasta la temperatura ambiente. Preferentemente, al menos aproximadamente un 80% de los componentes enzimáticos que estaban presentes y eran activos en el aditivo antes de calentar hasta la temperatura especificada siguen estando presentes/siendo activos después de que enfríe hasta la temperatura ambiente.
En una realización especialmente preferida, la composición de un aditivo para piensos se homogeneiza para producir un polvo.
En una realización alternativa preferida, la composición de un aditivo para piensos se formula en gránulos, como se describe en el documento WO2007/044968 (denominados gránulos TPT), incorporado en la presente memoria por referencia.
En otra realización preferida, cuando la composición de un aditivo para piensos se formula en gránulos, los gránulos comprenden una barrera salina hidratada con la que se recubre el núcleo proteico. La ventaja de tal recubrimiento salino es una mejor termotolerancia, mejor estabilidad en el almacenamiento y protección contra otros aditivos para piensos que de otra manera tendrían un efecto negativo sobre la enzima. Preferentemente, la sal usada para el recubrimiento salino tiene una actividad acuosa superior a 0,25 o una humedad constante superior a un 60% a 20°C.
Preferentemente, el recubrimiento salino comprende un Na2SO4.
El método para preparar una composición de un aditivo para piensos también puede comprender la etapa adicional de formación de gránulos con el polvo. El polvo se puede mezclar con otros componentes conocidos en la técnica. Se puede forzar el paso del polvo, o la mezcla que comprende el polvo, a través de una boquilla y las hebras resultantes se cortan en gránulos adecuados con una longitud variable.
Opcionalmente, la etapa de formación de gránulos puede incluir un tratamiento con vapor o una etapa de acondicionamiento antes de la formación de los gránulos. La mezcla que comprende el polvo se puede colocar en un acondicionador; por ejemplo, un mezclador con inyección de vapor. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada tal como de 60-100°C; las temperaturas típicas serían 70°C, 80°C, 85°C, 90°C o 95°C. El tiempo de permanencia puede variar entre segundos y minutos e incluso horas, tales como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.
Se sobreentenderá que la composición de un aditivo para piensos en la presente invención es adecuada para ser añadida a cualquier material de tipo pienso apropiado.
La expresión “material de tipo pienso”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere al material de tipo pienso básico que va a consumir un animal. Se sobreentenderá además que esto puede comprender, por ejemplo, al menos uno o más cereales no procesados y/o materiales procesados de origen vegetal y/o animal, tales como harina de soja o harina de hueso.
La expresión “material de pienso”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un material de tipo pienso al cual se han añadido una o más composiciones de un aditivo para piensos.
El experto sobreentenderá que diferentes animales necesitarán diferentes materiales de pienso y que incluso el mismo animal podrá necesitar diferentes materiales de pienso, dependiendo del objetivo para el que se cría el animal.
Preferentemente, el material de pienso puede comprender productos alimenticios que comprenden maíz, trigo, cebada, triticale, centeno, arroz, tapioca, sorgo y/o cualquiera de los subproductos, así como componentes ricos en proteínas como harina de soja, harina de colza, harina de canola (colza), harina de semilla de algodón, harina de girasol, harinas de subproductos de origen animal y mezclas de los mismos. Más preferentemente, el material de pienso puede comprender grasas animales y/o aceites vegetales.
Opcionalmente, el material de pienso también puede contener minerales adicionales tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales.
Preferentemente, el material de pienso es una mezcla de harina de soja y maíz.
En otro aspecto, se proporciona un método de preparación de material de pienso, que comprende poner en contacto un componente de piensos con una composición de un aditivo para piensos o un ingrediente para piensos de la invención o una composición de un aditivo para piensos que se puede obtener (preferentemente se obtiene) por un método de la invención o una premezcla de la invención o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, que tiene predominantemente actividad exopeptidasa, donde la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; o
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'
opcionalmente en combinación con al menos una endoproteasa, preferiblemente cuando la endoproteasa y/o la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina están inactivas (o sustancialmente inactivas) en el pienso antes de suministrar el pienso a un animal, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
También se proporciona material de pienso que comprende una composición de un aditivo para piensos o un ingrediente para piensos de la invención o una premezcla de la invención.
Normalmente, el material de pienso se produce en molinos de pienso en los cuales en primer lugar se muelen las materias primas hasta conseguir un tamaño de partícula adecuado y a continuación se mezclan con los aditivos apropiados. A continuación, se puede producir un material de pienso en forma de una papilla o gránulos; estos últimos conllevan normalmente un método en el cual se eleva la temperatura hasta un nivel diana y después se pasa el pienso a través de una boquilla para producir gránulos de un tamaño determinado. Los gránulos se dejan enfriar. Posteriormente, se pueden añadir aditivos líquidos tales como grasas y enzimas. La producción del material de pienso también puede conllevar una etapa adicional que incluye la extrusión o expansión antes de la formación de gránulos, en particular mediante técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor.
El material de pienso puede ser material de pienso para un animal monogástrico, tal como aves de corral (por ejemplo, pollos de engorde, gallinas ponedoras, pollos de engorde para fines reproductivos, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), cerdos (todas las categorías de edad), una mascota (por ejemplo perros o gatos) o peces; preferentemente, el material de pienso es para aves de corral.
Únicamente a título de ejemplo, un material de pienso para pollos —por ejemplo, pollos de engorde— puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo, en los porcentajes que se proporcionan en la siguiente tabla:
Figure imgf000113_0001
Únicamente a título de ejemplo, la descripción de la dieta para pollos, tal como pollos de engorde, puede ser tal como se indica en la siguiente tabla:
Figure imgf000113_0002
Únicamente a título de ejemplo, un material de pienso para gallinas ponedoras puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla; por ejemplo, en los porcentajes que se proporcionan en la siguiente tabla:
Figure imgf000113_0003
Figure imgf000114_0003
Únicamente a título de ejemplo, la descripción de la dieta para gallinas ponedoras puede ser tal como se indica en la siguiente tabla:
Figure imgf000114_0004
Únicamente a título de ejemplo, un material de pienso para pavos puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla; por ejemplo, en los porcentajes que se proporcionan en la siguiente tabla:
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Únicamente a título de ejemplo, la descripción de la dieta para pavos puede ser tal como se indica en la siguiente tabla:
Figure imgf000114_0002
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Únicamente a título de ejemplo, un material de pienso para lechones puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla; por ejemplo, en los porcentajes que se proporcionan en la siguiente tabla:
Figure imgf000115_0002
Únicamente a título de ejemplo, la descripción de la dieta para lechones puede ser tal como se indica en la siguiente tabla:
Figure imgf000115_0003
Únicamente a título de ejemplo, un material de pienso para cerdos en las fases de engorde/finalización puede comprender uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla; por ejemplo, en los porcentajes que se proporcionan en la siguiente tabla:
Figure imgf000116_0001
Únicamente a título de ejemplo, la descripción de la dieta para cerdos en las fases de engorde/finalización puede ser tal como se indica en la siguiente tabla:
Figure imgf000116_0002
Formas
La composición de un aditivo para piensos de la presente invención y otros componentes y/o el material de pienso que los comprende se pueden usar en cualquier forma adecuada.
La composición del aditivo para piensos de la presente invención se puede usar en forma de preparados sólidos o líquidos o alternativas de los mismos. Los ejemplos de preparados sólidos incluyen los polvos, pastas, bolos, cápsulas, pelotillas, comprimidos, polvillo y gránulos que pueden ser humectables, secados por dispersión o liofilizados. Ejemplos de preparados líquidos incluyen, sin carácter limitante, soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuoso-orgánicas.
En algunas aplicaciones, la composición de un aditivo para piensos de la presente invención se puede mezclar con el pienso o administrarse en el agua de beber.
Ejemplos adecuados de formas incluyen uno o más de: polvos, pastas, bolos, pelotillas, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, óvulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, sostenida, pulsátil o controlada.
A título de ejemplo, si la composición de la presente invención se usa en forma sólida —por ejemplo, en gránulos—, también puede contener uno o más de: excipientes tales como la celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dibásico de calcio y glicina; desintegrantes tales como el almidón (preferentemente fécula de maíz, patata o tapioca), glicolato sódico de almidón, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos; aglutinantes de formación de gránulos tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga; pueden incluirse agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.
Ejemplos de vehículos aceptables desde un punto de vista nutricional que se pueden usar para preparar las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silicílico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Los excipientes preferidos para las formas incluyen la lactosa, el almidón, una celulosa, el azúcar de la leche o polietilenglicoles de peso molecular elevado.
Para las suspensiones y/o los elixires acuosos, la composición de la presente invención se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materia colorante o tinciones, con agentes emulsionantes y/o de suspensión y con diluyentes tales como agua, propilenglicol y glicerina y combinaciones de los mismos.
Combinación con otros componentes
La composición de un aditivo para piensos, o ingrediente para piensos, o pienso o material de pienso o premezcla de la presente invención puede usarse en combinación con otros componentes.
La combinación de la composición de un aditivo para piensos de la presente invención, o ingrediente para piensos, o pienso o material de pienso o premezcla de la presente invención y otro componente que es adecuado para su consumo por animales y es capaz de proporcionar un beneficio médico o fisiológico al consumidor.
En una realización, el “otro componente” puede ser una o más enzimas.
Las enzimas adicionales adecuadas para su uso en la presente invención pueden ser una o más de las enzimas seleccionadas del grupo constituido por: endoglucanasas (E.C. 3.2.1.4); celiobiohidrolasas (E.C. 3.2.1.91), pglucosidasas (E.C. 3.2.1.21), celulasas (E.C. 3.2.1.74), liquenasas (E.C. 3.1.1.73), lipasas (E.C. 3.1.1.3), aciltransferasas de lípidos (generalmente clasificadas como E.C. 2.3.1.x), fosfolipasas (E.C. 3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 o E.C. 3.1.1.5), fitasas (por ejemplo, 6-fitasa (E.C. 3.1.3.26) o una 3-fitasa (E.C. 3.1.3.8), alfa-amilasas (E.C. 3.2.1.1), xilanasas (E.C. 3.2.1.8, E.C. 3.2.1.32, E.C. 3.2.1.37, E.C. 3.1.1.72, E.C. 3.1.1.73), glucoamilasas (E.C. 3.2.1.3), proteasas (por ejemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) o una bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) o una serina proteasa alcalina (E.C. 3.4.21.x) o una queratinasa (E.C. 3.4.x.x)) y/o mananasas (por ejemplo, una p-mananasa (E.C. 3.2.1.78)).
Convenientemente, el otro componente puede ser una fitasa (por ejemplo, una 6-fitasa (E.C. 3.1.3.26) o una 3- fitasa (E.C. 3.1.3.8)).
En una realización (particularmente para aplicaciones en piensos) el otro componente puede ser una o más de las enzimas seleccionadas del grupo constituido por xilanasas (E.C. 3.2.1.8, E.C. 3.2.1.32, E.C. 3.2.1.37, E.C. 3.1.1.72, E.C. 3.1.1.73), una amilasa (incluyendo a-amilasas (E.C. 3.2.1.1), amilasas formadoras de G4 (E.C. 3.2.1.60), pamilasas (E.C. 3.2.1.2) y Y-amilasas (E.C. 3.2.1.3); y/o una proteasa (por ejemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) o una bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) o una serina proteasa alcalina (E.C. 3.4.21.x) o una queratinasa (E.C. 3.4.x.x)). En una realización (especialmente para las aplicaciones en piensos) el otro componente puede ser una combinación de una amilasa (por ejemplo, las a-amilasas (E.C. 3.2.1.1)) y una proteasa (por ejemplo, la subtilisina (E.C. 3.4.21.62)).
En una realización (especialmente para las aplicaciones en piensos) el otro componente puede ser una p-glucanasa, por ejemplo, una endo-1,3(4)-p-glucanasa (E.C. 3.2.1.6).
En una realización (especialmente para las aplicaciones en piensos) el otro componente puede ser una mananasa, por ejemplo, una p-mananasa (E.C. 3.2.1.78)).
En una realización (especialmente para las aplicaciones en piensos) el otro componente puede ser una lipasa (E.C.
3.1.1.3), una aciltransferasa lipídica (por lo general clasificada como E.C. 2.3.1.x), o una fosfolipasa (E.C. 3.1.1.4, E.C.
3.1.1.32 o E.C. 3.1.1.5), convenientemente una lipasa (E.C. 3.1.1.3).
En una realización (especialmente para las aplicaciones en piensos) el otro componente puede ser una proteasa (por ejemplo, una subtilisina (E.C. 3.4.21.62) o una bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) o una serina proteasa alcalina (E.C.
3.4.21.x) o una queratinasa (E.C. 3.4.x.x)).
En otra realización, el otro componente puede ser una proteasa adicional. Convenientemente, la proteasa adicional se puede seleccionar a partir del grupo constituido por una aminopeptidasa y una carboxipeptidasa.
El término “aminopeptidasa” tal como se usa en este contexto, se refiere a una exopeptidasa que es capaz de escindir aminoácidos individuales, diaminoácidos o combinaciones de los mismos del terminal N de un sustrato proteico y/o peptídico. Preferentemente, una aminopeptidasa es capaz de escindir aminoácidos individuales solamente del terminal N de un sustrato proteico y/o peptídico.
La aminopeptidasa puede obtenerse (por ejemplo, se obtiene) de Lactobacillus; adecuadamente puede obtenerse de Lactobacillus helveticus.
En una realización, la aminopeptidasa puede ser una aminopeptidasa N (por ejemplo, PepN) (EC 3.4.11.2).
