CN107105707B - 脯氨酸耐受性三肽基肽酶及其用途 - Google Patents

脯氨酸耐受性三肽基肽酶及其用途 Download PDF

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Abstract

披露了一种用于生产水解产物的方法，该方法包括：(a)将至少一种蛋白质或其一部分与以下各项混合：(A)至少一种内切蛋白酶；以及(B)(a’)主要具有外切肽酶活性的至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在P1处的脯氨酸；以及在P1处的合成氨基酸；或(b’)至少一种具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在PV处的脯氨酸；以及在PV处的合成氨基酸；并且(b)回收该水解产物。本发明还涉及用于生产水解产物的方法，该方法包括内切蛋白酶、S53家族的外切三肽基肽酶和氨基肽酶的使用；涉及一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶、包含该脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合物、食品和/或饲料添加剂组合物、连同水解产物的用途；以及多种脯氨酸耐受性三肽基肽酶的用途。

Description

脯氨酸耐受性三肽基肽酶及其用途
技术领域
本发明涉及脯氨酸耐受性三肽基肽酶，用于在水解产物的制备中以及在包含所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶或水解产物的食品中使用。
发明背景
蛋白酶(与肽酶同义)是能够在底物肽、寡肽和/或蛋白质中的氨基酸之间裂解肽键的酶。
基于其催化反应机理和涉及催化活性位点的氨基酸残基将蛋白酶分组为7个家族。丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶是4个主要家族，而苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和未分组蛋白酶构成剩余的3个家族。
蛋白酶的底物特异性通常根据底物中特定氨基酸残基之间优选的键裂解来定义。典型地，底物肽中的氨基酸位置相对于易裂解键的位置(即蛋白酶裂解的位置)来定义：
NH2-……P3-P2-P1*P1’-P2’-P3’……-COOH
使用上述假想的肽进行说明，易裂解键由星号(*)表示，而氨基酸残基由字母‘P’表示，其中N末端至易裂解键的残基从P1开始，并且当远离易裂解键朝向N末端移动时编号增加。C末端至易裂解键的氨基酸残基从P1’开始，并且随着朝向C末端移动，残基编号增加。
基于其底物特异性，蛋白酶通常也可以细分为两个大组。第一组是内切蛋白酶，其是能够裂解肽或蛋白质底物的内部肽键并且倾向于远离N末端或C末端的蛋白水解肽酶。内切蛋白酶的实例包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。相比之下，第二组蛋白酶是外切肽酶，其裂解在位于朝向蛋白质或肽底物的C末端或N末端的氨基酸残基之间的肽键。
外切肽酶组的某些酶可能具有三肽基肽酶活性。因此，这样的酶能够从底物肽、寡肽和/或蛋白质的未经取代的N末端裂解3个氨基酸片段(三肽)。除了在P1和/或P1’位置处具有脯氨酸的肽键之外，已知三肽基肽酶从底物的N末端裂解三肽序列。可替代地，三肽基肽酶可以是脯氨酸特异性的，并且仅能够裂解在N末端至易裂解键(即在P1位置)具有脯氨酸残基的底物。
外切肽酶和内切蛋白酶两者在食品和饲料工业中以及在水解产物的生产中都有许多应用。
发明概述
在广泛的方面，本发明提供了用于生产水解产物的方法，该方法包括：(a)将至少一种蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(A)至少一种内切蛋白酶；以及
包含选自下组的一个或多个氨基酸序列、或其功能片段、或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列的三肽基肽酶，该组由以下各项组成：SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99；或从选自下组的一个或多个核苷酸序列、或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列、或通过遗传密码的简并性不同于这些核苷酸序列的核苷酸序列、或在中等严格或高严格条件下与其杂交的核苷酸序列表达的三肽基肽酶，该组由以下各项组成：SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ IDNo.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ IDNo.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ IDNo.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ IDNo.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ IDNo.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ IDNo.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99。
根据本发明的第一方面，提供了用于生产水解产物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(A)至少一种内切蛋白酶；以及
(B)(a’)主要具有外切肽酶活性的至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(b’)至少一种具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；并且
(b)回收该水解产物。
在第二方面，提供了用于生产水解产物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种选自由植物蛋白质、基于乳的蛋白质或蛋类蛋白质组成的组的蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(i)至少一种内切肽酶；
(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及
(iii)一种或多种氨基肽酶，并且
(b)回收该水解产物。
在第三方面，提供了(i)至少一种内切肽酶；(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及(iii)一种或多种氨基肽酶，在从选自下组的至少一种蛋白质或其一部分制造水解产物中的用途，该组由以下各项组成：植物蛋白质、基于乳的蛋白质或蛋类蛋白质，该水解产物用于在倾向于对未处理的水解产物具有免疫反应的受试者中降低免疫原性或用于降低水解产物的苦味。
在第四方面，提供了一种分离的核酸，该核酸包含：
(a)如本文中显示为SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.98或SEQ ID No.99的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.98或SEQ ID No.99具有至少约70％同一性的核苷酸序列；或
