CN107105709A - 脯氨酸耐受性三肽基肽酶在饲料添加剂组合物中的用途 - Google Patents

脯氨酸耐受性三肽基肽酶在饲料添加剂组合物中的用途 Download PDF

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Abstract

披露了一种制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括：(a)将至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶与一种或多种选自下组的成分混合，该组由以下各项组成：盐、包括山梨糖醇和甘油的多元醇、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3‑丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合；并且(b)任选地进行封装，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者(ii)(a’)在PV处的脯氨酸；以及(b’)在PV处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类；还披露了这样的脯氨酸耐受性三肽基肽酶、饲料添加剂组合物、饲料添加剂试剂盒、饲料或喂养料和/或预混物的用途。

Description

脯氨酸耐受性三肽基肽酶在饲料添加剂组合物中的用途
发明领域
本发明涉及在饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料中使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，以及涵盖所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶的使用的方法和/或用途。
发明背景
蛋白酶(与肽酶同义)是能够在底物肽、寡肽和/或蛋白质中的氨基酸之间裂解肽键的酶。
基于其催化反应机理和涉及催化活性位点的氨基酸残基将蛋白酶分组为7个家族。丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶是4个主要家族，而苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和未分组蛋白酶构成剩余的3个家族。
蛋白酶的底物特异性通常根据底物中特定氨基酸残基之间优选的键裂解来定义。典型地，底物肽中的氨基酸位置相对于易裂解键的位置(即蛋白酶裂解的位置)来定义：
NH2-……P3-P2-P1*P1’-P2’-P3’……-COOH
使用上述假想的肽进行说明，易裂解键由星号(*)表示，而氨基酸残基由字母‘P’表示，其中N末端至易裂解键的残基从P1开始，并且当远离易裂解键朝向N末端移动时编号增加。C末端至易裂解键的氨基酸残基从P1’开始，并且随着朝向C末端移动，残基编号增加。
基于其底物特异性，蛋白酶通常也可以细分为两个大组。第一组是内切蛋白酶，其是能够裂解肽或蛋白质底物的内部肽键并且倾向于远离N末端或C末端的蛋白水解肽酶。内切蛋白酶的实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。相比之下，第二组蛋白酶是外切肽酶，其裂解在位于朝向蛋白质或肽底物的C末端或N末端的氨基酸残基之间的肽键。
外切肽酶组的某些酶可能具有三肽基肽酶活性。因此，这样的酶能够从底物肽、寡肽和/或蛋白质的未经取代的N末端裂解3个氨基酸片段(三肽)。除了在P1和/或P1’位置处具有脯氨酸的键之外，已知三肽基肽酶从底物的N末端裂解三肽序列。可替代地，三肽基肽酶可以是脯氨酸特异性的，并且仅能够裂解在N末端至易裂解键(即在P1位置)具有脯氨酸残基的底物。
外切肽酶和内切蛋白酶两者都有许多应用。
增加蛋白质消化率，从而降低饮食成本并且提高家禽和猪饮食以及水生动物(aqua)和反刍动物饮食的营养物利用效率，是一个很大的商业领域。目前，用于饲料的可商购的蛋白酶是在高pH(8)下有活性的碱性蛋白酶，这意味着它们在胃肠道中较低处有活性(早期消化道中的pH更加酸性，而在小肠和大肠和盲肠的较后部分变得更接近中性)。通过在胃肠道中较后处(即较低处)有活性，它们在胃肠道较后处(在胃肠道较后处它们似乎增加擅长于利用容易消化的蛋白质的微生物群体)产生寡肽，这可能引起肠道疾病挑战和动物的营养物减少。
另外，在胃肠道的较后部分，粘膜比在坚韧的喉咙、前胃或胃中更不被很好地保护，因此更容易受到损伤导致炎症，这一现象与幼禽中的蛋白酶使用相关。
发明概述
在广泛的方面，本发明提供了一种制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括：
(a)将一种三肽基肽酶，该三肽基肽酶包含选自下组的一个或多个氨基酸序列、或其功能片段、或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ IDNo.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ IDNo.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ IDNo.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ IDNo.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99；或一种三肽基肽酶，该三肽基肽酶从选自下组的一个或多个核苷酸序列、或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列、或通过遗传密码的简并性不同于这些核苷酸序列的核苷酸序列、或在中等严格或高严格条件下与其杂交的核苷酸序列表达，该组由以下各项组成：SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96、SEQ ID No.97；与
一种或多种选自下组的成分混合，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、PVA、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合；并且
(b)任选地进行封装。
根据本发明的第一方面，提供了一种制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；与
一种或多种选自下组的成分混合，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合；并且
(b)任选地进行封装。
在第二方面，提供了通过本发明的方法可获得(例如获得)的饲料添加剂组合物。
在第三方面，提供了饲料添加剂组合物或饲料成分，该饲料添加剂组合物或饲料成分包含至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
根据本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及用于将其给予至动物的说明书。
根据本发明的第五方面，提供了一种预混物，该预混物包括本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分或通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
在第六方面，提供了一种制备喂养料的方法，该方法包括使饲料组分与本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分接触、或与通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物接触、或与本发明的预混物接触、或与至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶接触，任选地与至少一种内切蛋白酶组合，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
在第七方面，提供了一种喂养料，该喂养料包括本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分、或通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物、或本发明的预混物，或包括至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
根据第八方面，提供了一种用于改善动物的生物物理特性或用于改善动物的蛋白质消化率的方法，该方法包括向动物给予通过本发明的方法或用途可获得(例如获得)的饲料添加剂组合物、或本发明的饲料添加剂组合物、喂养料或预混物、或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
任选地给予至少一种饲料组分和/或至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
在第九方面，提供了本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分、或通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物、或本发明的喂养料或预混物、或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的用途，用于改善动物中的蛋白质消化率或用于改善动物的生物物理特征，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
在第十方面，提供了本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分、或通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物、或本发明的饲料喂养料或预混物、或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的用途，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸
用于维持动物的胃肠细胞健康；或用于维持或改善动物的胃肠细胞中的ATP水平；或用于维持或改善动物的胃肠细胞中的紧密连接完整性。
附图简要说明
现将参考附图，仅通过举例的方式描述本发明的实施例，在这些附图中：
图1显示了表达载体pTTT-pyrG-TRI083的质粒图谱。
图2显示了脯氨酸耐受性三肽基肽酶的pH特征曲线。
图3显示了在各种温度下展现脯氨酸耐受性三肽基肽酶的活性的曲线图。
图4显示了当 AFP(本文中称为AFP)(一种酸性蛋白酶)与脯氨酸耐受性三肽基肽酶组合使用时在每种酶的不同剂量下的酶活性。
图5显示了脯氨酸耐受性三肽基肽酶随着时间裂解底物AAPPA的能力。
图6显示裂解产物AAP随着时间从AAPPA底物的产生。
图7显示了表达载体pTTT-pyrG13-TRI071的质粒图谱。内源性信号序列被来自里氏木霉(Trichoderma reesei)酸性真菌蛋白酶(AFP)的分泌信号序列和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子替代(见图7的下部分)。
图8显示了 AFP对玉米大豆饲料的蛋白质水解的剂量响应。虚线代表仅使用胃蛋白酶和胰酶(pancreatin)的对照。
图9显示了DH对饲料样品中的酶组合物的依赖性。
图10显示了在不同条件下通过 AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶进行的饲料处理的效果。实心条代表在40℃下处理100min。空心条代表在40℃下处理200min。
图11显示了与脯氨酸耐受性三肽基肽酶相比，商业蛋白酶对回肠N消化率％的影响。
图12显示了与脯氨酸耐受性三肽基肽酶相比，商业蛋白酶对回肠能量消化率(MJ/kg)的影响。
图13显示了用直接与细胞培养基混合的蛋白酶处理1小时的肠上皮细胞的ATP含量。实心条-通过商业蛋白酶1处理；空心条-通过商业蛋白酶2处理；具有斜条纹的条-通过TRI083处理(本文中所用的TRI083意指具有如本文中SEQ ID No.29所示的成熟肽序列的酶)；具有横条纹的条-通过TRI083和 AFP的组合处理(为每种酶指定剂量)。
图14显示了用蛋白酶体外消化的饲料处理1小时的肠上皮细胞的ATP含量。实心条-通过商业蛋白酶1(加消化对照)处理；空心条-通过商业蛋白酶2处理；具有斜条纹的条-通过TRI083处理；具有横条纹的条-通过TRI083和 AFP的组合处理(为每种酶指定剂量)。
图15显示了四小时处理后的FITC-右旋糖酐渗透性。实心条-通过商业蛋白酶1处理；空心条-通过商业蛋白酶2处理；具有斜条纹的条-通过TRI083处理；具有横条纹的条-通过TRI083和 AFP的组合处理(为每种酶指定剂量)。
图16显示了从在应用测试物质之前和应用4小时之后的值计算的不同处理的TEER的相对变化。实心条-通过商业蛋白酶1处理；空心条-通过商业蛋白酶2处理；具有斜条纹的条-通过TRI083处理；具有横条纹的条-通过TRI083和 AFP的组合处理(为每种酶指定剂量)。
图17显示了许多脯氨酸耐受性三肽基肽酶氨基酸序列之间的比对。显示了xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV基序(已加框)。
图18显示了在补充商业蛋白酶A+B和三肽基肽酶(TRI083)的情况下，回肠N消化率(％)相对于NC的改善。
图19显示了在补充商业蛋白酶A+B和三肽基肽酶(TRI083)的情况下，回肠消化能(MJ/kg)相对于NC的改善。
图20显示了补充商业蛋白酶A+B和三肽基肽酶(TRI083)对肉仔鸡BWG的影响。
图21显示了补充商业蛋白酶A+B和三肽基肽酶(TRI083)对肉仔鸡FCR的影响。
图22显示了使用AAF-pNA作为底物，pH对TRI045(具有前原序列(pre-prosequence)SEQ ID No.98和成熟蛋白质SEQ ID No.99的三肽基肽酶)活性的影响(值是使用0.8μl TRI045的一项测试的平均值(n＝2)。
图23显示了表达载体pTTT-pyrG13-TRI045的质粒图谱。
图24显示了三肽基肽酶TRI045的pH特征曲线。
发明详细说明
本发明的重要发现是三肽基肽酶可以对在P1和/或P1’处具有脯氨酸以及在P1和/或P1’处具有任何其他氨基酸的底物具有外切肽酶活性。这是非常令人惊讶的，因为本领域已经记载的三肽基肽酶当脯氨酸在P1时典型地被抑制，或者当脯氨酸在P1时是活性的但是当在底物中的P1位置处存在除了脯氨酸以外的氨基酸时它是无活性的，这在本文中有时称为脯氨酸特异性三肽基肽酶。诸位发明人首次提出根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶对于在饲料和喂养料中使用非常有益，并且向饲喂脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含其的饲料添加剂组合物的动物提供益处。
有利地，教导用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且由于具有这样的广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如脯氨酸)的底物的裂解抑制。因此，使用这样的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以有效地和/或快速地分解蛋白质底物(例如存在于饲料和/或喂养料中)。这赋予在饲喂这样的蛋白质底物(例如存在于饲料或喂养料中)的动物中有效和/或快速地原位消化蛋白质底物，允许动物快速和/或有效地吸收消化的肽的另外的益处。
基于这些发现，提供了一种制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括：(a)将至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶与一种或多种选自下组的成分混合，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合；并且(b)任选地进行封装，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
本发明还提供通过前述实施例可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物。
如本文所使用的，术语“混合”是指一种或多种成分和/或酶的混合，其中该一种或多种成分或酶以任何顺序和任何组合添加。合适地，混合可以涉及同时或顺序地混合一种或多种成分和/或酶。
在一个实施例中，可以顺序地混合一种或多种成分和/或酶。
优选地，该一种或多种成分和/或酶可以同时混合。
合适地，用于本发明的方法和/或用途中或包括在本发明的任何产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在P1处的脯氨酸；以及在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
可替代地或另外地，用于本发明的方法和/或用途中或包括在本发明的任何产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在P1’处的脯氨酸；以及在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
如本文所使用的，术语“脯氨酸耐受性三肽基肽酶”涉及可以从肽、寡肽和/或蛋白质底物的N末端裂解三肽的外切肽酶。“脯氨酸耐受性三肽基肽酶”能够裂解脯氨酸处于位置P1的肽键以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1的肽键，和/或能够裂解脯氨酸处于位置P1’的肽键以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸在P1’处的肽键。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶不是内切蛋白酶。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶不是从底物的N末端裂解四肽的酶。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶不是从底物的N末端裂解二肽的酶。
在又进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶不是从底物的N末端裂解单个氨基酸的酶。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解脯氨酸处于位置P1的肽键，以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1的肽键。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解脯氨酸处于位置P1’的肽键，以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1’的肽键。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶也可能能够裂解其中存在于位置P1和/或P1’处的脯氨酸以其顺式或反式构型存在的肽键。
合适地，“除了脯氨酸以外的氨基酸”可以是选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
在另一个实施例中，“除了脯氨酸之外的氨基酸”可以是选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸。
合适地，在这样一个实施例中，可以排除合成氨基酸。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解其中脯氨酸存在于位置P1和P1’处的肽键。
令人惊奇的是，三肽基肽酶可以作用于在位置P1和/或P1’处具有脯氨酸的底物上。甚至更令人惊奇的是，除了该活性之外，当在位置P1和/或P1’处存在除了脯氨酸以外的氨基酸时，三肽基肽酶也可能具有活性。
除了在如上所述的各种底物的任何一种上具有活性之外，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以另外耐受在选自下组的一个或多个位置上的脯氨酸，该组由以下各项组成：P2、P2’、P3和P3’。
合适地，除了具有如上所述的活性之外，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以耐受在位置P2、P2’、P3和P3’处的脯氨酸。
这是有利的，因为其允许具有脯氨酸延伸的肽和/或蛋白质底物的有效裂解并允许宽范围的肽和/或蛋白质底物的裂解。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以对在P1位置具有一个或多个赖氨酸、精氨酸或甘氨酸的肽和/或蛋白质具有高的活性。
三肽基肽，例如用于本发明的方法和/或用途中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶能以本领域已知的任何适当方式配制。
在一些实施例中，另外的成分可以与三肽基肽酶混合，例如盐例如Na2SO4、麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、淀粉、滑石、聚乙烯醇(PVA)、多元醇(例如山梨糖醇和甘油)、苯甲酸盐、山梨酸盐、糖(例如蔗糖和葡萄糖)、丙二醇、1,3-丙二醇、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、乙酸钠、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其混合物。
在优选的实施例中，根据本发明的食品添加剂组合物或饲料添加剂组合物包含根据本发明的三肽基肽酶或根据本发明的发酵物，并且进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
在一个实施例中，该盐选自下组，该组由以下各项组成：Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4、MgSO4、CuSO4、Mg(NO3)2、(NH4)2SO4、硼酸钠、醋酸镁、柠檬酸钠或其组合。
在一些实施例中，多元醇可以与脯氨酸耐受性三肽基肽酶混合。
多元醇(例如甘油和/或山梨糖醇)能以5％(w/w)-70％(w/w)，优选10％-20％(w/w)、优选20％-50％(w/w)、以及更优选10％-50％(w/w)、以及更优选为10％-30％(w/w)的量混合，其中％(w/w)意指％(多元醇重量/溶液重量)，不希望受理论的约束，10％多元醇的较低浓度可能有助于增加酶的溶解度和储存稳定性。然而，许多商业酶需要30％甘油以便在感兴趣的浓度下随时间推移保持酶稳定。50％的更高级的多元醇仍可以进一步提高稳定性，但在该多元醇水平下，降低水分活性的另一益处是利于微生物保存。特别是对于食品酶，这在中性pH值下可以是非常重要的，在中性pH值下好的防腐剂的选择是有限的。
糖类(特别是葡萄糖)可以与脯氨酸耐受性三肽基肽酶混合。糖类像葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖全部都是对于许多酶可以作为使用多元醇的替代的物质的实例。合适地，它们(特别是葡萄糖)可以在5％(w/w)-50％(w/w)的范围内单独使用或与多元醇组合使用。
乙酸钠能以5％(w/w)-50％(w/w)，优选8％-40％、优选8％-12％(w/w)、优选10％-50％、并且更优选10％-30％(w/w)的量混合，其中％(w/w)意指％(乙酸钠重量/溶液重量)。
在一个实施例中，可以将脯氨酸耐受性三肽基肽酶与防腐剂混合。
合适地，防腐剂可以是苯甲酸酯(例如苯甲酸钠)和/或山梨酸钾。典型地，这些防腐剂可能以约0.1％-1％(合适地约0.2％-0.5％)的组合浓度使用。苯甲酸钠在pH<5.5时是最有效的，而山梨酸钠在pH<6时是最有效的。
在一个实施例中，一种或多种成分(例如当在本发明的方法和/或用途中使用时用于酶的配制)可以选自下组，该组由以下各项组成：小麦载体、多元醇、糖、盐和防腐剂。
合适地，糖是山梨糖醇。
合适地，盐是硫酸钠。
在一个实施例中，一种或多种成分(例如当在本发明的方法和/或用途中使用时用于配制酶)可以选自下组，该组由以下各项组成：小麦载体、多元醇、山梨糖醇、硫酸钠和防腐剂。
合适地，一种或多种成分(例如用于配制饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或预混物)可以选自下组，该组由以下各项组成：小麦载体、山梨糖醇和硫酸钠。
合适地，可以将脯氨酸耐受性三肽基肽酶与小麦载体混合。
合适地，可以将脯氨酸耐受性三肽基肽酶与山梨糖醇混合。
合适地，可以将脯氨酸耐受性三肽基肽酶与硫酸钠混合。
在优选的实施例中，用于本发明的方法和/或用途的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以用载体配制，该载体包含(或基本上由以下各项组成；或由以下各项组成)盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
在优选的实施例中，用于本发明的方法和/或用途中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以用载体配制，该载体包含(或基本上由以下各项组成；或由以下各项组成)Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4、MgSO4、CuSO4、Mg(NO3)2、(NH4)2SO4、硼酸钠、乙酸镁、柠檬酸钠或其组合。
在一个实施例中，用于本发明的方法和/或用途中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以用Na2SO4配制。
本发明的饲料添加剂组合物合适地包含用载体配制的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该载体包含(或基本上由以下各项组成；或由以下各项组成)盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
在一个实施例中，本发明的饲料添加剂组合物合适地包含用载体配制的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该载体包含(或基本上由以下各项组成；或由以下各项组成)Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4、MgSO4、CuSO4、Mg(NO3)2、(NH4)2SO4、硼酸钠、乙酸镁、柠檬酸钠或其组合。
在一个实施例中，本发明的饲料添加剂组合物合适地包含用Na2SO4配制的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以是热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
术语“热稳定的”意指当加热至高达约75℃的温度时酶保留其活性。合适地，“热稳定的”可以意指当加热至约80℃、更合适地约90℃时酶保留其活性。
有利地，当与非热稳定的变体相比时，热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶例如在饲料造粒工艺的热处理下更不易变性，和/或将在例如动物中在更长时间内保持其活性。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在约pH 2至约pH 7的范围内具有活性。合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在约pH 4至约pH 7的范围内、更合适地在约pH 4.5至约pH 6.5的范围内具有活性。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在酸性pH下具有活性(合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶在酸性pH下可能具有最佳活性)。脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在小于约pH 6的pH下、更合适地在小于约pH 5的pH下具有活性。优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在约2.5至约pH 4.0之间的pH下、更合适地在约3.0至约3.3之间的pH下具有活性。在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在约2.5的pH下具有活性。
有利地，在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在动物的胃肠道上部(例如在喉咙、前胃或胃中)具有活化和/或可以与存在于动物的胃肠道中的内源性蛋白酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)组合消化肽和/或蛋白质底物。
许多当前的饲喂实践涉及在高pH(例如pH 8)下向动物给予有活性的碱性蛋白酶。因此，碱性蛋白酶仅在胃肠道变得更碱性(例如在小肠和大肠和盲肠的较后部分)的动物的胃肠道中较低(例如较后)处有活性。不希望受理论束缚，据信在胃肠道的较后部分产生寡肽增加利用寡肽的微生物群体，这些微生物群体进而可以导致肠道疾病挑战和/或可用于动物摄取的营养物减少。此外，在胃肠道较后(即较低)处，粘膜比在较上部份(例如，喉咙、前胃或胃)的保护性更差，因此更容易受损，导致炎症。有利地，在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的使用减轻了这个问题，因为它能够消化上消化道中的底物，从而不实质上增加微生物群体和/或增加可用于动物摄取的营养物(例如氨基酸/肽)的量和/或减少炎症。
与空肠和回肠相比，鸡肽转运蛋白PEPT1在十二指肠中表达最高(陈(Chen)等人(2009)动物科学杂志(J.Anim.Sci.)77:1277-1283，其教导内容通过引用结合在此)，因此诸位发明人已经确定在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以促进动物对肽的吸收，因为蛋白质和/或肽底物(例如存在于饲料和/或喂养料中)的消化将对动物在胃肠道中、在十二指肠中早期的吸收有用。这与在胃肠道中早期无活性的碱性蛋白酶形成对比。
在一个实施例中，至少一种内切蛋白酶可以与脯氨酸耐受性三肽基肽酶组合用于本文中的任何应用。至少一种内切蛋白酶还可以包含在本文所述的饲料添加剂组合物、喂养料、试剂盒或预混物中。
如本文所使用的，术语“内切蛋白酶”与术语“内切肽酶”同义，并且是指能够裂解肽或蛋白质底物的内部肽键(例如，不位于肽或蛋白质底物的C末端或N末端)的蛋白水解肽酶的一种酶。这样的内切蛋白酶可以被限定为倾向于在远离N末端或C末端起作用的内切蛋白酶。
在一个实施例中，内切蛋白酶可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和选自未分组蛋白酶家族的蛋白酶。
在一个实施例中，内切蛋白酶可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：酸性真菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠罗蛋白酶、热稳定的细菌中性金属内切肽酶、金属中性内切肽酶、碱性丝氨酸蛋白酶、真菌内切蛋白酶或来自商业蛋白酶产品 AFP、 FP2、 NP的组。
合适地，内切蛋白酶可以是酸性内切蛋白酶。
优选地，内切蛋白酶可以是酸性真菌蛋白酶。
有利地，使用内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合可以增加底物裂解的效率。不希望受理论束缚，据信内切蛋白酶能够在远离C末端或N末端的多个区域裂解肽和/或蛋白质底物，从而产生用于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的更多的N末端以用作底物，从而有利地增加反应效率和/或减少反应时间。
使用酸性内切蛋白酶和在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶是非常有利的，因为这两种酶可以协同消化在动物的上消化道(例如喉咙、前胃或胃)中的肽和/或蛋白质底物，并且可以与存在于动物中的其他内源性蛋白酶(例如胃蛋白酶)组合起作用。
根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以是“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
如本文所使用的，术语“饲料内(in-feed)”意指酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)在动物的胃肠道(GIT)中是起作用的、优选地是主要起作用的、更优选地是唯一起作用的。换句话说，如本文所使用的术语“饲料内”意指在将饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物饲喂给动物之前，酶在饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物中是实质上无活性的(或是无活性的)。
这里术语“主要起作用的”意指该酶一旦进入GIT，主要对其底物起作用。换句话说，在进入GIT之前，定义为肽和/或蛋白质底物裂解为三肽的量的酶活性水平是其进入GIT后(特别是在其进入动物的喉咙、前胃或胃之后)的酶活性水平的小于约20％、合适地小于约10％、优选地小于约5％。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶在十二指肠中和在十二指肠之前的动物胃肠道的部分(例如在消化过程中饲料较早遇到的GIT的部分)中是有活性的。
如本文所使用的，术语“唯一起作用的”意指该酶在进入GIT之前是无活性的，并且一旦进入GIT就被活化。
如本文所使用的，术语“无活性的”意指酶是没有活性的。这可能意味着酶的活性受某种因素抑制，或者酶处于使其为无活性的环境中，或者在向动物饲喂之前立即使酶出现在其底物中这样使得没有足够的时间来活化。一旦酶进入动物的GIT，其“无活性”状态在任何情况下都是可逆的。
因此，在将饲料添加剂组合物饲喂给动物之前，合适地将脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)立即与至少一种蛋白质或其部分混合。
如本文所使用的术语“实质上无活性的”意指与在酶已经进入GIT(例如在动物的喉咙、前胃或胃中)时的酶活性相比，酶具有低活性。例如，实质上无活性的可能意指当与酶在GIT中(特别是在动物的喉咙、前胃或胃中)的活性相比时，在饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或预混物中的酶具有其活性的小于10％。
在饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物中将“饲料内”的酶维持在无活性或实质上无活性的状态能以本领域技术人员已知的许多方式来实现。