En una realización, la aminopeptidasa puede comprender la secuencia mostrada como:
MAVKRFYKTFHPEHYDLRINVNRKNKTINGTSTITGDVIENPVFINQKFM
TIDSVKVDGKNVDFDVIEKDEAIKIKTGVTGKAVIEIAYSAPLTDTMMGI
YPSYYELEGKKKQIIGTQFETTFARQAFPCVDEPEAKATFSLALKWDEQD
GEVALANMPEVEVDKDGYHHFEETVRMSSYLVAFAFGELQSKTTHTKDGV
LIGVYATKAHKPKELDFALDIAKRAIEFYEEFYQTKYPLPQSLQLALPDF
SAGAMENWGLVTYREAYLLLDPDNTSLEMKKLVATVITHELAHQWFGDLV
TMKWWDNLWLNESFANMMEYLSVDGLEPDWHIWEMFQTSEAASALNRDAT
DGVQPIQMEINDPADIDSVFDGAIVYAKGSRMLVMVRSLLGDDALRKGLK
YYFDHHKFGNATGDDLWDALSTATDLDIGKIMHSWLKQPGYPVVNAFVAE
DGHLKLTQKQFFIGEGEDKGRQWQIPLNANFDAPKIMSDKEIDLGNYKVL
REEAGHPLRLNVGNNSHFIVEYDKTLLDDILSDVNELDPIDKLQLLQDLR
LLAEGKQISYASIVPLLVKFADSKSSLVINALYTTAAKLRQFVEPESNEE
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El término “carboxipeptidasa”, tal como se usa en la presente memoria, tiene su significado habitual en la técnica y se refiere a una exopeptidasa que es capaz de escindir n aminoácidos del terminal C de un sustrato peptídico y/o proteico. En una realización, n puede ser al menos 1, convenientemente n puede ser al menos 2. En una realización, n puede ser al menos 3, convenientemente al menos 4.
En otras realizaciones, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (opcionalmente en combinación con una endoproteasa) puede usarse con una o más exopeptidasas adicionales. En una realización, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (opcionalmente en combinación con una endoproteasa) no se combina con una exopeptidasa específica a la prolina.
En una realización particularmente preferida, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede no combinarse con una enzima que tiene la siguiente secuencia polipeptídica:
M R T A A A S LTLA A TC LFE LA S A LM P R A P LIP A M K A K V A LP S G N A T FE Q Y ID H N N P G LG
TFP Q R Y W Y N P E F W A G P G S P V LLF T P G E S D A A D Y D G F LT N K T IV G R F A E E IG G A V ILLE
H R Y W G A S S P Y P E LT TE TLQ Y LTLE Q S IA D LV H FA K TV N LP FD E IH S S N A D N A P W V M T
G G S Y S G A L A A W T A S IA P G T F W A Y H A S S A P V Q A IY D F W Q Y F V P W E G M P K N C S K D L
N R W E Y ID H V Y E S G D IE R Q Q E IK E M F G LG A LK H F D D F A A A IT N G P W LW Q D M N F V S G
Y S R F Y K F C D A V E N V T P G A K S V P G P E G V G LE K A LQ G Y A S W F N S T Y LP G S C A E Y K Y W
TD K D A V D C Y D S Y E T N S P IY T D K A V N N T S N K Q W T W F LC N E P LF Y W Q D G A P K D E S T
IV S R IV S A E Y W Q R Q C H A Y FP E V N G Y TFG S A N G K TA E D V N K W TK G W D LTN TT R LIW
A N G Q F D P W R D A S V S S K T R P G G P LQ S T E Q A P V H V IP G G F H C S D Q W LV Y G E A N A G V Q
K V ID E E V A Q IK A W V A E Y P K Y R K P
En una realización, el componente adicional puede ser un estabilizante o un emulsionante o un aglutinante o un vehículo o un excipiente o un diluyente o un desintegrante.
El término “estabilizante”, tal como se usa en la presente memoria, se define como un ingrediente o una combinación de ingredientes que evita que un producto (por ejemplo, un producto de tipo pienso) cambie con el tiempo.
El término “emulsionante”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente del pienso) que evita la separación de las emulsiones. Las emulsiones son dos sustancias inmiscibles, una presente en forma de microgotas contenida dentro de la otra. Las emulsiones pueden estar constituidas por aceite en agua, donde la fase dispersada o en microgotas es un aceite y la fase continua es agua; o agua en aceite, donde el agua se convierte en la fase dispersada y la fase continua es el aceite. Las espumas, que son un gas en líquido, y las suspensiones, que son un sólido en líquido, también se pueden estabilizar con el uso de emulsionantes.
El término “aglutinante”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (por ejemplo un ingrediente del pienso) que mantiene al producto unido mediante una reacción física o química. Por ejemplo, durante la “gelificación”, se absorbe agua lo que proporciona un efecto aglutinante. Sin embargo, los aglutinantes pueden absorber otros líquidos, tales como aceites, y mantenerlos dentro del producto. En el contexto de la presente invención, los aglutinantes se usarían normalmente en productos sólidos o con una humedad baja; por ejemplo, productos de repostería: pastas, rosquillas, pan y otros. Ejemplos de aglutinantes de formación de gránulos incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y goma arábiga.
El término “vehículos” se refiere a materiales adecuados para administrar la enzima e incluyen cualquier material de este tipo conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizante o similares, que es atóxico y que no interactúa con ninguno de los componentes de la composición de manera perjudicial.
En una realización, la presente invención proporciona el uso de una composición (por ejemplo, una composición de un aditivo para piensos) que comprende una enzima de la presente invención formulada con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado de al menos uno de maltodextrina, caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o un componente del trigo, sacarosa, almidón, Na2SO4, talco, alcohol polivinílico (PVA), sorbitol, benzoato, sorbato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato y mezclas de los mismos.
En una realización preferida, la presente invención proporciona una composición (por ejemplo, una composición de un aditivo para piensos) o el uso de la misma y métodos para preparar la misma que comprende una enzima de la presente invención formulada con un compuesto seleccionado de uno o más del grupo constituido por una sal, poliol — incluyendo sorbitol y glicerol— , trigo o un componente del trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos.
Ejemplos de “excipientes” incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dibásico de calcio, glicina, almidón, el azúcar de la leche y polietilenglicoles de peso molecular elevado.
Ejemplos de “desintegrantes” incluyen uno o más de: almidón (preferentemente fécula de maíz, patata o tapioca), glicolato sódico del almidón, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos. Ejemplos de “diluyentes” incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina y combinaciones de los mismos.
Los otros componentes pueden usarse simultáneamente (por ejemplo, cuando están juntos en mezcla o incluso cuando se suministran por diferentes vías) o secuencialmente (por ejemplo, pueden suministrarse por diferentes vías) al aditivo para piensos de la presente invención.
Preferentemente, en una realización la composición de un aditivo para piensos o el ingrediente del pienso o el pienso o el material de pienso o la premezcla de acuerdo con la presente invención no comprende cromo o cromo orgánico. Preferentemente, en una realización la composición de un aditivo para piensos o el ingrediente del pienso o el pienso o el material de pienso o la premezcla de acuerdo con la presente invención no contiene ácido sórbico.
Característica biofísica
En un aspecto, se proporciona un método para mejorar una característica biofísica de un animal o para mejorar la digestibilidad de las proteínas por parte de un animal, que es un método que comprende administrar a un animal una composición de un aditivo para piensos que se puede obtener (por ejemplo, se obtiene) por un método o un uso de la invención o una composición de un aditivo para piensos, material de pienso o premezcla de la invención o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, que tiene predominantemente actividad exopeptidasa, donde la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'; y
opcionalmente al menos un componente del pienso y/o al menos un mineral y/o al menos una vitamina, comprendiendo el método, preferentemente, la administración de al menos una endoproteasa a un animal, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
El término “administrar” tal como se usa en la presente memoria, puede significar el suministro al animal de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o la composición de un aditivo para piensos antes, después o simultáneamente con un material de pienso (por ejemplo, la dieta usual del animal). Como alternativa, el término “administrar”, tal como se usa en la presente memoria, puede significar el suministro al animal de un material de pienso o premezcla que comprende la composición de un aditivo para piensos.
Adecuadamente, la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede ser capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'.
En otro aspecto, se proporciona el uso de una composición de un aditivo para piensos o un ingrediente para piensos de la invención o una composición de un aditivo para piensos que se puede obtener (preferentemente se obtiene) por un método de la invención o un material de pienso de piensos o premezcla de la invención para mejorar una característica biofísica de un animal o para mejorar la digestibilidad de las proteínas en un animal o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, que tiene predominantemente actividad exopeptidasa, donde la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) prolina en P1; y
(B) un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; o
(ii)
(a') prolina en P1'; y
(b') un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1'
para mejorar la digestibilidad de las proteínas en un animal o para mejorar una característica biofísica de un animal, preferiblemente en donde al menos una endoproteasa se usa en combinación, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
Convenientemente, el método y/o el uso pueden comprender además administrar a un animal al menos un componente del pienso, al menos un mineral, al menos una vitamina o combinaciones de los mismos. Además o como alternativa, el método y/o el uso pueden comprender además administrar a un animal al menos una endoproteasa. La expresión “característica biofísica”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier propiedad biofísica de un animal que mejora su salud y/o rendimiento y/o productividad.
A título de ejemplo, la característica biofísica puede ser una o más características seleccionadas del grupo constituido por una o más de las siguientes: rendimiento del animal, rendimiento de crecimiento de un animal, índice de transformación del alimento (FCR), capacidad de digerir una materia prima (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, incluyendo la digestibilidad del almidón, la grasa, las proteínas, la fibra), digestibilidad de nitrógeno (por ejemplo, digestibilidad ileal de nitrógeno) y energía digestible (por ejemplo, energía digestible ileal), retención de nitrógeno, rendimiento de la canal, tasa de crecimiento, ganancia en peso, peso corporal, masa, eficiencia del pienso, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño del huevo, peso del huevo, masa del huevo, tasa de puesta de huevos, ganancia en masa magra, porcentaje de ceniza ósea, miligramos de ceniza ósea, porcentaje de tocino dorsal, producción de leche, porcentaje de materia grasa láctea, rendimiento reproductivo como el tamaño de la camada, la capacidad de supervivencia de la camada, porcentaje de eclosión y el impacto ambiental; por ejemplo, producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.
Convenientemente, la característica biofísica puede ser una o más características seleccionadas a partir del grupo constituido por: índice de transformación del alimento, digestibilidad del nitrógeno (por ejemplo, digestabilidad del nitrógeno ileal) y energía digestible (por ejemplo, energía digestible ileal).
En una realización preferida, la característica biofísica puede ser la capacidad de digerir una proteína.
En una realización, la característica biofísica del animal se refiere al rendimiento del animal.
Convenientemente, administrar a un animal una composición de un aditivo para piensos y/o un pienso y/o un material de pienso y/o un ingrediente del pienso y/o una premezcla de la invención puede no aumentar de manera sustancial la incidencia de la enteritis necrótica en el animal cuando se compara con un animal al que no se ha alimentado con la composición de un aditivo para piensos ni/o el pienso ni/o el material de pienso ni/o el ingrediente de pienso ni/o la premezcla de la invención.
La expresión “aumentar sustancialmente la incidencia de la enteritis necrótica”, tal como se usa en la presente memoria, significa que la incidencia no aumenta en más de aproximadamente un 20%, convenientemente no aumenta en más de aproximadamente un 10%. Preferentemente, significa que la incidencia de la enteritis necrótica no aumenta en más de aproximadamente un 5%, más preferentemente más de aproximadamente un 1%.
Rendimiento
La expresión “rendimiento del animal”, tal como se usa en la presente memoria, se puede determinar por la eficacia del pienso y/o la ganancia del peso del animal y/o mediante el índice de transformación del alimento y/o mediante la digestibilidad de un nutriente en un pienso (por ejemplo, digestabilidad de un aminoácido) y/o energía digerible o energía metabolizable en un alimento y/o mediante la retención de nitrógeno.
Preferentemente, el “rendimiento del animal” se determina por la eficacia del pienso y/o la ganancia de peso del animal y/o mediante el índice de transformación del alimento.
Con “rendimiento mejorado del animal” se quiere decir que hay una mayor eficacia del pienso y/o mayor ganancia de peso y/o menor índice de transformación del alimento y/o mejor digestibilidad de los nutrientes o energía en un pienso y/o mejor retención de nitrógeno en el sujeto resultante del uso de una composición de un aditivo para piensos de la presente invención en comparación con alimentar al animal con una composición de pienso que no contiene la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención.
Preferentemente, la expresión “rendimiento mejorado del animal” significa que hay una mayor eficacia del pienso y/o mayor ganancia de peso y/o menor índice de transformación del alimento.
La expresión “eficacia del pienso”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de ganancia de peso en un animal que se produce cuando el animal se alimenta ad libitum o con una cantidad especificada de alimento durante un periodo de tiempo.
Por “mayor eficacia del pienso” se entiende que el uso de una composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención en el pienso da como resultado una mayor ganancia de peso por unidad de ingesta de pienso en comparación con un animal alimentado con la composición de pienso que no contiene la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con la presente invención.
Índice de transformación del alimento (FCR)
La expresión “índice de transformación del alimento”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de pienso con el que se alimenta un animal para aumentar el peso del animal en una cantidad especificada.
Un índice de transformación del alimento mejorado equivale a un menor índice de transformación del alimento.
Por “menor índice de transformación del alimento” o “índice de transformación del alimento mejorado” se entiende que el uso de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o una composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención en el pienso da como resultado que se necesite una cantidad de pienso para alimentar a un animal para aumentar el peso del animal en una cantidad especificada menor que la cantidad de pienso necesaria para aumentar el peso del animal en la misma cantidad sin la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o sin la composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención.
Digestibilidad de los nutrientes
La expresión “digestibilidad de los nutrientes”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la fracción de un nutriente que desaparece del tracto gastrointestinal o un segmento especificado del tracto gastrointestinal, por ejemplo, el intestino delgado. La digestibilidad de los nutrientes se puede medir como la diferencia entre lo que se administra al sujeto y lo que se excreta en las heces del sujeto o entre lo que se administra al sujeto y lo que permanece en la fracción que se está digiriendo en un segmento especificado del tracto gastrointestinal; por ejemplo, el íleon.