(c)在中等严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.98或SEQ ID No.99杂交的序列；或
(c)归因于遗传密码的简并性不同于SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ IDNo.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ IDNo.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.98或SEQ ID No.99的核苷酸序列。
在第五方面，提供了包含本发明的核酸(合适地是第二方面的分离的核酸)的载体(例如质粒)。
根据本发明的第六方面，提供了包含根据本发明的核酸序列或载体的宿主细胞。
根据本发明的第七方面，提供了一种用于表达主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的方法，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有共有序列裂解位点的肽的N末端裂解三肽，该共有序列裂解位点是：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
所述方法包括：
(a)用包含编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的核苷酸序列的核酸或载体转化宿主细胞；
(b)表达步骤(a)的核酸序列或载体；并且
(c)获得脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物，并且任选地进行分离和/或纯化和/或封装。
在第八方面，提供了至少一种内切蛋白酶和至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物在制造水解产物中的用途，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性，并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任一种方法获得，该水解产物用于在倾向于对未处理的水解产物具有免疫反应的受试者中降低免疫原性或用于减少水解产物的苦味。
在第九方面，提供了一种水解产物，该水解产物包含至少一种内切蛋白酶和主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任何一种方法获得。
根据第十方面，提供了一种组合物，该组合物包含至少一种主要具有外切肽酶的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任何一种方法获得；以及一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：多元醇，例如甘油和/或山梨糖醇；糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；盐，例如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐；防腐剂，例如，苯甲酸钠和/或山梨酸钾；或其组合。
在第十一方面，提供了一种用于生产喂养料或食物的方法，该方法包括使饲料组分或食品组分与本发明的水解产物或组合物接触。
在第十二方面，提供了食品添加剂组合物或饲料添加剂组合物，该组合物包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任何一种方法获得或包含本发明的水解产物；
任选地进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：多元醇，例如甘油和/或山梨糖醇；糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；盐，例如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐；防腐剂，例如，苯甲酸钠和/或山梨酸钾；或其组合。
在第十三方面，提供了包含根据本发明的水解产物的食品添加剂或饲料添加剂组合物。
在第十四方面，提供了一种食物或喂养料，该食物或喂养料包含：至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99的氨基酸序列、或其功能片段、或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列，或可通过本发明的方法获得；或包含本发明的水解产物和任选地至少一种食品或饲料成分。
在第十五方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任何一种方法获得；包含至少一种内切蛋白酶；以及将其共同给予的说明书。
在第十六方面中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：
(i)至少一种内切肽酶；
(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及
(iii)一种或多种氨基肽酶，以及将其共同给予的说明书。
在第十七方面，本发明提供了包含本发明的水解产物的非食物产品，其中非食物产品是在人类皮肤上使用的化妆品、洗剂或清洁剂。
在第十八方面，本发明提供了一种富含以下各项的水解产物：
(a)在其N末端具有脯氨酸的三肽；或
(b)在其N末端且在其C末端具有脯氨酸的三肽。
在本文描述的任何实施例中，通过本文所述的蛋白质水解过程产生的水解产物可以通过超滤或本领域已知的任何合适的膜分离来除去或渗透。
附图简要说明
现将参考附图，仅通过举例的方式描述本发明的实施例，在这些附图中：
图1显示了表达载体pTTT-pyrG-TRI083的质粒图谱。
图2显示了脯氨酸耐受性三肽基肽酶的pH特征曲线。
图3显示了在各种温度下展现脯氨酸耐受性三肽基肽酶的活性的曲线图。
图4显示了当
Figure BDA0001330130990000081
AFP(本文中称为AFP)(一种酸性蛋白酶)与脯氨酸耐受性三肽基肽酶组合使用时在每种酶的不同剂量下的酶活性。
图5显示了脯氨酸耐受性三肽基肽酶随着时间裂解底物AAPPA的能力。
图6显示裂解产物AAP随着时间从AAPPA底物的产生。
图7显示了表达载体pTTT-pyrG13-TRI071的质粒图谱。内源性信号序列被来自里氏木霉(Trichoderma reesei)酸性真菌蛋白酶(AFP)的分泌信号序列和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子代替(见图7的下部分)。
图8显示了
Figure BDA0001330130990000091
AFP对玉米大豆饲料的蛋白质水解的剂量响应。虚线代表仅使用胃蛋白酶和胰酶(pancreatin)的对照。
图9显示了DH对饲料样品中的酶组合物的依赖性。
图10显示了在不同条件下通过
Figure BDA0001330130990000092
AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶进行的饲料处理的效果。实心条代表在40℃下处理100min。空心条代表在40℃下处理200min。
图11显示了与脯氨酸耐受性三肽基肽酶相比，商业蛋白酶对回肠N消化率％的影响。
图12显示了与脯氨酸耐受性三肽基肽酶相比，商业蛋白酶对回肠能量消化率(MJ/kg)的影响。