举例来说，仅将饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物的含水量(wt％)维持在小于15％、优选小于10％就足以确保饲料内的酶在饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物中是无活性的或实质上无活性的。
在一个实施例中，饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物在混合饲料内的酶之后是(保持和/或储存)在干燥状态或实质上干燥状态。
如本文所使用的术语“干燥状态”意指饲料内的酶和/或饲料添加剂组合物不含水或只含非常少量的水。换句话说，如本文所使用的术语“干燥状态”可能意指饲料内的酶和/或饲料添加剂组合物包含小于5％、优选小于1％的含水量(wt％)。
在一个实施例中，用于本发明的方法和/或用途和/或产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以处于干燥或实质上干燥的状态。
在另一个实施例中，用于本发明的任何方法和/或用途和/或产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以与包含至少一种蛋白质或蛋白质的至少一部分的组合物混合，其中该组合物、该脯氨酸耐受性三肽基肽酶或其组合当混合时处于干燥或实质上干燥的状态。合适地，可以进一步混合内切蛋白酶。
当在本文中使用时，术语“干燥或实质上干燥的状态”意指组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合仅含有非常少量的水。换句话说，如本文所使用的术语“实质上干燥状态”可能意指组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合包含小于15％、优选小于10％的含水量(wt％)。
在一个实施例中，组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合在用于本发明的方法和/或用途之前、期间或之后(优选之前)可以是干燥的。
在另一个实施例中，组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合在用于本发明的方法和/或用途之前或之后包含小于15wt％水分含量。
在另一个实施例中，组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合在用于本发明的方法和/或用途之前或之后包含小于10wt％水分含量。合适地包含小于5wt％的水分含量，更合适地包含小于1wt％的水分含量。
在饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物中，通过在物理上防止酶与其底物相互作用，可以使脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合维持在无活性或实质上无活性的状态。例如，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合可以在其用于本发明的方法和/或用途、饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物之前胶囊化。
当在饲料添加剂组合物和/或喂养料和/或饲料和/或饲料成分和/或预混物中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合在物理上被防止与其底物相互作用时，那么一旦在GIT中物理屏障就被移除，从而允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合与其底物相互作用。
仅通过举例的方式，可以通过使胶囊化的脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合穿过动物的喉咙、前胃或胃来去除胶囊化。动物的喉咙、前胃或胃是处于非常低的(酸性)pH(例如pH 2-4)。可利用此酸度激活胶囊化的酶。
在一个实施例中，可用聚合物胶囊化酶，所述聚合物例如是甲壳素或壳聚糖、明胶、阿拉伯树胶或蜡。仅通过举例的方式，聚合物可以是如在薛(Xue)等人，食品与功能(Food Funct.)，2013年4月25日；2月6日(电子出版)；4(4)610-7中教导的明胶或阿拉伯树胶。可替代地，聚合物可以是如在张(Zhang)等人生物大分子(Biomacromolecules)2011，12,2894-2901中教导的基于壳聚糖的水凝胶。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“饲料内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合可以通过向动物饲喂酶来活化。
如本文所使用的，术语“无活性”可能意指在向动物饲喂之前即刻将酶呈递给其底物，这样使得酶进入动物的GIT之前没有足够的时间来活化。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶是发酵物的一部分。
如本文所使用的，术语“发酵物”是指在培养宿主细胞后(例如，在其结束时)存在的成分的混合物，该发酵物包括例如通过宿主细胞表达的三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)。发酵物可以包含根据本发明的三肽基肽酶，以及其他组分例如颗粒物质、固体、在培养期间未利用的底物、碎片、培养基、细胞废物等。在一个方面，将宿主细胞(特别是任何孢子)从发酵物中除去和/或灭活以提供无细胞的发酵物。
在其他实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶被分离或纯化。
本发明的酶，包括3PP和内切蛋白酶的组合，也在淀粉转化过程中有用，特别是在经历过液化的糊化的、未加工的和/或颗粒状淀粉的糖化和发酵过程中有用。所希望的最终产品(通常称为“最终发酵”或“EOF”产品)可以是能够通过淀粉底物的酶转化产生的任何产物。例如，所希望的产品可以是富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，该糖浆可以用于其他工艺(例如高果糖玉米糖浆(HFCS)的制备)，或可以被转化成许多其他有用的产品，例如抗坏血酸中间体(例如葡糖酸盐；2-酮-L-古洛糖酸；5-酮-葡糖酸盐；和2,5-二酮葡糖酸盐)；1,3-丙二醇；氨基酸(例如酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如乳酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、葡糖酸盐、衣康酸盐和草酰乙酸盐)；抗生素；抗菌剂；酶；维生素；激素；乙醇、丁醇和其他醇类；葡萄糖酸-δ-内酯；异抗坏血酸钠；ω-3脂肪酸；异戊二烯；以及其他生物化学药品和生物材料。本领域技术人员知道可以用于生产这些EOF产品的各种发酵条件。
本领域技术人员清楚地知道可以用于制备用于转化的淀粉底物的可获得的方法。可以从块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷类获得有用的淀粉底物。更具体地，可以从玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、树薯、木薯(tapioca)、高粱、水稻、碗豆、菜豆、香蕉或马铃薯中获得颗粒状淀粉。淀粉底物可以是来自研磨的全谷类的粗淀粉，其含有非淀粉级分，例如胚芽残余物和纤维。
液化通常涉及淀粉糊化，同时添加或随后添加α-淀粉酶，尽管可以任选地添加另外的液化诱导酶。在一些情况下，处于或低于糊化温度下进行淀粉的液化，典型地淀粉的液化需要具有不同性能标准的相似类别的酶。使用α-淀粉酶(任选地在其他酶的存在下)，可以将液化的淀粉糖化成具有较低聚合度(DP)的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的颗粒状淀粉的类型。
可以在液化和/或糖化期间将本发明的酶作为分离的酶溶液、干燥或颗粒状的酶、澄清的肉汤、超滤液浓缩物或全细胞肉汤(任选地作为共混物的一部分)来添加。本发明的酶也能以由表达这些酶的宿主细胞产生的培养细胞材料的形式添加。本发明的酶还可以在发酵或同时糖化和发酵(SSF)过程期间由宿主细胞分泌到反应介质中，这样使得酶连续地提供到反应中(参见下文)。生产和分泌本发明的酶的宿主细胞还可以表达另外的酶，例如葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。宿主细胞可以被工程化以表达广谱的各种糖解酶。
可以将通过用淀粉酶处理生产的可溶性淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可以使用葡萄糖异构酶(特别是固定在固体支持物上的葡萄糖异构酶)来实现该转化。
可溶性淀粉水解产物(特别是富含葡萄糖的糖浆)可以通过使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。产乙醇微生物包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。酵母的商业来源包括ETHANOL(乐斯福公司(LeSaffre))；(拉勒曼德公司(Lallemand))；RED(红星公司(Red Star))；(帝斯曼配料部(DSM Specialties))；和(阿尔泰克公司(Alltech))。产生其他EOF(例如上述那些)的微生物也是本领域已知的。如上所述，糖化和发酵过程可以作为SSF过程(其中发酵生物体表达本发明的酶)，任选地使用一种或多种另外的酶，例如葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶进行。发酵可以包括随后的EOF的富集、纯化和回收。
试剂盒
在一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及用于将其给予至动物的说明书。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
更合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从在位置P1处和在位置P1’处具有脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
合适地，该试剂盒可以进一步包含至少一种内切蛋白酶。
内切蛋白酶可以与脯氨酸耐受性三肽基肽酶单独分开，或者两种酶可以混合。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶能以本文所述或本领域技术人员已知的任何方式配制。
合适地，当试剂盒包含与至少一种内切蛋白酶组合的脯氨酸耐受性三肽基肽酶时，该说明书可以是用于共同给予其的说明书。
如本文所使用的，术语“共同给予”意指单独(例如顺序地)或一起(例如同时)给予一种或多种成分和/或酶。
活性和测定
用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性。
如本文所使用的，术语“外切肽酶”活性意指脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从底物(例如蛋白质和/或肽底物)的N末端裂解三肽。
如本文所使用的，术语“主要具有外切肽酶活性”意指三肽基肽酶没有或实质上没有内切蛋白酶活性。
“实质上没有内切蛋白酶活性”意指当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约100U内切蛋白酶活性。合适地，“实质上没有内切蛋白酶活性”意指当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)””中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约100U内切蛋白酶活性。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切肽酶当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约10U内切蛋白酶活性，更优选地，当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约1U内切蛋白酶活性。甚至更优选地，当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或外切三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中可以具有少于约0.1U内切蛋白酶活性。
“内切蛋白酶测定”
用于内切蛋白酶活性的偶氮酪蛋白测定
使用了由艾弗森(Iversen)和约根森1995(生物技术技巧(Biotechnology Techniques)9，573-576)描述的内切蛋白酶测定的改良版本。将50μl的酶样品添加到的4倍稀释的麦基尔文(McIlvaine)缓冲液(pH5)中的250μl的偶氮酪蛋白(0.25％w/v；来自西格玛公司(Sigma))中，并且在40℃下在振摇(800rpm)下孵育15min。通过添加50μl的2M三氯乙酸(TCA)(来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，丹麦)并以20,000g离心5min来终止反应。向195μl上清液样品中添加65μl的1M NaOH，并且测量在450nm处的吸光度。将内切蛋白酶活性的一个单位定义为在40℃下在450nm处在15min内产生0.1的吸光度增加的量。
“外切肽酶测定”
测定有两个部分：
第1部分-“外切肽酶广泛特异性测定”(EBSA)
将10μL的发色肽溶液(溶解于二甲亚砜(DMSO)中的10mM H-Ala-Ala-Ala-pNA；MW＝387.82；巴赫姆公司(Bachem)，瑞士)添加到在微量滴定板中的130μl乙酸钠(20mM，用乙酸调节至pH 4.0)中，并且在40℃下加热5分钟。添加10μL的适当稀释的酶，并且在405nm处在MTP读数器(Versa max，分子装置公司(Molecular Devices)，丹麦)中测量吸收。将一开特的蛋白水解活性定义为每秒释放1摩尔对硝基苯胺所需的酶的量。
第2部分(i)-P1脯氨酸测定
(a)将底物H-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val(MW＝897.12；来自谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根)以1mg/ml浓度溶解于10倍稀释的麦基尔文缓冲液(pH＝4.5)中。
(b)在40℃下将1000μl的底物溶液与10μg的脯氨酸耐受性三肽基肽酶溶液一起孵育。
(c)在7个时间点(0、30、60、120、720和900min)取100μl样品，用50μl 5％TFA稀释，加热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析；
(d)使用衔接到LTQ轨道阱(Orbitrap)经典混合质谱仪(赛默科技公司(ThermoScientific)，德国不来梅港市)的安捷伦(Agilent)1100系列毛细管HPLC系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉市(Santa Clara，CA))进行LC-MC/MS分析；
(e)将样品加载到50mm FortisTMC18柱(内径为2.1mm，并且实际尺寸为1.7μm)
(f)使用2％-28％溶剂B(H2O/CH3CN/HCOOH(50/950/0.65v/v/v))的14min梯度，以200μL/min的流速进行分离至IonMAX源-LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行；
(g)通过轨道阱测量肽质量(在m/z 400下以60.000的分辨率获得MS扫描)，并且选择多达2个最强的肽m/z，并且在线性离子阱(LTQ)中使用CID进行片段化。启用动态排除，列表大小为500质量，持续时间为40s，相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm；
(h)使用开源程序Skyline 1.4.0.4421(获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss Lab Software,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th Ave NESeattle,Washington,US)来访问RAW文件并提取MS1强度以构建色谱图。将前体同位素输入过滤器设置为3个计数(M、M+1和M+2)，分辨率为60,000，并且使用最强电荷状态；
(i)将底物和裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品(0、30、60、120、720和900min水解)中计算强度。
(j)将一个活性单位定义为在本测定中将在720min内水解50％的底物同时释放Arg-Gly-Pro的酶的量。
第2部分(ii)-P1’脯氨酸测定
(a)将肽H-Ala-Ala-Phe-Pro-Ala-NH2(MW＝474.5；来自谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根)以0.1mg/ml浓度溶解于10倍稀释的麦基尔文缓冲液(pH＝4.5)中。
(b)在40℃下将1000μl的底物溶液与10μg的脯氨酸耐受性三肽基肽酶溶液一起孵育。
(c)在7个时间点(0、30、60、120、720和900min)取100μl样品，用50μl 5％TFA稀释，加热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析；
(d)使用衔接到LTQ轨道阱(Orbitrap)经典混合质谱仪(赛默科技公司(ThermoScientific)，德国不来梅港市)的安捷伦(Agilent)1100系列毛细管HPLC系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉市(Santa Clara，CA))进行LC-MC/MS分析；
(e)将样品加载到50mm FortisTM C18柱(内径为2.1mm，并且实际尺寸为1.7μm)
(f)使用2％-28％溶剂B(H2O/CH3CN/HCOOH(50/950/0.65v/v/v))的14min梯度，以200μL/min的流速进行分离至IonMAX源-LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行；
(g)通过轨道阱测量肽质量(在m/z 400下以60.000的分辨率获得MS扫描)，并且选择多达2个最强的肽m/z，并且在线性离子阱(LTQ)中使用CID进行片段化。启用动态排除，列表大小为500质量，持续时间为40s，相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm；
(h)使用开源程序Skyline 1.4.0.4421(获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss Lab Software,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th Ave NESeattle,Washington,US)来访问RAW文件并提取MS1强度以构建色谱图。将前体同位素输入过滤器设置为3个计数(M、M+1和M+2)，分辨率为60,000，并且使用最强电荷状态；
(i)将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
(j)将一个活性单位定义为在本测定中将在720min内水解50％的底物同时释放Ala-Ala-Phe的酶的量。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有至少50nkat的活性/mg蛋白质并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有至少100U活性/mg蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有约50-2000nkat之间的活性/mg蛋白质并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有约1-500单位活性/mg蛋白质。注意，在实例2中描述了蛋白质测量。
“P1和P1’脯氨酸活性测定”
合适地，用于本发明中的三肽基肽酶可能能够裂解在位置P1和P1’处具有脯氨酸的底物。这可以使用下面教导的测定来进行评估。
在该测定中，通过LC-MS和无标记定量检查三肽基肽酶水解合成的底物AAPPA的能力。
(a)将肽H-AAPPA-NH2(MW＝424.3，谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根)溶解于20mM MES缓冲液(pH＝4.0(1mg/ml))中；
(b)在室温下，将1000μl的H-AAPPA-NH2溶液与200μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶溶液(40ug/ml)(底物/酶100:0.8)一起孵育；
(c)在7个时间点(0、5、15、60、180、720和1440min)取100μl样品，用50μl 5％TFA稀释，加热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析；
(d)使用衔接到LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司(Thermo Scientific)，德国不来梅港市)的Easy LC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞市)进行纳米LC-MS/MS分析；
(e)使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μmo.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μmo.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))；
(f)使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离至纳米电喷雾离子源(赛默科技公司(ThermoScientific)，丹麦欧登塞)-以数据依赖的MS/MS模式操作LTQ轨道阱经典仪器；
(g)通过轨道阱测量肽质量(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)，并且选择多达2个最强的肽m/z，并且在线性离子阱(LTQ)中使用CID进行片段化。启用动态排除，列表大小为500质量，持续时间为40s，相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm；
(h)使用开源程序Skyline 1.4.0.4421(获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss Lab Software,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th Ave NESeattle,Washington,US))来访问RAW文件，该程序可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素输入过滤器设置为3个计数(M、M+1和M+2)，分辨率为60,000，并且使用最强电荷状态；
(i)将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
(j)将一个活性单位定义为在本测定中将在24h内水解50％的底物同时释放AAP的酶的量。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有至少50nkat的活性/mg蛋白质并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有至少100U活性/mg蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有约50-2000nkat之间的活性/mg蛋白质(如在实例2中计算蛋白质浓度)并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有约1-500单位活性/mg蛋白质(如在实例2中计算蛋白质浓度)。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中可以具有至少10U活性/mg蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中具有约1U-500U活性之间的活性/mg蛋白质。
除了上述之外，脯氨酸耐受性三肽基肽酶还可以具有根据上面教导的“外切肽酶活性测定”的第1部分的活性。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中可以具有至少10U的活性/mg蛋白质，并且在本文教导的“外切肽酶活性测定”的第1部分中可以具有至少50nkatal/mg蛋白质。
在另一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中具有约1U-500U活性之间的活性/mg蛋白质，并且在本文教导的“外切肽酶活性测定”的第1部分中具有约50U-2000U开特之间的活性/mg蛋白质。
氨基酸和核苷酸序列
根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自任何来源，只要其具有本文所述的活性即可。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自木霉属(Trichoderma)。
合适地来自里氏木霉(Trichoderma reesei)，更合适地来自里氏木霉QM6A。
合适地来自绿木霉(Trichoderma virens)，更合适地来自绿木霉Gv29-8。
合适地来自深绿木霉(Trichoderma atroviride)。更合适地，来自深绿木霉IMI206040。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自曲霉属(Aspergillus)。
合适地来自烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)，更合适地来自烟曲霉菌CAE17675。
合适地来自川地曲霉(Aspergillus kawachii)，更合适地来自川地曲霉IFO4308。
合适地来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，更合适地来自构巢曲霉FGSC A4。
合适地来自米曲霉(Aspergillus oryzae)，更合适地来自米曲霉RIB40。
合适地来自赤曲霉(Aspergillus ruber)，更合适地来自赤曲霉CBS135680。
合适地来自土曲霉(Aspergillus terreus)，更合适地来自土曲霉NIH2624。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自离蠕孢属(Bipolaris)，合适地来自玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)，更合适地来自玉米小斑病菌C5。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自Togninia，合适地来自Togninia minima，更合适地Togninia minima UCRPA7。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自篮状菌属(Talaromyces)，合适地来自柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)，更合适地来自柄篮状菌ATCC 10500。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自节皮菌属(Arthroderma)，合适地来自苯黑末节皮真菌(Arthroderma benhamiae)，更合适地苯黑末节皮真菌CBS 112371。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自稻瘟菌属(Magnaporthe)，合适地来自稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)，更合适地稻瘟病菌70-1。
在另一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自镰刀菌属(Fusarium)。
合适地来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，更合适地来自尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种。
合适地来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，更合适地来自禾谷镰刀菌PH-1。
在进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能可获得(例如获得)自暗球腔菌属(Phaeosphaeria)，合适地来自小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)，更合适地来自小麦颖枯病菌SN15。
在又进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能可获得(例如获得)自伞菌属(Agaricus)，合适地来自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，更合适地来自双孢蘑菇burnettii变种JB137-S8。
在又进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自支顶孢属(Acremonium)，合适地来自支顶孢菌(Acremonium alcalophilum)。
在又进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自Sodiomyces，合适地来自Sodiomyces alkalinus。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自青霉属(Penicillium)。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自指状青霉(Penicillium digitatum)，更合适地来自指状青霉Pd1。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自草酸青霉(Penicillium oxalicum)，更合适地来自草酸青霉114-2。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自娄地青霉(Penicilliumroqueforti)，更合适地来自娄地青霉FM164。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自鲁本斯青霉(Penicillium rubens)，更合适地来自鲁本斯青霉威斯康星(Penicillium rubens Wisconsin)54-1255。
在另一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自新萨托菌属(Neosartorya)。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)，更合适地获得自费希新萨托菌NRRL181。
在一个实施例中，根据本发明使用的三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)不可获得(例如获得)自黑曲霉(Aspergillus niger)。
至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99或其功能片段；
(b)包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段；
(c)由包含序列SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码；
(d)由与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.96或SEQ ID No.97具有至少约70％序列同一性的核苷酸序列编码；
(e)由在中等严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码；或者
(f)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ IDNo.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ IDNo.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以表达为进一步经历转录后和/或翻译后修饰的多肽序列。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.98或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.98具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.98或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.98具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以是已经经历转录后和/或翻译后修饰(例如翻译后裂解)的“成熟”脯氨酸耐受性三肽基肽酶。合适地，这样的修饰可能导致酶的活化。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.99或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
在又进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.99或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
术语“功能片段”是保留其肽酶酶活性的氨基酸序列的一部分。因此，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的功能片段是主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的一部分，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；和/或