La expresión “digestibilidad de los nutrientes”, tal como se usa en la presente memoria, se puede medir como la diferencia entre la ingesta de un nutriente y el nutriente excretado por medio de la recogida de excremento total durante un periodo de tiempo; o mediante el uso de un marcador inerte que no es absorbido por el animal y que permite al investigador calcular la cantidad de nutriente que ha desaparecido en la totalidad del tracto gastrointestinal o un segmento del tracto gastrointestinal. Tal marcador inerte puede ser dióxido de titanio, óxido crómico o cenizas insolubles en ácido. La digestibilidad se puede expresar como un porcentaje del nutriente en el pienso o como las unidades de masa del nutriente digestible por unidades de masa del nutriente en el pienso.
La digestibilidad del nutriente, tal como se usa en la presente memoria, engloba la digestibilidad del almidón, la digestibilidad de las grasas, la digestibilidad de las proteínas y la digestibilidad de los aminoácidos.
Convenientemente, el uso de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de acuerdo con los métodos y/o los usos de cualquiera de los aspectos de la presente invención (opcionalmente, combinada con al menos una endoproteasa) aumenta la digestibilidad de las proteínas y/o los aminoácidos en un pienso para animales con la composición para un aditivo para piensos y/o un ingrediente del pienso y/o un pienso y/o material de pienso y/o premezcla de la invención.
La expresión “digestibilidad energética”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la energía total del pienso consumido menos la energía total de las heces o la energía total del pienso consumido menos la energía total de la fracción restante que se está digiriendo en un segmento especificado del tracto gastrointestinal del animal; por ejemplo, el íleon. La expresión “energía metabolizable”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la energía metabolizable aparente y se refiere a la energía total del pienso consumido menos la energía total contenida en las heces, la orina y los productos gaseosos de la digestión. La digestibilidad energética y la energía metabolizable se pueden medir como la diferencia entre la ingesta de energía total y la energía total excretada en las heces o presente en la fracción que se está digiriendo en un segmento especificado del tracto gastrointestinal usando los mismos métodos que para medir la digestibilidad de nutrientes, con las debidas correcciones para la excreción de nitrógeno con el fin de calcular la energía metabolizable del pienso.
Retención de nitrógeno
La expresión “retención de nitrógeno”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad del sujeto para retener nitrógeno de la dieta en forma de masa corporal. Se produce un equilibrio negativo de nitrógeno cuando la excreción de nitrógeno supera la ingesta diaria y a menudo se aprecia como pérdida de masa muscular. A menudo se asocia un equilibrio positivo de nitrógeno con el desarrollo muscular, especialmente en animales de engorde.
La retención de nitrógeno se puede medir como la diferencia entre la ingesta de nitrógeno y el nitrógeno excretado por medio de la recogida total de excrementos y orina durante un periodo de tiempo. Se sobreentiende que el nitrógeno excretado incluye las proteínas no digeridas del pienso, las secreciones proteináceas endógenas, las proteínas microbianas y el nitrógeno urinario.
Rendimiento de la canal y rendimiento de la carne
La expresión “rendimiento de la canal”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de la canal como una proporción del peso del cuerpo en vivo, tras un proceso de matanza comercial o experimental. El término “canal” se refiere al cuerpo de un animal que ha sido sacrificado para obtener alimentos, al que se le han eliminado la cabeza, vísceras, parte de las extremidades y plumas o piel. La expresión “rendimiento de la carne”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de carne comestible como una proporción del peso del cuerpo en vivo o la cantidad de un corte de carne especifico como una proporción del peso del cuerpo en vivo.
Ganancia de peso
En la presente invención, además, se proporciona un método para incrementar la ganancia de peso en un sujeto, por ejemplo, aves de corral o cerdos, que comprende alimentar al sujeto con un material de pienso que comprende una composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención.
Un “incremento de la ganancia de peso” se refiere a un animal que ha incrementado su peso corporal tras haber sido alimentado con el pienso que comprende una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o una composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención en comparación con un animal que ha sido alimentado con un pienso que no comprende la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o la composición de un aditivo para piensos de acuerdo con la presente invención.
Ventajas
Los autores de la presente invención han demostrado, por primera vez, que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es muy ventajosa para su uso en piensos y materiales de pienso y confiere ventajas a un animal alimentado con la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o un pienso y/o un material de pienso y/o una composición de un aditivo para piensos que comprende la misma.
De forma ventajosa, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina mostrada para su uso en la presente invención es capaz de actuar sobre una amplia gama de sustratos peptídicos y/o proteicos y, debido a que tiene la amplia especificidad de sustrato, no se inhibe fácilmente la escisión de sustratos enriquecidos con ciertos aminoácidos (por ejemplo, prolina). El uso de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina, por lo tanto, puede descomponer de forma eficaz y/o rápida los sustratos proteicos (por ejemplo, presentes en piensos y/o materiales de pienso). Esto confiere la ventaja adicional de digerir de forma eficaz y/o rápida un sustrato proteico in situ en un animal alimentado con el sustrato proteico (por ejemplo, que está presente en un pienso o material de pienso), lo que permite una captación rápida y/o eficaz de los péptidos digeridos por el animal.
También se divulga una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que, además de poseer las actividades descritas anteriormente, puede tolerar la prolina en la posición P2, P2', P3 y P3\ Esto es ventajoso, ya que permite la escisión eficaz de los sustratos peptídicos y/o proteicos que tienen tramos de prolina y permite la escisión de una amplia gama de sustratos peptídicos y/o proteicos.
También se divulgan tripeptidil peptidasas termoestables tolerantes a la prolina que son menos propensas a desnaturalizarse y/o que, por lo tanto, retengan la actividad durante un periodo de tiempo más largo en, por ejemplo, un animal, en comparación con una variante no termoestable.
Las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina de la presente memoria pueden ser activas a un pH ácido. Ventajosamente, una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene actividad a un pH ácido puede ser activa en el tracto gastrointestinal superior de un animal (por ejemplo, en la molleja, el proventrículo o el estómago) y/o puede digerir un sustrato peptídico y/o proteico en combinación con proteasas endógenas (por ejemplo, pepsina) que están presentes en el tracto gastrointestinal del animal.
Muchas prácticas de alimentación actuales conllevan administrar a los animales una proteasa alcalina activa a un pH elevado (por ejemplo, pH 8). Por lo tanto, las proteasas alcalinas son activas únicamente en la parte inferior (por ejemplo, la última parte) del tracto gastrointestinal de un animal, donde el tracto gastrointestinal se vuelve más alcalino, tal como la última parte del intestino delgado y el intestino grueso y el ciego. Sin entrar en consideraciones teóricas, se cree que la producción de oligopéptidos en la última parte del tracto gastrointestinal aumenta la población de microbios que usan los oligopéptidos lo que, a su vez, puede conllevar mayores problemas debidos a la enfermedad entérica y/o a una reducción de los nutrientes disponibles que el animal pueda captar. Además, en la última parte del tracto gastrointestinal (es decir, la inferior) la protección de la mucosa es peor que en la parte inicial (por ejemplo, la molleja, el proventrículo o el estómago) y, así pues, es más fácil que se produzca una lesión que conlleve inflamación. Favorablemente, el uso de una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina activa a un pH ácido alivia este problema, ya que es capaz de digerir su sustrato en la parte inicial del tracto gastrointestinal y de esta manera no incrementa de manera sustancial la población de microbios y/o aumenta la cantidad de nutrientes (por ejemplo, aminoácidos/péptidos) disponibles para que puedan ser captados por un animal y/o reduce la inflamación. Ventajosamente, el uso de una endoproteasa combinada con una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede aumentar la eficacia de escisión del sustrato. Sin entrar en consideraciones teóricas, se cree que una endoproteasa es capaz de escindir un sustrato peptídico y/o proteico en múltiples regiones alejadas del terminal C o N; por lo tanto, produce más extremos N-terminal que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina puede usar como sustrato, aumentando así favorablemente la eficacia de la reacción y/o reduce el tiempo de reacción.
El uso de una endoproteasa ácida y una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina activa a un pH ácido es sumamente favorable, ya que las dos enzimas pueden cooperar para digerir un sustrato peptídico y/o proteico en la parte inicial del tracto gastrointestinal (por ejemplo, la molleja, el proventrículo o el estómago) de un animal y pueden estar activas combinadas con otras proteasas endógenas (por ejemplo, la pepsina) presentes en el animal.
Convenientemente, administrar a un animal una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina conlleva un incremento de la ganancia de peso y/o una reducción del índice de transformación del alimento y/o una mayor digestibilidad del nitrógeno (por ejemplo, la digestibilidad ileal del nitrógeno) y/o una mayor digestión energética (por ejemplo, la digestión energética ileal).
En una realización, las composiciones y la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina de la presente invención han demostrado ser menos dañinas para las células (por ejemplo, del tracto GI) en comparación con proteasas convencionales usadas en aplicaciones en piensos. Sin desear entrar en consideraciones teóricas, dado que el ATP desempeña una función central en el metabolismo celular, está presente en todas las células metabólicamente activas y su nivel intracelular se regula de forma precisa en células sanas. El ATP se ha usado como una herramienta para la integridad funcional de las células vivas, ya que todas las células requieren ATP para permanecer vivas y realizar su función especializada. La mayor parte del ATP se encuentra dentro de las células vivas y vincula los procesos catabólicos y anabólicos. Las lesiones celulares o la disminución de oxígeno/sustrato da como resultado un rápido aumento en el ATP citoplasmático. La disminución en el ATP a menudo indica una lesión en las mitocondrias, que producen el ATP, o un aumento en el nivel de ATPasas que degradan el ATP. Las ATPasas están localizadas, por ejemplo, en los transportadores que acoplan el transporte de moléculas específicas al transporte. Sin embargo, el transporte de péptidos en el intestino habitualmente está mediado por el cotransporte de sodio, o el sodio se une al transportador junto con el péptido. A continuación, después de la unión, el ion de sodio mueve su gradiente electroquímico al interior de la célula y retira el aminoácido o el péptido junto con el mismo. Por supuesto, después del transporte del péptido, el sodio volvería a ser transportado contra el gradiente de concentración fuera de las células usando la energía del ATP, pero normalmente esta disminución en el ATP se restaura de forma bastante rápida (normalmente, las células sanas producen ATP tan rápido como lo usan). Por tanto, el contenido de ATP puede usarse como un indicador de células sanas. Los autores de la presente invención han descubierto con sorpresa que las proteasas disponibles en el mercado usadas en la industria de piensos tienen un efecto negativo sobre las células vivas. En cambio, en las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina de la presente invención, no se observó el efecto negativo.
Asimismo, se observó una disminución en la integridad de la unión ocluyente con las proteasas disponibles en el mercado usadas en la industria de piensos que, de nuevo, no fue así con las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina de la presente invención.
Definiciones adicionales
A no ser que se definan de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que normalmente les adjudica un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20a ed. , John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto en la técnica un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación.
Esta divulgación no está limitada por los métodos y los materiales ejemplares descritos en la presente memoria, y se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria al llevar a la práctica o al probar las realizaciones de esta divulgación. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A no ser que se indique de otro modo, las secuencias de ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente.
Los títulos que se proporcionan en la presente memoria no limitan los diversos aspectos o realizaciones de esta divulgación que se pueden obtener haciendo referencia a la memoria en su conjunto. En consecuencia, los términos que se definen inmediatamente a continuación se definen de un modo más completo haciendo referencia a la memoria en su conjunto.
En la presente memoria se hace referencia a los aminoácidos usando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una única letra.
El término “proteína”, tal como se usa en la presente memoria, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.
La expresión “secuencia de aminoácidos”, tal como se usa en la presente memoria, es un sinónimo del término “polipéptido” y/o del término “proteína”. En algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es un sinónimo del término “péptido”. En algunos casos, la expresión “secuencia de aminoácidos” es un sinónimo del término “enzima”.
Los términos “proteína” y “polipéptido” se usan indistintamente en la presente memoria. En la presente divulgación y las reivindicaciones, se pueden usar los códigos tradicionales de una letra y de tres letras para los residuos de aminoácidos. El código de 3 letras para los aminoácidos tal como está definido según la Comisión Conjunta IUPACIUB para la Nomenclatura Bioquímica (JCBN, por sus siglas en inglés). También se sobreentiende que más de una secuencia de nucleótidos puede codificar el mismo polipéptido debido a la degeneración del código genético.
A lo largo de esta memoria pueden aparecer otras definiciones de los términos. Antes de describir las realizaciones ejemplares con más detalle, se debe sobreentender que esta descripción no se limita a las realizaciones concretas descritas, las cuales, obviamente, pueden variar. También se debe sobreentender que la terminología usada en la presente memoria tiene únicamente el objetivo de describir realizaciones concretas y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporcione un intervalo de valores, se debe sobreentender que también se describe específicamente cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a no ser que el contexto indique claramente algo distinto, entre los límites superior e inferior de ese intervalo. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor mencionado o valor intermedio en un intervalo mencionado, y cualquier otro valor enunciado o intermedio en ese intervalo enunciado está englobado en esta divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden, independientemente, estar incluidos o excluidos del intervalo, y cada intervalo en el que uno, ninguno o ambos límites estén incluidos en los intervalos más pequeños también está englobado en esta divulgación, sujeto a cualquier límite excluido de manera específica en el intervalo mencionado. Cuando el intervalo mencionado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos también están incluidos en esta divulgación.
Debe señalarse que, tal como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno”, “una” y “el” o “la” incluyen los referentes en plural, a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a “una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina”, “una endoproteasa” o “una enzima” incluye una pluralidad de tales agentes candidatos y una referencia a “el pienso”, “el material de pienso”, “la premezcla” o “la composición de un aditivo para piensos” incluye una referencia a uno o más piensos, materiales de pienso, premezclas y equivalentes de los mismos conocidos para los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proporcionan únicamente por su divulgación anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria se debe interpretar como una admisión de que tales publicaciones constituyen la técnica anterior para las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria.
A continuación, se describirá la invención, únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a las figuras y los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación y expresión de tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina en Trichoderma reesei
Los genes sintéticos que codifican las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina se generaron usando los codones preferidos para la expresión en Trichoderma reesei, salvo para TRI079 (SEQ ID N° 57) y TRI083 (SEQ ID N° 56), que se generaron como secuencias genómicas. Las secuencias señal de secreción predichas (SignalP 4.0: Discriminating signal peptides from transmembrane regions. Thomas Nordahl Petersen, Soren Brunak, Gunnar von Heijne & Henrik Nielsen. Nature Methods, 8:785-786, 2011) fueron reemplazadas (salvo para TRI079 (y TRI083) por la secuencia señal de secreción proveniente de la proteasa fúngica ácida (AFP) de Trichoderma reesei y un intrón del gen de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA1) (véase el recuadro inferior de la Figura 7). Los genes sintéticos se introdujeron en el vector de destino pTTT-pyrG13 (tal como se describe en el documento US8592194 B2) usando la mezcla enzimática LR Clonase™ (Life Technologies), lo que da como resultado la construcción de los vectores de expresión pTTT-pyrG13 para las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina de la presente memoria. Los vectores de expresión que codifican las SEQ ID Nos 1,2 y 29 se muestran en la Figura 1 y las SEQ ID Nos 12 y 39 se muestran en la Figura 7. Los vectores de expresión que codifican la SEQ ID N° 96 o 97 (TRI045) se muestran en la Figura 2.
Se transformaron 5-10 pg de los vectores de expresión individualmente en una cepa adecuada de Trichoderma reesei usando transformación de protoplastos mediada por PEG esencialmente como se ha descrito previamente (documento US8592194 B2). Se recolectaron las esporas en germinación mediante centrifugación, se lavaron y trataron con 45 mg/mL de solución enzimática de lisado (Trichoderma harzianum, Sigma L1412) para lisar las paredes celulares fúngicas. Se realizó la preparación adicional de protoplastos por un método convencional, como se describe por Penttila et al. [Gene 61 (1987) 155-164], contenido que se incorpora en la presente memoria por referencia.
Se recolectaron las esporas usando una solución de NaCl al 0,85% y Tween 80 al 0,015%. Se usaron suspensiones de esporas para inocular cultivos líquidos. Los cultivos se hicieron crecer durante 7 días a 28°C y un 80% de humedad con agitación a 180 rpm. Se recolectaron los sobrenadantes de los cultivos mediante filtración al vacío y se usaron para medir la expresión y el rendimiento enzimático.
Purificación y caracterización
A. Purificación de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina
Se realizó una desalación de las muestras en una columna PD10 (GE Life Sciences, EE.UU.) equilibrada con acetato de Na 20 mM, pH 4,5 (tampón A). Para la cromatografía de intercambio iónico en Source S15 HR25/5 (GE Life Sciences, EE.UU.), la columna se equilibró con el tampón A. La muestra desalada (7 mL) se depositó sobre la columna con un caudal de 6 mL/min y la columna se lavó con el tampón A. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-0,35 M en acetato de Na 20 mM, pH 4,5 (35 min). Durante toda la duración, se recogieron fracciones de 10 mL. Las fracciones recogidas se sometieron a un ensayo para determinar la actividad de tipo tripeptidil-amino tal como se describe más adelante. Se calculó la concentración proteica en función de la absorbancia medida a 280 nm y la absorbancia teórica de la proteína se calculó usando la herramienta ExPASy ProtParam (http://web.expasy.org/cgi- bin/protparam/protparam).
B. Determinación de la actividad tripeptidil peptidasa y endopeptidasa tolerantes a la prolina
Se usó el péptido cromogénico H-Ala-Ala-Ala-pNA (PM = 387,82; Bachem, Suiza) para determinar la actividad de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en las muestras producidas como se ha descrito anteriormente. El ensayo se llevó a cabo de la siguiente manera: se añadieron 10 pL de la solución del péptido cromógeno (10 mM disuelto en sulfóxido de dimetilo; DMSO) a 130 pL de acetato de Na (20 mM, ajustado a pH 4,0 con ácido acético) en una placa de microvaloración y se calentó durante 5 min a 40°C. Se añadieron 10 pL de la enzima diluida de manera apropiada y se midió la absorción en un lector MTP (Versa max, Molecular Devices, Dinamarca) a 405 nm. Se definió un katal de actividad proteolítica como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 mol de p-nitroanilina por segundo. Ensayo de azoscaseína para determinar la actividad endoproteasa
Se usa una versión modificada del ensayo de endoproteasa descrito por Iversen y Jorgensen, 1995. Se añade una muestra de enzima de 50 pL a 250 pL de azocaseína (0,25% p/v; de Sigma) en tampón McIlvaine diluido 4 veces, pH 5 y se incuba durante 15 min a 40°C con agitación (800 rpm). Se hace finalizar la reacción añadiendo 50 pL de TCA 2 M y se centrifuga durante 5 min a 20.000 g. Se añaden 65 pL de NaOH 1 M a una muestra de 195 pL del sobrenadante y se mide la absorbancia a 450 nm. Se define una unidad de actividad endoproteasa como la cantidad que genera un aumento de la absorbancia de 0,1 en 15 min a 40°C.
Se observó que las muestras de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina producidas tal como se describe en el Ejemplo 1 están esencialmente exentas de actividad endopeptidasa simultánea. Tras la purificación tal como se describe en el Ejemplo 2A, la actividad simultánea endopeptidasa fue sustancialmente nula.
C. Perfil del pH
Para determinar el perfil de pH de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina TRI083 (Figura 2) y TRI045 (Figura 24) se utilizó el ensayo de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina descrito con el sustrato anterior H-Ala-Ala-Ala-pNA modificado, ya que se empleó el tampón Na-glicina 20 mM (pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 y 4,0) o el tampón acetato de Na 20 mM (pH 4,0, 4,5 y 5,5). Se observó que el pH óptimo de TRI083 y TRI045 fue de 4,0.
D. Perfil de la temperatura
Se usó el ensayo de tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina descrito anteriormente a las temperaturas 25, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 y 85°C. Se observó que la temperatura óptima de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina TRI083 fue de 50°C, mientras que no se observó actividad alguna a una temperatura de 70°C y superior (Figura 3).
Hidrólisis proteica usando una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina combinada con una endoproteasa (Alphalase® AFP)
Se expresaron las enzimas Alphalase® AFP y la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina TRI083 tal como se describe en el Ejemplo 1.
Tampón de ensayo: NaOAc 50 mM, pH 4,0, 3% de dimetilhemoglobina, 37°C, incubación de 1 h (100 pL de mezcla de reacción por pocillo MTP).
Reactivo de detención /color: Ácido trinitrobencenosulfónico al 0,05% en borato de Na 125 mM, pH 8,6 (200 pL por pocillo).
La placa se leyó a 450 nm usando un lector de microplacas Versa max (Molecular Devices) después de aproximadamente 20 min de incubación con reactivo de detención/color. Los resultados del ensayo (Figura 4) muestran un efecto sinérgico cuando se usa una endoproteasa (Alphalase® AFP) combinada con la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina.
Hidrólisis de un péptido de gliadina de 33 monómeros
Se estudió la capacidad de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para hidrolizar un sustrato sintético a partir de alfa gliadina (alfa-2-gliadina) mediante LC-MS y cuantificación sin marcadores. Se observó que escindía el sustrato en tripéptidos independientemente del contenido elevado en prolina del sustrato.
Configuración experimental
El oligómero de 33 unidades de gliadina (alfa-2-gliadina) (aa56-88) H-LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF-OH (Zedira GmbH; D-64293 Darmstadt, Alemania) C190H273N43O47 (PM=3911,46) (1 mg/mL; 0,26 mM) se incubó a 24°C en presencia de tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (0,01 mg/mL) en un volumen total de 1000 pL de tampón (pH=4,5) (relación de sustrato/enzima de 100:1, p/p). Las alícuotas (100 pL) de la reacción enzimática se detuvieron con 20 pL de ácido trifluoroacético (TFA) al 5% después de 0, 1, 3, 5, 10, 15 y 30 minutos, respectivamente. A continuación, las muestras se transfirieron a nuevos viales y se analizaron en el espectrómetro de masas LTQ Orbitrap.
Obtención de los datos, cuantificación sin marcadores y análisis de los datos por MS/MS
Se realizaron nanoanálisis de LC-MS/MS usando un Easy LC system (Thermo Scientific, Odense, Dinamarca) conectado a un espectrómetro de masas híbrido LTQ Orbitrap Classic (Thermo Scientific, Bremen, Alemania). Se cargaron las muestras en una columna trampa adaptada de 2 cm (100 gm d.i., 375 gm d.e., rellena de partículas de fase inversa Reprosil C18 de 5 gm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania)) conectada a una columna analítica de 10 cm (75 gm d.i., 375 gm d.e., rellena de partículas de fase inversa Reprosil C18 de 3 gm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania)) con una aguja de acero. La separación se realizó a un caudal de 300 nL/min usando un gradiente de 10 min de un 0-34% de disolvente B (H2O/CH3CN/TFE/HCOOH (100/800//100/1 v/v/v/v)) en la fuente iónica de nanoelectronebulización (Thermo Scientific, Odense, Odense, Dinamarca). Se operó el instrumento LTQ Orbitrap Classic en un modo MS/MS dependiente de los datos. Se midieron las masas peptídicas con el Orbitrap (se obtuvieron los barridos de MS con una resolución de 60.000 con una relación m/z de 400), se seleccionaron hasta 2 de las relaciones peptídicas m/z más intensas y se sometieron a fragmentación usando CID en la trampa lineal de iones (LTQ). Se permitió la exclusión dinámica con un tamaño de lista de 500 masas, duración de 40 s y amplitud másica de exclusión de ±10 ppm respecto a las masas de la lista.
Se accedió a los ficheros RAW con el programa de acceso público Skyline 1.4.0.4421 (se puede obtener de MacCoss Lab Software, Universidad de Washington, Departamento de Ciencias Genómicas, 3720 15th Ave NE Seattle, Washington, EE.UU.) el cual puede usar las intensidades MS1 para construir cromatogramas. Se fijó el filtro precursor de importación isotópica en un recuento de tres, (M, M+1 y M+2) con una resolución de 60.000 y se utilizó el estado de carga más intenso. Se introdujeron las secuencias peptídicas de los dos sustratos, así como de los productos de escisión en Skyline y se calculó la intensidad de cada muestra.
Los datos de LC-MS/MS se anotaron manualmente usando GPMAW para calcular los valores teóricos de la fragmentación.
Se aisló y se siguió en el tiempo la masa cargada triple del péptido alfa-2-gliadina intacto. El péptido intacto no era detectable después de 3 min y se hidrolizó muy rápido (Tabla 1). La hidrólisis completa del péptido de alfa-2-gliadina de 33 monómeros proporcionó los siguientes tripéptidos: LQL' q Pf ' PQP' QLP' YPQ' PQL' pYp ' QPQ' LPY' PQP' QPF. Se encontró que el producto intermedio YPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF, que resulta de la escisión de los cuatro tripéptidos LQL, QPF, PQP y QLP a partir del sustrato alfa-2-gliadina, se acumulaba y después disminuía (Tabla 1).
Tabla 1: Intensidad relativa del pico MS de la alfa-2-gliadina y los péptidos derivados
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Se detectó la acumulación de la mayoría de los tripéptidos más esperados. Los tripéptidos subrayados se detectaron y confirmaron en función de su fragmentación MS/MS: LQL' QPF' PQP' QLP' YPQ' PQL' PYP' q Pq ' LPY' PQP' QPF, mientras que los tripéptidos QPF se encontraron solamente en función de su masa.
En conclusión, se detectó que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina escinde el sustrato alfa-2-gliadina de manera consecutiva en tripéptidos independientemente del contenido elevado de prolina. Durante la hidrólisis, la prolina estaba presente en las posiciones P3, P2, P1, P1', P2' y P3', respectivamente.
Esto difiere de lo encontrado previamente de que la tripeptidil aminopeptidasa no escinde la prolina en las posiciones P1 o P1' (US7972808B2, US5821104, Reichard et al. 2006, Applied and Environmental Microbiology 72, 1739-1748).
Escisión del péptido AAPPA
Se examinó la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina para determinar su capacidad de hidrolizar un sustrato sintético AAPPA mediante una cuantificación sin marcadores y por LC-MS. El péptido H-AAPPA-NH2 (PM = 424,49, de Schafer-N, Copenhague) se disolvió en tampón MES 20 mM, pH = 4,0 (1 mg/ml). Se incubaron 1000 gL de la solución de H-AAPPA-NH2 con 200 gL de la solución de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (TRI083) (40 gg/mL) (sustrato/enzima 100:0,8) a temperatura ambiente. En siete puntos temporales (0, 5, 15, 60, 180, 720 y 1440 min) se extrajeron muestras de 100 gl, se diluyeron con 50 gl de TFA al 5%, se inactivaron por calor (10 min a 80°C) y se mantuvieron a -20°C hasta el análisis LC-MS.
