CN104024408B - 具有蛋白酶活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同生产这些多肽以及在例如动物饲料和洗涤剂中使用这些多肽的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽

参考序列表

本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体，载体和宿主细胞(包含植物和动物细胞)，以及生产和使用(尤其在动物饲料和洗涤剂中使用这些蛋白酶)这些蛋白酶的方法。

发明背景

在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物性蛋白来源获得这些必需蛋白。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。

当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆饼粉固体未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。

动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多鱼中，胃展现了低至pH1-2的强酸性pH，而肠展现了在pH6-7范围内的一个更中性的pH。除了胃和肠之外在胃之前家禽还具有一个嗉囊，该嗉囊中的pH主要取决于咽下的饲料并因此典型地处于pH4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，假如该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下的话。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的的：它是高度地酸稳定的以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的宽的生理pH下是有效地有活性的。

另外，动物饲料常常是以丸形式配制的，其中在该造丸过程中采用蒸汽。因此以下也是令人希望的，在动物饲料中使用的蛋白酶能在暴露于蒸汽处理之后保持活性。

多年以来，蛋白酶也被用在洗涤剂组合物中用于水解纺织品、硬质表面和其他表面(例如皮肤等)上的朊材料。这类洗涤剂组合物可通过粉末、片或肥皂条以手洗或自动化机器的方式用于纺织品的清洁中，以及作为粉末和片通过手工或机器的方式用在餐具洗涤中。

本发明的新的S53家族蛋白酶对于这些目的也是有用的。

为了生产用于工业使用的蛋白酶，重要的是生产高产量的蛋白酶，使得可获得足够量的该产品以能够以有利的价格提供该蛋白酶。

具有蛋白酶活性的多肽

具有蛋白酶活性的多肽、或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，该底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

本文将术语“蛋白酶”定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如此处使用的术语“母体蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包含任何属于EC3.4酶组的酶(包含其13个亚类中的每一个)。该EC编号指的是酶命名法(Enzyme Nomenclature)，1992来自NC-IUBMB，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚，包含增刊1-5，各自发表于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Bio-chem.)1994,223,1-5；欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1995,232,1-6；欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1996,237,1-5；欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1997,250,1-6；以及欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)1999,264,610-650。命名定期得以增补和更新；见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/en-zyme/index.html。

本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自由以下各项组成的组:

(a)属于EC3.4.21.酶组的蛋白酶；和/或

(b)S53肽酶家族的丝氨酸蛋白酶，其包含两种不同类型的肽酶：三肽氨肽酶(外切型)和内切肽酶。

如在生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.,巴雷特(Barrett)，A.J.&贝特曼(Bateman)，A.(2010)MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database).核酸研究(Nucleic Acids Res)38,D227-D233中。

S53肽酶家族包含酸起作用的内肽酶和三肽-肽酶。

催化三联体的残基是Glu、Asp、Ser，并且在氧阴离子穴中存在一个另外的酸性残基Asp。该Ser残基在枯草杆菌蛋白酶的Asp、His、Ser三联体中是等价于Ser的亲核体，并且该三联体的Glu是枯草杆菌蛋白酶中的广义碱基His的一个代替物。

该催化三联体或氧阴离子穴的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化和损失。来自芽孢杆菌19138(SEQ ID NO:5)的S53蛋白酶的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸的可能是位置Glu-82、Asp-86、Asp-175和Ser-353。

该S53家族的肽酶倾向于在酸性pH下最有活性(不像同源的枯草杆菌蛋白酶)，并且这可归因于羧基残基(尤其Asp)在该氧阴离子穴中的功能的重要性。

这些氨基酸序列不与S8家族中的那些密切相似，并且这一点与完全不同的活性部位残基以及关于最大活性的所得的较低的pH一起，为该家族提供了实质性的差异。

肽酶单元的蛋白折叠对于这个家族的成员来说与枯草杆菌蛋白酶的类似，亲族SB类型的实例。

关于本发明，鉴定并克隆了在低pH(3-4)下对大豆-玉米粉具有高活性的来自芽胞杆菌19138的一种新的S53蛋白酶。

为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行确定，而不论其是天然发生或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。

可使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包含与所讨论的蛋白酶的特异性有关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15、20、25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90、或95℃。蛋白酶底物的实例是胶原蛋白，如天青精交联的胶原蛋白(AZCL-胶原蛋白)，或suc-AAPR-pNA。适合的蛋白酶测定的实例在实验部分中描述。

相关技术说明

从芽胞杆菌分离的S53蛋白酶是本领域已知的。一个实例是凝结芽孢杆菌，从其中已经指定了与本发明的SEQ ID NO:5具有41.3％和37.2％的一致性的两种S53蛋白酶，并且芽胞杆菌MN-32与本发明的SEQ ID NO:5具有39.5％的一致性。

在诺埃尔(Noelling)等人，‘产溶媒细菌丙酮丁醇梭杆菌的基因组序列和比较分析(Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producingbacterium Clostridium acetobutylicum)’细菌学杂志(J Bacteriol.)183:4823-4838(2001)中，披露了与本发明的SEQ ID NO:5具有65.9％的一致性的一种可能的周质天冬氨酰蛋白酶(UNIPROT:Q97LD7，SEQ ID NO:9)。该公开表明它是一种丝氨酸蛋白酶。具有UNIPROT编号F0K735的相同序列也被胡(Hu)等人在‘在丙酮丁醇梭杆菌EA2018中的比较基因组和转录组分析显示与溶媒形成和木糖利用相关的遗传特征(Comparative genomicand transcriptomic analysis revealed genetic characteristics related tosolvent formation and xylose utilization in Clostridium acetobutylicumEA2018)’，BMC基因组学(BMC Genomics)12:93-93(2011)中披露，并且此外，包(Bao)，G李(Li)，Y在2011年4月将其提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库UNIPROT:F7ZTR3。

在WO2005/066339中，来自脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclusbacillus sp.)菌株的两个序列(SEQ ID NO:29和30)作为丝氨酸-羧基蛋白酶被披露。这些序列与本发明的SEQ IDNO:5具有52.3％的一致性。本申请未指出具有SEQ ID NO:29或30的肽的任何特异性用途，但指出包含所披露的各种肽的组合物在洗涤剂、食物、烘焙产品、酿造产品、果汁、动物饲料、制浆等中的用途。

本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S53肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了pH特性，尤其是pH稳定性特性，这使它们作为用于动物饲料和其他应用的候选物具有实质性利益。

本发明的蛋白酶是具有胰蛋白酶样特异性的酸性蛋白酶。这些蛋白酶在一个宽的从3-6的pH的范围下对Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA具有活性，并在经受低至3的pH2小时之后保持了多于80％的活性。

在动物饲料中使用蛋白酶以改善蛋白在饲料中的消化是已知的。WO95/28850披露了一种肌醇六磷酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶组合以改善植物性蛋白的溶解度。WO01/58275披露了在动物饲料中使用枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶。WO01/58276披露了在动物饲料中使用与以下蛋白酶相关的酸稳定性蛋白：拟诺卡菌NRRL18262(10R蛋白酶)，连同衍生自白拟诺卡氏菌DSM14010的一种蛋白酶。WO04/072221、WO04/111220、WO04/111223、WO05/035747、和WO05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶和它们在动物饲料中的使用。另外，WO04/072279披露了其他蛋白酶的使用。

WO04/034776披露了一种枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的使用。WO04/077960披露了一种通过采用一种细菌或真菌蛋白酶增加草料或谷物在反刍动物中的消化率的方法。

包含一种蛋白酶的并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包含ProAct(DSM NP/诺维信公司(Novozymes))、(丹尼斯克公司(Danisco))、(丹尼斯克公司)、(丹尼斯克公司)、Allzyme^TM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、Poultrygrow^TM(杰夫公司(Jefo))和DP100(诺伟思公司(Novus))。

发明概述

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自由以下各项组成的组：

(a)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；

(b)由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，

(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；

(d)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的置换、缺失、和/或插入的变体；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、以及重组宿主细胞，并涉及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物，例如动物饲料组合物或洗涤剂组合物，连同包含本发明的多肽的动物饲料添加剂。本发明进一步涉及制备用于动物饲料的一种组合物以提高动物饲料的营养价值的方法，以及处理蛋白以用在动物饲料组合物中的方法。

附图简要说明

在附图中：

图1显示来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶与10R蛋白酶相比的pH-活性曲线。Suc-AAPR-pNA被用作来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶的底物。Suc-AAPF-pNA被用作10R蛋白酶的底物。

图2显示来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶与10R蛋白酶相比在37℃下2小时之后的pH稳定性曲线(残余活性)。

图3显示与10R蛋白酶在pH6.5下的温度活性曲线相比来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶在pH4.0下的温度活性曲线。