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。可替代地或另外地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的功能片段是主要具有外切肽酶活性并且能够从在P1和P1’处具有脯氨酸的肽的N末端裂解三肽的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的一部分。
“部分”是仍然具有如上述所定义的活性的任何部分；合适地一部分可以是具有50个，更合适地至少100个氨基酸的长度。在其他实施例中，该部分可以为约150个或约200个氨基酸的长度。
在一个实施例中，功能片段可以是转录后和/或翻译后修饰(例如裂解)后的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的部分。合适地，功能片段可以包含如以下各项所示的序列：SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55或SEQ ID No.98。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.1的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.1具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.2的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.2具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.3的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.4的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.4具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.5的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.5具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.6的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.6具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.7的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.7具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.8的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.8具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.9的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.9具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.10的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.10具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.11的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.11具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.12的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.12具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.13的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.13具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.14的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.14具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.15的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.15具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.16的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.16具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.17的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.17具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.18的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.18具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.19的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.19具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.20的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.20具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.21的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.21具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.22的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.22具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.23的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.23具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.24的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.24具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.25的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.25具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.26的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.26具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.27的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.27具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.28的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.28具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.29的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.30的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.30具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.31的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.31具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.32的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.32具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.33的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.33具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.34的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.34具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.35的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.35具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.36的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.36具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.37的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.37具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.38的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.38具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.39的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.39具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.40的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.40具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.41的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.41具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.42的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.42具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.43的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.43具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.44的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.44具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.45的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.45具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.46的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.46具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.47的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.47具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.48的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.48具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.49的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.49具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.50的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.50具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.51的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.51具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.52的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.52具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.53的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.53具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.54的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.54具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.55的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.55具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.98的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.98具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.99的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少80％同一性的氨基酸或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少85％同一性的氨基酸或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少90％同一性的氨基酸或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少95％同一性的氨基酸或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少97％同一性的氨基酸或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少99％同一性的氨基酸或其功能片段。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组中的一个或多个的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98和SEQ ID No.99。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组中的一个或多个的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.98、和SEQ ID No.99，或与其具有至少70％同一性的序列，合适地与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
在一些实施例中，可能合适的是脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30和SEQ IDNo.31，或与其具有至少70％同一性的序列，合适地与其具有至少80％或与其具有90％同一性的序列。
在一些实施例中，可能合适的是脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.98和SEQ ID No.99，或与其具有至少70％同一性的序列，合适地与其具有至少80％或与其具有90％同一性的序列。
有利地，这些特定的氨基酸序列可能特别适合于裂解富含赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的肽和/或蛋白质底物。特别是在P1位置存在赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的情况。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组中的一个或多个的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.29、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33和SEQ ID No.34，或与其具有至少70％同一性的序列，合适地与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以具有序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQID No.29。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自下组的序列基序，该组由以下各项组成：xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含xEANLD。
x可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：G、T、S和V。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含y’Tzx’G。
y’可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：I、L和V。
z可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：S和T。
x’可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：I和V。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序QNFSV。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序xEANLD和y’Tzx’G或xEANLD和QNFSV。
在又进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序y’Tzx’G和QNFSV。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV。
一个或多个基序存在于用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶中。图17显示了这些基序的位置。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由如SEQ ID No.56、SEQ IDNo.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ IDNo.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ IDNo.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ IDNo.96、SEQ ID No.97所示的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列，合适地与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列编码。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQID No.97具有至少95％序列同一性，更优选地与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQID No.97具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由在中等严格条件下与SEQ IDNo.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ IDNo.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ IDNo.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ IDNo.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ IDNo.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码。合适地，在高严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ IDNo.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ IDNo.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
在一个实施例中，包含如SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97所示出的核苷酸序列的核苷酸序列可以是DNA、cDNA、合成的DNA和/或RNA序列。
优选地该序列是DNA序列，更优选地是编码本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的cDNA序列。
在一个方面，优选地，用于本发明的氨基酸和/或核苷酸序列是处于分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少实质上不含与该序列在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。用于本发明的氨基酸和/或核苷酸序列能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可能实质上不含一种或多种潜在污染的多肽和/或核酸分子。
在一个方面，优选地，用于本发明的氨基酸和/或核苷酸序列是处于纯化的形式。术语“纯化的”意指给定的组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。
酶
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.1、其功能片段、或与SEQID No.1具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.1具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.2、其功能片段、或与SEQID No.2具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.2具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.3、其功能片段、或与SEQID No.3具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.3具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.4、其功能片段、或与SEQID No.4具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.4具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.5、其功能片段、或与SEQID No.5具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.5具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.6、其功能片段、或与SEQID No.6具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.6具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.7、其功能片段、或与SEQID No.7具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.7具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.8、其功能片段、或与SEQID No.8具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.8具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.9、其功能片段、或与SEQID No.9具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ ID No.9具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.10、其功能片段、或与SEQ ID No.10具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.10具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.11、其功能片段、或与SEQ ID No.11具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.11具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.12、其功能片段、或与SEQ ID No.12具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.12具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.13、其功能片段、或与SEQ ID No.13具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.13具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.14、其功能片段、或与SEQ ID No.14具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.14具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.15、其功能片段、或与SEQ ID No.15具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.15具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.16、其功能片段、或与SEQ ID No.16具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.16具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.17、其功能片段、或与SEQ ID No.17具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.17具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.18、其功能片段、或与SEQ ID No.18具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.18具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.19、其功能片段、或与SEQ ID No.19具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.19具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.20、其功能片段、或与SEQ ID No.20具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.20具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.21、其功能片段、或与SEQ ID No.21具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.21具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.22、其功能片段、或与SEQ ID No.22具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.22具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.23、其功能片段、或与SEQ ID No.23具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.23具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.24、其功能片段、或与SEQ ID No.24具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.24具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.25、其功能片段、或与SEQ ID No.25具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.25具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.26、其功能片段、或与SEQ ID No.26具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.26具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.27、其功能片段、或与SEQ ID No.27具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.27具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.28、其功能片段、或与SEQ ID No.28具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.28具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.29、其功能片段、或与SEQ ID No.29具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.29具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.30、其功能片段、或与SEQ ID No.30具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.30具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.31、其功能片段、或与SEQ ID No.31具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.31具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.32、其功能片段、或与SEQ ID No.32具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.32具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.33、其功能片段、或与SEQ ID No.33具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.33具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.34、其功能片段、或与SEQ ID No.34具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.34具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.35、其功能片段、或与SEQ ID No.35具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.35具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.36、其功能片段、或与SEQ ID No.36具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.36具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.37、其功能片段、或与SEQ ID No.37具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.37具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.38、其功能片段、或与SEQ ID No.38具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.38具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.39、其功能片段、或与SEQ ID No.39具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.39具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.40、其功能片段、或与SEQ ID No.40具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.40具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.41、其功能片段、或与SEQ ID No.41具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.41具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.42、其功能片段、或与SEQ ID No.42具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.42具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.43、其功能片段、或与SEQ ID No.43具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.43具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.44、其功能片段、或与SEQ ID No.44具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.44具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.45、其功能片段、或与SEQ ID No.45具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.45具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.46、其功能片段、或与SEQ ID No.46具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.46具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.47、其功能片段、或与SEQ ID No.47具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.47具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.48、其功能片段、或与SEQ ID No.48具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.48具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.49、其功能片段、或与SEQ ID No.49具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.49具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.50、其功能片段、或与SEQ ID No.50具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.50具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.51、其功能片段、或与SEQ ID No.51具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.51具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.52、其功能片段、或与SEQ ID No.52具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.52具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.53、其功能片段、或与SEQ ID No.53具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.53具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.54、其功能片段、或与SEQ ID No.54具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.54具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.55、其功能片段、或与SEQ ID No.55具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.55具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.98、其功能片段、或与SEQ ID No.98具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.98具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.99、其功能片段、或与SEQ ID No.99具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地，该酶可以与SEQ IDNo.99具有至少80％，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、合适地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.56所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.57所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.58所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.59所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.60所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.61所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.62所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.63所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.64所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.65所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.66所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.67所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.68所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.69所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.70所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.71所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.72所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.73所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.74所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.75所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.76所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.77所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.78所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.79所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.80所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.81所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.82所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.83所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.84所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.85所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.86所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.87所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.88所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.89所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.90所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.91所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.92所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.93所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.94所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.95所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.96所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.97所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地与其具有至少80％的同一性，合适地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、优选地至少97％、优选地至少99％的同一性。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所定义的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。
如本文所使用的，术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在一个优选的实施例中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括当处于其天然环境中时或当其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为了易于指代，我们称该优选的实施例为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且当可操作地连接至其天然与之结合的整个启动子(该启动子也处于其天然环境中)时的整个核苷酸序列。然而，可以在核苷酸序列在其天然生物体中表达之后分离和/或纯化由本发明的范围所涵盖的氨基酸序列。优选地，然而，可以由在其天然生物体中的核苷酸序列表达本发明的范围所涵盖的氨基酸序列，但其中该核苷酸序列不在该生物体中与其天然结合的启动子的控制之下。
典型地，使用重组DNA技术(即重组DNA)制备由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列。然而，在本发明的替代性实施例中，可以使用本领域所熟知的化学方法整体或部分地合成该核苷酸序列(参见卡拉瑟斯(Caruthers MH)等人，(1980)核酸研究研讨会系列(NucAcids Res Symp Ser)，215-23；以及霍恩(Horn T)等人，(1980)核酸研究研讨会系列，225-232)。
核苷酸序列的制备
编码具有如本文所定义的特定性质的蛋白质或适合于修饰的蛋白质的核苷酸序列可以从生产所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是领域内所熟知的。举例来说，一旦已鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列就可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。
进一步举例来说，可以使用来自生产酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别编码酶的克隆。可替代地，可将含有与另一个已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
可替代地，编码酶的克隆可以通过这样来鉴定：将基因组DNA的片段插入表达载体(例如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂板于含有酶的底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而允许表达该酶的克隆能被鉴定出。
在又进一步的替代方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已建立的标准方法(例如，由Beucage S.L.等人(1981)四面体快报(Tetrahedron Letters)22，p 1859-1869或马瑟斯(Matthes)等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3，p 801-805描述的亚磷酰胺方法)合成制备。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。也可以使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如在US 4,683,202或在佐伯(Saiki R K)等人(科学(Science)(1988)239，pp 487-491中所描述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有如本文所定义的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或者其可以通过合成制得或者其可以通过利用重组DNA技术制备。
在本发明中涵盖的蛋白质可以与其他蛋白质(特别是酶)一起使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白质/酶和另一种蛋白质/酶(其可以是根据本发明的另一种蛋白质/酶)。这个方面在后面部分讨论。
优选地，当与本发明的范围本身有关或当由本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
分离的
在一个方面，优选地，根据本发明的氨基酸序列或核酸或酶是处于分离的形式。术语“分离的”意指序列或酶或核酸至少实质上不含与该序列、酶或核酸在自然界中天然结合或在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的序列、酶或核酸能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。
纯化的
在一个方面，优选地，根据本发明的序列、酶或核酸是处于纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约80％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。合适地，其可能以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所定义的特定性质的多肽的一个或多个氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这样的多肽的任何核苷酸序列(下文称为“一个或多个同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在本发明上下文中，同源序列意在包括与主题序列可以具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的氨基酸或核苷酸序列。典型地，同源物将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
在一个实施例中，同源序列意在包括与主题序列相比具有一个或若干个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。
在一个实施例中，本发明涉及其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。
合适地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上、优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上确定。
在一个实施例中，本发明涉及一种核酸序列(或基因)，该核酸序列(或基因)编码其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或编码通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。
在本发明上下文中，同源序列意在包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
同源性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。
可以在连续序列上计算％同源性，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(affinegap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。当然，高的空位罚分将会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。
因此，最大％同源性或％同一性的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这样的比对的合适的计算机程序是Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于：例如，BLAST程序包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，简明分子生物学试验方案(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)1999，174(2):247-50；FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)1999，177(1):187-8；以及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(阿特休尔(Altschul)等人，1990，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)403-410)以及AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，第7-58页至7-60页)，例如像在基因组查询(GenomeQuest)搜索工具(www.genomequest.com)中。
尽管最终的％同源性可以按照同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarityscore matrix)，其基于化学相似性或进化距离对各个成对比较赋予分数。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用Vector NTI程序包的默认值。
可替代地，基于类似于CLUSTAL的一种算法，可以使用Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多重比对功能计算同源性百分比(希金斯(Higgins DG)和夏普(Sharp PM)(1988)，基因(Gene)73(1)，237-244)。
一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选地％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分软件进行此计算，并且生成数值结果。
当确定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地使用如下参数用于成对比对：
对于BLAST
空位开始 9
空位延伸 2
对于CLUSTAL DNA 蛋白质
重量矩阵 IUB Gonnet 250
空位开始 15 10
空位延伸 6.66 0.1
在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上、优选在至少30个连续核苷酸上、优选在至少40个连续核苷酸上、优选在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上确定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上、优选在至少200个连续核苷酸上、优选在至少300个连续核苷酸上、优选在至少400个连续核苷酸上、优选在至少500个连续核苷酸上、优选在至少600个连续核苷酸上、优选在至少700个连续核苷酸上、优选在至少800个连续核苷酸上确定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可以在整个序列上确定。
合适地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上确定。
合适地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在本文教导的整个序列上确定。
在本发明的上下文中，术语“查询序列”意指与主题序列比对以便看看其是否属于本发明的范围内的同源序列或外源序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。
在一个优选的实施例中，序列通过全局比对程序进行比对，并且通过将由程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
在一个实施例中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认打分矩阵和默认空位罚分，将该两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以主题序列的长度。
在又进一步的优选实施例中，全局比对程序选自下组，该组由以下各项组成：CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，并且通过程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
序列还可以具有产生沉默改变和导致功能上等价的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要保留物质的二级结合活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有类似亲水性值的含不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如根据下表，可以进行保守取代。第二列相同框中的氨基酸，优选第三列相同行的氨基酸可以彼此取代。
本发明还涵盖可能出现的同源取代(取代和替换两者在本文中用于意指现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可能发生非同源取代，即从一类残基至另一类氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。
替换也可以通过合成氨基酸(如非天然氨基酸)进行，包括；α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Br-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-戊氨酸*、缬氨酸，对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(苄基)*。出于上面论述的目的(与同源性或非同源性取代相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(例如甘氨酸或β-丙氨酸残基)之外的烷基基团，例如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基团在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如西蒙·RJ(Simon RJ)等人，美国国家科学院院刊(PNAS)(1992)89(20),9367-9371以及奥尔韦尔·DC(Horwell DC)，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)(1995)13(4),132-134。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列。
不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且此类同源物及其片段通常将能够选择性杂交至本文序列表中所示的序列。此类序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格条件下用包含于随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针来探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG威斯康星PileUp程序是广泛使用的。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格条件低的严格条件下使用。
可替代地，此类多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是希望的以便引入限制性酶识别位点，或以便改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、替代性的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealing label)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。此类引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
一般地，引物可以通过合成方法制备，包括一次一个核苷酸地逐步制备希望的核酸序列。利用自动化技术完成该工艺的技术是本领域轻易获得的。
较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。
如本文所使用的，术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在中严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。
也包括在本发明范围内的是能够在中等到最大严格条件下与本文提供的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明涵盖在中等严格条件下(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})可与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在更优选的方面，本发明涵盖在高严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})可与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
优选地，杂交在本文教导的整个序列上进行分析。
分子进化
作为非限制性实例，可以在体内或体外产生许多位点定向或随机突变到核苷酸序列中，并随后通过各种方式筛选编码多肽的改善的功能。
此外，多核苷酸序列的突变或天然变体可以与野生型或其他突变或天然变体重组以产生新的变体。也可以筛选此类新变体以改善编码的多肽的功能。新的优选变体的生产可以通过本领域已建立好的各种方法来实现，例如错误阈值诱变(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)、DNA改组(US 5,605,793)、外显子介导的基因组装WO 00/58517。这些和类似的随机定向分子进化方法的应用允许鉴定和选择具有优选特征的本发明的酶的变体，而没有蛋白质结构或功能的任何先验知识，并且允许产生不可预测但有益的突变或变体。在本领域中有许多用于优化或改变酶活性的分子进化的应用的实例，这样的实例包括但不限于以下的一个或多个：在宿主细胞中或体外优化的表达和/或活性、增加的酶活性、改变的底物和/或产物特异性、增加或降低的酶或结构稳定性、在优选的环境条件下(例如温度、pH、底物)改变的酶活性/特异性。
定点诱变
一旦已经分离出编码蛋白质的核苷酸序列，或者已经鉴定了推定的编码蛋白质的核苷酸序列，就可能希望突变该序列以制备本发明的蛋白质。
可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包括侧接希望突变的位点的核苷酸序列。
森永(Morinaga)等人(生物技术(Biotechnology)(1984)2，p 646-649)中披露了一种合适的方法。在纳尔逊(Nelson)和朗(Long)(分析生物化学(AnalyticalBiochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了将突变引入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
重组
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列-即使用重组DNA技术已经制备的序列。
这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术解释在文献中，例如，萨姆布鲁克(J.Sambrook)、弗里奇(E.F.Fritsch)、马尼亚蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中。
合成
在一个方面，用于本发明的序列是合成序列-即通过体外化学或酶促合成已经制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体的最佳密码子使用产生的序列，例如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母。
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。
可用控制序列(例如调控序列)控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以由载体编码。换句话说，载体可以包含编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的核苷酸序列。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖基因组中的稳定掺入。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列可操作地连接至调控序列，该调控序列能够在由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列中发挥作用。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。可替代地，该选择可通过共转化来完成(如WO 91/17243中所描述的)。
载体可在体外用于例如产生RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在进一步的实施例中，本发明提供通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体内，将该载体引入相容的宿主细胞内，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。此类序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
密码子优化
编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以在特定宿主生物体中表达。
编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在原核或真核细胞中表达。合适地，编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在真菌宿主生物体(例如木霉，优选里氏木霉)中表达。