Se realizaron nanoanálisis de LC-MS/MS usando un sistema Easy LC (Thermo Scientific, Odense, Dinamarca) conectado a un espectrómetro de masas híbrido LTQ Orbitrap Classic (Thermo Scientific, Bremen, Alemania). Se cargaron las muestras en una columna trampa adaptada de 2 cm (100 gm d.i., 375 gm d.e., rellena de partículas de fase inversa Reprosil C18 de 5 gm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania)) conectada a una columna analítica de 10 cm (75 gm d.i., 375 gm d.e., rellena de partículas de fase inversa Reprosil C18 de 3 gm (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania)) con una aguja de acero. La separación se realizó a un caudal de 300 nL/min usando un gradiente de 10 min de un 0-34% de disolvente B (H2O/CH3CN/TFE/HCOOH (100/800//100/1 v/v/v/v)) en la fuente iónica de nanoelectronebulización (Thermo Scientific, Odense, Dinamarca). Se operó el instrumento LTQ Orbitrap Classic en un modo MS/MS dependiente de los datos. Se midieron las masas peptídicas con el Orbitrap (se obtuvieron los barridos de MS con una resolución de 60.000 con una relación m/z de 400), se seleccionaron hasta 2 de las relaciones peptídicas m/z más intensas y se sometieron a fragmentación usando CID en la trampa lineal de iones (LTQ). Se permitió la exclusión dinámica con un tamaño de lista de 500 masas, duración de 40 s y amplitud másica de exclusión de ±10 ppm respecto a las masas de la lista.
Se accedió a los ficheros RAW con el programa de acceso público Skyline 1.4.0.4421, que puede usar las intensidades MS1 para construir cromatogramas. Se fijó el filtro precursor de importación isotópica en un recuento de tres, (M, M+1 y M+2) con una resolución de 60.000 y se utilizó el estado de carga más intenso. Se introdujeron las secuencias peptídicas del sustrato, así como de un producto de escisión en Skyline y se calculó la intensidad de cada muestra.
El análisis mostró que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (TRI083) con el tiempo es capaz de degradar el péptido AAPPA (Figura 5) y de generar el producto AAP (Figura 6), lo que indica que el enlace peptídico PP en AAPPA se hidroliza por la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (TRI083).
Ejemplo 2
Materiales y métodos
1. Tratamiento enzimático del pienso de maíz y soja
Se tamizó la harina del pienso hasta obtener un tamaño de partícula inferior a 212 gm, se suspendió en agua hasta obtener una suspensión espesa al 10% (p/p) y se ajustó el pH a pH 3,5. Después, se añadieron 138 gL de esta suspensión al 10% a cada pocillo en una placa MTP de 96 pocillos usando una estación de trabajo automatizada de laboratorio Beckman Coulter Biomek NXp. Se usaron puntas de calibre ancho. A continuación, se añadieron 20 gL de la solución enzimática que contenía las proteasas que se iban a estudiar en acetato 20 mM, pH 3,5 y después se añadieron 10 gL (1,14 U/gL) de pepsina disuelta en agua. La placa se incubó a 40°C durante 45 minutos en una incubadora/agitador iEMS a 1150 rpm. A continuación, se añadieron 34 gL de pancreatina 1,126 mg/mL en bicarbonato de Na 1 M y la placa se incubó a 40°C durante 60 minutos en iEMS a 1150 rpm. Después, se centrifugó la placa a 5°C, 4000 rpm durante 15 min, se transfirieron 10 gL de sobrenadante a placas nuevas (placa Corning antiadhesiva n° 3641) que contenían 190 gL de agua en cada pocillo para obtener una dilución 20x. Las placas obtenidas (placas maestras) se almacenaron en el congelador a -20°C.
2. Mediciones del grado de hidrólisis
El método de análisis del grado de hidrólisis (DH) de las proteínas solubles se basa en la reacción de los grupos amino primarios con el o-ftaldialdehído (ensayo OPA). Referencia: P.M. Nielsen, D. Petersen y C. Dambmann. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science. 66 (2001) 642-646.
Para el ensayo OPA se llevó a cabo el siguiente procedimiento. Se transfirieron 10-25 gL de la muestra del pienso tratada con la enzima de la placa maestra a la nueva placa, después se añadieron a la placa 175 gL del reactivo OPA que contenía borato de sodio, dodecilsulfato y ditiotreitol. Las mediciones del punto final de la densidad óptica a 340 nm se realizaron inmediatamente después de 2 min y 5 segundos de la mezcla.
Efecto de Alphalase® AFP (una proteasa ácida) sobre pienso de maíz y soja en presencia de pepsina y pancreatina. Estudios in vitro
En la siguiente tabla se presenta la composición del pienso de maíz y soja (Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin. S. Yu, A. Cowieson, C. Gilbert, P. Plumstead y S. Dalsgaard J. Anim. Sci. 90 (2012) 1824-1832. Información suplementaria).
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El pienso de maíz y soja se trató con Alphalase® AFP (NSP24, disponible en Genencor División, Food Enzymes) (denominada en la presente memoria “AFP”) con diferentes concentraciones (450, 1000 y 1500 ppm respecto al pienso de maíz y soja) en presencia de pepsina y pancreatina (Figura 8). Los resultados se presentan más adelante; el nivel de mejora del DH del pienso de maíz y soja es de un 4,5, 6,3 y un 9,0%, respectivamente.
Ejemplo 3
Efecto de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en el pienso de maíz y soja en presencia de pepsina y pancreatina en presencia y ausencia de Alphalase® AFP. Estudios in vitro
En estos estudios, la Alphalase® AFP y la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se usaron únicamente con dosis de 1000 y 450 ppm, respectivamente. El experimento se realizó según el Ejemplo 2. Los resultados se presentan en la Tabla 2. En el experimento de control únicamente se usaron la pepsina y la pancreatina. La mejora de la hidrólisis es la relación entre el tratamiento y el control.
Tabla 2. Efecto de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina y la Alphalase® AFP en la hidrólisis del pienso de maíz y soja
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Tal como se puede apreciar por la Tabla 2, la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina por sí sola no proporciona un beneficio suficiente en la hidrólisis de la proteína del maíz y la soja. El rendimiento de la Alphalase® AFP es similar a los resultados presentados en el Ejemplo 2. Sin embargo, la combinación de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina y la Alphalase® AFP proporciona los resultados máximos y se puede asociar con la acción sinérgica de las endo y exoproteasas.
Ejemplo 4a
Validación de la respuesta a la dosis de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (a veces denominada 3PP en la presente memoria) en combinación con endoproteasas sobre la hidrólisis de pienso de maíz y soja en ausencia de pepsina y pancreatina
El objetivo del trabajo fue identificar el origen del rendimiento enzimático y monitorizar de manera fiel un posible rendimiento aditivo o sinérgico de las endo y exoproteasas. Por esta razón, se realizaron los experimentos en ausencia de pepsina y pancreatina y los resultados se resumen en la Figura 9. Por lo demás, el experimento se realizó según el Ejemplo 2.
Tal como se puede apreciar en la Figura 9, el grado de hidrólisis cuando se usa la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina con endoproteasas es muy pronunciado. Es obvio que este fenómeno es sinérgico, ya que la respuesta a la dosis depende del nivel de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina y de la naturaleza de la endoproteasa. En el caso de Alphalase®, el efecto es mucho más pronunciado.
Ejemplo 4b
Validación de la respuesta a la dosis de 3PP en combinación con diferentes dosificaciones de endoproteasas AFP sobre la hidrólisis de pienso de maíz y soja en presencia de pepsina y pancreatina
Para estimar el nivel de sinergia entre el AFP y la 3PP, el experimento realizado de acuerdo con el Ejemplo 2 se realizó con diferentes dosificaciones de las enzimas y en presencia de pepsina y pancreatina.
Como puede observarse por la Figura 10, el nivel del grado de hidrólisis aumenta con la inclusión de AFP, tanto a 1000 como a 2000 ppm. La adición de 3PP aumenta adicionalmente la hidrólisis. Esto es así para un tiempo de reacción de 100 y 200 min.
Ejemplo 5
Estabilidad de las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina en presencia de pepsina
Materiales y métodos
Solución de pepsina: En este ejemplo se usó pepsina porcina procedente de Sigma (P7000, 674 unidades Sigma/mg) y se preparó en agua MilliQ a 10000 unidades Sigma/ml. La mezcla de preincubación de tripeptidil peptidasa y pepsina contenía: 2,5 pl de muestra de tripeptidil peptidasa, 95 pl de tampón GAT (glicina 50 mM-ácido acético 50 mM-tris 50 mM, pH 3,5), 5 pl de pepsina en agua milliQ (10000 unidades Sigma/ml) (concentración final de unidades de pepsina: 500 unidades Sigma/mL de la mezcla de reacción) en la mitad inferior del área de una MTP Corning de 96 pocillos. En el control, la mezcla de preincubación contuvo 5 pL de agua en lugar de 5 pL de pepsina. La mezcla se incubó a 40°C durante 60 min y se mantuvo en hielo. Para la actividad residual, la mezcla de ensayo contenía la mezcla de preincubación de 5 pl, 85 pl de ácido acético -acetato de sodio 0,1 M (pH 4,0), 5 pl de sustrato AAF-pNA (2,5 mg/ml)(H-Ala-Ala-Phe-pNA. BACHEm , L- 1095). Se siguió la lectura a 410 nm usando un lector de microplacas (Power Wave X de Bio-Tek Instruments Inc.) cada 0,5 min a 30°C. N = 2.
Resultados
La Tabla 3 muestra que en las condiciones de ensayo y la preincubación a 40°C durante 60 min, se encontró que la actividad residual era de más de un 80% para todas las tripeptidil peptidasas en presencia de 500 unidades de pepsina/ml de la mezcla de preincubación.
Tabla 3: Recuperación de actividad para tripeptidil peptidasas
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Ejemplo 6
Análisis de tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina (3PP) para su estabilidad a bajo pH a pH 2,5 a 40°C durante 60 min
Como requisito para el uso de las enzimas en pienso para animales monogástricos, las enzimas deben ser activas a un pH menor. Por esta razón, las varias tripeptidil peptidasas se han ensayado con la reacción sobre el sustrato sintético AAF-pNA, a pH 2,5.
El sustrato tripeptídico AAF-pNA se preparó a 2,5 mg/ml en DMSO. Se usaron las tripeptidil peptidasas como caldo. La mezcla de reacción que contiene 2,5 pl de enzima y 90 pL de tampón GAT (pH 2,5) fue preparada en placas de incubación de 96 pocillos.
La placa de incubación se mezcló y se incubó a 40°C durante 60 min. A continuación, se añadieron 50 pL de Mes-NaOH 0,2 M, pH 6,0 a cada pocillo y se mezcló a 600 rpm durante 2 min. Después de eso, se recogieron 5 pl de la mezcla de incubación en una placa de ensayo de 96 pocillos ya llena con 85 pl de tampón ácido acético 0,1 M, pH 4,0 y 5 pl de solución a 2,5 mg/ml de AAF-pNA.
La mezcla de reacción se agitó a 600 rpm durante 2 min y fue sometida a lectura directamente en un lector de microplaca a 410 nm a 30°C cada 0,5 min durante 15 min.
Para medir la actividad enzimática inicial, se llevó a cabo un procedimiento similar, salvo la etapa de incubación enzimática a 40°C durante 60 min.
En la Tabla 4 se presentan los resultados de la medición inicial y final de la actividad con la recuperación de la actividad.
Tabla 4. Actividad inicial y final y su recuperación para las tripeptidil peptidasas
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A partir de la Tabla 4 puede observarse que las tripeptidil peptidasas enumeradas anteriormente son considerablemente estables a pH 2,5 y 40°C durante 60 min, ya que se retuvieron actividades de más de un 70%. A partir de estos resultados, puede concluirse que las tripeptidil peptidasas tolerantes a la prolina enumeradas anteriormente son estables a bajo pH; por ejemplo, en el tracto digestivo superior de los animales monogástricos.
Conclusiones
Este trabajo demostró la actividad de las enzimas en condiciones que imitan el sistema de digestión monogástrico. Se demuestra que las tripeptidil peptidasas enumeradas anteriormente son estables a bajo pH y en presencia de pepsina y, por tanto, son ideales para aplicaciones en piensos.
Ejemplo 7
Tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en el pienso para animales
Se compraron un total de 288 pollos de engorde machos Ross 308 de un día de edad de un criadero comercial. En el inicio del estudio, se repartieron de manera aleatoria 8 aves en jaulas en batería de acuerdo con los respectivos tratamientos por bloques. Se seleccionaron únicamente aves sanas para el experimento y a lo largo del estudio no se reemplazaron las aves. El estudio consistió en los siguientes tratamientos (Tabla 5):
Tabla 5 - Diseño experimental
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Los pesos de las aves se registraron al inicio del estudio (d0), el día 14 y al terminarse el estudio (d21). La jaula es la unidad experimental. Las dietas se suministraron en forma de papilla y se formularon para cumplir o exceder las normas NRC, excepto para Ca y AvP (Tabla 5). Todo el pienso se mezcló usando una mezcladora Davis S-20; la mezcladora se lavó entre cada tratamiento para evitar contaminación cruzada entre raciones. Se recogieron las muestras de cada dieta de tratamiento en el inicio, la mitad y el final de cada lote y se juntaron y picaron para analizar la actividad enzimática en el pienso.
Todas las aves se alimentaron con una ración a base de maíz y soja hasta el día 14; desde el día 14, se administraron las raciones de tratamiento. Se añadió fitasa a todas las raciones de tratamiento. En el cambio de pienso, se retiraron los comederos de las jaulas, se pesaron, se vaciaron y se rellenaron con la dieta de tratamiento apropiada. El último día del estudio (d21) se pesaron los comederos y las aves, para determinar la ingesta de pienso (FI, por sus siglas en inglés) y la ganancia de peso corporal (BWG, por sus siglas en inglés) en el periodo experimental. Se examinaron los gallineros a diario para detectar la mortalidad. Cuando un ave se sacrificó o falleció, se registró la fecha y el peso (kg) de la eliminación. Se realizó una necropsia macroscópica en todas las aves eliminadas o sacrificadas para determinar la posible causa de la muerte. Se determinó el índice de transformación del alimento (FCR) corregido respecto a la mortalidad.