图13显示了使用内切肽酶和不同内切肽酶/外切肽酶组合(内切肽酶(Endo)：
Figure BDA0001330130990000093
FP2，PepN：在储备液中的197nkatH-Ala-pNA/mL；脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)4,375nkatH-Ala-Ala-Ala-pNA/mL)，15％(w/w)WPI水解的丝氨酸等同物的增加。
图14显示了使用内切肽酶和三肽基肽酶(内切肽酶(Endo)：
Figure BDA0001330130990000094
FP2，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI071＝3PP_Fo)4,375nkatH-Ala-Ala-Ala-pNA/mL)，15％(w/w)WPI水解的丝氨酸等同物的增加。
图15显示了在预水解的H-Ala-Ala-Ala-OH存在和不存在下，使用H-Ala-Ala-Ala-pNA分析的里氏木霉脯氨酸耐受性三肽基肽酶的米凯利斯-门滕(Michaelis-Menten)图。添加的预水解抑制剂含有Ala-Ala-Ala、Ala-Ala和Ala。浓度以水解前的H-Ala-Ala-Ala-OH的浓度给出。
图16显示了使用液相色谱-质谱(LC-MS)测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-乳球蛋白片段(肽IIAEK)进行的消化。
图17显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-乳球蛋白片段(肽ALPMHIR)进行的消化。
图18显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-乳球蛋白片段(肽WENGECAQK)进行的消化。
图19显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-乳球蛋白片段(肽VYVEELKPTPEGDLEILLQK)进行的消化。
图20显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-乳球蛋白的脯氨酸耐受性三肽基肽酶消化产物EELKPTPEGDLEILLQK进行的进一步消化。
图21显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-乳球蛋白片段(肽VAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLR)进行的消化。
图22显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-酪蛋白(GPFPIIV)的胰蛋白酶片段进行的消化。
图23显示了使用LC-MS测量的通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对β-酪蛋白(HKEMPFPK)的胰蛋白酶片段进行的消化。
图24显示了通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶对缓激肽进行的消化。
图25显示了多种脯氨酸耐受性三肽基肽酶氨基酸序列之间的比对。显示了xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV基序(加框)。
图26显示了使用AAF-pNA作为底物，pH对TRI045(具有前原序列(pre-prosequence)SEQ ID No.98和成熟蛋白质SEQ ID No.99的三肽基肽酶)活性的影响(值是使用0.8μl TRI045的一项测试的平均值(n＝2)。
图27显示了表达载体pTTT-pyrG13-TRI045的质粒图谱。
图28显示了三肽基肽酶TRI045的pH特征曲线。
发明详细说明
本发明的重要发现是三肽基肽酶可以对在P1和/或P1’处具有脯氨酸以及在P1和/或P1’处具有任何其他氨基酸的底物具有外切肽酶活性。这是非常令人惊讶的，因为本领域已经记载的三肽基肽酶当脯氨酸在P1时典型地被抑制，或者当脯氨酸在P1时是活性的但是当在底物中的P1位置处存在除了脯氨酸以外的氨基酸时它是无活性的，这在本文中有时称为脯氨酸特异性三肽基肽酶。
诸位发明人首次提出根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶对于用于制备水解产物非常有利，并且向进食水解产物、或包含水解产物的食品和/或饲料、和/或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与至少一种内切蛋白酶组合)的食品或饲料添加剂组合物的受试者提供益处。
可替代地或另外地，当与未处理的水解产物相比时，使用内切蛋白酶和三肽基肽酶产生的水解产物也可以具有降低的苦味。
有利地，教导用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且由于具有这样的广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如脯氨酸和/或赖氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物的裂解抑制。因此，此类脯氨酸耐受性三肽基肽酶的使用可以有效地和/或快速地分解蛋白质底物(例如存在于用于制备水解产物的底物中)。
基于这些发现，提供了一种用于生产水解产物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(A)至少一种内切蛋白酶；以及
(B)(a’)主要具有外切肽酶活性的至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(b’)至少一种具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；并且
(b)回收该水解产物。
合适地，该方法可以包括将在步骤(b)中回收的水解产物与至少一种食品或饲料成分混合的另外步骤。
合适地，用于产生水解产物的方法的适当步骤(A)和步骤(B)可以同时(例如在相同的时间)进行。
合适地，在添加脯氨酸耐受性三肽基肽酶之前，可以将该蛋白质或其部分与内切蛋白酶混合。合适地，在添加脯氨酸耐受性三肽基肽酶和一种或多种如本文详细说明的另外的蛋白酶之前，可以将该蛋白质或其部分与内切蛋白酶混合。
在第二方面还提供了一种用于产生水解产物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种选自由植物蛋白质、基于乳的蛋白质或蛋类蛋白质组成的组的蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(i)至少一种内切肽酶；
(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及
(iii)一种或多种氨基肽酶，并且
(b)回收该水解产物。
合适地，可以将(i)、(ii)和/或(iii)与蛋白质或其部分同时混合。
可替代地，在步骤(a)中的混合的顺序能以特定的顺序进行，即(i)可以在(ii)和/或(iii)之前进行。
在另一个方面，还提供了(i)至少一种内切肽酶；(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及(iii)一种或多种氨基肽酶，在从选自下组的至少一种蛋白质或其一部分制造水解产物中的用途，该组由以下各项组成：植物蛋白质、基于乳的蛋白质或蛋类蛋白质，该水解产物用于在倾向于对未处理的水解产物具有免疫反应的受试者中降低免疫原性或用于降低该未处理的水解产物的苦味。