图4显示与10R蛋白酶在pH9.0下对10Suc-AAPX-pNA底物的P1特异性相比来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶在pH4.0下对10Suc-AAPX-pNA底物的P1特异性。

图5显示来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶与10R蛋白酶相比对大豆-玉米粉的相对活性。

图6显示以升高的蛋白酶剂量在砂囊消化物孵育1小时后与未孵育的样品相比的游离α-氨基基团的水平，并且

图7显示在用来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶或10R蛋白酶处理之后并在胃孵育(■)和完全胃+肠道孵育(□)之后测量的体外消化样品中的蛋白水解度(DH，％)。不同的字母表明统计上显著的差异。

序列表综述

SEQ ID NO:1是如从芽孢杆菌19138中分离的DNA序列。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1演绎的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是具有HQ标记的重组表达DNA序列的DNA序列。

SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3演绎的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是成熟蛋白酶芽孢杆菌19138的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是从SEQ ID NO.3获得的成熟蛋白酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是10R蛋白酶(WO05/035747，SEQ ID NO:1)的DNA序列。

SEQ ID NO:8是10R蛋白酶(WO05/035747，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是来自丙酮丁醇梭杆菌(SWISSPROT:F0K735)的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是迟缓芽孢杆菌分泌信号。

序列的一致性矩阵

定义

等位基因变体:术语“等位基因变体”意思指占据同一染色体基因座的一个基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。一种多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的一种多肽。

cDNA：术语“cDNA”意思指可以由从一个真核细胞获得的经过剪接的成熟mRNA分子通过反转录来制备的一种DNA分子。cDNA缺乏内含子序列，这些序列可以存在于相应的基因组DNA中。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由一个开放阅读框确定，通常始于ATG起始密码子或替代起始密码子如GTG和TTG，并以终止密码子如TAA、TAG、和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的多肽的多核苷酸所需的所有元件。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的或外来的，或对于彼此来说是天然的或外来的。这类控制序列包含但不限于一个前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，该控制序列包含一个启动子，以及转录和翻译终止信号。该控制序列可配备有接头，目的是引入特异性限制性位点，促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区域的连接。

表达：术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的额外的核苷酸相连接的线性或环状DNA分子。

片段：术语“片段”意指使一个或多个(若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽，其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面，一个片段包含至少415个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸11-425)，至少425个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸6至430)。在另一个方面，一个片段包含至少420个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:4的氨基酸11-430)，至少430个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:4的氨基酸6至435)。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指容易被包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包含母体细胞的与其不完全相同的任何子代，这种不同归因于发生在复制期间的突变。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指被人手修饰的多核苷酸，相对于在自然中发现的多核苷酸。在一个方面，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的，更多至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，至少90％纯的，以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定的。该多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成起源的，或其任意组合。

分离的多肽：术语“分离的多肽”意指被人手修饰的多肽，相对于在自然中发现的多肽。在一个方面，该多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。

成熟的多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的编号中的氨基酸1至435，SEQ ID NO:2的氨基酸-204至-177是一个信号肽。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:4的编号中的氨基酸1至442，SEQ ID NO:4的氨基酸-203至-177是一个信号肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟肽编码序列”意指编码一种具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸613-1917。在SEQ ID NO:1的编号中的其他核苷酸1至84编码一种信号肽。在另一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的编号中的核苷酸610-1929。在SEQ ID NO:3的编号中的其他核苷酸1至81编码一种信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链亦或双链的核酸分子。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构造，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，这样使得控制序列指导编码序列的表达。

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中存在P1处Arg或Lys后酰胺底物的裂解；糜蛋白酶样，其中裂解发生在P1处疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，在P1处Ala之后裂解。出于本发明的目的，根据以下的“材料与方法”中描述的过程确定蛋白酶活性。

本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:5的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。可替代地，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。

序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，1970，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice(赖斯)等人，2000，Trends Genet.(遗传学趋势)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(翁施)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，Rice(赖斯)等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用的任选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严谨度条件：不同的严谨度条件定义如下。

术语“非常低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在45℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在50℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在55℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在60℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在70℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。在一个方面，一个子序列包含至少1245个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸643至1887)，例如以及至少1275个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸628至1902)。在另一个方面，一个子序列包含至少1260个核苷酸(例如SEQ ID NO:3的核苷酸640至1899)，例如以及至少1290个核苷酸(例如SEQ ID NO:3的核苷酸625至1914)。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内部的形式下的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组结合的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指按重量计包含最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多肽天然或重组结合的其他多肽物质的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该多肽是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％、至少99.5％纯的、和100％纯的。本发明的多肽优选地处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基置换、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。置换意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

发明详细说明

具有蛋白酶活性的多肽

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自由以下各项组成的组：

(a)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽；

(b)由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽：

(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，和/或

(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；

(d)包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或多个(若干个)氨基酸的置换、缺失、和/或插入的变体；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

本发明涉及分离的多肽,这些分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽相差不多于五十个氨基酸，例如相差四十三个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十五个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽的多肽具有至少80％，例如至少85％，例如至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ IDNO:2的成熟多肽相差不多于五十个氨基酸，例如相差四十三个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十五个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明进一步涉及分离的多肽,这些分离的多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽的多肽相差不多于五十个氨基酸，例如相差四十三个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十五个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽的多肽具有至少80％，例如至少85％，例如至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ IDNO:4的成熟多肽相差不多于五十个氨基酸，例如相差四十三个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十五个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少90％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少91％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少92％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少93％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少94％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少95％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少96％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少97％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少98％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有至少99％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:5的多肽具有100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，例如至少85％，例如至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:5的多肽相差不多于五十个氨基酸，例如相差四十三个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十五个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少85％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少90％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少91％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少92％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少93％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少94％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少95％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少96％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少97％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少98％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有至少99％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明的一个实施例是一种多肽或由与SEQ ID NO:6的多肽具有100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽。

本发明还涉及分离的多肽在动物饲料中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％，例如至少85％，例如至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差不多于五十个氨基酸，例如相差四十三个氨基酸、相差四十个氨基酸、相差三十五个氨基酸、相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N端和/或C端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至435或由其构成。

本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N端和/或C端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸1至442或由其构成。

本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N端和/或C端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸1至435或由其构成。

本发明的多肽优选地包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N端和/或C端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸1至442或由其构成。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约)。

SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或其片段，可以用于设计核酸探针，用以根据本领域中众所周知的方法从不同属或种的菌株中鉴别并且克隆出编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体而言，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白)，以检测相对应的基因。这类探针涵盖于本发明中。

可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3同源的克隆或DNA或其子序列，优选地在DNA印迹中使用载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸在中至非常高严谨度条件下与标记的核酸探针杂交，该标记的核酸探针相应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；其全长互补链；或其子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片而进行检测。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是其片段。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸，或其片段。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严谨度条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃(高严谨度)和在70℃(非常高严谨度)使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针而言，严谨度条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算法所计算的T_m以下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特(Denhardt)溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后将载体材料在计算的T_m以下5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次持续15分钟并且使用6X SSC洗涤2次，每次15分钟。

本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

本发明进一步涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

在具体实施例中，本发明和根据本发明使用的母体蛋白酶和/或蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：

(a)属于EC3.4.21.酶组的蛋白酶；以及

(b)S53肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；如在生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.5(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.,巴雷特(Barrett)，A.J.&贝特曼(Bateman)，A.(2010)MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database).核酸研究(Nucleic Acids Res)38,D227-D233中。

为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行确定，而不论其是天然或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。

本发明还涉及变体，这些变体包含SEQ ID NO:2的多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的置换、缺失和/或插入。可替代地，本发明还涉及在一个或多个(若干个)位置处包含一个置换、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的多肽的变体。SEQ ID NO:2的多肽的氨基酸置换、缺失和/或插入的总数量不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

本发明还涉及变体，这些变体包含SEQ ID NO:4的多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的置换、缺失和/或插入。可替代地，本发明还涉及在一个或多个(若干个)位置处包含一个置换、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:4的多肽的变体。SEQ ID NO:4的多肽的氨基酸置换、缺失和/或插入的总数量不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

本发明还涉及变体，这些变体包含SEQ ID NO:5的多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的置换、缺失和/或插入。可替代地，本发明还涉及在一个或多个(若干个)位置处包含一个置换、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:5的多肽的变体。SEQ ID NO:5的多肽的氨基酸置换、缺失和/或插入的总数量不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

本发明还涉及变体，这些变体包含SEQ ID NO:6的多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸的置换、缺失和/或插入。可替代地，本发明还涉及在一个或多个(若干个)位置处包含一个置换、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:6的多肽的变体。SEQ ID NO:6的多肽的氨基酸置换、缺失和/或插入的总数量不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