El d21, se sacrificaron todas las aves de la jaula mediante inyección intracardiaca de pentobarbitona de sodio y se expulsó el contenido del íleon inferior lavándolo cuidadosamente con agua destilada. Se combinaron las fracciones que se estaban digiriendo de las aves de una jaula, lo que dio como resultado ocho muestras por tratamiento alimenticio. Las muestras de las fracciones que se estaban digiriendo se congelaron inmediatamente después de la recogida, se liofilizaron y se procesaron. Se analizaron las muestras de las fracciones que se estaban digiriendo y las dietas para determinar el marcador, el nitrógeno (N) y la energía total con el fin de calcular los coeficientes de digestibilidad.
Tabla 6 - Formulaciones alimenticias
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Análisis estadístico
Los datos se analizaron usando ANOVA y se llevó a cabo una separación de la media para evaluar las diferencias entre las diferentes enzimas y las dosis enzimáticas. Se utilizó la jaula como unidad experimental.
Resultados
Tabla 7 - Rendimiento y resultados de la digestibilidad
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La suplementación de la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina dio como resultado una reducción significativa en el FCR en comparación con el control negativo y la proteasa comercial B y una reducción numérica en comparación con la proteasa comercial A.
Complementar la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina aumentó de manera significativa la BWG en comparación con el NC; no ocurrió lo mismo ni para la proteasa comercial A ni para la proteasa comercial B. La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina aumentó de manera significativa el porcentaje de digestibilidad ileal del N en comparación con el control y la proteasa comercial B (Figura 11). La tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina también aumentó de manera significativa la energía digerida hasta un nivel significativamente mayor que el control negativo y numéricamente mayor que las dos proteasas comerciales (Figura 12).
Conclusiones
En conclusión, complementar la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina dio como resultado un rendimiento de las aves significativamente mejor que el NC y la proteasa comercial B en lo que se refiere al FCR y la BWG. Hubo un aumento numérico en la BWG y una reducción en el FCR cuando se complementó la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina en comparación con la proteasa comercial A.
Las mejoras en el rendimiento en las aves fueron impulsadas por una mejor digestibilidad proteica (N) y energética en comparación con las proteasas comerciales.
Ejemplo 8
Combinación de proteasa fúngica ácida (Alphalase® AFP) y tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (TRI083) en pienso para animales
Se compraron un total de 432 pollos de engorde machos Ross 308 de un día de edad de un criadero comercial. En el inicio del estudio, se repartieron de manera aleatoria 8 aves en jaulas en batería de acuerdo con los respectivos tratamientos por bloques. Se seleccionaron únicamente aves sanas para el experimento y a lo largo del estudio no se reemplazaron las aves. El estudio consistió en los siguientes tratamientos (Tabla 8):
Tabla 8 - Diseño experimental
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Los pesos de las aves se registraron al inicio del estudio (d0), el día 14 y al terminarse el estudio (d21). La jaula es la unidad experimental. La dieta se suministró en forma de papilla y se formuló para cumplir o exceder las normas NRC, excepto para Ca y AvP (Tabla 9.2). Todo el pienso se mezcló usando una mezcladora Davis S-20; la mezcladora se lavó entre cada tratamiento para evitar contaminación cruzada entre raciones. Se recogieron las muestras de cada dieta de tratamiento en el inicio, la mitad y el final de cada lote y se juntaron y picaron para analizar la actividad enzimática en el pienso.
Tabla 7 - Formulaciones alimenticias
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Todas las aves se alimentaron con una ración a base de maíz y soja hasta el día 14; desde el día 14, se administraron las raciones de tratamiento. Las dosis de enzima usadas en el estudio se seleccionaron para que fueran las más comercialmente relevantes. Se añadió fitasa a todas las raciones de tratamiento. En el cambio de pienso, se retiraron los comederos de las jaulas, se pesaron, se vaciaron y se rellenaron con la dieta de tratamiento apropiada. El último día del estudio (d21) se pesaron los comederos y las aves, para determinar la ingesta de pienso (FI) y ganancia de peso corporal (BWG) en el periodo experimental. Se examinaron los gallineros a diario para detectar la mortalidad. Cuando un ave se sacrificó o falleció, se registró la fecha y el peso (kg) de la eliminación. Se realizó una necropsia macroscópica en todas las aves eliminadas o sacrificadas para determinar la posible causa de la muerte. Se determinó el índice de transformación del alimento (FCR) corregido respecto a la mortalidad.
El d21, se sacrificaron todas las aves de la jaula mediante inyección intracardiaca de pentobarbitona de sodio y se expulsó el contenido del íleon inferior lavándolo cuidadosamente con agua destilada. Se combinaron las fracciones que se estaban digiriendo de las aves de una jaula, lo que dio como resultado ocho muestras por tratamiento alimenticio. Las muestras de las fracciones que se estaban digiriendo se congelaron inmediatamente después de la recogida, se liofilizaron y se procesaron. Se analizaron las muestras de las fracciones que se estaban digiriendo y las dietas para determinar el marcador, el nitrógeno (N) y la energía total con el fin de calcular los coeficientes de digestibilidad.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron usando ANOVA y se llevó a cabo una separación de la media para evaluar las diferencias entre las diferentes enzimas y las dosis enzimáticas. Se utilizó la jaula como unidad experimental.
Resultados
Tabla 8 - Rendimiento y resultados de la digestibilidad
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A partir de la Tabla 8 puede observarse que hubo un efecto significativo del tratamiento sobre el FCR, no hubo diferencia significativa entre aves alimentadas con la dieta NC y AFP en solitario, aunque hubo una reducción numérica en el FCR. Sin embargo, las dietas suplementadas con una combinación de AFP y tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina redujeron significativamente el FCR hasta un nivel inferior al control y la proteasa comercial B.
Hubo un aumento numérico en la digestibilidad ileal de N (%) cuando la dieta NC se suplementaba con AFP en solitario. Hubo una mejora por etapas en la digestibilidad ileal de N (%) según aumentaba la dosis de tripeptidil peptidasa por encima de la AFP, teniendo la combinación de AFP y 0,007 g/MT de tripeptidil peptidasa una digestibilidad ileal de N (%) significativamente mayor que NC, la proteasa comercial B y AFP en solitario.
Asimismo, hubo un aumento numérico por etapas en la digestibilidad ileal de la energía según se añadía tripeptidil peptidasa en dosis crecientes por encima de la AFP; en todos los casos la combinación de AFP y tripeptidil peptidasa fue significativamente mejor que el control negativo.
Conclusiones
En conclusión, hay un efecto beneficioso de la combinación de AFP y tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina sobre la mejora del rendimiento de las aves. Esta está impulsada por un aumento en la digestibilidad ileal de N y la energía en aves alimentadas con la combinación en lugar de solamente con la enzima AFP en solitario. La combinación de AFP y tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina confirió niveles significativamente mayores de digestibilidad de N y energía que algunas proteasas comerciales.
Ejemplo 9
Materiales y métodos
Evaluación del contenido de proteína en las proteasas
Para añadir cantidades equivalentes de proteasas en los ensayos, se midió el contenido de proteína de las proteasas usando el kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA. Se preparó la solución madre de enzimas, mientras que el resto de las enzimas estaban en forma líquida. Las proteasas se diluyeron a 1:10, 1:100 y 1:1000 con agua MQ, después de lo cual se midió el contenido de proteína de acuerdo con las instrucciones del kit.
Digestión in vitro del pienso con proteasas
Se realizaron digestiones in vitro por simulación del tracto gastrointestinal superior (UGIT, por sus siglas en inglés) con pienso a base de soja y maíz para producir material de ensayo para experimentos de cultivo celular HT-29 MTX E12. Se trituraron 5,0 g de pienso de pollo en un mortero y se hidrataron con 15 ml de agua MQ. Las proteasas se añadieron a las digestiones de acuerdo con la Tabla 1, se ajustó el pH a 5,5 y las digestiones se incubaron a 39°C en un baño de agua durante 20 min mezclando los frascos a intervalos de cinco minutos. Se simularon las condiciones del proventrículo y la molleja añadiendo 2,5 ml de HCl 1,5 M y 2,5 ml de solución de pepsina (1,8 mg/ml en agua MQ) a las digestiones, ajustando el pH a 2,5 e incubando los frascos a 39°C en un baño de agua durante 40 min con mezcla a intervalos de 5 min. Se simularon las condiciones del intestino delgado añadiendo 2,5 ml de NaHCO3 que contenía 18,5 mg de pancreatina, ajustando el pH a 6,3-6,5 e incubando los frascos a 39°C en un baño de agua durante 60 min mezclando a intervalos de 5 min. Las digestiones se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 min y se recogieron los sobrenadantes en tubos nuevos. Las enzimas digestivas y las proteasas se inactivaron incubando los sobrenadantes en agua en ebullición durante 4 minutos. Las digestiones se enfriaron en hielo y se almacenaron en un congelador (-20°C) para los experimentos de cultivo celular.
La cantidad de proteína se ajustó de modo que la concentración final de cada proteína fuera de aproximadamente 1 gg/ml de solución añadida a las células.
Tabla 9: Cantidad de proteasa en las digestiones
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Cultivo celular
Se mantuvieron células HT-29 MTX E12 (HPA Cultures, Salisbury, Inglaterra) en DMEM (alto contenido de glucosa) suplementado con FBS al 10 %, aminoácidos no esenciales MEM 1 x, piruvato de sodio 1 x, antibiótico-antimicótico 1 x a 37°C, en una atmósfera de CO2 al 8%. Todos los medios y suplementos se adquirieron en Life Technologies.
Para estudios que investigan los efectos de las proteasas sobre las uniones ocluyentes y los marcadores de inflamación en células diferenciadas, las células HT-29 MTX E12 se sembraron a una densidad de 5,7 x 104 células/pocillo en insertos de cultivo celular recubiertos con colágeno de tipo I de cola de rata en medio de cultivo completo y se diferenciaron durante 14 días. En el 4° día de diferenciación, las células se movieron a condiciones de suero asimétricas usando el medio de cultivo sin suero sobre el lado apical y el medio completo sobre el lado del inserto. Esta condición se usó hasta el final de la diferenciación, cambiando el medio en intervalos de tres días. Las soluciones de ensayo se aplicaron sobre la cámara apical de las células.
Mediciones de ATP
Se sembraron células HT-29 MTXE12 a una densidad de 2500 células/pocillo en microplacas blancas de 96 pocillos con medio de cultivo completo durante una noche, y después se cambió el medio sin suero a las células para otra incubación más durante una noche. En el tercer día de cultivo, las células se trataron con materiales de ensayo y se realizó la medición de ATP. Como material de ensayo, las proteasas se diluyeron a 0,01,0,1,0,25, 0,5, 1,2,5 y 5 gg/ml (en función de su cantidad de proteína) en SFM. Para la combinación de tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina (TRI083) y Alphalase® AFP, la cantidad de ambas enzimas se añadió en una cantidad igual. Cuando se usaron proteasas en el pienso, el sobrenadante del pienso se diluyó 1:1 en SFM y se añadió una cantidad igual de proteasas como en la digestión in vitro (Tabla 3). El contenido de ATP de las células se midió usando el sistema de control ATPLite™ (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante después de 15 min o 1 h desde el inicio del experimento.
Ensayo de permeabilidad con FITC-dextrano
Se estudió el efecto de proteasas sobre la permeabilidad macromolecular de la capa epitelial controlando el flujo de FITC dextrano a través de la capa diferenciada de células HT-29 MTX E12. Las células diferenciadas se lavaron con medio HBSS y se equilibraron en HBSS a 37°C, durante 30 minutos. Se retiró el medio HBSS y se añadieron a las células 0,5 ml de soluciones de ensayo. Las soluciones de ensayo se prepararon diluyendo el pienso digerido in vitro 1:1 con HBSS y añadiendo dos cantidades de proteasas en las muestras (1 y 10 gg/ml). Se incluyó FITC-dextrano (peso molecular de 10.000) en las soluciones de ensayo como 1 mg/ml. La HBSS en las cámaras apicales de las células se remplazó con las soluciones de ensayo, y las células se colocaron en la incubadora durante 1 h. Las células se agitaron con un agitador orbital (30 rpm) durante este tiempo para minimizar el efecto de la capa acuosa no agitada. Después de 1 h, se extrajeron muestras de 200 pl de la cámara basolateral y se añadieron 200 pl de HBSS nueva en el lado basolateral. Esto se continuó durante 3 horas adicionales. La muestra final se extrajo después de que hubieran pasado 24 horas desde el inicio del estudio. Después de eso, se midió la fluorescencia de las muestras y se calculó el Papp usando la siguiente fórmula:
n K(cm 3) Ci (100 pM)
Pavv = A (cm2) X T~x~Cf
Mediciones de TEER
Se estudió la integridad de la monocapa de células HT-29 MTXE12 por medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) usando un voltio ohmímetro epitelial. La TEER se midió antes y después del tratamiento, se restó la resistencia de un filtro vacío sin células de los valores medidos, se multiplicó por el área superficial del filtro y los resultados se expresaron como Dxcm2. Se calculó un cambio porcentual en TEER después del tratamiento restando la TEER medida antes del tratamiento de la TEER medida después del tratamiento, dividiendo este valor por la TEER medida antes del tratamiento y multiplicando por 100.
Resultados
Ejemplo 9.1
Efecto de proteasas sobre el contenido de ATP en las células tratadas por proteasas
La deficiencia de ATP es un marcador de citotoxicidad, pero también describe la situación global en la reserva de energía de las células. El contenido de ATP se midió a partir de células HT-29 MTXE12 después del tratamiento con proteasas mezcladas directamente con el medio de cultivo celular por el sistema ATPLite™ . Se observaron cambios significativos dependientes de la dosis después de una hora de tratamiento con la proteasa comercial 1 y la proteasa comercial 2 (Figura 13). Esto daría lugar a la suposición de que la proteasa comercial 1 y la proteasa comercial 2 tienen un efecto negativo sobre las células vivas.