在本文所述的任何实施例中，超滤或膜分离可以用于改善本文所述的蛋白质水解过程。这可以增加具有高度降低的变应原性的短肽的产生。
在一个实施例中，在本发明的方法和/或用途中使用的该至少一种蛋白质可以选自下组，该组由以下各项组成：植物蛋白质，优选地其中该蛋白质是麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白的免疫原性片段、谷物蛋白、谷蛋白、大豆蛋白中的一种或多种。
在另一个实施例中，在本发明的方法和/或用途中使用的该至少一种蛋白质可以选自下组，该组由以下各项组成：基于乳的蛋白质，优选地其中该蛋白质是酪蛋白，例如β-酪蛋白；乳球蛋白，例如β-乳球蛋白；或乳清蛋白中的一种或多种。
合适地，在本发明的方法和/或用途中使用的该至少一种蛋白质可以是蛋类蛋白质。
如本文所使用的，术语“S53家族的外切三肽基肽酶”是指主要具有外切肽酶活性以及具有从蛋白质和/或肽底物的N末端裂解三肽的能力的蛋白酶。S53家族肽酶广泛地涵盖丝氨酸蛋白酶的一个类别。虽然S53家族包括内切蛋白酶和外切肽酶两者，但是本文中该定义旨在仅指主要具有外切肽酶活性的三肽基肽酶。
在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定”(EBSA)中，“S53家族的外切三肽基肽酶”具有至少约50nkat/mg蛋白质的活性。合适地，根据本发明的“S53家族的外切三肽基肽酶”在本文教导的EBSA活性测定中具有约50-2000nkat/mg蛋白质之间的活性。
内切蛋白酶、S53家族的外切三肽基肽酶和氨基肽酶的组合在本文中被称为“三酶组合物”。术语“三酶组合物”是指至少内切蛋白酶、S53家族的外切三肽基肽酶和氨基肽酶的组合。换句话说，术语“三酶组合物”还可以包括一种或多种另外的酶活性和/或另外的成分。
在一个实施例中，S53家族的外切三肽基肽酶可以是脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
如本文所使用的，术语“氨基肽酶”是指能够从蛋白质和/或肽底物的N末端裂解单个氨基酸的外切肽酶。
氨基肽酶可以是从乳杆菌属(Lactobacillus)中可获得的(例如获得)。
合适地，氨基肽酶可以是从瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)中可获得的。更合适地，氨基肽酶可以是从瑞士乳杆菌ATCC 12046中可获得的。
与根据本发明的内切蛋白酶和外切三肽基肽酶组合使用的氨基肽酶可以是氨基肽酶N(例如PepN)(EC 3.4.11.2)。
在一个实施例中，与S53家族的内切蛋白酶和外切三肽基肽酶组合使用的氨基肽酶可以包含如下所示的序列：
MAVKRFYKTFHPEHYDLRINVNRKNKTINGTSTITGDVIENPVFINQKFMTIDSVKVDGKNVDFDVIEKDEAIKIKTGVTGKAVIEIAYSAPLTDTMMGIYPSYYELEGKKKQIIGTQFETTFARQAFPCVDEPEAKATFSLALKWDEQDGEVALANMPEVEVDKDGYHHFEETVRMSSYLVAFAFGELQSKTTHTKDGVLIGVYATKAHKPKELDFALDIAKRAIEFYEEFYQTKYPLPQSLQLALPDFSAGAMENWGLVTYREAYLLLDPDNTSLEMKKLVATVITHELAHQWFGDLVTMKWWDNLWLNESFANMMEYLSVDGLEPDWHIWEMFQTSEAASALNRDATDGVQPIQMEINDPADIDSVFDGAIVYAKGSRMLVMVRSLLGDDALRKGLKYYFDHHKFGNATGDDLWDALSTATDLDIGKIMHSWLKQPGYPVVNAFVAEDGHLKLTQKQFFIGEGEDKGRQWQIPLNANFDAPKIMSDKEIDLGNYKVLREEAGHPLRLNVGNNSHFIVEYDKTLLDDILSDVNELDPIDKLQLLQDLRLLAEGKQISYASIVPLLVKFADSKSSLVINALYTTAAKLRQFVEPESNEEKNLKKLYDLLSKDQVARLGWEVKPGESDEDVQIRPYELSASLYAENADSIKAAHQIFTENEDNLEALNADIRPYVLINEVKNFGNAELVDKLIKEYQRTADPSYKVDLRSAVTSTKDLAAIKAIVGDFENADVVKPQDLCDWYRGLLANHYGQQAAWDWIREDWDWLDKTVGGDMEFAKFITVTAGVFHTPERLKEFKEFFEPKINVPLLSREIKMDVKVIESKVNLIEAEKDAVNDAVAKAID
如本文所使用的，术语“混合”是指一种或多种成分和/或酶的混合，其中该一种或多种成分或酶以任何顺序和任何组合添加。合适地，混合可以涉及同时或顺序地混合一种或多种成分和/或酶。
在一个实施例中，可以顺序地混合一种或多种成分和/或酶。
优选地，该一种或多种成分和/或酶可以同时混合。
如本文所使用的，术语“回收水解产物”是指分离水解产物。在一些实施例中，这可涉及将水解的物质与未水解的蛋白质和/或肽底物分离。在其他实施例中，可以另外地或可替代地涉及将水解物质从用于制备所述水解产物的本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶或三酶组合物分离。在一个实施例中，该水解产物可以包含纯度为至少80％、更合适地至少90％、甚至更合适地至少95％的水解物质。优选地，该水解产物可以包含纯度为至少约99％的水解物质。
在一个实施例中，在本发明的方法和/或用途中使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或三酶组合物可以在至少约40℃的温度下与底物(例如蛋白质和/或肽底物)一起孵育。换句话说，本发明的方法可以在至少约40℃的温度下进行。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或三酶组合物可以在至少约45℃、合适地至少约50℃的温度下与底物一起孵育。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或三酶组合物可以在至少约55℃的温度下与底物一起孵育。
在另一个实施例中，在本发明的方法和/或用途中使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或三酶组合物可以在约40℃至约70℃之间的温度下与底物(例如蛋白质和/或肽底物)一起孵育。换句话说，本发明的方法可以在约40℃至约70℃之间的温度下进行。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或三酶组合物可以在约40℃至约60℃之间的温度下；甚至更合适地在约45℃至约65℃之间的温度下与底物一起孵育。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或三酶组合物可以在约50℃至约60℃之间的温度下与底物一起孵育。
合适地，用于本发明的方法和/或用途中或包括在本发明的任何产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在P1处的脯氨酸；以及在P1处的选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸的氨基酸。