密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如至少约多于1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、60个、70个、80个或100个密码子)同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的过程。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏好性。密码子偏好性(生物体之间密码子使用的差异)常常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可获得性。细胞中选择的tRNA的优势度通常是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。
因此，基因可以被定制为基于密码子优化在给定生物体中的最佳基因表达。因此，经过这种定制的核苷酸序列和/载体可以被称为“密码子优化的”核苷酸序列和/或载体。
密码子使用表可以容易地获得，例如在密码子使用数据库(“Codon UsageDatabase”)中，并且这些表可以不同的方式调整适用。参见，纳卡穆拉(Nakamura,Y.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态(Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for the year 2000)”核酸研究(Nucl.Acids Res.)28:292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，例如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯)。在一些实施例中，在用于本发明的编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的序列中的一个或多个密码子(例如1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在一个实施例中，编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的核苷酸序列可以是已经密码子优化用于在里氏木霉中表达的核苷酸序列。
在一个实施例中，密码子优化的序列可以包含如SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ IDNo.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.97所示的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列。合适地是与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
优选地，密码子优化的序列可以包含与SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95具有至少95％序列同一性，更优选与SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95或SEQ ID No.97具有至少99％同一性的核苷酸序列。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由在中等严格条件下与SEQ IDNo.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ IDNo.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ IDNo.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码。合适地，是在高严格条件下与SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ IDNo.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ IDNo.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
还提供了包含一个或多个选自下组的序列的载体(例如质粒)，该组由以下各项组成：SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ IDNo.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ IDNo.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作地连接至调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举例来说，本发明涵盖包含可操作地连接至这样的一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语可操作地连接的指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。调控序列“可操作地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌引导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列可操作地连接至至少一个启动子。
其他启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的示例是本领域所熟知的。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”-其与术语例如“结合物”、“盒”和“杂交体”同义-包括直接或间接附接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接附接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
构建体可甚至含有或表达标记，该标记允许该遗传构建体的选择。
对于某些应用，优选的是，本发明的构建体至少包含可操作地连接至启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括含有该核苷酸序列或表达载体并用于重组产生具有本文所定义的特定性质的蛋白质的任何细胞。
因而，本发明的另一个实施例提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可以对细胞进行选择以便和所述载体相容，这些细胞可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌物种。
取决于编码本发明多肽的核苷酸序列的性质和/或进一步加工表达的蛋白质的需要，可以优选真核宿主例如酵母或其他真菌。一般地，酵母比真菌细胞更为优选，这是因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质从酵母分泌不佳，或在某些情况下不能适当地加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应当选择不同的真菌宿主微生物。
合适宿主细胞-例如酵母、真菌和植物宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。
宿主细胞可能是蛋白酶缺陷或蛋白酶不足的菌株。上述可以是例如蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL 125，该米曲霉JaL 125具有缺失的称作“alp”的碱性蛋白酶基因。该菌株描述于WO 97/35956中。
合适地，该宿主细胞可以是木霉属宿主细胞，优选是里氏木霉宿主细胞。在其他实施例中，宿主细胞可以是属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、嗜热真菌属、支顶孢属、曲霉属、青霉属、毛霉属、脉孢菌属、腐质霉属等属的任何成员。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许当存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和芽孢杆菌属物种，包括枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
在原核宿主的转化的教导在本领域中是有据可查的，例如参见萨姆布鲁克(Sambrook)等人(分子克隆：实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞-例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉属作为宿主微生物描述在EP0 238 023中。
另一种宿主生物可以是植物。用于转化植物的通用技术的综述可以在波特里库斯(Potrykus)(植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol)[1991]42:205-225)和克里斯托(Christou)(农业食品工业高科技(Agro-Food-Industry Hi-Tech)1994年3月/4月，17-27)的文章中找到。关于植物转化的进一步的教导可以在EP-A-0449375中找到。
关于真菌、酵母和植物的转化的通用教导在以下部分中提供。
转化的真菌
宿主生物体可以是真菌例如霉菌。适合的这样的宿主的实例包括属于嗜热真菌属、支顶孢属、曲霉属、青霉属、毛霉属、脉孢菌属、木霉属等属的任何成员。
在一个实施例中，宿主生物体可以是丝状真菌。
在US-A-5741665中讨论了转化丝状真菌，其中说明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域熟知的。发现适用于粗糙脉孢菌(N.crassa)的技术的广泛综述，例如在戴维斯(Davies)和塞瑞斯(de Serres)，酶学方法(Methods Enzymol)(1971)17A:79-143中。
也可用于转化丝状真菌的进一步的教导在US-A-5674707中进行了综述。
此外，丝状真菌中的基因表达在蓬特(Punt)等人(2002)生物技术趋势(TrendsBiotechnol)2002年5月；20(5):200-6，阿彻(Archer)和皮博迪(Peberdy)生物技术关键评论(Crit Rev Biotechnol)(1997)17(4):273-306中教导。
本发明涵盖使用这些标准技术制备的根据本发明的转基因的丝状真菌的生产。
合适地，该宿主生物体可以是木霉属宿主生物体，优选是里氏木霉宿主生物体。
在另一个实施例中，宿主生物体可以属于曲霉属，例如黑曲霉(Aspergillusniger)。
根据本发明的转基因的曲霉菌也可以通过以下例如特纳(Turner G.)1994(用于遗传操作的载体(Vectors for genetic manipulation)，在：马蒂内利(Martinelli)，S.D.，金霍恩(Kinghorn J.R.)(编辑)曲霉属：在工业微生物学中的进展的50年(Aspergillus:50years on.Progress in industrial microbiology)，第29卷，阿姆斯特丹爱思唯尔(Elsevier Amsterdam)1994.pp.641-666)的教导来制备。
转化的酵母
在另一个实施例中，转基因的生物体可以是酵母。
在例如分子生物学方法(Methods Mol Biol)(1995)，49:341-54和生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)(1997)10月；8(5):554-60中提供了酵母中异源基因表达的原理的综述。
在这方面，酵母-例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS微生物评论(FEMS Microbiol Rev)(2000，24(1):45-66)可用作异源基因表达的运载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达的原理和基因产物分泌的综述由欣奇克利夫(EHinchcliffe)、肯尼(E Kenny)(1993，“酵母作为异源基因表达的运载体(Yeast as avehicle for the expression of heterologous genes)”，酵母(Yeasts)，第5卷，安东尼H罗斯、和J斯图尔特哈里森，编辑，第2版，学术出版社)给出。
对于酵母的转化，已经开发了若干种转化方案。例如，根据本发明的转基因的酵母菌可以通过以下教导来制备：Hinnen等人(1978，美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA)75，1929)；贝格斯(Beggs，J D)(1978，自然，伦敦，275，104)；和伊图(Ito,H)等人(1983，细菌学杂志(J Bacteriology)153,163-168)。
转化的酵母细胞可以使用各种选择性标记(例如营养缺陷型标记显性抗生素抗性标记)来选择。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可呈现在细胞的表面。
蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的上下文中。
异源分泌前导序列的典型实例是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如来自曲霉属的glaA-，18个和24个氨基酸型两者)、α-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的那些。
举例来说，在酶学方法(Methods Enzymol)(1990)182:132-43中综述了异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌。
转录后和翻译后修饰
合适地，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以由本文教导的任何一种核苷酸序列编码。
取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。设想用于本发明方法和/或用途的酶(例如，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)涵盖已经经历转录后(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)和/或翻译后修饰的酶。
转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的)“剪切”或“裂解”。
在一些实施例中，多肽(例如本发明的三肽基肽酶，例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)可以被剪切或裂解。这可能导致脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶从无活性或实质上无活性状态转化为活性状态(即能够进行本文所述的活性)。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以是对成熟肽进一步进行翻译后修饰的前肽，即具有脯氨酸耐受性三肽基肽酶活性的多肽。
仅通过举例的方式，SEQ ID No.1与SEQ ID No.29相同，除了SEQ ID No.1经历了翻译后和/或转录后修饰以除去一些氨基酸，更具体地自N末端除去197个氨基酸。因此，在某些情况下(即在一些宿主细胞中)可以考虑作为前肽的如SEQ ID No.1所示的多肽-其通过翻译后和/或转录后修饰进一步加工成成熟肽(SEQ ID No.29)。关于翻译后和/或转录后修饰的精确的修饰，例如一个或多个裂解位点可以根据宿主物种略有不同。在一些宿主物种中可能没有翻译后和/或转录后修饰，因此前肽将等同于成熟肽(即具有本发明的三肽基肽酶活性的多肽)。不希望受理论束缚，与通过参考SEQ ID No.29与SEQ ID No.1相比所示的裂解位点相比，一个或多个裂解位点可以在任一方向上移位几个残基(例如1个、2个或3个残基)。换句话说，例如，不是在位置197(R)处裂解，例如，裂解可以在位置196-A、195-A、194-A、198Q、199E、200P处发生。另外或可替代地，裂解可导致约197个氨基酸的去除，在一些实施例中，裂解可能导致194个和200个之间残基的去除。
转录后和/或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将理解，蛋白质(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)可能发生的转录后和/或翻译后修饰的类型可以取决于其中蛋白质(例如，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)被表达的宿主生物体。
检测
用于检测和测量氨基酸序列表达的各种方案在本领域中是已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。
各种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于各种核酸和氨基酸测定。
许多公司，例如Pharmacia Biotech(新泽西州皮斯卡塔韦)，威斯康辛州麦迪逊普洛麦格公司(Promega，Madison，WI)和俄亥俄州克利夫兰美国生物化学公司(BiochemicalCorp，Cleveland，OH)提供用于这些程序的商业试剂盒和试验方案。
合适的报告分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。教导使用这些标记的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
而且，可以如US-A-4,816,567所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
根据本发明使用的氨基酸序列可以作为融合蛋白产生，例如有助于提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和(β-半乳糖苷酶)。还可方便地在融合蛋白伴侣和感兴趣的蛋白序列之间包括进蛋白水解切割位点，以允许除去融合蛋白序列。
优选地，融合蛋白将不妨碍蛋白序列的活性。
在大肠杆菌中的基因融合表达系统已经在生物技术新见(Curr OpinBiotechnol)(1995)6(5):501-6中进行了综述。
在本发明的另一个实施例中，氨基酸序列可以连接到异源序列以编码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽文库，编码表达由可商购的抗体识别的异源表位的嵌合物质可能是有用的。
通用重组DNA方法技术
除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见，例如，萨姆布鲁克(J.Sambrook)、弗里奇(E.F.Fritsch)、马尼亚蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；奥苏贝尔(Ausubel,F.M.)等人(1995和定期补充；分子生物学现代方法(Current Protocols in MolecularBiology)，第9、13和16章，纽约州约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.，NY)；罗(B.Roe)、瑰柏翠(J.Crabtree)、卡恩(A.Kahn)，1996，DNA分离和测序：基本技术(DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)；盖特(M.J.Gait)(编辑)，1984年，寡核苷酸合成：实用方法(OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach)，Irl出版社；以及，利利(D.M.J.Lilley)和达尔伯格(J.E.Dahlberg)，1992，酶学方法：DNA结构，部分A：DNA的合成和物理分析(Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA)，酶学方法(Methods in Enzymology)，学术出版社。这些一般性文本中的每一个以引用方式并入本文。
剂量
用于本发明方法和/或用途的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以按任何合适的量给药。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约0.01mg-100mg；0.5mg-100mg；1mg-50mg；5mg-100mg；5mg-20mg，10mg-100mg；0.05mg-50mg；或0.10mg-10mg的酶/kg饲料添加剂组合物的量给药。
在某些实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约0.01g至1000g的酶/kg饲料添加剂组合物的量给药，例如0.1g至500g，例如0.5g至700g，例如以约0.01g-200g，0.01g-100g；0.5g-100g；1g-50g；5g-100g；5g-20g，5g-15g，10g-100g；0.05g-50g；或0.10g-10g的酶/kg饲料添加剂组合物的量。
在一个优选的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约5mg-20mg酶/kg饲料添加剂组合物的量给药，
确切的量将取决于所使用的组合物的具体类型和取决于特定蛋白酶活性/mg蛋白质。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约1mg至约1kg酶/kg饲料和/或喂养料和/或预混物的量给药。合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约1mg至约250g/kg饲料和/或喂养料和/或预混物给药。优选地，以约1mg至约100g(更优选地约1mg至约1g)/kg饲料和/或喂养料和/或预混物给药。
内切蛋白酶可能以少于约6.0g酶/公吨(MT)饲料的量给药。
合适地，内切蛋白酶可能以少于约4.0g酶/MT、合适地少于约2.0g酶/MT的量给药。
在另一个实施例中，内切蛋白酶可能以约0.5g至约5.0g之间的酶/MT饲料给药。合适地，内切蛋白酶可能以约0.5g至约3.0g之间的酶/MT饲料给药。更合适地，内切蛋白酶可能以约1.0g至约2.0g的酶/MT饲料给药。
在一个实施例中，氨基肽酶可能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或饲料添加剂组合物的量给药。合适地，氨基肽酶可能以在约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或饲料添加剂组合物的量给药。更合适地，以在约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物和/或饲料添加剂组合物的量给药。
动物
本文所用的术语“动物”是指要给予或已经给予根据本发明的饲料添加剂组合物或包括根据本发明的所述饲料添加剂组合物的喂养料的动物。
优选地，动物为哺乳动物、反刍动物、单胃动物、鱼或甲壳类动物，包括诸如牲畜或驯养动物(例如宠物)。
在一个实施例中，“动物”为牲畜。
如本文所使用的，术语“家畜”是指任何农场动物。优选地，牲畜是以下各项中的一种或多种：乳牛或公牛(包括小牛)、猪(包括仔猪、生猪、生长猪、母猪)、家禽(包括肉鸡、小鸡、蛋鸡和火鸡)、鸟、鱼(包括淡水鱼，例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤)和海鱼(例如黑鲈)、甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。
在另一个实施例中，“动物”为驯养动物或宠物或动物园环境中饲养的动物。
如本文所使用的，术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。
在一个实施例中，动物为单胃动物。在一个优选的实施例中，单胃动物可为家禽或猪(或其组合)。
在另一个实施例中，动物为反刍动物。
术语动物不旨在是指人类。
封装
在一个实施例中，对根据本发明的饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或喂养料进行封装。
在一个优选的实施例中，将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或喂养料封装于袋(例如纸袋)中。
在替代性实施例中，可以将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或喂养料密封在容器中。可使用任何合适的容器。
饲料
本发明的饲料添加剂组合物可用作饲料，或者可用于饲料的制备中。
本文所用的术语“饲料”与“喂养料”同义。
饲料可以是处于溶液或如固体的形式-取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
当用作饲料(例如功能饲料)或用于饲料(例如功能饲料)的制备时，本发明的组合物可以与以下各项中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
在一个优选的实施例中，本发明的饲料添加剂组合物与饲料组分混合形成喂养料。
本文所用的术语“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。
在一个实施例中，包括将脯氨酸耐受性三肽基肽酶和选自下组的一种或多种成分的饲料添加剂组合物可以与至少一种蛋白质或其部分混合，该组由以下各项组成：小麦载体、多元醇、糖、盐和防腐剂(任选地与内切蛋白酶组合)，该蛋白质或其部分是动物蛋白质和植物蛋白质(例如选自以下各项中的一种或多种：麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白、胶原蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白或鱼粉、肉类蛋白或肉粉(包括肉骨粉)、羽毛蛋白或羽毛粉、蛋类蛋白、大豆蛋白、或谷物蛋白质)，优选地包含于玉米、大豆粉、玉米干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦、包括谷蛋白的小麦蛋白、小麦副产品、麦麸、包括玉米蛋白粉的玉米副产品、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、全脂大豆、动物副产品粉、醇溶性蛋白(优选是玉米蛋白(例玉蜀黍玉米蛋白)和/或高粱醇溶蛋白(例如来自高粱))、来自油料种子的蛋白质(优选来自大豆种子蛋白、向日葵种子蛋白、油菜籽蛋白、卡诺拉(油菜)种子蛋白或其组合)或其组合中。
优选地，饲料可以是草料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。
本文所用的术语‘秣料’是指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。草料涵盖已经切下的植物。
术语‘秣料’包括干草、秸秆、青贮饲料、压缩饲料和颗粒饲料、油和混合给养，也包括发芽谷物和豆类。
秣料可得自选自以下的一种或多种植物：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、Chaumoellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自自然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、谷子、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于配合饲料的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、裸麦、玉蜀黍、大豆、高粱、燕麦、和大麦。
合适地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，该微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
用于本发明的维生素可以包括维生素A、维生素D3、维生素E、维生素K3、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸、泛酸或其混合物。
本发明的任何喂养料可包括一种或多种选自下组的饲料材料，该组包含以下各项：a)谷类，例如小粒谷类(如小麦、大麦、裸麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷类，如玉蜀黍或高粱；b)来自植物的副产物，诸如干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦粉头、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、玉米纤维、玉米胚芽粉、玉米麸皮、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、谷蛋白粉、小麦粉头、小麦粗粉或其组合；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉(油菜籽)、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰子肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
本发明的喂养料可含有至少30％、至少40％、至少50％或至少60％以重量计的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
另外或可替代地，本发明的喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、裸麦、燕麦、来自植物(例如谷类)的副产物(诸如干酒糟可溶物(DDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦粉头、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、玉米纤维、玉米胚芽粉、玉米麸皮、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、谷蛋白粉、小麦粉头、小麦粗粉或其组合。一些蛋白质源也可视为高纤维：获自例如以下来源的蛋白质：向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花。
在本发明中，饲料可能是下列中的一种或多种：配合饲料和预混料，包括丸、核或(喂牛的)饼状饲料；作物或作物残茬：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新鲜剪草和其他饲料植物；肉骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；保存的饲料植物：干草和青贮饲料；海藻；整株或通过破碎、碾磨等制备的种子和谷物；发芽谷物和豆类；酵母提取物。
在本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物消费的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以干燥形式(例如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖鱼食。鱼食物通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(例如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
如本文所使用的，术语“接触”指的是间接或直接将本发明的组合物应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。
在一个实施例中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如饲料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。
对于一些应用，重要的是使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这允许组合物赋予以下有利特征中的一种或多种：生物物理特性选自下组中一种或多种，该组由以下各项组成：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养消化率，包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响、例如粪肥输出和/或氮排泄。
可将本发明的饲料添加剂组合物和受控量的一种或多种酶散布、涂布和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原材料)。
优选地，本发明的饲料添加剂组合物将是热稳定的以便进行高达约70℃；高达约85℃；或高达约95℃的热处理。该热处理可能进行长达约1分钟；长达约5分钟；长达约10分钟；长达约30分钟；长达约60分钟。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至特定温度之前添加剂中存在且有活性的酶组分的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。
在一个特别优选的实施例中，将饲料添加剂组合物均化，以制成粉末。
在一个可供选择的优选实施例中，将饲料添加剂组合物配制成如WO2007/044968中所述的颗粒剂(称为TPT颗粒剂)，该文献以引用的方式并入本文。
在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。这样的盐包衣的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。
优选地，用于盐包衣的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。
优选地，盐涂层包含Na2SO4。
制备饲料添加剂组合物的方法也可包括将粉末制成粒料的进一步步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的粒料。
任选地，制粒步骤可包括在粒料形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。混合物在达到规定的温度(例如从60℃-100℃)的调节器中加热，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、95℃。停留时间可以从几秒钟到几分钟甚至几小时变化。例如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应当理解，本发明的饲料添加剂组合物适于加入至任何适宜的饲料材料中。