优选地，氨基酸变化是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸置换、缺失或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端甲硫氨酸残基；具有至多约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合域。

保守置换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)的组内。一般不改变比活性的氨基酸置换是本领域中已知的，并且(例如)由H.纽拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白(The Proteins)(学术出版社(Academic Press)，纽约(New York))中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的这样一种性质。举例来说，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。一种母体多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来识别，该程序如定点突变诱发或丙氨酸扫描突变诱发(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一种技术中，将单个丙氨酸突变在分子中的每个残基处引入，并且对所产生的突变体分子测试蛋白酶活性以鉴定对该分子活性至关重要的氨基酸残基。同样参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报309:59-64。还可以从与母体多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。

可以做出单个或多个氨基酸置换、缺失、和/或插入并且使用诱变、重组、和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包含易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409、WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆、诱变的多肽的活性(内丝(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)l7:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域中已知的，并且包含连接编码多肽的编码序列，以使得它们同框，并且融合多肽的表达受到相同的启动子和终止子的控制。融合蛋白还可以使用内蛋白技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。

融合多肽可以进一步包含两个多肽之间的一个切割位点。在融合蛋白分泌之后，该位点被裂解，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包含但不限于在以下披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；罗斯默森-威尔森(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-雷西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能与遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

该多肽可以由包含对于His标记或HQ标记的编码的重组DNA序列来表达，以在任意翻译后修饰之后给出包含该His标记或HQ标记的全部或部分的成熟多肽。该HQ标记(具有序列-RHQHQHQ)可以在该翻译后修饰期间完全或部分裂解掉，得到例如另外的氨基酸，例如附接至该成熟多肽的N端的-RHQHQH、-RHQHQ、-RHQH、-RHQ、-RH或-R。该His标记(具有序列-RPHHHHHH)可以在该翻译后修饰期间完全或部分裂解掉，得到另外的氨基酸，例如附接至该成熟多肽的N端的-RPHHHHH、-RPHHHH、-RPHHH、-RPHH、-RPH、-RP或-R。

实施例

在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸汽稳定性等，和/或pH特性如酸稳定性、pH最佳值等。

本发明的一个实施例是与10R蛋白酶相比具有在25℃在pH3和5之间，如在pH4和5之间，例如pH3，例如pH4，例如pH5下改善的蛋白酶活性的分离的多肽。

本发明的一个另外的实施例是与10R蛋白酶相比具有在15℃和60℃之间，如在25℃和50℃之间，例如在15℃、在25℃、在37℃、在50℃或在60℃下改善的蛋白酶活性的分离的多肽。

本发明的一个其他的实施例是与10R蛋白酶相比在40℃在pH3.0和5.0之间，例如在pH3.0、在pH4.0或在pH5.0下对大豆-玉米粉改善的蛋白酶活性。

本发明的另一个实施例是当与空白样品(不存在蛋白酶)相比时改善的肉仔鸡消化物的蛋白降解活性，该活性表现为在40℃下1小时之后砂囊中游离α-氨基基团的水平。

酸度/碱度特性

在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了关于pH的有益的特性，如酸稳定性、pH最佳值等。该蛋白酶在一个低的pH下的稳定性是有益的，这样一来该蛋白酶可以在穿越胃之后在肠中具有活性。在本发明的的一个实施例中，该蛋白酶在pH3下2小时之后保持了>80％的活性，如使用实例3中所述的方法确定的。

温度-活性

可如在实例3中所述的确定该蛋白酶的温度-活性曲线。在低温度(30℃-40℃)下的活性对于在动物中蛋白的消化可以是有利的。

在一个实施例中，本发明包含一种蛋白酶，当与在60℃下的蛋白酶的活性(cf.实例3)相比时，该蛋白酶具有在25℃下0.20或更高的相对活性，或在37℃下0.50或更高的相对活性的pH4.0下的温度活性曲线。

热稳定性

可如在实例8中所述的确定热稳定性，即使用DSC测量来确定经纯化的蛋白酶蛋白的变性温度(T_d)。Td指示了该蛋白的热稳定性：T_d越高，热稳定性越高。因此，在一个优选的实施例中，本发明的蛋白酶具有一个T_d，该T_d高于参照蛋白酶的T_d，其中该T_d是在经纯化的蛋白酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定的)上确定的。

在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度T_d，所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性、和/或造丸稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于相应的值(如SEQ ID NO:6的蛋白酶的残余活性或T_d)，更优选地是它的至少101％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或者至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或T_d)的值是SEQ ID NO:6的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。

在仍另外的具体实施例中，本发明的热稳定的蛋白酶具有至少50℃的熔化温度T_m(或变性温度T_d)，如通过在实例10(即在20mM乙酸钠，pH值4.0)中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的。在仍另外的具体实施例中，该T_m是至少51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100℃。

蒸汽稳定性

蒸汽稳定性可以如在实例9中所述的通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后蛋白酶分子的残余活性来确定。

造丸稳定性

造丸稳定性可如在实例10中所述的通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。由该混合器用蒸汽将该饲料调节至95℃。在调节之后，将该饲料加压成丸并确定残余活性。

具有蛋白酶活性的多肽的来源

可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。为了本发明的目标，结合给定来源，如在此使用，术语“获得自”应指由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的株系产生的多核苷酸编码的多肽。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是具有蛋白酶活性的来自例如杆菌、厚壁菌或放线菌的门之内的一种革兰氏阳性细菌或来自例如变形菌门的门之内的一种革兰氏阴性细菌的多肽。

在一方面，该多肽是来自杆菌纲的一种细菌的一种蛋白酶，例如来自芽孢杆菌目，或来自芽孢杆菌属，或来自芽孢杆菌属种19138。

这些分类单位的菌株在许多培养物保藏中心对于公众来说是容易获得的，这些保藏中心如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)、以及农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(NRRL)。

可以使用上述探针，鉴定多肽并从其他来源包含从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物获得该多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码一种多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员众所周知的的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。

用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包含从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参看例如，伊尼斯(Innis)等，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methodsand Application)，学术出版社，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属的一种菌株或来自芽孢杆菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

本发明还涉及包含下述多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性程度，所述分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、pH最佳值等方面不同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸置换，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸置换来构建。对于核苷酸置换的一般描述，参见，例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸在高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；或如在此定义的其等位基因变体和子序列(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

在一方面，该多核苷酸包含以下或由其组成：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的具有蛋白酶活性的编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.4的一个片段的一个子序列，例如SEQ ID NO:1的核苷酸613-1917的多核苷酸或SEQ ID NO:3的核苷酸610-1929的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含与一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中该控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下的表达。

多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子序列，由宿主细胞识别的多核苷酸，用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中示出转录活性的任何多核苷酸，包含突变的、截短的、和杂交的启动子，并且可以获得自编码细胞外或细胞内多肽的基因，对于宿主细胞而言，是同源的亦或异源的。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白”(“Useful proteins from recombinant bacteria”)、以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从以下基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，包含曲霉中一种编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自曲霉中一种编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包含修饰的启动子，包含来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代)；及其突变的、截短的、以及杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1/GAP、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子由罗马努斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的合适的转录终止子序列。终止子序列与编码多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是一个合适的前导序列，当被转录时是对于通过宿主细胞来翻译而言重要的mRNA的一个非翻译区。该前导序列与编码多肽的多核苷酸的5’-末端可操作地连接。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子从以下基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选的多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。

用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由郭(Guo)和舍曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包含对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由西蒙(Simonen)和帕夫拉(Palva)，1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽是从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原)。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在多肽的N-末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。

也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核系统中的调节序列包含lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包含在氨甲蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及以重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生表达载体时，该编码序列是位于该载体中，由此使该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于载体与该载体待引入其中的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。

载体优选地包含允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(若干个)选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在一个丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。

载体优选包含其允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。作为替代方案，该载体可以包含引导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中染色体中的一个(多个)精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。

对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究15:9163-9175；WO00/24883)。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个额外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个可扩增的选择性标记基因与该多核苷酸可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含扩增的选择性标记基因拷贝和由此额外的多核苷酸拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含与指导本发明多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是适用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包含但不限于：芽孢杆菌、短芽孢杆菌、梭菌、土芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、类芽孢杆菌、以及链霉菌。革兰氏阴性细菌包含大肠杆菌和假单胞菌。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌目细胞，包含但不限于解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包含但不限于产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、以及变铅青链霉菌细胞。