可替代地或另外地，用于本发明的方法和/或用途中或包括在本发明的任何产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在P1’处的脯氨酸；以及在P1’处的选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸的氨基酸。
如本文所使用的，术语“脯氨酸耐受性三肽基肽酶”涉及可以从肽、寡肽和/或蛋白质底物的N末端裂解三肽的外切肽酶。在本文中也称为3PP的“脯氨酸耐受性三肽基肽酶”能够裂解脯氨酸处于位置P1的肽键以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1的肽键，和/或能够裂解脯氨酸处于位置P1’的肽键以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1’的肽键。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶不是内切蛋白酶。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶不是从底物的N末端裂解四肽的酶。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶不是从底物的N末端裂解二肽的酶。
在又进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶不是从底物的N末端裂解单个氨基酸的酶。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解脯氨酸处于位置P1的肽键，以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1的肽键。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解脯氨酸处于位置P1’的肽键，以及裂解除了脯氨酸以外的氨基酸处于P1’的肽键。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶也可能能够裂解其中存在于位置P1和/或P1’处的脯氨酸以其顺式或反式构型存在的肽键。
合适地，“除了脯氨酸以外的氨基酸”可以是选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
在另一个实施例中，“除了脯氨酸之外的氨基酸”可以是选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、或缬氨酸。
合适地，在这样一个实施例中，可以排除合成氨基酸。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解其中脯氨酸存在于位置P1和P1’处的肽键。
令人惊奇的是，三肽基肽酶可以作用于在位置P1和/或P1’处具有脯氨酸的底物上。甚至更令人惊奇的是，除了该活性之外，当在位置P1和/或P1’处存在除了脯氨酸以外的氨基酸时，三肽基肽酶也可能具有活性。
除了在如上所述的各种底物的任何一种上具有活性之外，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以另外耐受在选自下组的一个或多个位置上的脯氨酸，该组由以下各项组成：P2、P2’、P3和P3’。
合适地，除了具有如上所述的活性之外，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以耐受在位置P2、P2’、P3和P3’处的脯氨酸。
这是有利的，因为其允许具有脯氨酸延伸的肽和/或蛋白质底物的有效裂解并允许宽范围的肽和/或蛋白质底物的裂解。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以对在P1位置上具有一个或多个赖氨酸、精氨酸或甘氨酸的肽和/或蛋白质具有高活性。不希望受以下理论的束缚：在P1位置处包含这些氨基酸的肽和/或蛋白质底物对于许多三肽基肽酶和/或蛋白酶可能通常难以消化，并且一旦遇到这样的残基，肽和/或蛋白底物通过三肽基肽酶和/或蛋白酶的裂解可能停止或减慢。有利地，通过使用本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，可以有效地消化在P1处包含赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的蛋白质和/或肽底物。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能对在P1位置处具有赖氨酸的肽和/或蛋白质具有优先的活性。有利地，这允许具有高赖氨酸含量的底物(例如乳清蛋白)的有效裂解。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以包含氨基酸丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的催化三联体。
用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可能是热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶。
术语“热稳定的”意指当加热至高达约60℃的温度时酶保留其活性。合适地，“热稳定的”可以意指当加热至约65℃、更合适地约70℃时酶保留其活性。
有利的是，当与热稳定的变体相比时，热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶不容易变性，和/或将在例如动物中在更长的时期内保留其活性。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以在约pH 2至约pH 7的范围内具有活性。合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以在约pH 4至约pH 7的范围内、更合适地在约pH 4.5至约pH 6.5的范围内具有活性。
合适地，本发明的方法(特别是水解步骤)可以在2至约7之间的pH下进行。
在一个进行例中，本发明的方法(特别是水解步骤)可以在约4至约7(例如4.5至6.5)之间的pH下进行。
使用在约pH 4至约pH 7之间的pH范围内具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶是有利的，因为这允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶与在该pH范围内具有活性的再多一种内切蛋白酶一起使用。
当使用在约pH 4至约pH 7之间的pH范围内具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶时，合适地它可以与中性或碱性内切蛋白酶组合使用。
有利地，这意味着在酶处理之间不需要改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶或三酶组合物的组分同时添加到反应中，这可以使产生水解产物的方法更快和/或更有效和/或更成本-有效。此外，这允许更有效的反应，因为在较低的pH值下，底物可能从溶液中沉淀出来，因此不会被裂解。