Ejemplo 9.2
Efecto de pienso digerido in vitro con proteasas sobre el contenido de ATP celular
El contenido de ATP también se midió a partir de células HT-29 MTXE12 después de una hora de tratamiento usando pienso digerido in vitro que contenía proteasas. La mayor cantidad de la proteasa comercial 1 y la proteasa comercial 2 están mostrando una reducción significativa en la cantidad de ATP en comparación con el pienso de control digerido in vitro y que, por tanto, da lugar a la posible citotoxicidad de las células. Eso confirmaría el efecto negativo de las altas dosificaciones de la proteasa comercial 1 y la proteasa comercial 2 sobre las células vivas (véase la Figura 14). Ejemplo 9.3
Evaluación de la permeabilidad
Se estudió el efecto del pienso digerido in vitro con proteasas sobre la permeabilidad macromolecular usando el ensayo de permeabilidad con FITC-dextrano. Después de la inactivación térmica del pienso 1 digerido se añadieron 10 pg/ml de proteasa. En algunos de los ensayos, se usó medio con pH 6,5 para evaluar el efecto de un pH inferior. Para la permeabilidad de FITC-dextrano, el indicador se mezcló con el pienso digerido in vitro y se aplicó sobre el compartimento apical. Después de las cuatro horas, se calculó la permeabilidad (Figura 15).
Como puede observarse por la figura, tanto la proteasa comercial 1 como la proteasa comercial 2 aumentan significativamente la permeabilidad macromolecular de las células; por tanto, tienen un efecto negativo sobre esas células. Ni TRI083 en solitario ni en combinación con Alphalase® AFP indujeron tal respuesta.
Se observó un fenómeno similar durante la medición de TEER. Se observó una disminución en la integridad de la unión ocluyente tanto para la proteasa comercial 1 como para la proteasa comercial 2 (Figura 16), que también daría lugar a la conclusión del efecto negativo de la proteasa comercial 1 y la proteasa comercial 2 sobre las células vivas, mientras que la TRI083 en solitario o en combinación con Alphalase® AFP no contribuye a ningún efecto negativo para las células.
Ejemplo 10
La suplementación de tripeptidil peptidasa (TRI083) en pienso para animales mejora la digestibilidad de los nutrientes Se compraron un total de 288 pollos de engorde machos Ross 308 de un día de edad de un criadero comercial. En el inicio del estudio, se repartieron de manera aleatoria 8 aves en jaulas en batería de acuerdo con los respectivos tratamientos por bloques. Se seleccionaron únicamente aves sanas para el experimento y a lo largo del estudio no se reemplazaron las aves. El estudio consistió en los siguientes tratamientos (Tabla 10.1):
Tabla 10.1 - Diseño experimental
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Se registró el peso de las aves en el inicio del estudio (d0), en el día 14 y al finalizar el estudio (d21). La jaula es la unidad experimental. Las dietas se suministraron en forma de papilla y se formularon para cumplir o exceder las normas NRC, excepto para Ca y AvP (Tabla 10.2). Todo el pienso se mezcló usando una mezcladora Davis S-20; la mezcladora se lavó entre cada tratamiento para evitar contaminación cruzada entre raciones. Se recogieron las muestras de cada dieta de tratamiento en el inicio, la mitad y el final de cada lote y se juntaron y picaron para analizar la actividad enzimática en el pienso.
Tabla 10.2 - Formulaciones alimenticias
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Todas las aves se alimentaron con una ración a base de maíz y soja hasta el día 14; desde el día 14, se administraron las raciones de tratamiento. Las dosis de enzima usadas en el estudio se seleccionaron para que fueran las más comercialmente relevantes. Se añadió fitasa a todas las raciones de tratamiento. En el cambio de pienso, se retiraron los comederos de las jaulas, se pesaron, se vaciaron y se rellenaron con la dieta de tratamiento apropiada. El último día del estudio (d21) se pesaron los comederos y las aves, para determinar la ingesta de pienso (FI) y la ganancia de peso corporal (BWG) en el periodo experimental. Se examinaron los gallineros a diario para detectar la mortalidad. Cuando un ave se sacrificó o falleció, se registró la fecha y el peso (kg) de la eliminación. Se realizó una necropsia macroscópica en todas las aves eliminadas o sacrificadas para determinar la posible causa de la muerte. Se determinó el índice de transformación del alimento (FCR) corregido respecto a la mortalidad.
El d21, se sacrificaron todas las aves de la jaula mediante inyección intracardiaca de pentobarbitona de sodio y se expulsó el contenido del íleon inferior lavándolo cuidadosamente con agua destilada. Se combinaron las fracciones que se estaban digiriendo de las aves de una jaula, lo que dio como resultado ocho muestras por tratamiento alimenticio. Las muestras de las fracciones que se estaban digiriendo se congelaron inmediatamente después de la recogida, se liofilizaron y se procesaron. Se analizaron las muestras de las fracciones que se estaban digiriendo y las dietas para determinar el marcador, el nitrógeno (N) y la energía total con el fin de calcular los coeficientes de digestibilidad.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron usando ANOVA y se llevó a cabo una separación de la media para evaluar las diferencias entre las diferentes enzimas y las dosis enzimáticas. Se utilizó la jaula como la unidad experimental.
Resultados
Tabla 10.3 - Rendimiento y resultados de digestibilidad
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Hubo un efecto significativo del tratamiento sobre el FCR; las aves alimentadas con la tripeptidil peptidasa (TRI083) tienen un FCR significativamente inferior que la dieta NC y la proteasa comercial A.
Hubo un aumento significativo en la digestibilidad ileal de N (%) cuando la dieta NC se suplementaba con tripeptidil peptidasa (TRI083). El aumento en el porcentaje de digestibilidad de N fue comparable entre la tripeptidil peptidasa (TRI083) y la proteasa comercial A; ambas conferían una digestibilidad de N significativamente mayor que la proteasa comercial B (Figura 18). Asimismo, hubo un aumento significativo en la energía digestible ileal frente al control negativo cuando se suplementaba cada una de las enzimas proteasa; la digestibilidad ileal de la energía fue numéricamente máxima cuando se suplementaba tripeptidil peptidasa (TRI083) (Figura 19).
Conclusiones
En conclusión, hay un efecto beneficioso de la tripeptidil peptidasa (TRI083) sobre la mejora del rendimiento de las aves a través de la reducción del FCR. Esta está dirigida por un aumento en la digestibilidad ileal de N y la energía en aves alimentadas con tripeptidil peptidasa (TRI083).
La tripeptidil peptidasa (TRI083) confería niveles significativamente mayores de digestibilidad de N y energía que algunas proteasas comerciales.
Ejemplo 11
La suplementación de tripeptidil peptidasa (TRI083) en pienso para animales mejora el rendimiento de pollos de engorde
Se compraron un total de 1600 pollos de engorde machos Ross 708 de un día de edad de un criadero comercial. Al inicio del estudio, se asignaron aleatoriamente 40 aves a corrales de suelo de acuerdo con los tratamientos respectivos por bloques. Se seleccionaron únicamente aves sanas para el experimento y a lo largo del estudio no reemplazaron las aves. El estudio consistió en los siguientes tratamientos (Tabla 11.1):
Tabla 11.1 - Diseño experimental
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Los pesos de las aves se registraron al inicio del estudio (d0) y en los cambios de dieta en d10, d25 y al terminarse el estudio (d42). El corral es la unidad experimental. Todas las dietas se suministraron en forma de puré. Las dietas PC se formularon para cumplir o exceder las normas NRC y las dietas NC estaban especificadas a la baja en un 50% de la fracción no digerida de los aminoácidos en las dietas PC (Tabla 11.2). Todo el pienso se mezcló usando una mezcladora Davis S-20; la mezcladora se lavó entre cada tratamiento para evitar contaminación cruzada entre raciones. Se recogieron las muestras de cada dieta de tratamiento en el inicio, la mitad y el final de cada lote y se juntaron y picaron para analizar la actividad enzimática en el pienso.
Tabla 11.2 - Formulaciones alimenticias
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Todas las aves fueron alimentadas con raciones de tratamiento durante todo el estudio. Las dosis de enzima usadas en el estudio se seleccionaron para que fueran las más comercialmente relevantes. Se añadió fitasa a todas las raciones de tratamiento a 500 FTU/kg. En el cambio de pienso, se retiraron los comederos de las jaulas, se pesaron, se vaciaron y se rellenaron con la dieta de tratamiento apropiada. El último día del estudio (d42) se pesaron los comederos y las aves, para determinar la ingesta de pienso (FI) y la ganancia de peso corporal (BWG) en el periodo experimental. Se examinaron los gallineros a diario para detectar la mortalidad. Cuando un ave se sacrificó o falleció, se registró la fecha y el peso (kg) de la eliminación. Se realizó una necropsia macroscópica en todas las aves eliminadas o sacrificadas para determinar la posible causa de la muerte. Se determinó el índice de transformación del alimento (FCR) corregido respecto a la mortalidad.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron usando ANOVA y se llevó a cabo una separación de la media para evaluar las diferencias entre las diferentes enzimas y las dosis enzimáticas. Se usó el corral como la unidad experimental.
Resultados
Tabla 11.3 - Resultados de rendimiento
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Figure imgf000143_0001
Hubo un efecto significativo del tratamiento en la BWG; las aves alimentadas con la dieta NC tenían pesos corporales significativamente inferiores que las aves alimentadas con la dieta PC. El tratamiento enzimático con las proteasas comerciales A B aumentó numéricamente el peso corporal, pero no hasta un nivel significativamente diferente del de las aves con NC. La suplementación con tripeptidil peptidasa (TRI083) aumentó significativamente la ganancia de peso corporal de las aves en comparación con NC hasta un nivel no significativamente diferente del de las aves con PC (Figura 20).
Asimismo, el FCR en las aves con NC fue significativamente mayor que en las aves con PC. No hubo efecto significativo de la proteasa comercial A B sobre el FCR en comparación con NC. La tripeptidil peptidasa (TRI083) redujo significativamente el FCR en comparación con las aves con NC hasta un nivel no significativamente diferente del de las aves con PC (Figura 21).
Conclusiones
En conclusión, hay un efecto beneficioso de la tripeptidil peptidasa (TRI083) sobre la mejora del rendimiento de las aves a través de la reducción del FCR y el aumento de la BWG en dietas deficientes en nutrientes. La tripeptidil peptidasa (TRI083) aumentó la BWG y redujo el FCR hasta niveles mayores que las proteasas comerciales A B.
Ejemplo 12
Estabilidad de la tripeptidil peptidasa TRI045 (SEQ ID N° 99) en presencia de pepsina
M ateria les y m étodos
Solución de pepsina: Se utilizó pepsina de cerdo de Sigma (P7000, 674 unidades Sigma/mg, www.sigma.com) en este ejemplo y se preparó en agua MiliQ a 10.000 unidades Sigma/mL a 10.000 unidades Sigma/mL.
La mezcla de preincubación contenía: 2,5 gl de muestra de sedolisina, 95 gl de tampón GAT (glicina 50 mM-ácido acético 50 mM-Tris 50 mM, pH 3,5), 5 gl de pepsina en agua milliQ (10.000 unidades Sigma/ml) (concentración final de unidades de pepsina: 500 unidades Sigma/mL de la mezcla de reacción) en la mitad inferior del área de una MTP Corning de 96 pocillos. En el control, la mezcla de preincubación contuvo 5 gL de agua en lugar de 5 gL de pepsina. La mezcla se incubó a 40°C durante 60 min y se mantuvo en hielo. Para someter a ensayo la actividad residual, la mezcla de ensayo contenía los 5 gL de la mezcla de preincubación, 85 gl de ácido acético-acetato de sodio 0,1 M (pH 4,0), 5 gl de H-Ala- Ala-Phe-pNA (2,5 mg/mL) de BACHEM.com (L-1095.0250). Se realizó una lectura a 410 nm en un lector de microplacas cada 0,5 min a 30°C. N = 2.
Resultados
En las condiciones de ensayos y una preincubación a 40°C durante 60 min, se observó que la actividad residual era de más de un 90% para TRI045 en presencia de 500 unidades de pepsina/mL de mezcla de preincubación.
Ejemplo 13
TRI045 (SEQ ID N° 99) como enzima para el pienso para promover la hidrólisis de las proteínas del pienso
Los animales producen y secretan proteasas en su tracto digestivo para digerir el pienso. Estas proteasas incluyen endoproteasas de tipo pepsina, tripsina y quimiotripsina y exopeptidasas de tipo carboxipeptidasa A y B, etc. Sin embargo, los animales no producen aminopeptidasas como enzimas digestivas o al menos no en una cantidad apreciable. Tal como se muestra este ejemplo, la adición de la tripeptidil peptidasa TRI045 (sedolisina) promueve la digestión proteica en un sistema in vitro para el pienso a base de maíz y soja. En este ejemplo se muestra que la TRI045 tiene una actividad elevada a un pH entre 4 y 6,5.
M ateria les y m étodos
Se preparó el sustrato tripeptídico de H-Ala-Ala-Phe-pNA (AAF-pNA de BACHEM.com, L-1095.0250), para la sedolisina a una concentración de 2,5 mg/mL en DMSO. La reacción se preparó mezclando 8,5 gl de AAF-pNA, 7 gl de DMSO, 32 gl de agua y 50 gl de tampón con pH 4,14-6,57 y 0,8 gl o 1,5 gl de TRI045. Se hizo comenzar la reacción a 30°C añadiendo la enzima TRI045. Se registró la velocidad de reacción inicial usando un lector de microplacas en intervalos de 0,5 min a 410 nm en una placa de 96 pocillos.
Resultados
En la Tabla 12 se muestra que la TRI045 tuvo una actividad óptima a aproximadamente pH 5,0, pero mantuvo aproximadamente un 50% de actividad a aproximadamente pH 4 y pH 6,5, lo que es ideal para la digestión gástrica del pienso. En la Figura 22 se muestra además que el grado final de la reacción que se alcanzó a pH 5, pH 5,5 y pH 6 fue muy similar. El pH elevado óptimo es ideal para el pienso para animales, ya que en tal situación la pancreatina tendría tiempo para generar más sustratos oligopeptídicos para la TRI045.