可以例如通过原生质体转化(参见，例如常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、通过使用感受态细胞(参见，例如杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829，或杜博楠(Dubnau)和大卫多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、通过电穿孔(参见，例如茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)或通过接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞之中。可以例如通过原生质体转化(参见，例如哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(见，例如Dower等人，1988，核酸研究(NucleicAcids Res.)16:6127-6145))实现将DNA引入到大肠杆菌细胞之中。可以例如通过原生质体转化和电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004，微生物学报(Folia Microbiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、通过接合(参见，例如马卓德(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)或通过转导(参见，例如伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)实现将DNA引入到链霉菌细胞之中。可以例如通过电穿孔(参见，例如崔(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或通过结合(参见，例如皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)实现将DNA引入到假单胞菌细胞之中。可以例如通过天然感受态(参见，例如佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)或通过接合(参见，例如克莱怀尔(Clewell)，1981,微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现向链球菌细胞中引入DNA。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。

该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包含子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辞典(Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥(Cambridge)，英国中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如在霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文，第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文)。

该真菌宿主细胞可以是一个酵母细胞。如在此所使用的“酵母”包含产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)、以及属于不完全真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，为了本发明的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.,帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所述进行定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或者亚罗酵母(Yarrowia)细胞，例如一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

该真菌宿主细胞可以是一个丝状真菌细胞。“丝状真菌”包含真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉菌(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟腊菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、福射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属物种的合适方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及Hinnen等人，1978，美国科学院院刊75:1920。

生产方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及(b)回收该多肽。在优选的方面，细胞属于芽孢杆菌属。在一个更优选方面，该细胞是芽孢杆菌-19138。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，在实验室或工业发酵罐中，进行摇瓶培养、以及小规模或大规模发酵(包含连续，分批，补料分批，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

以下的“核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法”中提供了更多的细节。

该多肽可以使用本领域中已知的特定用于这些多肽的方法进行检测。这些检测方法可包含使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。举例来说，可以使用一种酶检验来测定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包含，但不局限于离心，过滤，提取，喷雾干燥，蒸发，或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。

可以通过本领域已知的多种方法纯化该多肽，该方法包含但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，蛋白纯化(Protein Purification)，编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden)，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在替代性方面，不回收多肽，而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该多肽。该多肽可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将包含该多肽的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、可口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草(temperate grass)，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模型生物体拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞代谢区，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉层和种皮。

同样包含于本发明范围内的是这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(若干个)表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体宜为包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在这些宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入所讨论的植物中所必需的DNA序列(后者取决于使用的DNA引入方法)。

调节序列(如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列)的选择(例如)基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(PlantPhysiology)86:506描述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、和稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年度综述(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)、或代谢库组织(metabolic sink tissue)(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学24:863-878)；种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)；来自豆球蛋白B4和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)；来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本技术领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，该启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码多肽的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

核酸构建体是根据本领域已知的常规技术并入到植物基因组中，这些常规技术包含：农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(盖瑟(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。

目前，根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学19:15-38)，并且还可被用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，用于产生转基因单子叶植物的所选方法是粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。根据本披露使用的额外的转化方法包含美国专利号6,395,966和7,151,204中所述的那些(这二者都通过引用以其全文结合在此)。

在转化之后，根据本领域中众所周知的方法对并入了该表达构建体的转化株进行选择并且使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将编码多肽的构建体通过杂交引入具体植物品种，而根本无需直接转化那个给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。这种后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体或根据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。这类步骤的非限制性实例进一步在美国专利号7,151,204中明确地表达。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)在有益于产生多肽的条件下，培养包含编码该多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞，以及(b)回收该多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明的蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富集了这样一种蛋白酶。术语“富含”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。

该组合物可以包含本发明的蛋白酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以例如通过微生物(如细菌或真菌)或通过植物或通过动物产生另外的一种或多种酶。这些组合物可以根据本领域中已知的方法制备，并且可以呈液体或干组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该蛋白酶可以根据本领域中已知的方法稳定化。

应用

本发明还针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物的方法。

在动物饲料中的用途

本发明还针对在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的蛋白酶的方法，以及包含本发明多肽的饲料组合物和饲料添加剂。

术语动物包含所有动物，包含人。动物的实例为非反刍动物，和反刍动物。反刍动物包含，例如，动物，如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非-反当动物包含单胃动物，如猪(pig或swine)(包含但不限于小猪，生长中的猪和大母猪)；家禽，如火鸡，鸭和鸡(包含但不限于适于烤焙的小鸡，蛋鸡)；马(包含但不限于热血动物、冷血动物和温血动物)，小牛；和鱼(包含但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳类动物(包含但不限于河虾和对虾)。

术语饲料或饲料组合物指适宜或者意在由动物摄入的任意化合物、制剂、混合物或者组合物。

在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。

在具体实施例中，明确限定了处于往饲料中添加的蛋白酶或当包含在饲料添加剂中时的形式的蛋白酶。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制品至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制品至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。

明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确剂量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果能够优化剂量。

然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必那么纯；它可以例如包含其他酶，此时可将其称为蛋白酶制品。

该蛋白酶制剂可以(a)直接加入饲料(或者直接用于蛋白处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后加入饲料(或者用于处理过程中)的中间组合物，如饲料添加剂或者预混合物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制品的纯度。

具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制品，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制品却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。

这类蛋白酶制品当然可以与其他酶混合。

该蛋白可以是一种动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者他可以是一种植物性蛋白。

本文所用术语植物性蛋白指的是包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白，包含修饰的蛋白和蛋白衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10、20、30、40、50或60％(w/w)。

植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)，十字花科，藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。

在具体实施例中，植物性蛋白来源是得自蝶形花科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。

在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。

植物性蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。

大豆为优选的植物性蛋白来源。

植物性蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。

在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白如植物性蛋白或蛋白来源(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白来源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶促反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。

在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。

在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些蛋白是在摄入之前被水解的。

术语改善动物饲料的营养价值指的是提高饲料中的营养的可利用性。在本发明中，改善营养价值具体指的是改善饲料的蛋白部分的可利用性，从而导致蛋白提取的增加，较高的蛋白产量，和/或蛋白利用的改善。当饲料的营养价值增加时，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改善。

能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。

在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。

除本发明的蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素和/或至少一种微量矿物质和/或至少一种大量矿物质。

另外，可任选的，饲料添加成分是着色剂例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素；稳定剂；生长改善添加剂和芳香化合物/调味品，例如甲氧甲酚，茴香脑，十-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞、亚丁基苯酞、辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧生产种类；另外，可以使用一种支持物，其可包含例如按重量计40％-50％的木质纤维、按重量计8％-10％的硬脂酸、按重量计4％-5％的姜黄粉、按重量计4％-58％的迷迭香粉、按重量计22％-28％的石灰岩、按重量计1％-3％的树胶如阿拉伯树胶、按重量计5％-50％的糖和/或淀粉以及按重量计5％-15％的水。

本发明的一种饲料或饲料添加剂还可包含选自以下各项之中的至少一种其他的酶：肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC3.4)，磷脂酶A1(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶如，例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。

在具体实施例中，这些其他酶被明确定义(如上对蛋白酶制剂定义的)。

抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、Leucocin(林可霉素)A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin(死亡素)、防卫肽、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer(罗伯特·莱勒)，2000)、Plectasins(菌丝霉素)以及他汀类，包含在WO03/044049和WO03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO94/01459和WO02/090384中披露的。

多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。

产生活性氧的种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。

通常，脂溶性和水溶性维生素，以及微量矿物质形成部分所谓的意在加入饲料中的预混合物，而大量矿物质通常单独加入饲料。这些组合物的任一个类型，当富含于本发明的蛋白酶时，都是本发明的动物饲料添加剂。

在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。

下文列出了这些组分的非-排他性实例：

脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如，Ca-D-泛酸盐。

微量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大量矿物质的实例为钙、磷和钠。

这些组分的营养需求(以家禽和小猪/猪举例)列于WO01/58275中的表A中。营养需求指的是应在饮食中以所示浓度提供这些组分。

在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO01/58275中的表A所详细说明的单个组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种，或直至所有15种单个组分中的任一种，一种或多种。更具体地，本发明的添加剂包含该至少一种单个组分，其含量能使其在饲料中的浓度落入表A第4或第5或第6栏所示的范围。

在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选地以在以下的表1中所详细说明的饲料内浓度范围提供(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。

表1：一般的维生素建议

维生素	小猪饮食	肉仔鸡饮食
			维生素A	10,000-15,000IU/kg饲料	8-12,500IU/kg饲料
维生素D3	1800-2000IU/kg饲料	3000-5000IU/kg饲料
			维生素E	60-100mg/kg饲料	150-240mg/kg饲料
维生素K3	2-4mg/kg饲料	2-4mg/kg饲料
			维生素B1	2-4mg/kg饲料	2-3mg/kg饲料
维生素B2	6-10mg/kg饲料	7-9mg/kg饲料
			维生素B6	4-8mg/kg饲料	3-6mg/kg饲料
维生素B12	0.03-0.05mg/kg饲料	0.015-0.04mg/kg饲料
			烟酸(维生素B3)	30-50mg/kg饲料	50-80mg/kg饲料
泛酸	20-40mg/kg饲料	10-18mg/kg饲料
			叶酸	1-2mg/kg饲料	1-2mg/kg饲料
生物素	0.15-0.4mg/kg饲料	0.15-0.3mg/kg饲料
			氯化胆碱	200-400mg/kg饲料	300-600mg/kg饲料