任何适合的碱性内切蛋白酶都可以用于本发明中。合适地，碱性内切蛋白酶可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以在酸性pH下具有活性(合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶在酸性pH下可能具有最佳活性)。脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以在小于约pH 6的pH下、更合适地在小于约pH 5的pH下具有活性。优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在约2.5至约pH4.0之间的pH下、更合适地在约3.0至约3.3之间的pH下具有活性。
合适地，本发明的方法(特别是水解步骤)可以在2至约4(例如3至3.3)之间的pH下进行。在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以在约2.5的pH下具有活性。
在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以与酸性内切蛋白酶组合使用，并且有利地不需要在酶处理之间改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶或三酶组合物的组分同时添加到反应中，这可以使产生水解产物的方法更快和/或更有效和/或更成本-有效。
对于本文中的任何应用，至少一种内切蛋白酶可以与脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶组合使用。例如，至少一种内切蛋白酶可以包括在本发明的组合物和/或食品添加剂组合物和/或非食物产品中。
如本文所使用的，术语“内切蛋白酶”与术语“内切肽酶”同义，并且是指能够裂解肽或蛋白质底物的内部肽键(例如，不位于肽或蛋白质底物的C末端或N末端)的蛋白水解肽酶的一种酶。这样的内切蛋白酶可以定义为倾向于在远离N末端或C末端起作用的那些。
在一个实施例中，内切蛋白酶可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和选自未分组蛋白酶家族的蛋白酶。
在一个实施例中，内切蛋白酶可以是选自下组中的一种或多种：酸性真菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，或者来自商业蛋白酶产品的组：
Figure BDA0001330130990000171
AFP、
Figure BDA0001330130990000172
FP2、
Figure BDA0001330130990000173
NP、
Figure BDA0001330130990000174
碱性蛋白酶、
Figure BDA0001330130990000175
PXT、
Figure BDA0001330130990000176
PBR、
Figure BDA0001330130990000177
30L、
Figure BDA0001330130990000178
PHT或
Figure BDA0001330130990000179
51FP。
在一个实施例中，内切蛋白酶可以是酸性内切蛋白酶。合适地，内切蛋白酶可以是酸性真菌蛋白酶。
有利地，使用内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶的组合可以增加底物裂解的效率。不希望受理论束缚，据认为内切蛋白酶能够在远离C末端或N末端的多个区域裂解肽和/或蛋白质底物，从而产生用于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的更多的N末端以用作底物，从而有利地增加反应效率和/或减少反应时间和/或更有效地除去抗原(从而降低免疫原性)。
在本发明中使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以是“食品内(in-food)”脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
如本文所使用的，术语“食品内(in-food)”或“饲料内(in-feed)”意指酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物)在受试者的胃肠道(GIT)中是起作用的、优选地是主要起作用的、更优选地是唯一起作用的。换句话说，如本文所使用的，术语“食品内”意指在由受试者消费组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料之前，酶在组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中实质上无活性(或是无活性的)。
这里术语“主要起作用的”意指该酶一旦进入GIT，主要对其底物起作用。换句话说，在进入GIT之前，定义为肽和/或蛋白质底物裂解为三肽的量的酶活性水平小于约20％、合适地小于约10％、优选地小于约5％的其进入GIT后的酶活性水平。
如本文所使用的，术语“唯一起作用的”意指该酶在进入GIT之前是无活性的，并且一旦进入GIT就被活化。
如本文所使用的，术语“无活性的”意指酶是没有活性的。这可能意味着酶的活性受某种因素抑制，或者酶处于使其为无活性的环境中，或者在向动物饲喂之前立即使酶出现在其底物中这样使得没有足够的时间来活化。一旦酶进入受试者的GIT，其“无活性”状态在任何情况下都是可逆的。
因此，合适地，可以将脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物在被受试者消费其之前立即与至少一种蛋白质或其部分混合。
如本文所使用的，术语“实质上无活性的”意指与其进入GIT后的活性相比，酶具有低的活性。例如，实质上无活性可能意味着当与其在GIT中的活性相比时，在饲料添加剂组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中的酶具有其活性的小于10％。
在组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中将“食品内”酶维持在无活性或实质上无活性的状态能以本领域的技术人员已知的多种方式来实现。
举例来说，仅将组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料的含水量(wt％)维持在小于15％、优选小于10％就足以确保在组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中食品内酶是无活性的或实质上无活性的。
在一个实施例中，组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料在混合食品内酶后是(维持和/或储存)于干燥的状态或实质上干燥的状态。
如本文所使用的，术语“干燥的状态”意指脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)和/或组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料不包含或只含有非常少量的水。换句话说，如本文所使用的，术语“干燥的状态”可以意指脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物和/或组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料包含小于5％、优选小于1％的水含量(wt％)。
在一个实施例中，用于本发明的方法和/或用途和/或产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物可以处于干燥或实质上干燥的状态。