Tabla 12. Efecto del pH en la actividad de TRI045 usando H-Ala-Ala-Phe-pNA como sustrato (los valores son el promedio de una prueba con una dosis de 0,8 pl de TRI045 (n=2) y una prueba con una dosis de 1,5 pl de TRI045
(n=1))
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Ejemplo 14
Efecto de TRI045 (SEQ ID N° 99) más pepsina y pancreatina en la hidrólisis del sustrato de tipo pienso de maíz y soja
El sistema de reacción in vitro contuvo 140 pL de una suspensión espesa de pienso de maíz y soja al 10% (p/v) (14 mg de pienso de maíz y soja), 10 pL de TRI045 en MES-NaOH 50 mM pH 6,0 y 10 pL de pepsina porcina (1,14 U/pL en agua). La reacción se incubó con agitación a 40°C durante 45 min, posteriormente se añadieron 34 pL de pancreatina porcina (0,4636 mg/mL en bicarbonato de Na 1 M) y se incubó durante 60 min más. Después de la incubación, la placa de 96 pocillos se centrifugó y se usaron los sobrenadantes para el ensayo de la actividad residual de TRI045 y para los ensayos con OPA y BCA (véase más abajo).
Las mediciones del grado de hidrólisis de las proteínas solubles se basan en la reacción de los grupos amino primarios con el o-ftaldialdehído (ensayo OPA). Referencia: P.M. Nielsen, D. Petersen y C. Dambmann, Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science, 66 (2001) 642-646.
Para el ensayo con OPA se llevó a cabo el siguiente procedimiento. Se transfirieron 10-25 pL de la muestra del pienso tratada con la enzima de la placa maestra a la nueva placa; después se añadieron a la placa 175 pL del reactivo OPA que contenía borato de sodio, dodecilsulfato y ditiotreitol. Las mediciones del punto final de la densidad óptica a 340 nm se realizaron inmediatamente después de 2 min y 5 segundos de la mezcla.
Para cuantificar la concentración proteica de cada muestra de proteasa, se utilizó el kit de reactivos de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, cat n° 23228). La muestra de TRI045 no se purificó antes de la cuantificación. El kit de ensayo de proteínas Pierce BCA es una formulación compatible con detergentes que usa el ácido bicinconínico (BCA) para la detección y la cuantificación colorimétricas de las proteínas totales. Este método combina la reducción bien conocida de Cu2+ en Cu1+ por la proteína en un medio alcalino con la detección colorimétrica altamente sensible y selectiva del ion catiónico cuproso (Cu+1) usando un reactivo único que contiene ácido bicinconínico. El producto de la reacción de color morado de este ensayo se forma debido a la quelación de dos moléculas de BCA con un ion cuproso. Este complejo hidrosoluble muestra una marcada absorbancia a 562 nm que es prácticamente lineal con la concentración creciente de proteína en un amplio intervalo de trabajo (20-2000 pg/mL). Está documentado que la estructura macromolecular de la proteína, la cantidad de enlaces peptídicos y la presencia de cuatro aminoácidos particulares —cisteína, cistina, triptófano y tirosina— son responsables de la formación de color con el BCA.
Para las determinaciones con OPA (grupos amino totales liberados) y BCA (proteína total en la fracción soluble), los sobrenadantes se diluyeron 20 veces y se usaron 10 pl.
En el sistema que contiene 1000 ppm de TRI045, en presencia de pepsina y pancreatina porcinas, la liberación de grupos amino libres a partir del pienso de maíz y soja (como una medida de la hidrólisis proteica (valor OPA)) aumentó en un 9% y la solubilidad proteica aumentó en un 5%.
Para estudiar la estabilidad de la TRI045 en las condiciones del ensayo in vitro descritas anteriormente (incubación en presencia de pepsina a pH 3 durante 45 min a 40°C y posteriormente en presencia de pancreatina durante 60 min a 40°C), posteriormente se sometió a ensayo la actividad residual de la TRI045. La mezcla de reacción contuvo 50 pl de tampón HAC-NaAC 0,1 M (pH 5,0), 10 pl de sobrenadante y 5 pl de AAF-pNA (5 mg/mL en DMSO). Se controló la velocidad de reacción a 410 nm y 30°C cada 30 segundos usando un lector de microplacas. Como control, se utilizó una proteasa comercial con la misma concentración de 1000 ppm.
Conclusión para los Ejemplos 12-14
La velocidad de reacción para el control (únicamente pepsina y pancreatina) fue de 4,3 mOD/min, para la proteasa comercial fue de 11,0 mOD/min y para la TRI045 fue de 19,3 mOD/min. Después de restar el control (4,3 mOD/min), la actividad residual de la TRI045 sobre el sustrato AAF-pNA fue 2,2 veces mayor que para la proteasa comercial. De estos resultados se deduce que la TRI045 es estable respecto a la pepsina y la pancreatina a 40°C durante al menos 100 minutos.
En conclusión, con este ejemplo se demuestra que la TRI045 es estable respecto a la pepsina y la pancreatina cuando se incuba durante 105 min a 40°C en presencia de pienso de maíz y soja en un intervalo de pH de 3 a 7. También tuvo el efecto adicional de aumentar la solubilización proteica y la hidrólisis proteica en presencia de pepsina y pancreatina cuando se utilizó el pienso de maíz y soja como sustrato en condiciones que imitan al sistema de digestión monogástrico (BEDFORD, M.R., & CLASSEN, H.L. (1993) “An in vitro assay for prediction of broiler intestinal viscosity and growth when fed rye-based diets in the presence of exogenous enzymes”. Poultry Science, 72: 137-143); es decir, la reacción se llevó a cabo a 40°C a pH 3,0-3,3 en presencia de pepsina durante 45 min y a continuación se elevó el pH hasta pH 6,5-7,0, se añadió pancreatina y se incubó 60 min más.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar una composición de aditivo para piensos que comprende:
mezclar al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; y
uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol que incluye sorbitol y glicerol, trigo o un componente de trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propano diol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos y
opcionalmente embalaje,
en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición de aditivo alimentario comprende además al menos una endoproteasa, preferiblemente en donde la al menos una endoproteasa es una endoproteasa ácida.
3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es además capaz de escindir tripéptidos del terminal N de un péptido que tiene Prolina en P1 y P1'; y/o
la endoproteasa y la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se mezclan con una composición que comprende al menos una proteína o al menos una porción de una proteína, en donde la composición, la endoproteasa y la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o combinaciones de las mismas están en estado seco o sustancialmente seco cuando se mezclan; y/o
la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o la al menos una endoproteasa, o una combinación de las mismas se encapsula o se inactiva de otro modo antes de mezclarla con dicha composición; y/o
la al menos una proteína o porción de la misma es una proteína animal o una proteína vegetal (por ejemplo, seleccionada entre una o más de una gliadina, una beta-caseína, una beta-lactoglobulina o un fragmento inmunogénico de una gliadina, una beta-caseína, una beta-lactoglobulina, glicinina, beta-conglicinina, cruciferina, napina, hordeínas, queratinas, harinas de plumas o de pelo, colágeno, proteína de suero, proteína de pescado, harina de pescado, proteína de carne, proteína de huevo, proteína de soja o proteína de cereales), preferiblemente comprendidas en maíz, harina de soja, granos secos de maíz con solubles de destilería (cDDGS), trigo, proteínas de trigo que incluyen gluten, derivados del trigo, salvado de trigo, granos secos de trigo con solubles de destilería (wDDGS), productos derivados del maíz que incluyen harina de gluten de maíz, cebada, avena, centeno, triticale, soja con toda la grasa, harinas de subproductos de origen animal, una proteína soluble en alcohol (preferiblemente una zeína (por ejemplo, un maíz con zeína de maíz)) y/o una kafirina (por ejemplo, de sorgo), una proteína de semillas oleaginosas (preferiblemente de proteínas de semillas de soja, proteínas de semillas de girasol, proteínas de colza, proteínas de semilla de canola o combinaciones de las mismas) o una combinación de las mismas; y/o
la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina se puede obtener de Trichoderm a preferiblemente Trichoderm a reesei.
4. Una composición de aditivo para piensos o un ingrediente para piensos que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; y
uno o más ingredientes seleccionados del grupo constituido por: una sal, poliol que incluye sorbitol y glicerol, trigo o un componente de trigo, acetato de sodio, trihidrato de acetato de sodio, talco de sorbato de potasio, alcohol polivinílico (PVA), benzoato, sorbato, 1,3-propano diol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, metabisulfito, formiato o una combinación de los mismos, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético, preferiblemente en el que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o la endoproteasa están inactivas (o sustancialmente inactivas) en la composición de aditivos de alimentación antes de suministrar a un animal la composición de aditivo para piensos.
5. Una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos comprende además al menos una endoproteasa.
6. Un kit que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; e instrucciones para administrarlo a un animal,
en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
7. Un kit de acuerdo con la reivindicación 6 en el que el kit comprende además al menos una endoproteasa.
8. Una premezcla que comprende una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 y al menos un mineral y/o al menos una vitamina, preferiblemente en la que la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o endoproteasa está inactiva (o sustancialmente inactiva) en la premezcla antes de suministrar la premezcla a un animal.
9. Un método para preparar un pienso que comprende poner en contacto un componente para piensos con una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5 o una premezcla de acuerdo con la reivindicación 8 o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'
opcionalmente en combinación con al menos una endoproteasa, preferiblemente en donde la tripeptidil peptidasa y/o la endoproteasa tolerantes a la prolina están inactivas (o sustancialmente inactivas) en el pienso antes de suministrar el pienso a un animal, en donde la al menos una peptidasa tripeptidil tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
10. Un pienso que comprende una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos de acuerdo con la reivindicación 4 o la reivindicación 5, o una premezcla de acuerdo con la reivindicación 8, o que comprende al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en la que dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen (i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1' preferiblemente cuando la endoproteasa y/o la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina están inactivas (o sustancialmente inactivas) en el pienso antes de suministrar el pienso a un animal, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
11. Un método no terapéutico para mejorar una característica biofísica de un animal o para mejorar la digestibilidad de proteínas de un animal, método que comprende administrar a un animal una composición de aditivo para piensos según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, o un pienso según la reivindicación 10, o una premezcla según la reivindicación 8, o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en la que dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen:
(i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1'; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1'; y
opcionalmente al menos un componente para piensos y/o al menos un mineral y/o al menos una vitamina, preferiblemente en donde el método comprende administrar a un animal al menos una endoproteasa, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
12. El uso de una composición de aditivo para piensos o ingrediente para piensos según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, o un alimento o pienso según la reivindicación 10, o una premezcla según la reivindicación 8, o al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina que tiene predominantemente actividad exopeptidasa en donde dicha tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina es capaz de escindir tripéptidos del terminal N de péptidos que tienen: (i)
(A) Prolina en P1; y
(B) Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos en P1; y/o
(ii)
(a') Prolina en P1 '; y
(b') Un aminoácido seleccionado entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina o aminoácidos sintéticos o aminas en P1 '
para mejorar la digestibilidad de proteínas en un animal o para mejorar no terapéuticamente una característica biofísica de un animal, preferiblemente en donde al menos una endoproteasa se usa en combinación, en donde la al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina:
(a) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional de la misma que retiene dicha actividad peptidasa;
(b) comprende un aminoácido que tiene al menos un 80% o al menos un 90% de identidad con la SEQ ID N° 29, la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2 o un fragmento funcional del mismo que retiene dicha actividad peptidasa;
(c) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia SEQ ID N° 56;
(d) está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un 80% o al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 56;
(e) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la SEC ID N° 56 en condiciones de alta rigurosidad; o
(f) está codificada por una secuencia de nucleótidos que difiere de la SEQ ID N° 56 debido a la degeneración del código genético.
13. Un método según la reivindicación 11 o un uso según la reivindicación 12, en el que la característica biofísica se selecciona del grupo constituido por uno o más de los siguientes: rendimiento del animal, rendimiento de crecimiento de un animal, índice de transformación del alimento (FCR), capacidad de digerir una materia prima (por ejemplo, digestibilidad de nutrientes, incluyendo la digestibilidad del almidón, la grasa, las proteínas, la fibra), digestibilidad de nitrógeno (por ejemplo, digestibilidad ileal de nitrógeno) y energía digestible (por ejemplo, energía digestible ileal), retención de nitrógeno, rendimiento de la canal, tasa de crecimiento, ganancia en peso, peso corporal, masa, eficiencia del pienso, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño del huevo, peso del huevo, masa del huevo, tasa de puesta de huevos, ganancia en masa magra, porcentaje de ceniza ósea, miligramos de ceniza ósea, porcentaje de tocino dorsal, producción de leche, porcentaje de materia grasa láctea, rendimiento reproductivo como el tamaño de la camada, la capacidad de supervivencia de la camada, porcentaje de eclosión y el impacto ambiental; por ejemplo, producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno, preferiblemente en donde la característica biofísica es la capacidad de digerir proteínas.
14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 u 11 o 12 o un uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13 en el que: la al menos una endoproteasa, tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o combinación de las mismas se mezcla con al menos una proteína o porción de la misma inmediatamente antes de suministrar a un animal con la composición de aditivo para piensos; y/o
en donde la al menos una endoproteasa, tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina o combinación de las mismas se activa suministrando la al menos una endoproteasa, tripeptidil peptidasa o combinación de las mismas a un animal; y/o
la tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina y la endoproteasa es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal; y/o
la al menos una endoproteasa y al menos una tripeptidil peptidasa tolerante a la prolina son activas en el duodeno y partes del tracto gastrointestinal del animal que precede al duodeno; y/o
cuando se alimenta a un animal, la composición de aditivo para piensos no aumenta sustancialmente la incidencia de enteritis necrótica en dicho animal en comparación con un animal que no se alimenta con dicha composición de aditivo para piensos.
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