本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所示的。另外，这类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。

WO01/58275相当于US09/779334，被列入本文作为参考。

根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，此外还包含至少一种本文所要求的蛋白酶。

此外，或替代地(对于以上所示的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体实施例中，可代谢能量，粗蛋白，钙，磷，甲硫氨酸，甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量落入WO01/58275，表B，范围2，3，4或5中的任何一个中(R.2-5)。

粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)X6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.，1984，官方分析方法(Official Methodsof Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official AnalyticalChemists)，华盛顿特区)。

可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirements inswine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会，美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table ofEnergy Values for Poultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩.ISBN90-71463-12-5计算。

完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable1997，gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaarde wanvoedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg6,8219pk Lelystad.ISBN90-72839-13-7计算。

在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白。

本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干玉米酒糟(Dried Distillers Grains)，通常量为0-30％。

在另一具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。

可将动物饮食制备成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明加入必需维生素和矿物质的足够量。以固体或液体酶配制品的形式加入酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可加入固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可加入该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，在造丸步骤之后加入一种液体蛋白酶/酶制剂。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。

饮食中最终的酶浓度范围为0.01-200mg酶蛋白/kg饮食，例如在0.5-25mg酶蛋白/kg动物饮食的范围内。

当然，应该以有效量，即足以改善饲料的水解、消化性和/或营养价值的量使用蛋白酶。目前期望以下述量(剂量范围)申的一种或多种施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数(ppm)。

为了测定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性，底物和试验)测定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。

使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。

洗涤剂组合物

可在洗涤剂组合物中添加本发明的蛋白酶，因此该蛋白酶成为洗涤剂组合物的组分。

例如，可将本发明的洗涤剂组合物配制为手洗或机洗洗涤剂组合物，包含适于预处理带有污渍的织物的洗衣用添加剂组合物和漂洗中添加的织物柔顺剂组合物，或配制为用于一般性家庭硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制为用于手洗或机器洗餐具操作。

在一个特定方面，本发明提供了包含本发明的蛋白酶的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可包含一种或多种其他酶，例如另一种蛋白酶，如来自芽孢杆菌的碱性蛋白酶，脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。

一般说来，所选择的一种或多种酶的特性应与所选择的洗涤剂相容(即最佳pH，与其他酶的和非酶的成分的相容性等)，并且这一种或多种酶应以有效量存在。

合适的脂肪酶包含细菌或真菌来源的那些。包含化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用脂肪酶的实例包含来自腐质霉属(与嗜热霉属同义)，例如来自如EP258068和EP305216描述的疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉)或来自如WO96/13580中描述的特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、施氏假单胞菌(GB1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属物种菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达图瓦(Dartois)等人，(1993)，生物化学与生物物理学报(Biochemica et Biophysica Acta)，1131:253-360)、嗜热脂肪芽抱杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)。脂肪酶变体的其他实例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079以及WO97/07202中描述的那些。优选的可商购获得的脂肪酶包含Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(诺维信公司)。适当的淀粉酶(α-和/或β-淀粉酶)包含来源于细菌或真菌的淀粉酶。包含化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包含例如从芽孢杆菌(例如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株)获得的α-淀粉酶。有用的淀粉酶的实例是描述于WO94/02597、WO94/18314、WO95/26397、WO96/23873、WO97/43424、WO00/60060、和WO01/66712中的变体，尤其是在以下一个或多个位置具有替换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。可商购的淀粉酶是Natalase^TM、Supramyl^TM、Stainzyme^TM、Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(诺维信公司)，Rapidase^TM和Purastar^TM(来自杰能科国际有限公司)。

合适的纤维素酶包含细菌或真菌来源的那些。包含化学修饰的或蛋白工程化的突变体。合适的纤维素酶包含来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例为在EP0495257、EP531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP0 531 315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及WO99/01544中的那些纤维素酶变体。可商购获得的纤维素酶包含Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(杰能科国际有限公司)、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社)。

合适的过氧化物酶/氧化酶包含植物、细菌或真菌来源的那些酶。包含化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用过氧化物酶的实例包含来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602、以及WO98/15257中描述的那些。可商购获得的过氧化物酶包含Guardzyme^TM(诺维信)。

这一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包含所有这些酶的一种组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂(即单独添加剂或组合添加剂)可配制为颗粒、液体、浆体等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，尤其是无尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。

无尘颗粒可以例如如在US4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇包含12至20个碳原子，并且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜涂覆材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238216中披露的方法制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，如条，片，粉末，颗粒，糊或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地包含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或可以是非水性的。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，该表面活性剂可以是非离子型的(包含半极性)和/或阴离子型的和/或阳离子型的和/或两性型的。这些表面活性剂典型地以按重量计0.1％至60％的水平存在。

当包含在该洗涤剂中时，洗涤剂通常包含从约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。

当其中包含非离子型表面活性剂时，该洗涤剂将通常包含约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧化物、壬基苯酚乙氧化物、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

该洗涤剂可以包含0-65％洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙二胺三氨基五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)。

洗涤剂还可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡啶-N-氧化物、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯(如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以包含漂白系统，其可以包含H₂O₂源，如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。可替代地，漂白系统可包含例如酰胺型、酰亚胺型或砜型的过氧酸。

可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的一种或多种酶稳定化，这些稳定剂例如为多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且该组合物可以如(例如)WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制。

该洗涤剂还可以包含其他的常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包含粘土、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光增亮剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、或香料。

目前期望在洗涤剂组合物中加入任何酶，特别是本发明的酶，加入量相当于每升洗涤液加0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液加0.05-5mg酶蛋白，特别优选每升洗涤液加0.1-1mg酶蛋白。

另外可以将本发明的酶加入WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中。

核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法

本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶的这类多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白酶的方法，包含(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)对回收该蛋白。

该蛋白对于宿主细胞来说可以是天然的或异源的。术语“蛋白”在此并不是指特定长度的编码产物并且，因此，包含肽、寡肽和蛋白。术语“蛋白”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白还包含杂合多肽和融合多肽。

优选地，该蛋白是一种蛋白酶。例如，该蛋白可以是一种水解酶，例如蛋白水解酶或蛋白酶。

该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。

以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料与方法

蛋白酶测定法

1)Suc-AAPR-pNA测定法：

pNA底物：Suc-AAPR-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1720)。

温度：室温(25℃)

分析缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，和11.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl分析缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中并用0.01％Triton X-100进一步稀释45倍)开始测定。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

2)Suc-AAPF-pNA测定法：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1400)。

温度：室温(25℃)

分析缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，和11.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl分析缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中并用0.01％Triton X-100进一步稀释45倍)开始测定。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

3)Protazyme OL测定法：

底物：Protazyme OL片(交联和染色的胶原；来自麦格酶公司(Megazyme))

温度：受控的(分析温度)。

分析缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，和11.0。

通过温和搅拌，将一片Protazyme OL片悬浮于中2.0ml0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬液和500μl的分析缓冲液分散在微量离心管(Eppendorf tube)中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将微量离心管转移至设定为分析温度的艾本德(Eppendorf)恒温混匀仪来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400转/分钟)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

4)Protazyme AK测定法：

底物：Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司)

温度：受控的(分析温度)。

分析缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH6.5。

通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于中2.0ml0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬液和500μl的分析缓冲液分散在微量离心管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将微量离心管转移至设定为分析温度的艾本德恒温混匀仪来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400转/分钟)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。

5)Suc-AAPX-pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPA-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1775)

Suc-AAPR-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1720)

Suc-AAPD-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1835)

Suc-AAPI-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1790)

Suc-AAPM-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1395)

Suc-AAPV-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1770)

Suc-AAPL-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1390)

Suc-AAPE-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1710)

Suc-AAPK-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1725)

Suc-AAPF-pNA(Bachem(瑞士巴亨)L-1400)

温度：室温(25℃)

分析缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl₂，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH4.0或9.0。

将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl分析缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中并用0.01％Triton X-100进一步稀释45倍)开始测定。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的量度。

结果提供于以下实例3中。

菌株

芽胞杆菌-19138(19138)是从1990年获得的来自澳大利亚并提供给诺维信公司(以前的诺和诺德公司(Novo Nordisk A/S))的土壤样品中分离的。