在另一个实施例中，用于本发明的任何方法和/或用途和/或产品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以与包含至少一种蛋白质或蛋白质的至少一部分的组合物混合，其中该组合物、该脯氨酸耐受性三肽基肽酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物当混合时处于干燥或实质上干燥的状态。合适地，可以进一步混合内切蛋白酶。
当在本文中使用时，术语“干燥或实质上干燥的状态”意指组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合仅含有非常少量的水。换句话说，如本文所使用的，术语“实质上干燥的状态”可以意指组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物包含小于15％、优选小于10％的水含量(wt％)。
在一个实施例中，组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物在用于本发明的方法和/或用途之前、期间或之后(优选之前)可以是干燥的。
在另一个实施例中，组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物在用于本发明的方法和/或用途之前或之后包含小于15wt％水分含量。
在另一个实施例中，组合物、脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物在用于本发明的方法和/或用途之前或之后包含小于10wt％水分含量；更合适地小于5wt％水分含量，并且甚至更合适地小于1wt％水分含量。
在组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中，通过物理上防止酶与其底物相互作用，可以使脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“食品内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合维持在无活性或实质上无活性的状态。例如，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“食品内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物可以在其用于本发明的方法和/或用途、组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中之前胶囊化。
当在组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物和/或食物和/或喂养料中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“食品内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物在物理上被防止与其底物相互作用时，那么一旦在GIT中就移除物理屏障，从而允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“食品内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物与其底物相互作用。
仅通过举例的方式，可以通过使胶囊化的脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如“食品内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物穿过受试者的喉咙(gizzard)、前胃或胃以去除胶囊化。受试者的喉咙、前胃或胃的pH(酸性)非常低(例如pH 2-4)。可利用此酸度激活胶囊化的酶。
在一个实施例中，可将聚合物用酶胶囊化，所述聚合物是例如甲壳素或壳聚糖、明胶、阿拉伯树胶或蜡。仅通过举例的方式，聚合物可以是如在薛(Xue)等人，食品与功能(Food Funct.)，2013年4月25日；2月6日(电子出版)；4(4)610-7中教导的明胶或阿拉伯树胶。可替代地，聚合物可以是如在张(Zhang)等人生物大分子(Biomacromolecules)2011,12,2894-2901中教导的基于壳聚糖的水凝胶。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如，“食品内”脯氨酸耐受性三肽基肽酶)、内切蛋白酶或其组合和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物可以通过由受试者对酶的消费来活化。
如本文所使用的，术语“无活性的”可能意味着，在受试者消费酶之前立即使酶出现在其底物中这样使得酶进入受试者的GIT之前没有足够的时间来活化。
在一些实施例中，酶的失活是永久性失活，例如，通过高温、化学或pH变性。因此，在这样的实施例中，“无活性的”可以是永久无活性的，例如，包括在受试者的GIT中。
本发明的酶，包括3PP和内切蛋白酶的组合，也在淀粉转化过程中有用，特别是在经历过液化的糊化的、未加工的和/或颗粒状淀粉的糖化和发酵过程中有用。所希望的最终产品(通常称为“最终发酵”或“EOF”产品)可以是能够通过淀粉底物的酶转化产生的任何产物。例如，所希望的产品可以是富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，该糖浆可以用于其他过程(例如高果糖玉米糖浆(HFCS)的制备)中，或可以将该糖浆转化成许多其他有用的产物，例如抗坏血酸中间体(例如葡糖酸盐；2-酮-L-古洛糖酸；5-酮-葡糖酸盐；和2,5-二酮葡糖酸盐)；1,3-丙二醇；氨基酸(例如酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如乳酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、葡糖酸盐、衣康酸盐和草酰乙酸盐)；抗生素；抗菌剂；酶；维生素；激素；乙醇、丁醇和其他醇类；葡萄糖酸δ-内酯；异抗坏血酸钠；ω-3脂肪酸；异戊二烯；以及其他生物化学品和生物材料。本领域技术人员知道可以用于生产这些EOF产品的各种发酵条件。
本领域技术人员清楚地知道可以用于制备用于转化的淀粉底物的可获得的方法。可以从块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷类获得有用的淀粉底物。更具体地，可以从玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、粟、树薯、木薯(tapioca)、高粱、水稻、碗豆、菜豆、香蕉或马铃薯中获得颗粒状淀粉。淀粉底物可以是来自研磨的全谷类的粗淀粉，其含有非淀粉级分，例如胚芽残余物和纤维。
液化通常涉及淀粉糊化，同时添加或随后添加α-淀粉酶，尽管可以任选地添加另外的液化诱导酶。在一些情况下，处于或低于糊化温度下进行淀粉的液化，典型地需要具有不同性能标准的相似类别的酶。使用α-淀粉酶(任选地在其他酶的存在下)，可以将液化的淀粉糖化成具有较低聚合度(DP)的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的颗粒状淀粉的类型。