如本文所使用的，术语“饲料材料”是指由动物消费的基础饲料材料。进一步应当理解，饲料材料可能包括，例如至少一种或多种未加工的谷物和/或加工过的植物和/或动物材料(例如大豆粉或骨粉)。
如本文所使用的，术语“喂养料”是指已添加一种或多种饲料添加剂组合物的饲料材料。
技术人员会认识到，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养该动物的目的。
优选地，喂养料可包含以下的饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、水稻、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的组分，如大豆粉、油菜籽粉、卡诺拉(油菜籽)粉、棉籽粉、向日葵籽粉、动物副产物粉及其混合物。更优选地，喂养料可包括动物脂肪和/或植物油。
任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(例如钙)和/或另外的维生素。
优选地，喂养料为玉米大豆粉混合物。
在另一个方面，提供了一种制备喂养料的方法，该方法包括使饲料组分与本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分接触、或与通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物接触、或与本发明的预混物接触、或与至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶接触，任选地与至少一种内切蛋白酶组合，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
还提供了一种喂养料，该喂养料包含本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分、或通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物或本发明的预混物。
喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过该方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，该步骤包括制粒之前的挤出或膨化，尤其是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
喂养料可为单胃动物的喂养料，诸如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭子、鹅、水禽)、生猪(所有年龄段)、宠物(例如狗、猫)或鱼，优选地，喂养料为家禽的喂养料。
仅通过举例的方式，鸡(如肉鸡)的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
成分 起始鸡(％) 成鸡(％)
玉蜀黍 46.2 46.7
小麦粗粉 6.7 10.0
玉蜀黍DDGS 7.0 7.0
大豆粉48％CP 32.8 26.2
An/Veg脂肪共混物 3.0 5.8
L-赖氨酸HCl 0.3 0.3
DL-甲硫氨酸 0.3 0.3
L-苏氨酸 0.1 0.1
盐 0.3 0.4
石灰岩 1.1 1.1
磷酸氢钙 1.2 1.2
家禽维生素和微量矿物质 0.3 0.3
仅通过举例的方式，鸡(例如肉鸡)的饮食规格可能如在下表中列出：
仅通过举例的方式，蛋鸡的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
成分 下蛋阶段(％)
玉蜀黍 10.0
小麦 53.6
玉蜀黍DDGS 5.0
大豆粉48％CP 14.9
小麦粗粉 3.0
大豆油 1.8
L-赖氨酸HCl 0.2
DL-甲硫氨酸 0.2
L-苏氨酸 0.1
盐 0.3
磷酸氢钙 1.6
石灰岩 8.9
家禽维生素和微量矿物质 0.6
仅通过举例的方式，蛋鸡的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 16.10
家禽代谢能(kcal/kg) 2700
赖氨酸(％) 0.85
甲硫氨酸(％) 0.42
甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.71
苏氨酸(％) 0.60
钙(％) 3.85
有效磷(％) 0.42
钠(％) 0.16
仅通过举例的方式，火鸡的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
仅通过举例的方式，火鸡的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 29.35 26.37 22.93 20.00
家禽代谢能(kcal/kg) 2.850 2.900 2.950 3.001
钙(％) 1.43 1.33 1.22 1.02
有效磷(％) 0.80 0.71 0.65 0.53
钠(％) 0.16 0.17 0.17 0.17
可消化的赖氨酸(％) 1.77 1.53 1.27 1.04
可消化的甲硫氨酸(％) 0.79 0.71 0.62 0.48
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 1.12 1.02 0.90 0.74
可消化的苏氨酸(％) 1.03 0.89 0.73 0.59
仅通过举例的方式，仔猪的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
仅通过举例的方式，仔猪的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 21.50 20.00
猪消化能(kcal/kg) 3380 3320
猪净能量(kcal/kg) 2270 2230
钙(％) 0.80 0.75
可消化磷(％) 0.40 0.35
钠(％) 0.20 0.20
可消化的赖氨酸(％) 1.23 1.14
可消化的甲硫氨酸(％) 0.49 0.44
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.74 0.68
可消化的苏氨酸(％) 0.80 0.74
仅通过举例的方式，生长猪/成猪的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
仅通过举例的方式，生长猪/成猪的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 22.60
猪代谢能(kcal/kg) 3030
钙(％) 0.75
有效磷(％) 0.29
可消化赖氨酸(％) 1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.73
可消化苏氨酸(％) 0.66
形式
可以任何适宜的形式使用本发明的饲料添加剂组合物和其他组分和/或包括该饲料添加剂组合物和其他组分的喂养料。
本发明的饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其替代形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、混悬液和乳剂。
在一些应用中，本发明的饲料添加剂组合物可与饲料混合，或施用于饮用水中。
针对速释型、迟释型、调释型、缓释型、脉冲释放型或控释型应用，形式的合适的实例包括粉剂、糊剂、大丸剂、粒剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、珠剂、溶液或悬浮液中的一种或多种，其可包含调味剂或染色剂。
举例来说，如果本发明的组合物以固体(例如颗粒)形式使用，那么它也可以包含以下各项中的一种或多种：辅料，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选是玉米、马铃薯、木薯淀粉)，乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐；造粒粘结剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石可以包括在内。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的实例包括(例如)水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟基甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、牛奶糖或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本发明的组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油及其组合)进行组合。
与其他组分的组合
本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物可与其他组分组合使用。
将本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物与适合于动物消费的另一种组分组合能够为消费者提供医疗或生理益处。
在一个实施例中，“另一种组分”可为一种或多种酶。
合适地，用于本发明中的另外的酶可以是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣聚糖酶(E.C.3.1.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂肪酰基转移酶(通常分类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
合适地，其他组分可以是植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8))。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、形成G4的淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)；和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是淀粉酶(例如，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂肪酰基转移酶(通常分类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)，合适的是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在另一个实施例中，其他组分可以是另外的蛋白酶。合适地，另外的蛋白酶可以选自下组，该组由以下各项组成：氨基肽酶和羧肽酶。
如在本发明上下文中所使用的，术语“氨基肽酶”是指能够从蛋白质和/或肽底物的N末端裂解单个氨基酸、二氨基酸或其组合的外切肽酶。优选地，氨基肽酶能够仅从蛋白质和/或肽底物的N末端裂解单个氨基酸。
氨基肽酶可获自(例如获得自)乳杆菌属(Lactobacillus)，合适地可获自瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
在一个实施例中，氨基肽酶可以是氨基肽酶N(例如PepN)(EC3.4.11.2)。
在一个实施例中，氨基肽酶可以包含如以下各项所示的序列：
MAVKRFYKTFHPEHYDLRINVNRKNKTINGTSTITGDVIENPVFINQKFMTIDSVKVDGKNVDFDVIEKDEAIKIKTGVTGKAVIEIAYSAPLTDTMMGIYPSYYELEGKKKQIIGTQFETTFARQAFPCVDEPEAKATFSLALKWDEQDGEVALANMPEVEVDKDGYHHFEETVRMSSYLVAFAFGELQSKTTHTKDGVLIGVYATKAHKPKELDFALDIAKRAIEFYEEFYQTKYPLPQSLQLALPDFSAGAMENWGLVTYREAYLLLDPDNTSLEMKKLVATVITHELAHQWFGDLVTMKWWDNLWLNESFANMMEYLSVDGLEPDWHIWEMFQTSEAASALNRDATDGVQPIQMEINDPADIDSVFDGAIVYAKGSRMLVMVRSLLGDDALRKGLKYYFDHHKFGNATGDDLWDALSTATDLDIGKIMHSWLKQPGYPVVNAFVAEDGHLKLTQKQFFIGEGEDKGRQWQIPLNANFDAPKIMSDKEIDLGNYKVLREEAGHPLRLNVGNNSHFIVEYDKTLLDDILSDVNELDPIDKLQLLQDLRLLAEGKQISYASIVPLLVKFADSKSSLVINALYTTAAKLRQFVEPESNEEKNLKKLYDLLSKDQVARLGWEVKPGESDEDVQIRPYELSASLYAENADSIKAAHQIFTENEDNLEALNADIRPYVLINEVKNFGNAELVDKLIKEYQRTADPSYKVDLRSAVTSTKDLAAIKAIVGDFENADVVKPQDLCDWYRGLLANHYGQQAAWDWIREDWDWLDKTVGGDMEFAKFITVTAGVFHTPERLKEFKEFFEPKINVPLLSREIKMDVKVIESKVNLIEAEKDAVNDAVAKAID
如本文所使用的，术语“羧肽酶”具有在本领域中的通常含义，并且是指能够从肽和/或蛋白质底物的C末端裂解n个氨基酸的外切肽酶。在一个实施例中，n可以是至少1，合适地，n可以是至少2。在其他实施例中，n可以是至少3，合适地至少4。
在其他实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶组合)可以与一种或多种另外的外切肽酶一起使用。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶组合)不与脯氨酸特异性外切肽酶组合。
在特别优选的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶不能与具有以下多肽序列的酶组合：
MRTAAASLTLAATCLFELASALMPRAPLIPAMKAKVALPSGNATFEQYIDHNNPGLGTFPQRYWYNPEFWAGPGSPVLLFTPGESDAADYDGFLTNKTIVGRFAEEIGGAVILLEHRYWGASSPYPELTTETLQYLTLEQSIADLVHFAKTVNLPFDEIHSSNADNAPWVMTGGSYSGALAAWTASIAPGTFWAYHASSAPVQAIYDFWQYFVPVVEGMPKNCSKDLNRVVEYIDHVYESGDIERQQEIKEMFGLGALKHFDDFAAAITNGPWLWQDMNFVSGYSRFYKFCDAVENVTPGAKSVPGPEGVGLEKALQGYASWFNSTYLPGSCAEYKYWTDKDAVDCYDSYETNSPIYTDKAVNNTSNKQWTWFLCNEPLFYWQDGAPKDESTIVSRIVSAEYWQRQCHAYFPEVNGYTFGSANGKTAEDVNKWTKGWDLTNTTRLIWANGQFDPWRDASVSSKTRPGGPLQSTEQAPVHVIPGGFHCSDQWLVYGEANAGVQKVIDEEVAQIKAWVAEYPKYRKP
在一个实施例中，附加组分可以是稳定剂、或乳化剂、或粘结剂、或载体、或赋形剂、或稀释剂、或崩解剂。
如本文所使用的，术语“稳定剂”被定义为保持产品(例如饲料产品)免于随时间而变化的成分或成分的组合。
如本文所使用的，术语“乳化剂”是指防止乳剂分离的成分(例如饲料成分)。乳剂是两种不混溶的物质，一种以小滴形式存在，包含于另一者中。乳剂可以由以下各项组成：水包油(其中液滴或分散相是油并且连续相是水)；或油包水(其中水成为分散相并且连续相是油)。也可通过使用乳化剂而使泡沫(即气体分散于液体中)和悬浮液(即固体分散于液体中)稳定。
如本文所使用的，术语“粘合剂”是指经通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分(例如饲料成分)。例如，在“胶凝”期间，水被吸收，从而提供结合效果。然而，粘合剂可吸收其他液体(例如油)，从而将其保持在产品中。在本发明的上下文中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等)中。造粒粘合剂的实例包括如下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯树胶。
“载体”意指适合于给予酶的材料且包括本领域已知的任何这样的材料，例如像任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等，这些材料是无毒的并且并不以有害方式与组合物的任何组分相互作用。
在一个实施例中，本发明提供了一种组合物(例如饲料添加剂组合物)的用途，该组合物包括用至少一种生理上可接受的载体配制的本发明的酶，该载体选自以下各项中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、聚乙烯醇(PVA)、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
在优选的实施例中，本发明提供了一种组合物(例如饲料添加剂组合物)或其用途以及制备该组合物的方法，该组合物包含用一种化合物配制的本发明的酶，该化合物选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
“赋形剂”的实例包括以下各项中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、牛奶糖和高分子量聚乙二醇。
“崩解剂”的实例包括以下各项中的一种或多种：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐。
“稀释剂”的实例包括以下各项中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及其组合。
其他组分可同时(如当其他组分同时存在于混合物中或者哪怕当它们通过不同途径提供时)或依次(如其他组分可通过不同途径提供)用于本发明的饲料添加剂中。
在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物不包含铬或有机铬。
在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物不包含山梨酸。
生物物理特性
在一个方面，提供了一种用于改善动物的生物物理特性或用于改善动物的蛋白质消化率的方法，该方法包括向动物给予通过本发明的方法或用途可获得(例如获得)的饲料添加剂组合物、或本发明的饲料添加剂组合物、喂养料或预混物、或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
如本文所使用的，术语“给予”可能意指在饲喂喂养料(例如动物常规饮食)之前、之后或同时饲喂动物脯氨酸耐受性三肽基肽酶或所述饲料添加剂组合物。可替代地，如本文所使用的术语“给予”可能意指向动物饲喂包含所述饲料添加剂组合物的喂养料或预混物。
合适地，至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
在另一个方面，提供了本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分、或通过本发明的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物、或本发明的饲料喂养料或预混物(用于改善动物的生物物理特征或用于改善动物中的蛋白质消化率)、或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的用途，用于改善动物中的蛋白质消化率或用于改善动物的生物物理特征，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N-末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
合适地，该方法和/或用途可以进一步包括向动物给予至少一种饲料组分、至少一种矿物质、至少一种维生素或其组合。
可替代地或另外地，该方法和/或用途可以进一步包括向动物给予至少一种内切蛋白酶。
如本文所使用的，“生物物理特性”意指改善动物健康和/或性能以及/或者产量的动物的任何生物物理性质。
举例来说，生物物理特性可以是选自下组的一种或多种，该组由以下各项中的一种或多种组成：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养消化率、包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响，例如粪肥输出和/或氮排泄。
合适地，生物物理特性可以是选自下组的一种或多种，该组由以下各项组成：饲料转化率、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)。
在优选的实施例中，生物物理特性可以是消化蛋白质的能力。
在一个实施例中，动物的生物物理特性是指动物性能。
合适地，当与未喂食饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或本发明的预混物的动物相比时，向动物给予饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或本发明的预混物可能不会实质上增加动物的坏死性肠炎的发病率。
如本文所使用的，术语“实质上增加坏死性肠炎的发生率”意指发病率不会增加超过约20％、合适地不会增加超过约10％。优选地，意味着坏死性肠炎的发生率不会增加超过约5％、更优选地不会增加超过约1％。
性能
如本文所使用的，“动物性能”可通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率和/或通过饲料中营养物的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中消化能或代谢能和/或氮保留来确定。
优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。
“改善的动物性能”意指与给动物饲喂不包含根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的饲料组合物相比，由使用本发明的饲料添加剂组合物引起的在受试者中存在增加的饲料效率、和/或增加的增重、和/或降低的饲料转化率、和/或饲料中改善的营养物的消化率或能量和/或改善的氮保留。
优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率和/或增加的增重和/或降低的饲料转化率。
如本文所使用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。
“增加的饲料效率”意指与饲喂不包含根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的饲料组合物的动物相比，在饲料中使用根据本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入中增加的增重。
饲料转化率(FCR)
如本文所使用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或饲料添加剂组合物导致动物增重指定量饲喂给动物的所需要的饲料量低于不具有所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶或不具有根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下使动物增重相同量时所需的饲料量。
营养物质消化率
本文所用的营养物质消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养物质的比率。营养物消化率可测量为所给予至受试者的营养物与受试者粪便中所排出来的营养物之间的差值、或给予至受试者的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养物之间的差值。
如在此使用的，营养物消化率可通过在一段时间期间收集总排泄物，测量所摄入营养物与所排泄的营养物之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养的量的惰性标记物来测量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养物的百分比，或表示为可消化的营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。
如本文所使用的营养物消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
合适地，根据本发明的方法和/或用途或任何方面使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与至少一种内切蛋白酶组合)增加饲喂饲料添加剂组合物和/或饲料成分和/或饲料和/或喂养料和/或预混物的动物中的蛋白质和/或氨基酸消化率。
如本文所使用的能量消化率意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所使用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消费的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。可使用与测定营养物质消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
氮保留率
如本文所使用的氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。
氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。
屠体收率和产肉量
本文所用的术语‘屠体收率’是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语‘屠体’是指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。本文所用的术语‘产肉量’是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。
增重
本发明还提供了增加受试者(如家禽或生猪)体重的方法，该方法包括向所述受试者饲喂包括根据本发明的饲料添加剂组合物的喂养料。
“增加的增重”是指与饲喂不包含所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶或根据本发明的所述饲料添加剂组合物的动物相比，动物在饲喂包含根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或饲料添加剂组合物的饲料时具有增加的体重。
优点
诸位发明人首次提出这样的脯氨酸耐受性三肽基肽酶对于在饲料和喂养料中使用非常有益，并且向饲喂脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含其的饲料和/或喂养料和/或饲料添加剂组合物的动物提供益处。
有利地，教导用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且由于具有这样的广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如脯氨酸)的底物的裂解抑制。因此，使用这样的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以有效地和/或快速地分解蛋白质底物(例如存在于饲料和/或喂养料中)。这提供在饲喂这样的蛋白质底物(例如存在于饲料或喂养料中)的动物中有效和/或快速地原位消化蛋白质底物，允许动物快速和/或有效地吸收消化的肽的另外的益处。
本发明还提供了脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该脯氨酸耐受性三肽基肽酶除了具有如上所述的活性之外可以耐受在位置P2、P2'、P3和P3'处的脯氨酸。这是有利的，因为其允许具有脯氨酸延伸的肽和/或蛋白质底物的有效裂解并允许宽范围的肽和/或蛋白质底物的裂解。
本发明还提供了热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶与非热稳定的变体相比更不容易变性和/或将因此在例如动物中保持更长时间的活性。
本文中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在酸性pH下可能是有活性的。有利地，在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在动物的胃肠道上部(例如在喉咙、前胃或胃中)具有活性和/或可以与存在于动物的胃肠道中的内源性蛋白酶(例如胃蛋白酶)组合消化肽和/或蛋白质底物。
许多当前的饲喂实践涉及在高pH(例如pH 8)下向动物给予有活性的碱性蛋白酶。因此，碱性蛋白酶仅在胃肠道变得更碱性(例如在小肠和大肠和盲肠的较后部分)的动物的胃肠道中较低(例如较后)处有活性。不希望受理论束缚，据信在胃肠道的较后部分产生寡肽增加利用寡肽的微生物群体，这些微生物群体进而可以导致肠道疾病挑战和/或可用于动物摄取的营养物减少。此外，在胃肠道较后(即较低)处，粘膜比在较上部份(例如，喉咙、前胃或胃)的保护性更差，因此更容易受损，导致炎症。有利地，在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的使用减轻了这个问题，因为它能够消化上消化道中的底物，从而不实质上增加微生物群体和/或增加可用于动物摄取的营养物(例如氨基酸/肽)的量和/或减少炎症。
有利地，使用内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合可以增加底物裂解的效率。不希望受理论束缚，据信内切蛋白酶能够在远离C末端或N末端的多个区域裂解肽和/或蛋白质底物，从而产生用于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的更多的N末端以用作底物，从而有利地增加反应效率和/或减少反应时间。
使用酸性内切蛋白酶和在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶是非常有利的，因为这两种酶可以协同消化在动物的上消化道(例如喉咙、前胃或胃)中的肽和/或蛋白质底物，并且可以与存在于动物中的其他内源性蛋白酶(例如胃蛋白酶)组合起作用。
有利地给动物饲喂脯氨酸耐受性三肽基肽酶导致增加的增重和/或降低的饲料转化率和/或增加的氮消化率(例如回肠氮消化率)和/或增加的能量消化(例如回肠能量消化)。
在一个实施例中，与用于饲料应用的常规蛋白酶相比，本发明的组合物和脯氨酸耐受性三肽基肽酶已显示对细胞(例如胃肠道)的危害较小。不希望受理论束缚，因为ATP在细胞代谢中起着核心作用，所以在所有代谢活性细胞中都存在，并且其细胞内水平在健康细胞中被精确地调节。ATP已经被用作活细胞功能完整性的工具，因为所有细胞都需要ATP保持活力并执行其特定的功能。大多数ATP都发现于活细胞内，并且连接分解代谢和合成代谢的过程。细胞损伤或氧/底物消耗导致细胞质ATP迅速下降。ATP的减少通常表明产生ATP的线粒体的损伤，或使ATP降解的ATP酶水平的增加。ATP酶位于例如转运蛋白中，该转运蛋白将特定分子的转运与该转运相结合。然而，肠中的肽转运通常由钠共转运介导，或该钠与肽结合到转运蛋白上。在结合之后，该钠离子然后将其电化学梯度下移到细胞内部，并随之拉动氨基酸或肽。当然，在肽转运之后，通过利用ATP能将钠逆着浓度梯度转回到细胞外，但是通常ATP的这种减少相当迅速地得以恢复(正常的、健康的细胞产生ATP与它们使用ATP一样快)。因此，可以将ATP含量用作健康细胞的指标。令人惊奇地，诸位发明人发现，在饲料工业中使用的可商购的蛋白酶对活细胞具有负面影响。与本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶形成对比，没有观察到这样的负面影响。
同样，观察到在饲料工业中使用的可商购的蛋白酶降低紧密连接完整性，而本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶不是这样的。
另外的定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本披露所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。辛格尔顿(Singleton)等人，微生物学和分子生物学词典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)，第20版，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)，纽约(1994)；以及黑尔(Hale)和迈尔哈姆(Marham)，哈珀柯林斯生物学词典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)，哈珀永久出版社(HarperPerennial)，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本披露并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，任何核酸序列均以5'至3'取向从左到右书写，氨基酸序列以氨基至羧基取向从左到右书写。
本文提供的标题并不是对本披露的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，下面立即定义的术语得以更全面地定义。
在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。
如本文所使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本披露和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，归因于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本披露并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露的范围仅由所附权利要求限定。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与该所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本披露内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本披露中，但依据该所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下，将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本披露中。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在此和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“脯氨酸耐受性三肽基肽酶”、“内切蛋白酶”、或“酶”)包括多种这样的候选试剂，并且提及“饲料”、“喂养料”、“预混物”或“饲料添加剂组合物”包括提及一种或多种本领域技术人员已知的饲料、喂养料、预混物及其等同物等。