实例1：DNA制备和芽胞杆菌-19138基因组的测序

通过QIAamp DNA血液迷你试剂盒(凯杰公司，希尔登，德国)分离芽胞杆菌-19138(19138)的染色体DNA。将每种菌株的5ug的染色体DNA送到FASTERIS SA，瑞士进行基因组测序。将该基因组通过亿明达(Illumina)测序进行测序。将该基因组序列对于分泌的S53蛋白酶进行分析并鉴定该S53蛋白酶(SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2)。

芽胞杆菌-19138S53肽酶的表达

为了来自芽胞杆菌-19138(SEQ ID NO:1)的S53肽酶基因的表达克隆使用一种线性整合载体系统。该线性整合构建体是一种PCR融合产物，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间的基因连同一个强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。该融合是通过SOE PCR进行的(荷顿(Horton)，R.M.，亨特(Hunt)，H.D.，霍(Ho)，S.N.，普伦(Pullen)，J.K.和皮斯(Pease)，L.R.(1989)。不使用限制性内切酶的工程杂合基因，通过重叠延伸进行基因剪接(Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes,gene splicing by overlap extension)基因(Gene)77:61-68))。专利申请WO2003095658中也描述了该SOE PCR方法。在三联启动子系统(如WO99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因启动子(amyQ)和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。针对氯霉素乙酰基转移酶的基因编码被用作标记(描述于例如戴德瑞奇森(Diderichsen)，B.；波尔森(Poulsen)，G.B.；约根森(Joergensen)，S.T.；枯草芽孢杆菌的一种有用的克隆载体(Auseful cloning vector for Bacillus subtilis)30:312(1993))。在芽胞杆菌染色体上通过同源重组将最终的基因构建体整合到果胶酸裂解酶位点中。

用包含悬垂于两个侧翼片段的基因特异性引物从芽孢杆菌19138菌株的染色体DNA扩增S53基因的基因片段。从菌株iMB1361的基因组DNA扩增上游和下游侧翼片段(描述于WO2003/095658中)。用迟缓芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)代替天然的分泌信号表达该S53肽酶。用直接融合至C端的C端HQHQHQH标记表达它。该表达序列是SEQ ID NO:3。

通过重叠延伸(SOE)PCR反应使这两个载体片段和该基因片段经受剪接，以将这三个片段装配到一个线性载体构建体中。将两μl的该PCR产物转化到枯草芽孢杆菌中。在补充有6μg氯霉素每ml的LB板上选择转化株。将包含该整合表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。采集包含上清液的酶并如实施例2中所描述的将该酶进行纯化。

实例2：来自芽孢杆菌-19138的S53蛋白酶的纯化

如实例1中所示的构建枯草芽孢杆菌菌株至该培养基中，以表达来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶。该基因产物被构建为具有一个C端-HQHQHQH标记以助于它的纯化。

将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。通过添加固体硫酸铵至0.2μm滤液至硫酸铵终浓度3.2M(NH₄)₂SO₄(80％饱和)使该S53蛋白酶沉淀。在离心(20000x g，20min)之后，通过添加大约4体积的去离子水将该沉淀溶解。用3M Tris碱将溶解的酶溶液的pH调节至pH7.5并施加至Ni-NTA超流柱(来自凯杰公司(QIAGEN))，将该超流柱在50mM HEPES/NaOH，5mM咪唑，500mM NaCl，pH7.5中平衡。在首先用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，并且然后用具有15mM咪唑的平衡缓冲液进行洗涤，将该蛋白酶用50mM HEPES/NaOH，500mM咪唑，pH7.5分步洗脱。在洗脱期间收集各部分并将该S53蛋白酶峰转移至在G25交联葡聚糖(Sephadex)柱(来自GE医疗保健公司(GE Healthcare))上的20mM MES/NaOH，1mM CaCl₂，pH6.5。用3M Tris碱将该G25交联葡聚糖转移的酶的pH调节至pH7.5并将这些溶液施加至Q-琼脂糖(sepharose)FF柱(来自GE医疗保健公司)，将该柱在20mM HEPES/NaOH，1mM CaCl₂，pH7.5中平衡。在用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，在相同的缓冲剂中将蛋白酶经八个柱体积的线性NaCl梯度(0-->0.5M)进行洗脱。分析来自该柱的部分的蛋白酶活性(在pH4使用Protazyme OL测定法)，并且通过SDS-PAGE进一步分析活性部分。将纯的部分合并，并且将该合并物用20％CH₃COOH调节pH至pH6.0。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且用于进一步表征。

实例3：来自芽孢杆菌19138的S53蛋白酶的表征

将Suc-AAPR-pNA测定法用于获得pH-活性曲线。将Protazyme OL测定法用于获得pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH稳定性曲线，将蛋白酶在pH2至pH11的不同分析缓冲液中稀释7x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃孵育2小时。在孵育之后，通过用pH4.0分析缓冲液稀释该样品，使该蛋白酶孵育物的pH返回至该样品在残余活性测定之前相同的pH值。将Protazyme OL测定法用于获得在pH4.0时的温度-活性曲线。使用Suc-AAPX-pNA测定和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得在pH4.0时该S53蛋白酶的P1-特异性。使用稍有不同的条件获得10R蛋白酶的数据。pH-活性曲线基于Suc-AAPF-pNA，pH-稳定性曲线使用Suc-AAPF-pNA为活性底物，温度曲线基于pH6.5处的Protazyme AK，并且P1-特异性曲线在pH9.0处。

结果显示在下表2-5中。对于表2，活性是相对于酶的最佳pH而言。对于表3，活性是相对于样品的残余活性而言，将该样品在稳定条件下(5℃，pH4.0或pH9.0)保持。对于表4，活性是相对于该酶在pH4.0(针对10R蛋白酶是pH6.5)的最佳温度而言。对于表5，活性是相对于酶的最佳底物而言。

表2：pH-活性曲线

表3：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)

表4：在pH4.0或pH6.5处的温度活性曲线

表5：在pH4.0或pH9.0处对底物10Suc-AAPX-pNA的P1-特异性

来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶的基于Suc-AAPR-pNA底物的pH-活性曲、pH-稳定性曲线(在37℃下在2小时之后的残余活性)、在pH4.0基于Protazyme OL的温度活性曲线以及在pH4.0下对10Suc-AAPF-pNA底物的P1特异性与10R蛋白酶的数据对比也示于图2-5中。

来自芽孢杆菌19138的S53蛋白酶的其他表征

测定N-端序列为：VTPNPTG。

通过SDS-PAGE测定的相对分子量是大约M_r＝52kDa。

通过完整分子量分析测定的分子量是46811.5Da。

该成熟序列(来自MS数据，EDMAN数据，芽胞杆菌-19138翻译序列加HQ标记(HQHQH)的七种氨基酸残基中的五种给出)：

VTPNPTGRMTNDLVSRYNVQPLYTKGANGSGQTIGIVTLADFNPSDAYSYWQYNNINVNPNRITKINVDGGSGLSEDAGSDETSLDVEQSGALAPGANLNVYVGPNTDTGFVDAYAKAINDNVAHQISASWGESESLINYYVQQQMETPEYAETFNQLFMQAAAQGTSMFASAGDSGAYDASGDLNTYDLSVDNPADSPYITAAGGTTVPFTYTSTQYNLSITVPQERAWGWDYLYPLFDARGLNNPTGWAQRYFVGGGGGFSQLFATPDYQTGVSGVNSYTAVHQWTPSSDFTSVTRDAQPTIVTGTGTGRNLPDLSMNADPYTGYSVYFNLPTTNGATTVDSGWATYGGTSFVAPQLAGLSALINSANGSEAGFWNPQLYRFAQSNHSPLHPLNTAGASNDNVFYSGTPGAIYNQATGLGTPDVTALAQAFGKHQHQH(SEQ IDNO:6)

来自这一成熟序列的计算的分子量是46810.2Da。

这些数据表明，该-HQHQHQH标记的两个氨基酸残基(QH)从该基因产物的C端裂解，可能归因于自动蛋白水解作用。

实例4：大豆-玉米粉活性测定法

使用使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定以获得在pH3-7时该蛋白酶的活性曲线。

分析缓冲液：制备100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CAPS，1mMCaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100并使用HCl或NaOH调节至pH值以使得在将大豆-玉米粉底物(1g，30:70比率)与测定缓冲液(10mL)混合之后给出一种浆体，该浆体的终pH是以下pH中的一个：3.0、4.0,5.0,6.0和7.0。

在添加蛋白酶和在40℃下孵育(500rpm)3小时之前将2mL大豆-玉米粉浆体混合30min。经由100μl100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc，1.75g/L乙酸，5mM CaCl₂，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH6.0)添加蛋白酶。在离心(10min，3000x g，0℃)之后收集上清液，并基于o-邻苯二甲酸-二醛(OPA)方法使用一种比色测定法确定蛋白酶活性，该方法基本上根据尼耳森(Nielsen)等人(尼耳森(Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，戴普曼(Dampmann)，C.确定食物蛋白水解度的改善的方法(Improved method for determining food proteindegree of hydrolysis)食品科学杂志(J Food Sci)，2001,66:642-646)。本测定检测游离α-氨基基团，并因此蛋白酶活性可被测量为吸光度的增加。将每份上清液的第一个500μl穿过100kDa Microcon过滤器通过离心(60min，12,000x g，5℃)进行过滤。将这些样品在去离子水中稀释10x，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。最后将200μlOPA试剂分配到所有孔中，并摇动该板(10秒，750rpm)，并在340nm处测量吸光度。蛋白酶活性水平被计算为酶处理的样品和空白样品的吸光度之间的差异，并且表述为“OD x稀释系数”。

结果示于以下的图5和表6中。该来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶对大豆-玉米粉的蛋白水解活性在pH3.0下是高的，并随着pH升高而下降。该活性在pH3和4下显著地比10R蛋白酶更高，表明来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶在单胃动物的上部消化道(此处存在酸性pH环境)中是一种更加有效的酶。

表6：在pH3.0、4.0、5.0、6.0、和7.0处对大豆-玉米粉的蛋白酶活性

实例5：在砂囊条件下的蛋白降解活性

收集来自喂食玉米-大豆饮食的21天大的肉仔鸡的砂囊消化物材料；冻干并用小型磨咖啡机进行研磨。将该研磨的砂囊样品悬浮于(47％w/v)缓冲液(100mM琥珀酸，1mMCaCl₂·2H₂O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH3)中，并在4℃下过夜。将该悬浮液加热至40℃并将1ml分配到多个管中，保持40℃。将代表空白(0h)的三个管即刻离心(3000x g，0℃，10min)并冷冻上清液。经由50μl100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc，1.75g/L乙酸，5mM CaCl₂，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH6.0)向余下的管中添加酶，并将这些样品在振荡(500rpm)的同时在40℃下孵育1小时。将这些样品离心(3000x g，0℃，10min)并且恢复上清液并冷冻。通过使用在“大豆-玉米粉活性测定法”下所述的测定法通过分析上清液中的游离α-氨基基团确定该蛋白酶的蛋白水解效果。

这些结果(图6和表7)显示与未被允许孵育的空白样品相比孵育1小时的空白样品中的游离α-氨基基团的显著增加。这表明有活性的蛋白酶存在于最可能来自胃蛋白酶的消化物样品中，该胃蛋白酶存在于肉仔鸡的砂囊中。在包含来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶后，游离α-氨基基团的水平进一步以剂量反应方式增加。这些数据表明来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶将能够降解肉仔鸡的砂囊中的蛋白，并且起的作用在该砂囊中已经存在的胃蛋白酶活性之上。

表7：与未孵育的样品相比，用增加剂量的来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶在pH3 下孵育砂囊消化物(1h，40℃)之后的游离α-氨基基团

^a,b,c,d不同的上标字母表示统计差异。平均值的比较是使用由ANOVA程序(SAS研究所有限公司)提供的图基(Tukey)检验(α＝0.05)进行的。

实例6：体外消化试验模拟胃和小肠消化

使用体外消化测定在设计为刺激单胃动物胃和小肠消化的机构中来评估这些蛋白酶对一种饲料底物(大豆-玉米粉)的影响。

该孵育过程由以下组成：在pH3用猪胃蛋白酶的胃消化阶段(SP7000,西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，MO，USA)，接着是在pH3.8短的十二指肠孵育以及在pH7.0用胰酶的小肠孵育(8xUSB，P-7545，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，MO，USA)。

该体外消化是使用了一种基于吉尔森(Gilson)液体处理机(生物实验室公司(Biolab)，丹麦)的自动化系统进行的。对于每份样品，将0.8g饲料称取到一个管中，并且将所有管放置在液体处理机中(40℃，500rpm)。溶液添加以及pH测量是自动进行的。在0min的时间，添加4.1mL HCl(24mM CaCl₂)以在该溶液中达到pH3.0。在30min的时间，添加0.5mlHCl(24mM CaCl₂，3000U胃蛋白酶/g饲料)以及100μL的100mM乙酸钠缓冲液(258.6g NaOAc每公升，0.57％乙酸，pH6.0)。在90min的时间，添加900μL NaOH以达到pH约3.8并且在120min的时间添加包含6.5mg胰酶/g饲料的400μL1M NaHCO₃溶液以使得在该溶液中达到pH6.8。在30、60、90、115、120和180min的时间测量pH。在30min的时间经由100μL NaOAc缓冲液添加测试蛋白酶。

使用一种基于o-邻苯二甲酸-二醛(OPA)方法的比色测定确定蛋白水解度(DH)，该方法基本上根据尼耳森(Nielsen)等人(尼耳森(Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，戴普曼(Dampmann)，C.确定食物蛋白水解度的改善的方法(Improved method for determiningfood protein degree of hydrolysis)食品科学杂志(J Food Sci)，2001,66:642-646)。本测定检测游离α-氨基基团，并且因此蛋白酶活性可被测量为吸光度的增加。将每份上清液的第一个500μl穿过100kDa Microcon过滤器通过离心(60min，11,000rpm，5℃)进行过滤。将这些样品在去离子水中稀释100x，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。最后将200μl OPA试剂分配到所有孔中，并摇动该板(10秒，750rpm)，并在340nm处测量吸光度。裂解的肽键(DH)的百分比计算为：

DH(％)＝100×h/h_tot，

其中h_tot是肽键每蛋白等效物的总数，并且h是水解的键的数目。基于原料的氨基酸序列计算h_tot。在本研究中根据安德尔-尼森(Adler-Nissen)(食物蛋白的酶水解(J.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins).爱思唯尔应用科学出版社.1986)使用了对于大豆的值(7.8g等效物每kg蛋白)。在OPA方法中对于h的表述是：

h＝(丝氨酸-NH₂-β)/αmeqv/g蛋白，

其中α＝0.970并且β＝0.342，根据安德尔-尼森(Adler-Nissen)(通过三硝基苯磺酸确定食物蛋白水解产物的水解度(Determination of the degree of hydrolysis offood protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid).农业与食品化学杂志(Journal of Agricultural and Food Chemistry)，27:1256-1262.1979)。丝氨酸-NH₂计算为：

丝氨酸-NH₂＝(OD_空白-OD_样品)/(OD_标准-OD_空白)×0.9516meqv/L×0.1×100/X×P，

其中丝氨酸-NH₂＝meqv丝氨酸-NH₂/g蛋白；X＝g样品；P＝在样品中蛋白％，并且0.1是以公升计的样品体积(L)。

统计：使用方差分析(ANOVA)程序进行登记过的这些参数的统计分析并使用由ANOVA程序(SAS,5Administrators Guide to Annually Licensed Windows(对年度许可视窗的5管理员指南)，Mackintosh(麦金托什)，和Linux版本，发行5.1.SAS研究所，Cary(卡里)，NC.(2003))提供的学生t-检验(α＝0.05)进行均数比较。

这些结果(表8和图7)显示10R蛋白酶对体外消化的胃孵育期间的蛋白水解(DH)没有影响，而来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶显著增加DH。在包含胃和肠孵育两者的完全体外消化程序之后，该10R蛋白酶显著增加DH，而受来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶的影响仅是用数字表示的。在胃孵育期间来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶的活性呈现了在消化过程早期获得蛋白水解的一个新的机会，并且通过混合分别在胃和肠道隔室起作用的蛋白酶可能还呈现获得增加蛋白消化率的机会。

表8：用来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶或10R蛋白酶处理之后并在胃孵育和完全 胃+肠道孵育之后测量的体外消化样品中的水解度(DH，％)

^a,b每栏中不同的上标字母表明统计差异。

图7显示在用来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶或10R蛋白酶处理之后并在胃孵育和完全胃+肠道孵育之后测量的体外消化样品中的水解度(DH，％)。不同的字母表明统计上显著的差异。

实例7：嗉囊、砂囊和回肠消化物的蛋白水解活性

收集来自喂食玉米-大豆饮食的21天大的肉仔鸡的嗉囊、砂囊和回肠消化物材料；冻干并用小型磨咖啡机进行研磨。将这些研磨的样品悬浮(47％w/v)于以下的缓冲液中并且使其在4℃与水化合过夜(不搅拌)：

嗉囊缓冲液：100mM HEPES，1mM CaCl₂·2H₂O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH5

砂囊缓冲液：100mM琥珀酸，1mM CaCl₂·2H₂O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH1.67

回肠缓冲液：100mM HEPES，1mM CaCl₂·2H₂O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH7.2