本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的披露内容而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。
现仅以举例的方式参照以下附图和实例来描述本发明。
实例
实例1
脯氨酸耐受性三肽基肽酶在里氏木霉中的克隆和表达。
使用用于在里氏木霉中表达的优选密码子产生编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的合成基因，除了作为基因组序列产生的TRI079(SEQ ID No.57)和TRI083(SEQ ID No.56)之外。预测的分泌信号序列(SignalP 4.0：鉴别来自跨膜区的信号肽，托马斯·诺达尔·彼得森(Thomas Nordahl Petersen)、索伦·布鲁纳克( Brunak)、贡纳·冯海耶(Gunnarvon Heijne)和亨里克·尼尔森(Henrik Nielsen)自然方法(Nature Methods)，8:785-786，2011)被来自里氏木霉酸性真菌蛋白酶(AFP)的分泌信号序列和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子替换(TRI079和TRI083除外)(参见图7下小图)。
使用LR ClonaseTM酶混合物(生命技术公司(Life Technologies))，将合成基因导入目的载体pTTT-pyrG13(如在US 8592194B2中所述，其教导内容通过引用结合在此)，导致用于本文的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的表达载体pTTT-pyrG13的构建。编码SEQ ID No 1、2和29的表达载体显示在图1中，编码SEQ ID No 12和39的表达载体显示在图7中。编码SEQID No 96或97(TRI045)的表达载体显示于图2中。
使用PEG介导的原生质体转化，将5-10μg的表达载体单独地转化到合适的里氏木霉菌株中，本质上如先前(US 8592194B2)所述的。将发芽孢子通过离心收获，洗涤并用45mg/ml的裂解酶溶液(哈茨木霉(Trichoderma harzianum，西格玛公司L1412))处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备，如通过等人[基因(Gene)61(1987)155-164]所述的，其内容通过引用结合在此。
使用0.85％NaCl、0.015％Tween 80的溶液收获孢子。将孢子悬浮液用于接种液体培养物。使培养物在28℃和80％湿度下随着在180rpm下振摇生长7天。通过真空过滤收获培养物上清液，并且用于测量表达和酶性能。
纯化和表征
A.脯氨酸耐受性三肽基肽酶的纯化
在用20mM乙酸钠(pH 4.5，缓冲液A)平衡的PD10柱(GE生命科学公司(GE LifeSciences)，美国)上进行样品脱盐。对于源S15HR25/5(GE生命科学公司(GE LifeSciences)，美国)上的离子交换层析，柱用缓冲液A平衡。将脱盐样品(7ml)以6ml/min的流速应用到柱上，并且柱用缓冲液A洗涤。用在20mM乙酸钠(pH 4.5)中的0-0.35M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质(35分钟)。在整个运行过程中，收集10ml级分。如下所述针对三肽基氨基活性对收集的样品进行测定。基于在280nm处的吸光度测量和使用ExPASy ProtParam工具(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)计算的蛋白质的理论吸光度来计算蛋白质浓度。
B.脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切肽酶活性的确定
将发色肽H-Ala-Ala-Ala-pNA(MW＝387.82；巴赫姆公司，瑞士)用于确定如上所述产生的样品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的活性。如下进行测定：在微量滴定板中将10μL的发色肽溶液(10mM溶解在二甲亚砜；DMSO中)添加到130μl醋酸钠(20mM，用乙酸调节至pH4.0)中，并在40℃下加热5分钟。添加10μL适当稀释的酶，并在405nm处在MTP读数器(Versamax，分子器件公司(Molecular Devices)，丹麦)中测量吸收。将一开特的蛋白水解活性定义为每秒释放1摩尔对硝基苯胺所需的酶的量。
用于内切蛋白酶活性的偶氮酪蛋白测定。
使用由艾弗森(Iversen)和约根森(1995)描述的内切蛋白酶测定的改良版本。将50μl的酶样品添加到的4倍稀释的麦基尔文(McIlvaine)缓冲液(pH 5)中的250μl的偶氮酪蛋白(0.25％w/v；来自西格玛公司(Sigma))中，并且在40℃下在振摇(800rpm)下孵育15min。通过添加50μl的2M TCA终止反应，并以20,000g离心5min。向195μl上清液样品中添加65μl的1M NaOH，并且测量在450nm处的吸光度。将内切蛋白酶活性的一个单位定义为在40℃下在15min内产生0.1的吸光度增加的量。
发现如在实例1中所描述产生的脯氨酸耐受性三肽基肽酶样品实质上不含内切肽酶副活性。如在实例2A中所描述进行纯化后，实质上没有检测到内切肽酶副活性。
C.pH特征曲线
使用上述采用H-Ala-Ala-Ala-pNA底物描述的脯氨酸耐受性三肽基肽酶测定(其中改良是使用缓冲液20mM甘氨酸钠(pH 2.0、2.5、3.0、3.5和4.0)或20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0、4.5和5.5))来确定脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083(图2)和TRI045(图24)的pH特征曲线。观察到TRI083和TRI045的最佳pH为4.0。
D.温度特征曲线
在25℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和85℃温度下使用上述脯氨酸耐受性三肽基肽酶测定。发现脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083的最佳温度为50℃，而发现在70℃和更高温度下没有活性(图3)。
使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切蛋白酶( AFP)组合进行蛋白质水解
酶： AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083如实例1中所述进行表达。
测定缓冲液：50mM NaOAc、pH 4.0、3％二甲基血红蛋白，37℃，孵育1小时(每MTP孔中100μl反应混合物)。
终止/显色试剂：0.05％三硝基苯磺酸在125mM硼酸钠pH 8.6(每孔200μl)中。
在与终止/显色试剂孵育约20min之后，使用Versa max酶标仪(分子器件公司)在450nm处读板。当内切蛋白酶( AFP)与脯氨酸耐受性三肽基肽酶组合使用时，测定的结果显示出协同效应(图4)。
33聚体麦醇溶蛋白肽的水解
通过LC-MS和无标记定量，检测三肽基氨基肽酶水解来自α-麦醇溶蛋白(α-2-麦醇溶蛋白)的合成底物的能力。发现将底物裂解成三肽，而与底物中的高脯氨酸含量无关。
实验设置
将麦醇溶蛋白(α-2-麦醇溶蛋白)(aa56-88)H-LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF-OH的33聚体(Zedira股份有限公司；德国达姆施塔特D-64293号)C190H273N43O47(MW＝3911.46)(1mg/ml；0.26mM)在脯氨酸耐受性三肽基肽酶(0.01mg/ml)的存在下，在总体积为1000μl的缓冲液(pH＝4.5)(底物/酶比例100:1，w/w)中、于24℃下孵育。分别在0、1、3、5、10、15和30分钟后，用20μl 5％三氟乙酸(TFA)终止酶反应的等分试样(100μl)。然后将样品转移到新小瓶中，并且在LTQ轨道阱质谱仪上进行分析。
数据采集、无标记定量和MS/MS数据分析
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421(可获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss LabSoftware,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th AveNE Seattle,Washington,US))访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将两个底物的肽序列及其裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
使用GPMAW来手动注释LC-MS/MS数据以计算片段化的理论值。
分离完整的α-2-麦醇溶蛋白肽的三重带电质量并随着时间进行跟踪。完整的肽在3min后不能检测到，并且非常快速地水解(表1)。33聚体α-2-麦醇溶蛋白肽的全部水解将给出以下三肽：LQL′QPF′PQP′QLP′YPQ′PQL′PYP′QPQ′LPY′PQP′QPF。由从α-2-麦醇溶蛋白底物裂解四种三肽LQL、QPF、PQP和QLP产生的中间产物YPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF发现累积并随后减少(表1)。
表1：α-2-麦醇溶蛋白和衍生的肽的相对MS峰强度
检测到大部分预期的三肽的积累。基于其MS/MS片段化，发现并证实了加下划线的三肽：LQL′QPF′PQP′QLP′YPQ′PQL′PYP′QPQ′LPY′PQP′QPF，而QPF三肽仅基于其质量被发现。
总之，发现脯氨酸耐受性三肽基肽酶将底物α-2-麦醇溶蛋白连续裂解成三肽，而与高脯氨酸含量无关。在水解期间，脯氨酸分别存在于P3、P2、P1、P1’、P2′和P3'位置。
这与先前的发现三肽基氨基肽酶不会裂解在P1或P1'位置的脯氨酸形成对比(US7972808B2、US 5821104，赖卡德(Reichard)等人，2006，应用与环境微生物(Applied andEnvironmental Microbiology)72,1739-1748)。
AAPPA肽的裂解
通过LC-MS和无标记定量，检测脯氨酸耐受性三肽基肽酶水解合成底物AAPPA的能力。将肽H-AAPPA-NH2(MW＝424.49，来自谢弗-N公司，哥本哈根)溶解于20mM MES缓冲液(pH＝4.0(1mg/ml))中。在室温下将1000μl的H-AAPPA-NH2溶液与200μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)溶液(40ug/ml)(底物/酶100:0.8)一起孵育。在七个时间点(0、5、15、60、180、720和1440min)取出100μl样品，用50ul 5％TFA进行稀释，热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析。
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物的肽序列以及裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
分析显示，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)随着时间能够降解肽AAPPA(图5)并产生产物AAP(图6)，表明AAPPA中的PP肽键被脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)水解。
实例2
材料和方法
1.玉米大豆饲料的酶处理
将饲料面粉筛分至小于212μm的粒度，并且悬浮在水中至10％(w/w)浆液，并且将pH调至pH 3.5。然后，使用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)Biomek NXp实验室自动化工作站将138μL 10％的该浆液添加到96MTP孔板中的每个孔中。使用大口径吸头。然后添加在20mM乙酸盐(pH 3.5)中含有待测试的蛋白酶的20μl酶溶液，然后添加溶解于水中的10μL(1.14U/μL)胃蛋白酶。在iEMS孵化器/振摇器中(以1150rpm)，在40℃下将板孵育45分钟。然后添加34μL在1M碳酸氢钠中的胰蛋白酶(1.126mg/mL)，并且在iEMS(以1150rpm)中在40℃下将板孵育60分钟。然后在5℃、4000rpm下将板离心15min，将10μL上清液转移至在每个孔中含有190μL水的新板(康宁板(corning plate)#3641未结合)以进行20x稀释。将获得的板(母版)储存在-20℃的冰箱中。
2.水解度测量。
可溶性蛋白质的水解度(DH)的分析方法是基于使用邻苯二醛的伯胺基团的反应(OPA-测定)。参考文献：尼尔森(P.M.Nielsen)、彼得森(D.Petersen)和丹布曼(C.Dambmann)，用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(Improved Method forDetermining Food Protein Degree of Hydrolysis)，食品科学杂志(Journal of FoodScience)，66(2001)642-646。
对于OPA测定，进行以下程序。将来自母板通过酶处理的10-25μl饲料样品转移到新板中，然后向板中添加175μl含有硼酸钠、十二烷基硫酸盐和二硫苏糖醇的OPA试剂。就在2分钟和5秒钟混合之后，进行在340nm处的光密度的终点测量。
在胃蛋白酶和胰液素存在下， AFP(酸性蛋白酶)对玉米大豆饲料的影响。体外研究。
玉米大豆饲料的组成提供在下表中(植酸盐和肌醇磷酸盐(IP1-5)的相互作用，包括IP5异构体与膳食蛋白质和铁的相互作用，以及胃蛋白酶的抑制。余(S.Yu)、A.Cowieson、吉尔伯特(C.Gilbert)、普林斯迪(P.Plumstead)和达尔斯加德(S.Dalsgaard)，动物科学杂志(J.Anim.Sci.)90(2012)1824-1832，补充信息)。
成分 量，％
玉米 60.01
大豆粉 31.52
大豆油 4.00
盐 0.40
DL-甲硫氨酸 0.20
石灰岩 1.16
磷酸氢钙 1.46
维生素和矿物质混合物 1.25
在胃蛋白酶和胰液素存在下，用不同浓度(相对于玉米大豆饲料的450ppm、1000ppm和1500ppm)的 AFP(NSP24，可获自杰能科公司食品酶部门(GenencorDivision，Food Enzymes))(本文中称为“AFP”)处理玉米大豆饲料(图8)。结果提供如下：玉米大豆饲料DH的改善的水平分别为4.5％、6.3％和9.0％。
实例3
在 AFP存在和不存在下，并且在胃蛋白酶和胰液素存在下，脯氨酸耐受性三肽基肽酶对玉米大豆饲料的影响。体外研究。
在这些研究中， AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶仅分别以1000ppm和450ppm的剂量使用。按照实例2进行该实验。结果提供于表2中。在对照实验中，仅使用胃蛋白酶和胰液素。水解的改善是处理和对照之间的比率。
表2.脯氨酸耐受性三肽基肽酶和 AFP对玉米大豆饲料的水
解的影响。
对照 3PP AFP AFP+3PP
水解度，％ 24.5±2.0 25.5±1.6 28.6±3.6 32.3±2.6
水解的改善，％。 100±8.2 104±6.5 117±14.7 132±10.7
从表2可以看出，脯氨酸耐受性三肽基肽酶本身不能在玉米大豆蛋白水解中产生足够的益处。 AFP的表现与在实例2中提供的结果类似。然而，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和 AFP的组合给出了最大的结果，并且可以与内切和外切蛋白酶的协同作用相关联。
实例4a
在胃蛋白酶和胰液素不存在下，验证脯氨酸耐受性三肽基肽酶(有时本文中称为3PP)与内切蛋白酶组合对玉米大豆饲料水解的剂量响应。
该工作的目的是鉴定酶性能的起源，并且真正地监测内切和外切蛋白酶的可能添加剂或协同表现。由于这个原因，在胃蛋白酶和胰液素不存在下进行这些实验，并且将结果总结在图9中。否则，按照实例2进行该实验。
从图9可以看出，当脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切蛋白酶一起使用时水解度是非常显著的。很明显，这种现象是协同作用的，因为剂量响应取决于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的水平和内切蛋白酶的性质。在的情况下，效果更加显著。
实例4b
在胃蛋白酶和胰液素存在下，验证3PP与不同剂量的AFP内切蛋白酶组合对玉米大豆饲料水解的剂量响应。
为了估计AFP和3PP之间的协同作用水平，用不同剂量的酶并且在胃蛋白酶和胰液素的存在下，实施了根据实例2进行的实验。
从图10可以看出，水解度水平随着在1000ppm和2000ppm下包含AFP而增加。3PP的添加进一步增加了水解。对于100min和200min的反应时间是这样的。
实例5
脯氨酸耐受性三肽基肽酶在胃蛋白酶存在下的稳定性
材料与方法
胃蛋白酶溶液：在该实例中使用来自西格玛公司的猪胃蛋白酶(P7000，674个西格玛单位/mg)，并将该胃蛋白酶以10000个西格玛单位/ml制备于MilliQ水中。三肽基肽酶胃蛋白酶预孵育混合物包含：在96孔康宁MTP的半底部区域中的2.5μl三肽基肽酶样品、95μlGAT缓冲液(50mM甘氨酸-50mM乙酸-50mM tris，pH 3.5)、在milliQ水中的5μL胃蛋白酶(10000个西格玛单位/ml)(最终胃蛋白酶浓度单位：500个西格玛单位/ml反应混合物)。对于对照，预孵育混合物含有5μl水而不是5μl胃蛋白酶。将混合物在40℃下孵育60min，然后保存在冰上。对于残留活性，测定混合物含有5μl预孵育混合物、85μl的0.1M乙酸-乙酸钠(pH 4.0)、5μl底物AAF-pNA(2.5mg/ml)(H-Ala-Ala-Phe-pNA，巴赫姆公司(BACHEM)，L-1095)。在30℃下每0.5min跟踪一次使用酶标仪(来自博奥-宝特仪器公司(Bio-TekInstruments Inc.)的Power Wave X)进行的410nm读数。N＝2。
结果
表3显示在测定条件下并且在40℃下预孵育60min，在500个单位胃蛋白酶/mL预孵育混合物存在下，对于所有三肽基肽酶发现残留活性超过80％。
表3：三肽基肽酶的活性恢复
样品 TRI043 TRI050 TRI053 TRI071 TRI071 TRI071 TRI071
无胃蛋白酶 0.379 0.919 0.525 1.219 1.105 0.936 1.214
有胃蛋白酶 0.529 0.880 0.588 1.118 1.127 0.924 1.091
活性恢复(％) 140 96 112 112 102 99 90
实例6
分析脯氨酸耐受性三肽基肽酶(3PP)在pH 2.5、40℃下60min的低pH稳定性
作为对单胃动物饲料中酶的使用的要求，酶应当在较低pH下具有活性。由于这个原因，已经在pH 2.5下使用对合成底物AAF-pNA的反应来测试三肽基肽酶的数目。
在DMSO中以2.5mg/ml制备三肽底物AAF-pNA。三肽基肽酶用作肉汤。在96孔孵育板中制备含有2.5μl酶和90μL GAT缓冲液(pH 2.5)的反应混合物。
将孵育板混合并在40℃下孵育60min。然后向每个孔中添加50μl 0.2M Mes-NaOHpH 6.0，以600rpm混合2min。然后，将5μl孵育混合物置于96孔测定板中，该测定板已经填充有85μl 0.1M乙酸缓冲液(pH 4.0)和5μl 2.5mg/ml AAF-pNA溶液。
将反应混合物在600rpm下搅拌2min，并在酶标仪中在30℃下在410nm处每0.5min一次直接读取持续15min。
为了测量初始酶活性，除了在40℃下酶孵育60min的步骤之外，进行类似的程序。
用活性恢复测量的初始和最终活性的结果提供于表4中。
表4.对三肽基肽酶的初始、最终活性及其恢复。
从表4可以看出，上面列出的三肽基肽酶在pH2.5和40℃下持续60分钟相当稳定，因为保留了70％以上的活性。从这些结果可以得出结论，上面列出的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在低pH下(例如在单胃的上消化道中)是稳定的。
结论
这项工作显示酶在模拟单胃消化系统的条件下的活性。显示上面列出的三肽基肽酶在低pH下和在胃蛋白酶存在下是稳定的，因此是饲料应用的理想选择。
实例7
在动物饲料中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶
从商业孵化场购买了总共有288只一天大的Ross 308雄性肉仔鸡。在研究开始时，根据通过分区进行的各自的处理，将8只禽随机分配到层架式笼子中。仅选择健康的禽用于实验，并且在整个研究过程中没有禽被更换。该研究由以下处理组成(表5)：
表5-实验设计
商业蛋白酶产品A是胰蛋白酶家族蛋白酶，并且商业蛋白酶产品B是枯草杆菌蛋白酶家族蛋白酶，它们都不是根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
在研究开始(d0)、第14天和在研究终止(d21)时记录禽重量。笼子是实验单位。饮食以糊状形式喂养，并且配制成符合或超过NRC标准，除了Ca和AvP外(表5)。使用戴维斯(Davies)S-20混合器将所有饲料混合，在每个处理之间冲洗混合器以防止口粮之间的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每个处理饮食中收集样品，并且一起切碎用于分析饲料中的酶活性。
所有的禽都饲喂玉米大豆基础口粮直到第14天；从第14天起饲喂处理口粮。将植酸酶添加到所有的处理口粮中。在饲料更换时，将饲养者从笼子中移走、反向称重、清空、并用适当的处理饮食重新填充。在研究的最后一天(d21)，称重饲料和禽以确定实验期间的摄食量(FI)和增重(BWG)。每天检查禽的死亡率。当禽被剔除或发现死亡时，记录日期和移除重量(kg)。对所有死亡或被剔除的禽进行了肉眼尸检，以确定死亡的可能原因。确定针对死亡率进行了校正的饲料转化率(FCR)。
在d21时，通过心脏内注射戊巴比妥钠将每个笼子中的所有禽进行安乐死，并用蒸馏水轻轻冲洗来呈现回肠较下部分的内容物。合并笼子内的禽的消化物，产生8个样品/饮食处理。收集后，立即将消化物样品冷冻、干燥并加工。分析饮食和消化物样品的标记、氮(N)和总能量以便计算消化率系数。
表6-饮食配制品
成分％ 0-14天 14-21天
玉蜀黍 48.78 57.09
大豆粉，48％CP 40.06 34.7
卡诺拉粉 4 4
大豆油 3 1.35
L-赖氨酸HCl 0.13 0.07
DL-甲硫氨酸 0.28 0.22
L-苏氨酸 0.03 0
盐 0.33 0.33
石灰岩 1 0.98
磷酸氢钙 2.09 0.97
家禽Vits/TE's 0.3 0.3
计算分析
蛋白质％ 24.98 22.97
MEP MJ/KG 12.4 12.34
钙％ 1.05 0.76
AV PHOS％ 0.5 0.3
ALYS％ 1.27 1.1
AM+C％ 0.94 0.84
ATHRE％ 0.83 0.73
ATRYP％ 0.26 0.23
统计分析
使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶和酶剂量之间的差异。将笼子用作实验单位。
结果
表7-性能和消化率结果
每个值代表9个重复的平均值(每个重复8只禽)。
ab不共享上标的列中的平均值不同(P<0.05)。
商业蛋白酶A是胰蛋白酶家族蛋白酶，并且商业蛋白酶B是枯草杆菌蛋白酶家族蛋白酶，它们都不是根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶的补充导致与阴性对照和商业蛋白酶B相比FCR的显著降低以及与商业蛋白酶A相比数值的降低。
与NC相比，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的补充显著增加了BWG，对于商业蛋白酶A或商业蛋白酶B而言并不是这种情况。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶与对照和商业蛋白酶B相比显著增加了回肠N消化率(图11)。脯氨酸耐受性三肽基肽酶也显著增加了显著大于阴性对照和数值上大于两种商业蛋白酶的水平的被消化的能量(图12)。
结论
总之，在FCR和BWG方面，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的补充导致比NC和商业蛋白酶B显著更好的禽表现。当与商业蛋白酶A相比，当脯氨酸耐受性三肽基肽酶被补充时，存在BWG数值增加和FCR降低。
与商业蛋白酶相比，我们通过改善能量和蛋白质(N)消化率而推动的禽的性能的改善。
实例8
在动物饲料中酸性真菌蛋白酶( AFP)和脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)的组合
总共有432只一天大的Ross 308雄性肉仔鸡从商业孵化场购买。在研究开始时，根据通过分区进行的各自的处理，将8只禽随机分配到层架式笼子中。仅选择健康的禽用于实验，并且在整个研究过程中没有禽被更换。该研究由以下处理组成(表8)：
表8-实验设计
商业蛋白酶产品A是胰蛋白酶家族蛋白酶，并且商业蛋白酶产品B是枯草杆菌蛋白酶家族蛋白酶，它们都不是根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
在研究开始(d0)、第14天和在研究终止(d21)时记录禽重量。笼子是实验单位。饮食以糊状形式喂养，并且配制成符合或超过NRC标准，除了Ca和AvP外(表9.2)。使用戴维斯(Davies)S-20混合器将所有饲料混合，在每个处理之间冲洗混合器以防止口粮之间的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每个处理饮食中收集样品，并且一起切碎用于分析饲料中的酶活性。
表7-饮食配制品
所有的禽都饲喂玉米大豆基础口粮直到第14天；从第14天起饲喂处理口粮。将在研究中使用的酶剂量选择为最有商业意义的。将植酸酶添加到所有的处理口粮中。在饲料更换时，将饲养者从笼子中移走、反向称重、清空、并用适当的处理饮食重新填充。在研究的最后一天(d21)，称重饲料和禽以确定实验期间的摄食量(FI)和增重(BWG)。每天检查禽的死亡率。当禽被剔除或发现死亡时，记录日期和移除重量(kg)。对所有死亡或被剔除的禽进行了肉眼尸检，以确定死亡的可能原因。确定针对死亡率进行了校正的饲料转化率(FCR)。
在d21时，通过心脏内注射戊巴比妥钠将每个笼子中的所有禽进行安乐死，并用蒸馏水轻轻冲洗来呈现回肠较下部分的内容物。合并笼子内的禽的消化物，产生8个样品/饮食处理。收集后，立即将消化物样品冷冻、干燥并加工。分析饮食和消化物样品的标记、氮(N)和总能量以便计算消化率系数。
统计分析
使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶和酶剂量之间的差异。将笼子用作实验单位。
结果
表8-性能和消化率结果
每个值代表9个重复的平均值(每个重复8只禽)。
ab不共享上标的列中的平均值不同(P<0.05)。
从表8可以看出，处理对FCR有显著的影响，尽管FCR数值降低，喂食NC饮食和单独的AFP的禽之间没有显著的差异。然而，补充有AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合的饮食将FCR显著降低至低于对照和商业蛋白酶B的水平。
当NC饮食补充有单独的AFP时，回肠N消化率(％)的数值增加。随着除AFP外三肽基肽酶剂量增加，回肠N消化率逐步改善(％)，AFP和0.007g/MT三肽基肽酶的组合具有比单独的NC、商业蛋白酶B和AFP具有显著更高的回肠N消化率(％)。
类似地，随着除AFP外以渐增剂量添加三肽基肽酶，回肠能量消化率在数值上逐步增加，在所有情况下，AFP和三肽基肽酶的组合显著优于阴性对照。
结论
总之，AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合对改善禽的性能有有益的作用。这是由在饲喂组合而不仅仅是单独的AFP酶的禽中N和能量的回肠消化率增加所推动。AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合相较于一些商业蛋白酶赋予显著更高的N和能量消化率水平。
实例9
材料与方法
蛋白酶中蛋白质含量的评估
为了在测试中添加等量的蛋白酶，蛋白酶的蛋白质含量使用PierceTM BCA蛋白测定试剂盒进行测量。制备酶储备溶液，而其余的酶处于液体形式。蛋白酶用MQ水按1:10、1:100和1:1000稀释，其后根据试剂盒中的说明测量蛋白质含量。
用蛋白酶体外消化饲料
采用基于大豆-玉米的饲料，通过模拟上消化道(UGIT)进行体外消化以产生用于HT-29MTX E12细胞培养实验的测试材料。用研钵压碎5.0g粒化的鸡饲料，并用15ml MQ水水合。将蛋白酶添加到根据表1的消化物中，将pH调节至5.5，并且通过以5分钟间隔混合瓶子将消化物在39℃水浴下孵育20min。通过将2.5ml的1.5M HCl和2.5ml胃蛋白酶溶液(1.8mg/ml在MQ水中)添加到消化物中，调节pH至2.5，并且通过以5min间隔混合将瓶子在39℃水浴中孵育40min来模拟前胃和喉咙的条件。通过添加含有18.5mg胰液素的2.5ml的NaHCO3，将pH调节至6.3-6.5，并通过以5min间隔混合将瓶子在39℃水浴下孵育60min来模拟小肠的条件。将消化物以30000×g离心30min，并且将上清液收集到新管中。通过将上清液在沸水中孵育4分钟来灭活消化性酶和蛋白酶。将消化物在冰上冷却并储存在冷冻库(-20℃)中用于细胞培养实验。
调整蛋白质的量，使得对于每种蛋白质，添加到细胞中的最终浓度为约1μg/ml溶液。
表9：消化物中蛋白酶的量
细胞培养
在37℃下、在8％CO2气氛中，将HT-29MTX E12细胞(HPA培养公司(HPA Cultures)，索尔兹伯里市(Salisbury)，英格兰)保持在补充有10％FBS、1×MEM非必需氨基酸、1×丙酮酸钠、1×抗生素-抗真菌剂的DMEM(高葡萄糖)中。从生命技术公司(Life Technologies)购买所有的培养基和补充剂。
对于调查蛋白酶对分化细胞的紧密连接和炎症标记物的影响的研究，将HT-29MTXE12细胞以5.7×104个细胞/孔的密度接种到完全培养上的大鼠尾部I型胶原包被的细胞培养插入物上并分化14天。在分化的第4天，使用插入物的顶面的无血清培养基和基面的完全培养基将细胞移动到不对称的血清条件。通过以三天间隔更换培养基，使用该条件直到分化结束。将测试溶液应用于细胞的顶端室。
ATP测量
将HT-29MTXE12细胞以2500个细胞/孔的密度接种在具有完全培养基的白色96孔微量板上过夜，然后为细胞更换无血清培养基用于又另外的过夜孵育。在培养的第3天，用测试材料处理细胞，并进行ATP测量。作为测试材料，将蛋白酶在SFM中稀释为0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml和5μg/ml(基于其蛋白质的量)。对于脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)和 AFP的组合，两种酶以相等的量添加。当使用饲料中的蛋白酶时，将饲料上清液在SFM中以1:1稀释，并如在体外消化中那样添加等量的蛋白酶(表3)。在开始实验15min或1h后，使用ATPLiteTM监测系统(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))按照制造商的说明测量细胞的ATP含量。
FITC-右旋糖酐渗透性测定
通过监测穿过分化的HT-29MTX E12细胞层的FITC右旋糖酐通量来研究蛋白酶对上皮层的大分子渗透性的影响。分化的细胞用HBSS培养基洗涤并在+37℃的HBSS中平衡30分钟。除去HBSS培养基，并向细胞中添加0.5ml测试溶液。通过用HBSS以1:1稀释体外消化的饲料，并向样品中添加两倍量的蛋白酶(1μg/ml和10μg/ml)来制备测试溶液。FITC-右旋糖酐(分子量10 000)以1mg/ml包含在测试溶液中。用测试溶液代替细胞顶端室中的HBSS，并将细胞置于培养箱中1h。在此期间，用轨道振摇器(30rpm)摇动细胞以最小化未搅拌的水层的影响。1h后，从基底外侧室抽取200μl样品，并将200μl新鲜的HBSS添加到基底外侧。使其持续另外的3小时。从研究开始已经进行24小时后抽取最终样品。之后测量样品的荧光，并使用以下公式计算Papp：
TEER测量
通过使用上皮伏特欧姆计(Epithelial Voltohmmeter)测量跨上皮电阻(TEER)来研究HT-29MTXE12细胞单层的完整性。在处理之前和之后测量TEER，从测量值中减去没有细胞的空滤波器的电阻，乘以滤波器的表面积，并且结果表示为Ω×cm2。从处理后测量的TEER中减去处理前测量的TEER，将该值除以处理前测量的TEER并乘以100，来计算处理后TEER的百分比变化。
结果
实例9.1
蛋白酶对经蛋白酶处理的细胞中ATP含量的影响
ATP缺乏是细胞毒性的标志，但也描述了细胞能量库的总体情况。在用通过ATPLiteTM系统直接与细胞培养基混合的蛋白酶处理后，从HT-29MTXE12细胞测量ATP含量。在用商业蛋白酶1和商业蛋白酶2处理1小时后，观察到显著的剂量依赖性变化(图13)。这将导致商业蛋白酶1和商业蛋白酶2对活细胞具有负面影响的假设。
实例9.2
经蛋白酶体外消化的饲料对细胞ATP含量的影响
使用含有蛋白酶的体外消化的饲料处理1小时后，也从HT-29 MTXE12细胞测量ATP含量。与对照体外消化的饲料相比，商业蛋白酶1和商业蛋白酶2的最高量显示ATP量的显著降低，并且因此导致细胞的可能的细胞毒性。这将证实高剂量的商业蛋白酶1和商业蛋白酶2对活细胞的负面影响(参见图14)。
实例9.3
渗透性评估
使用FITC-右旋糖酐渗透性测定法研究了经蛋白酶体外消化的饲料对大分子渗透性的影响。在经消化的饲料的热灭活之后，添加1μg/ml和10μg/ml的蛋白酶。在一些测定中，使用pH 6.5的培养基来评估较低pH的影响。对于FITC-右旋糖酐渗透性，将示踪剂与经体外消化的饲料混合并施用于顶端隔室。四小时后，计算渗透率(图15)。
从图中可以看出，商业蛋白酶1和商业蛋白酶2两者都显著增加了细胞的大分子渗透性，因此其对这些细胞具有负面影响。单独的TRI083或与 AFP组合都不会引发这样的反应。
在TEER测量期间观察到类似的现象。对于商业蛋白酶1和商业蛋白酶2(图16)，观察到紧密连接完整性的降低，这也将导致形成商业蛋白酶1和商业蛋白酶2对活细胞的负面影响的结论，而TRI083单独或与 AFP组合不会对细胞产生任何负面影响。