所得pH是：在嗉囊样品中pH5；在砂囊样品中pH3；以及在回肠样品中pH7。将这些悬浮液加热至40℃并将1mL分配到多个管中，保持在40℃。将代表空白(T₀)的三个管即刻离心(3000x g，0℃，10min)并冷冻上清液。经由50μl100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/l NaAc，1.75g/l乙酸，5mM CaCl₂，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH6.0)向余下的管中添加酶(200mg酶蛋白/kg底物)，并在振荡(500rpm)的同时在40℃下，将这些嗉囊和回肠样品孵育3小时(T₃)，而将这些砂囊样品孵育1小时(T₁)。将这些样品离心(3000x g，0℃，10min)并且恢复上清液并冷冻。使用o-邻苯二甲酸二醛(OPA)测定通过分析伯胺确定蛋白水解活性。

这些结果示于表9中。对于这些消化物类型(嗉囊、砂囊和回肠)中的每种，在空白T₀样品中的伯胺的水平之间具有显著差异，并将这些空白样品孵育1或3小时。这一差异可归于底物中存在的以及源自饮食原料或动物的蛋白酶的活性。在孵育该嗉囊和砂囊消化物期间，与孵育3小时(嗉囊)或1小时(砂囊)的空白样品相比，来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶进一步提高了伯胺的水平，证明了在给定的条件下该蛋白酶对该底物具有蛋白水解活性。在嗉囊或回肠条件下不可能将该来自芽胞杆菌的S53蛋白酶与10R蛋白酶的活性区分开，而在砂囊条件下来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶比10R蛋白酶表现显著更好。在回肠条件下，两种蛋白酶都在数字上增加了伯胺的水平。这些数据表明来自芽胞杆菌19138的S53蛋白酶在家禽和猪的整个胃肠道中(而尤其在上部胃肠道(此处pH倾向于比其他部分中稍微更具有酸性)中)具有降解食物蛋白的潜力。

表9：与10R蛋白酶相比，当用肉仔鸡消化物孵育时，来自芽胞杆菌19138的S53蛋白 酶的蛋白水解活性，并表示为由OPA测定法(OD₃₄₀×稀释系数)所测量的伯胺的水平

在一栏中的没有通过相同的上标字母连接起来的^a,b,c,d值是通过图基克雷默(Tukey Kramer)检验(α＝0.05)(由ANOVA程序(SAS研究所有限公司)提供)确定的统计性差异。

实例8：热稳定性

将蛋白酶的蛋白样品的等分试样(如实例2中所述的经过纯化的)脱盐或使用预装PD-10柱改变缓冲液为20mM乙酸钠，pH4.0或在4℃下以2-3h步骤针对2×500ml20mM乙酸钠，pH4.0进行透析，随后是一个过夜步骤。将该样品进行0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2A280单位。在差示扫描量热法(DSC)中使用该透析缓冲液作为参照。使用真空吸引器对该样品进行脱气并搅拌大约10分钟。

以1.5℃/min的连续扫描速率从20℃-90℃在MicroCal VP-DSC上进行DSC扫描。使用MicroCal起点软件(Origin software)(4.10版本)进行数据处理，并将变性温度T_d(也称为熔解温度T_m)定义为温度自记曲线的峰尖端的温度。

实例9：蒸汽稳定性

使用以下测定法评价蒸汽处理后该蛋白酶的残余活性。

在这些试验中，使用修改设置从而该蒸汽是从蒸汽发生器中提供的并导入到箱中。当温度达到约93℃-94℃时，通过抽屉将放置在板上的这些样品插入到该箱中。插入这些样品后，温度即降低4℃。当温度停留在大约不变的90℃时，孵育30秒。其后，将该板快速从该箱中移出，将这些样品放置在冰上，重悬浮并针对蛋白酶活性使用Suc-AAPF-pNA或o-邻苯二甲酸二醛(OPA)测定法进行评价。将每个酶样品与未经过蒸汽处理的相似样品进行对比以计算残余活性。

实例10：造丸稳定性测试

如美国专利号4,106,991，实例1中所述的方式进行酶粒化。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量低于1％并过筛以获得具有250μm至850μm粒子范围的产物。最终，将该产物用棕榈油和碳酸钙以如在美国专利号4,106,991，实例22中所述的方式进行包衣。

在小型卧式搅拌器中，大致地将50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在大型卧式搅拌器中将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。将该饲料从该搅拌器中以大约300kg/小时的速率导至调节器(带有蒸汽注入的串联搅拌器)。该调节器通过注入蒸汽将该饲料加热至95℃(在排气口进行测量)。在该调节器中的停留时间是30秒。将该饲料从该调节器中导至配备有3.0×35mm水平冲模的西蒙黑森(Simon Heesen)压力机中并被压缩至具有大约15mm的长度的丸。在压缩后，将这些丸放置在冷气机中并冷却15分钟。

在造丸之前使用Suc-AAPF-pNA测定法测量蛋白酶活性，并在造丸之后测量该饲料丸中的蛋白酶活性。通过将丸状饲料中的蛋白酶活性相对于非丸状饲料中的活性相对比确定造丸稳定性。

在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员来说从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包含定义的本披露为准。

Claims (25)

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下各项组成的组：

(a)由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5加N端His标记、SEQ ID NO:5加N端HQ标记、SEQ ID NO:2加N端His标记、或SEQ ID NO:2加N端HQ标记构成的多肽；

(b)由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1加编码N端His标记的多核苷酸、或SEQ ID NO:1加编码N端HQ标记的多核苷酸所编码的多肽。

2.权利要求1所述的多肽，其中所述具有蛋白酶活性的多肽获得自或能够获得自芽孢杆菌属。

3.权利要求1所述的多肽，根据Suc-AAPF-pNA分析，在37℃和pH4-5时，所述多肽比10R蛋白酶具有更高的相对蛋白酶活性。

4.权利要求1或2所述的多肽，根据Protazyme AK测定法，在15℃-60℃温度下，所述多肽在pH4时比10R蛋白酶在pH6.5时具有更高的相对活性。

5.权利要求1-3任一项所述的多肽，在pH3-5和40℃时，所述多肽对大豆-玉米粉比10R蛋白酶具有提高的蛋白酶活性。

6.权利要求1-3任一项所述的多肽，当与不存在蛋白酶的空白样品相比时所述多肽具有改善的肉仔鸡消化物的蛋白降解活性，该活性表现为在40℃下1小时之后砂囊中游离α-氨基基团的水平。

7.权利要求1-3任一项的多肽，根据OPA测定法，当用肉仔鸡砂囊消化物孵育时，与10R蛋白酶相比，所述多肽释放更多的伯胺。

8.一种组合物，该组合物包含权利要求1-7中任一项所述的多肽。

9.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-7中任一项所述的多肽。

10.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求9所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至在表达宿主细胞内指导该多肽产生的一个或多个控制序列上。

11.一种重组表达宿主细胞，该重组表达宿主细胞包含如权利要求10所述的核酸构建体或表达载体。

12.一种产生如权利要求1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包含：

(a)培养一种细胞，在有益于产生该多肽的条件下，处于野生型形式的该细胞产生该多肽；并且

(b)回收该多肽。

13.一种产生如权利要求1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包含：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求11所述的重组表达宿主细胞；并且

(b)回收该多肽。

14.一种产生如权利要求1-7中任一项所述的多肽的方法，该方法包含：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞用编码权利要求1-7中任一项所述的多肽的多核苷酸转化；并且

(b)回收该多肽。

15.至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽在以下各项中的用途：

(i)在动物饲料中；

(ii)在动物饲料添加剂中；

(iii)在用于动物饲料的组合物的制备中；

(iv)用于提高动物饲料的营养价值；

(v)用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；

(vi)用于增加动物饮食中的蛋白的水解度；和/或

(vii)用于处理蛋白。

16.一种用于提高动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽。

17.一种动物饲料添加剂，包含：

(i)至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽；以及

(ii)至少一种脂-溶性维生素，和/或

(iii)至少一种水-溶性维生素，和/或

(iv)至少一种微量矿物质。

18.如权利要求17所述的动物饲料添加剂，其进一步包含淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和/或β-葡聚糖酶。

19.一种动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白含量，并包含至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽。

20.一种用于处理蛋白的方法，包含将至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽添加至至少一种蛋白或蛋白来源中的步骤。

21.如权利要求20所述的方法，其中大豆包含在该至少一种蛋白来源中。

22.至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽在洗涤剂中的用途。

23.一种洗涤剂组合物，该组合物包含至少一种如权利要求1-7中任一项所述的多肽。

24.如权利要求23所述的洗涤剂组合物，其中该组合物包含一种或多种其他的酶。

25.如权利要求24所述的洗涤剂组合物，其中该其他的酶选自下组，该组由以下各项组成：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、木葡聚糖酶、果胶酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(haloperoxygenase)以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。