实例10
动物饲料中三肽基肽酶(TRI083)的补充改善了营养物消化率
从商业孵化场购买了总共288只一天大的Ross 308雄性肉仔鸡。在研究开始时，根据通过分区进行的各自的处理，将8只禽随机分配到层架式笼子中。仅选择健康的禽用于实验，并且在整个研究过程中没有禽被更换。该研究由以下处理组成(表10.1)：
表10.1-实验设计
在研究开始(d0)第14天和在研究终止(d21)时记录禽重量。笼子是实验单位。饮食以糊状形式喂养，并且配制成符合或超过NRC标准，除了Ca和AvP外(表10.2)。使用戴维斯(Davies)S-20混合器将所有饲料混合，在每个处理之间冲洗混合器以防止口粮之间的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每个处理饮食中收集样品，并且一起切碎用于分析饲料中的酶活性。
表10.2-饮食配制品
所有的禽都饲喂玉米大豆基础口粮直到第14天；从第14天起饲喂处理口粮。将在研究中使用的酶剂量选择为最有商业意义的。将植酸酶添加到所有的处理口粮中。在饲料更换时，将饲养者从笼子中移走、反向称重、清空、并用适当的处理饮食重新填充。在研究的最后一天(d21)，称重饲料和禽以确定实验期间的摄食量(FI)和增重(BWG)。每天检查禽的死亡率。当禽被剔除或发现死亡时，记录日期和移除重量(kg)。对所有死亡或被剔除的禽进行了肉眼尸检，以确定死亡的可能原因。确定针对死亡率进行了校正的饲料转化率(FCR)。
在d21时，通过心脏内注射戊巴比妥钠将每个笼子中的所有禽进行安乐死，并用蒸馏水轻轻冲洗来呈现回肠较下部分的内容物。合并笼子内的禽的消化物，产生8个样品/饮食处理。收集后，立即将消化物样品冷冻、干燥并加工。分析饮食和消化物样品的标记、氮(N)和总能量以便计算消化率系数。
统计分析
使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶和酶剂量之间的差异。将笼子用作实验单位。
结果
表10.3-性能和消化率结果
每个值代表9个重复的平均值(每个重复8只禽)。
ab不共享上标的列中的平均值不同(P<0.05)。
xy不共享共同上标的列中的平均值不同(P<0.1)
处理对FCR存在显著的影响，饲喂三肽基肽酶(TRI083)的禽具有比饲喂NC饮食和商业蛋白酶A的那些显著更低的FCR。
当NC饮食补充有三肽基肽酶(TRI083)时，回肠N消化率(％)存在显著增加。N消化率％的增加在三肽基肽酶(TRI083)和商业蛋白酶A之间是可比较的，三肽基肽酶(TRI083)和商业蛋白酶A两者都比商业蛋白酶B赋予显著更高的N消化率(图18)。
类似地，当补充每种蛋白酶时，回肠消化能相对于阴性对照存在显著增加；当补充三肽基肽酶(TRI083)时，回肠能量消化率在数值上最高(图19)。
结论
总之，三肽基肽酶(TRI083)通过降低FCR对改善禽的性能具有有益的影响。这是由在饲喂三肽基肽酶(TRI083)的禽内N和能量的回肠消化率的增加所推动。
三肽基肽酶(TRI083)比一些商业蛋白酶赋予显著更高的N和能量消化率水平。
实例11
在动物饲料中补充三肽基肽酶(TRI083)可以改善肉仔鸡的性能
从商业孵化场购买了总共1600只一天大的Ross 708雄性肉仔鸡。在研究开始时，根据通过分区进行的各自的处理，将40只禽随机分配到地面围栏中。仅选择健康的禽用于实验，并且在整个研究过程中没有禽被更换。该研究由以下处理组成(表11.1)：
表11.1-实验设计
在研究开始时(d0)、和在d10、d25饮食变化时、和在研究终止时(d42)时记录了禽的重量。围栏是实验单位。所有饮食都是以糊状形式饲喂的。配制PC饮食以满足或超过NRC标准，并且NC饮食被降低-用50％的PC饮食中氨基酸的未消化部分说明(表11.2)。使用戴维斯(Davies)S-20混合器将所有饲料混合，在每个处理之间冲洗混合器以防止口粮之间的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每个处理饮食中收集样品，并且一起切碎用于分析饲料中的酶活性。
表11.2-饮食配制品
在整个研究中给所有的禽都饲喂处理口粮。将在研究中使用的酶剂量选择为最有商业意义的。将植酸酶以500FTU/kg添加到所有处理口粮中。在饲料更换时，将饲养者从笼子中移走、反向称重、清空、并用适当的处理饮食重新填充。在研究的最后一天(d42)，称重饲料和禽以确定实验期间的摄食量(FI)和增重(BWG)。每天检查禽的死亡率。当禽被剔除或发现死亡时，记录日期和移除重量(kg)。对所有死亡或被剔除的禽进行了肉眼尸检，以确定死亡的可能原因。确定针对死亡率进行了校正的饲料转化率(FCR)。
统计分析
使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶和酶剂量之间的差异。围栏用作实验单位。
结果
表11.3-性能结果
每个值代表9个重复的平均值(每个重复8只禽)。
ab不共享上标的列中的平均值不同(P<0.05)。
处理对BWG有显著影响；饲喂NC饮食的禽比饲喂PC饮食的禽具有显著更低的体重。用商业蛋白酶A+B进行酶处理，在数量上增加体重，但不能达到与NC禽显著不同的水平。与NC相比，补充三肽基肽酶(TRI083)显著增加禽的增重至与PC禽无显著差异的水平(图20)。
类似地，NC禽中的FCR显著高于PC禽。与NC相比，商业蛋白酶A+B对FCR无显著影响。与NC禽相比，三肽基肽酶(TRI083)显著降低FCR至与PC禽无显著差异的水平(图21)。
结论
总之，三肽基肽酶(TRI083)通过在营养缺乏饮食中降低FCR和增加BWG对改善禽的性能具有有益的影响。
三肽基肽酶(TRI083)相比于商业蛋白酶A+B以更大的水平增加BWG和降低FCR。
实例12
在胃蛋白酶存在下TRI045(SEQ ID No.99)三肽基肽酶的稳定性
材料和方法
胃蛋白酶溶液：在该实例中使用来自西格玛公司的猪胃蛋白酶(P7000，674个西格玛单位/mg，www.sigma.com)，并以10000个西格玛单位/ml在MilliQ水中制备。
预孵育混合物包括：在96孔康宁MTP的半底部区域中的2.5μl sedolisin样品、95μl GAT缓冲液(50mM甘氨酸–50mM乙酸–50mM Tris，pH 3.5)、在milliQ水中的5μL胃蛋白酶(10000个西格玛单位/ml)(最终胃蛋白酶单位浓度：500个西格玛单位/ml反应混合物)。对于对照，预孵育混合物含有5μl水而不是5μl胃蛋白酶。将混合物在40℃下孵育60min，然后保存在冰上。为了测定残留活性，测定混合物含有5μl预孵育混合物、85μl的0.1M乙酸-乙酸钠(pH 4.0)、5μl的H-Ala-Ala-Phe-pNA(2.5mg/ml，来自BACHEM.com，L-1095.0250)。在30℃下每0.5min在酶标仪上跟进410nm读数。N＝2。
结果
在测定条件下并在40℃下预孵育60min，在500个单位胃蛋白酶/mL预孵育混合物存在下，对于TRI045发现残留活性超过90％。
实例13
TRI045(SEQ ID No.99)作为饲料酶促进饲料蛋白水解
动物产生并将蛋白酶分泌到消化道中用于饲料消化。这些蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的内切蛋白酶以及羧肽酶A和B等的外切肽酶。然而，动物不产生氨基肽酶作为消化酶或至少不是处于可感知的量。
如在本实例中所示，三肽基肽酶TRI045(sedolisin)的添加在基于玉米大豆饲料的体外系统中促进蛋白质消化。该实例显示TRI045在pH4和6.5之间具有高活性
材料和方法
在DMSO中以2.5mg/ml制备用于sedolisin的三肽底物H-Ala-Ala-Phe-pNA(来自BACHEM.com，L-1095.0250)。通过混合8.5μl AAF-pNA、7μl DMSO、32μl水和50μl缓冲液(pH4.14-6.57)和0.8μl或1.5μl TRI045来制备反应。通过添加酶TRI045在30℃下开始反应。使用酶标仪在96孔板中每隔0.5min间隔在410nm处记录初始反应速率。
结果
表12显示TRI045在pH 5.0附近具有最佳活性，但在pH 4和pH 6.5附近仍具有约50％活性，这对于胃部饲料消化是理想的。图22进一步显示在pH 5、pH 5.5和pH 6达到的最终反应度非常相似。高pH最适宜条件对于动物饲料是理想的，因为在这种情况下，胰液素将有时间为TRI045制备更多的寡肽底物。
表12.使用H-Ala-Ala-Phe-pNA作为底物时pH对TRI045活性的影响(值是使用0.8μl TRI045(n＝2)的一项测试和使用1.5μl TRI045剂量(n＝1)的一项测试的平均值)。
实例14
TRI045(SEQ ID No.99)加胃蛋白酶和胰液素对玉米大豆饲料底物的水解的影响。
体外反应体系含有140μl 10％(w/v)玉米大豆饲料浆料(14mg玉米大豆饲料)、在50mM MES-NaOH(pH 6.0)中的10μl TRI045、10μl猪胃蛋白酶(在水中1,14U/μL)。将反应物在40℃下振摇孵育45min，然后添加34μl猪胰液素(0.4636mg/mL，在1M碳酸氢钠中)，并且进一步孵育另外的60min。孵育后，将96孔板离心，并将上清液用于残留TRI045活性测定和用于OPA和BCA测定(见下文)。
可溶性蛋白质的水解度测量是基于伯胺基团与邻苯二甲醛(OPA-测定)的反应。参考文献：尼尔森(P.M.Nielsen)、彼得森(D.Petersen)和C.Dambmann，用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(Improved Method for Determining Food Protein Degree ofHydrolysis)，食品科学杂志(Journal of Food Science)，66(2001)642-646。
对于OPA测定，进行以下程序。将来自母板通过酶处理的10-25μl饲料样品转移到新板中，然后向板中添加175μl含有硼酸钠、十二烷基硫酸盐和二硫苏糖醇的OPA试剂。就在2分钟和5秒钟混合之后，进行在340nm处的光密度的终点测量。
为了定量每个蛋白酶样品的蛋白质浓度，使用皮尔斯公司(Pierce)BCA蛋白测定试剂试剂盒(赛默科技公司，目录号23228)。定量之前未纯化TRI045样品。皮尔斯公司BCA蛋白测定试剂盒是一种基于二喹啉甲酸(BCA)的洗涤剂兼容配制品，用于比色检测和总蛋白定量。该方法将通过在碱性介质中的蛋白质进行的从Cu2+至Cu1+的熟知的还原反应与使用含有二喹啉甲酸的独特试剂对亚铜阳离子(Cu+1)的高灵敏度和选择性比色检测相结合。该测定的紫色反应产物通过BCA的两个分子与一个亚铜离子的螯合来形成。这种水溶性复合物在562nm处显示出强烈的吸光度，其与在宽的工作范围(20-2000μg/mL)下增加的蛋白质浓度几乎成线性关系。据报道，蛋白质的大分子结构、肽键的数目和四种特定氨基酸半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的存在负责BCA的颜色形成。
对于OPA(释放的总氨基基团)和BCA(在可溶性级分中的总蛋白)确定，将上清液稀释20倍，并使用10ul进行。
在含有1000ppm的TRI045的系统中，在猪胃蛋白酶和胰液素的存在下，游离氨基基团从玉米大豆饲料中的释放(作为蛋白质水解(OPA值)的量度)增加了9％并且蛋白质溶解度增加了5％。
为了测试TRI045在上述体外测定条件下的稳定性(在胃蛋白酶存在下在pH3、40℃下孵育45min，随后在40℃下在胰液素存在下孵育60min)。随后测定TRI045的残留活性。反应混合物含有50μl缓冲液0.1M HAC-NaAC(pH5.0)、10μl上清液和5μl AAF-pNA(5mg/ml在DMSO中)。使用酶标仪，每30秒在410nm和30℃下跟踪反应速率。作为对照，使用相同浓度的1000ppm的商业蛋白酶。
实例12-14的结论
对照(仅胃蛋白酶和胰液素)的反应速率为4.3mOD/min，商业蛋白酶的反应速率为11.0mOD/min，并且TRI045的反应速率为19.3mOD/min。在减去对照(4.3mOD/min)后，TRI045对AAF-pNA底物的残留活性比商业蛋白酶高2.2倍。这些结果表明TRI045在40℃下对胃蛋白酶和胰液素稳定至少100分钟。
总之，该实例表明，当在3至7的pH范围下、在玉米大豆饲料存在下、在40℃下孵育105min时，TRI045对胃蛋白酶和胰液素稳定。当在模拟单胃消化系统的条件下将玉米大豆饲料用作底物时，在胃蛋白酶和胰液素的存在下还存在增加蛋白质溶解和蛋白质水解的另外的效果(贝德福德(BEDFORD，M.R.)和克拉森(CLASSEN，H.L.)(1993)“当在外源酶存在下饲喂基于黑麦的饮食时用于预测肉鸡肠粘度和生长的体外测定”，家禽科学(PoultryScience)，72:137-143)，即反应在40℃、pH 3.0-3.3下、在胃蛋白酶存在下进行45min，然后将pH升至pH 6.5-7.0，并且添加胰液素用于另外60min孵育，
在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域的技术人员将是显而易见的。尽管本发明已经结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解要求保护的本发明不应该不当地受限于此类特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的、用于执行本发明的所描述的实施例的各种修改旨在落入如下权利要求书的范围内。

Claims (37)

1.一种制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶与一种或多种选自下组的成分混合，该组由以下各项组成：盐、包括山梨糖醇和甘油的多元醇、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合；并且
(b)任选地进行封装，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该饲料添加剂组合物进一步包括至少一种内切蛋白酶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶进一步能够从在P1和P1’处具有脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种内切蛋白酶是酸性内切蛋白酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该内切蛋白酶和脯氨酸耐受性三肽基肽酶与包含至少一种蛋白质或蛋白质的至少一部分的组合物混合，其中该组合物、该内切蛋白酶和脯氨酸耐受性三肽基肽酶或其组合当混合时处于干燥或实质上干燥的状态。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据权利要求2-6中任一项所述的该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或该至少一种内切蛋白酶或其组合在与所述组合物混合之前被胶囊化或以其他方式灭活。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种蛋白质或其部分是动物蛋白质或植物蛋白质(例如选自以下各项中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，大豆球蛋白，β-伴大豆球蛋白，十字花科蛋白，油菜籽蛋白，大麦醇溶蛋白，角蛋白，羽毛或毛发粉，胶原蛋白，乳清蛋白，鱼蛋白，鱼粉，肉类蛋白，蛋类蛋白，大豆蛋白，或谷物蛋白)，优选地包含于以下各项中：玉米、大豆粉、玉米干酒糟及可溶物(cDDGS)、小麦、包括谷蛋白的小麦蛋白、小麦副产品、麦麸、小麦干酒糟及可溶物(wDDGS)、包括玉米蛋白粉的玉米副产品、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、全脂大豆、动物副产品粉、醇溶性蛋白(优选是玉米蛋白(例玉蜀黍玉米蛋白)和/或高粱醇溶蛋白(例如来自高粱))、来自油料种子的蛋白质(优选来自大豆种子蛋白、向日葵种子蛋白、油菜籽蛋白、卡诺拉种子蛋白或其组合)或其组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获自木霉属，优选可获自里氏木霉。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99或其功能片段；
(b)包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段；
(c)由包含序列SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码；
(d)由与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.96或SEQ ID No.97具有至少约70％序列同一性的核苷酸序列编码；
(e)由在中等严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码；或者
(f)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ IDNo.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ IDNo.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶由包含SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.96、SEQ ID No.97的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列或在高严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的序列编码。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含氨基酸序列SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99或与其具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
13.一种饲料添加剂组合物，通过根据前述权利要求中任一项所述的方法可获得(例如获得)。
14.一种饲料添加剂组合物或一种饲料成分，包含至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类；并且
包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：盐、包括山梨糖醇和甘油的多元醇、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、聚乙烯醇(PVA)、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
15.根据权利要求14所述的饲料添加剂组合物或饲料成分，其中所述饲料添加剂组合物或饲料成分进一步包括至少一种内切蛋白酶。
16.根据权利要求15所述的饲料添加剂组合物或饲料成分，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
17.一种试剂盒，包含至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类；并且包含用于将该试剂盒给予至动物的说明书。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含至少一种内切蛋白酶。
19.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
20.一种预混物，包含根据权利要求13至16中任一项所述的饲料添加剂组合物或饲料成分或通过如权利要求1-12中任一项所述的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
21.一种制备喂养料的方法，该方法包括使饲料组分与根据权利要求13至16中任一项所述的饲料添加剂组合物或饲料成分接触，或与通过如权利要求1-12中任一项所述的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物接触，或与根据权利要求20所述的预混物接触，或与至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶接触，任选地与至少一种内切蛋白酶组合，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
22.一种喂养料，该喂养料包括根据权利要求13至16中任一项所述的饲料添加剂组合物或饲料成分或通过如权利要求1-12或权利要求21中任一项所述的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物或根据权利要求20所述的预混物或包括至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
23.一种用于改善动物的生物物理特征或用于改善动物的蛋白质消化率的方法，该方法包括向动物给予通过如权利要求1-12中任一项所述的方法或用途可获得的(例如获得的)饲料添加剂组合物或根据权利要求13至16中任一项所述的饲料添加剂组合物或根据权利要求22所述的喂养料或根据权利要求20所述的预混物或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类；以及
任选地给予至少一种饲料组分和/或至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该方法包括向动物给予至少一种内切蛋白酶。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
26.根据权利要求13-16中任一项所述的饲料添加剂组合物或饲料成分或通过根据权利要求1-12中任一项所述的方法可获得的(优选获得的)饲料添加剂组合物或根据权利要求22所述的饲料或喂养料或根据权利要求20所述的预混物或至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的用途，用于改善动物中的蛋白质消化率或用于改善动物的生物物理特征，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或者
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
27.根据权利要求26所述的用途，其中组合使用至少一种内切蛋白酶。
28.根据权利要求26或27所述的用途，其中该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸或胺类。
29.根据权利要求23-25中任一项所述的方法或根据权利要求26-28中任一项所述的用途，其中该生物物理特性选自下组，该组由以下各项中的一种或多种组成：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养物消化率，包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响，例如粪肥输出和/或氮排泄。
30.根据权利要求23-25或29中任一项所述的方法或根据权利要求26-29中任一项所述的用途，其中该生物物理特征是消化蛋白质的能力。
31.根据权利要求1-12或23-25或29-30中任一项所述的方法或根据权利要求26-30中任一项所述的用途，其中将该至少一种内切蛋白酶、脯氨酸耐受性三肽基肽酶或其组合在将该饲料添加剂组合物饲喂给动物之前与至少一种蛋白质或其部分混合。
32.根据权利要求1-12或23-25或29-31中任一项所述的方法或根据权利要求26-31中任一项所述的用途，其中通过将至少一种内切蛋白酶、脯氨酸耐受性三肽基肽酶或其组合饲喂给动物来激活该至少一种内切蛋白酶、三肽基肽酶或其组合。
33.根据权利要求1-12或23-25或29-32中任一项所述的方法或根据权利要求26-32中任一项所述的用途，其中该内切蛋白酶和脯氨酸耐受性三肽基肽酶在动物的胃肠道中是起作用的或主要起作用的。
34.根据权利要求1-12或23-25或29-33中任一项所述的方法或根据权利要求26-32中任一项所述的用途或根据权利要求13-16中任一项所述的饲料添加剂组合物或根据权利要求20所述的预混物或根据权利要求22所述的喂养料，其中在将该饲料添加剂组合物和/或预混物和/或喂养料饲喂给动物之前，该内切蛋白酶和/或脯氨酸耐受性三肽基肽酶在该饲料添加剂组合物中和/或在该预混物中和/或在该喂养料中是无活性的(或实质上无活性的)。
35.根据权利要求1-12或23-25或29-34中任一项所述的方法或根据权利要求26-34中任一项所述的用途，其中该至少一种内切蛋白酶和至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶在十二指肠和十二指肠前的动物胃肠道部分中是有活性的。
36.根据权利要求1-12或23-25或29-35中任一项所述的方法或根据权利要求26-35中任一项所述的用途，其中当与不饲喂所述饲料添加剂组合物的动物相比时，当给动物饲喂所述饲料添加剂组合物时不实质上增加所述动物中坏死性肠炎的发生率。
37.一种如本文中参考说明书、实例和附图所描述的方法、用途、饲料添加剂组合物、饲料添加剂试剂盒、饲料或喂养料或预混物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107467370A (zh) * 2017-10-13 2017-12-15 无锡正大生物股份有限公司 一种饲料用功能性诱食剂及其制备方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018015697A (es) * 2016-06-23 2019-05-27 Ew Nutrition Gmbh Composición de alimentación que comprende una proteasa ácida.
WO2018005229A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps In feed assay of microbial proteases using peptide substrates
CN110099698B (zh) 2016-12-23 2023-02-17 海德堡医药研究有限责任公司 鹅膏蕈碱抗体缀合物
WO2018224035A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Novozymes A/S Polypeptide, use and method for hydrolysing protein
US10980253B2 (en) * 2017-12-28 2021-04-20 Global Earth Solutions, Llc Composition, system and method for pellet or flake production
CA3113290A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Imbria Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating and preventing leber's hereditary optic neuropathy
CN110551790B (zh) * 2019-07-29 2021-09-14 浙江大学 一种乳源活性肽的制备方法及应用
CN117491351B (zh) * 2023-12-27 2024-04-05 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种肉鸡饲料有效磷的仿生消化测定试剂盒和测定方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821104A (en) * 1994-11-08 1998-10-13 Novo Nordisk A/S Tripeptidyl aminopeptidase
WO2002068623A2 (en) * 2001-02-23 2002-09-06 Dsm Ip Assets B.V. Genes encoding proteolytic enzymes from aspargilli
WO2011077359A2 (en) * 2009-12-21 2011-06-30 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
US7972808B2 (en) * 2002-06-04 2011-07-05 Dsm Ip Assets B.V. Protein hydrolysate rich in tripeptides
WO2013102674A2 (en) * 2012-01-05 2013-07-11 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Protease deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DE3590766T (zh) 1985-03-30 1987-04-23
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
BR9106435A (pt) 1990-05-09 1993-05-04 Novo Nordisk As Preparado de celulase,enzima demonstrando atividade de andoglucanase,enzima de endoglucanase,construcao de dna,vetor de expressao celula,processo para produzir uma enzima de endoglucanase,aditivo composicao detergente,e processo para reduzir a taxa em que os tecidos contendo celulose,se tornam asperos,prover clareamento da cor de tecidos contendo celulose colorida,prover uma variacao localizada da cor de tecidos contendo colorida,e melhorar as propriedades de drenagem de polpa
DE4112440C1 (zh) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
US5486461A (en) * 1991-11-08 1996-01-23 Novo Nordisk A/S Casein hydrolyzate and method for production of such casein hydrolyzate
AU666443B2 (en) 1992-12-10 1996-02-08 Dsm N.V. Production of heterologous proteins in filamentous fungi
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
CN1120235C (zh) 1996-03-27 2003-09-03 诺沃奇梅兹有限公司 碱性蛋白酶缺陷型丝状真菌
CA2329122A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
EP1851323B1 (en) * 2005-02-24 2016-09-28 DSM IP Assets B.V. Enzymatic process for producing I-P-P from kappa casein
JP2008539204A (ja) * 2005-04-28 2008-11-13 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 血圧降下タンパク質加水分解物
MX354218B (es) 2005-10-12 2018-02-19 Genencor Int Inc Star Granulos estables y durables con agentes activos.
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
AU2012348782B2 (en) * 2011-12-06 2017-10-26 Fondazione Istituto Insubrico Di Ricerca Per La Vita New proteases able to hydrolyze gluten peptides and proteins at acidic pH, from the Actinomycete Actinoallomurus
CN102771749B (zh) * 2012-07-16 2013-10-16 中国农业科学院农产品加工研究所 一种利用小麦面筋蛋白制备热反应肉味香精的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821104A (en) * 1994-11-08 1998-10-13 Novo Nordisk A/S Tripeptidyl aminopeptidase
WO2002068623A2 (en) * 2001-02-23 2002-09-06 Dsm Ip Assets B.V. Genes encoding proteolytic enzymes from aspargilli
US7972808B2 (en) * 2002-06-04 2011-07-05 Dsm Ip Assets B.V. Protein hydrolysate rich in tripeptides
WO2011077359A2 (en) * 2009-12-21 2011-06-30 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
WO2013102674A2 (en) * 2012-01-05 2013-07-11 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Protease deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UTZ REICHARD,等: "Sedolisins, a New Class of Secreted Proteases from Aspergillus fumigatus", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107467370A (zh) * 2017-10-13 2017-12-15 无锡正大生物股份有限公司 一种饲料用功能性诱食剂及其制备方法

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