可以在液化和/或糖化期间将本发明的酶作为分离的酶溶液、干燥或颗粒状的酶、澄清的肉汤、超滤液浓缩物或全细胞肉汤(任选地作为共混物的一部分)来添加。本发明的酶也能以由表达这些酶的宿主细胞产生的培养细胞材料的形式添加。本发明的酶还可以在发酵或同时糖化和发酵(SSF)过程期间由宿主细胞分泌到反应介质中，这样使得酶连续地提供到反应中(参见下文)。生产和分泌本发明的酶的宿主细胞还可以表达另外的酶，例如葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶。宿主细胞可以被工程化以表达广谱的各种糖解酶。
可以将通过用淀粉酶处理生产的可溶性淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)。可以使用葡萄糖异构酶(特别是固定在固体支持物上的葡萄糖异构酶)来实现该转化。
可溶性淀粉水解产物(特别是富含葡萄糖的糖浆)可以通过使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。产乙醇微生物包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。酵母的商业来源包括ETHANOL
Figure BDA0001330130990000221
(乐斯福公司(LeSaffre))；
Figure BDA0001330130990000222
(拉勒曼德公司(Lallemand))；RED
Figure BDA0001330130990000223
(红星公司(Red Star))；
Figure BDA0001330130990000224
(帝斯曼配料部(DSM Specialties))；和
Figure BDA0001330130990000225
(阿尔泰克公司(Alltech))。产生其他EOF(例如上述那些)的微生物也是本领域已知的。如上所述，糖化和发酵过程可以作为SSF过程(其中发酵生物体表达本发明的酶)，任选地使用一种或多种另外的酶，例如葡糖淀粉酶和/或α-淀粉酶进行。发酵可以包括随后的EOF的富集、纯化和回收。
水解产物
本发明还提供通过本发明的方法可获得(例如获得)的水解产物。
合适地，这样的水解产物可以富含三肽。合适地，该水解产物可以富含一种或多种在其N末端具有脯氨酸的三肽和/或其N末端和C末端具有脯氨酸的三肽。
优选地，这样的水解产物可以富含一种或多种在其N末端具有脯氨酸和在其C末端具有脯氨酸的三肽。
可替代地或另外地，该水解产物可以包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或本文所述的三酶组合物，例如任何一个本文所述的氨基酸序列或通过本文的任何方法可获得(例如获得)的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
如本文所使用的，术语“水解产物”在本领域中具有其通常的含义，并且是指从使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶处理蛋白质或其部分产生的产物。蛋白质或其部分的蛋白水解裂解的程度可以从最小限度(例如在单个蛋白质上的单个肽键的裂解)到广泛，这取决于例如处理的条件(例如处理的长度)、温度、蛋白质的浓度、以及脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶的纯度、浓度和活性。
因此，“水解产物”典型地包含通过使用至少一种蛋白酶(合适地脯氨酸耐受性三肽基肽酶)裂解肽和/或蛋白质底物而可获得的短肽的混合物。合适地，这样的水解产物可以实质上富含三肽，并且任选地也可以富含单个氨基酸和/或二肽。
有利地，三肽、二肽和/或单个氨基酸的富集可以导致动物和/或人类更有效地摄取水解产物。
具有高含量的三肽以及二肽的水解产物是营养上有利的，因为二肽和三肽的肠吸收经由PepT1受体发生，该PepT1受体独立于游离氨基酸的摄取而起作用(吉尔伯特(Gilbert)等人，2008，动物科学杂志(J ANIM SCI)，86:2135-2155)。
如本文所使用的，术语“实质上富含三肽”意指通过本领域已知的任何方法(例如液相色谱-质谱(LC-MS))测量的总肽浓度中，至少约20％(合适地至少约30％)的那些肽是三肽。合适地，至少约40％的那些肽是三肽，更合适地至少约50％。
在一个实施例中，如本文所使用的，术语“实质上富含三肽”意指通过本领域已知的任何方法(例如液相色谱-质谱(LC-MS))测量的总肽浓度中，至少约70％的那些肽是三肽。
有利地，在蛋白质水解过程中可以使用超滤。酶促膜反应器具有至少一个连接到水解反应器的超滤膜。因此，在水解期间可以使用超滤以除去酶抑制肽和/或产生具有由膜的分子量截止值确定的分子量的肽级分。这对于生产具有高度降低的变应原性的短肽是有用的。酶促膜反应器还可以促进蛋白质底物向所希望的肽的更高的转化以及所应用的蛋白水解酶的再使用。酶促膜反应器的使用实例在艾西尔(Eisele)等人(2013)，欧洲食品研究与技术(European Food Research and Technology)236,483-490以及Cheison SC、王(Wang Z)、徐(Xu SY)(2007)农业与食品化学杂志(J Agric Food Chem)55,3896-3904中给出。
在一个实施例中，水解产物可以包含小于约20％、合适地小于约10％的全长起始底物(例如至少一种蛋白质)。合适地，水解产物可以包含小于约5％、更合适地小于约1％的全长起始底物(例如至少一种蛋白质)。
在一些实施例中，水解产物可以不包含或实质上不包含全长起始底物。
如在上下文中使用的，术语“实质上不”意指小于约0.5％、合适地小于约0.1％的全长起始底物。
在内切蛋白酶、S53家族的外切三肽基肽酶和氨基肽酶已被用于制造水解产物情况下，据信这样的水解产物将富含单个氨基酸、二肽和三肽。
在一个实施例中，存在于这样的水解产物中的单个氨基酸、二肽和三肽可以按照所述每一种的摩尔浓度进行定量。在一个实施例中，水解产物中单个氨基酸、二肽和三肽的摩尔比可以是至少约20％的单个氨基酸至至少约10％的二肽至至少约10％的三肽。
在另一个实施例中，水解产物中单个氨基酸、二肽和三肽的摩尔比可以是至少约10％的单个氨基酸至至少约20％的二肽至至少约20％的三肽。
根据本发明的方法可获得的或用于本文教导的任何应用的水解产物在倾向于对至少一种蛋白质或其部分具有免疫响应的受试者中可能具有降低的免疫原性，该至少一种蛋白质或其部分形成用于生产的水解产物的消化的底物。
本发明的水解产物通过将至少一种蛋白质或其部分与内切蛋白酶和脯氨酸耐受性三肽基肽酶混合来生产。
在水解产物的制造中用作底物的蛋白质或其部分可以是动物蛋白质或植物蛋白质(例如蔬菜蛋白质)。
合适地，蛋白质或其部分可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白；或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白、胶原蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白、肉蛋白、蛋类蛋白、大豆蛋白、大麦醇溶蛋白和谷物蛋白。
在一个实施例中，优选地，蛋白质或其部分是植物蛋白质、基于乳的蛋白质、蛋类蛋白质或其组合。
在一个实施例中，优选地蛋白质或其部分是植物蛋白质，优选地其中该蛋白质是麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白的免疫原性片段、谷物蛋白、谷蛋白、大豆蛋白质中的一种或多种。
在一个实施例中，优选地，蛋白质或其部分是基于乳的蛋白质，优选地其中该蛋白质是酪蛋白(例如β-酪蛋白)；乳球蛋白，例如β-乳球蛋白；或乳清蛋白中的一种或多种。
在一个实施例中，优选地蛋白质或其部分是蛋类蛋白质。
蛋白质或其部分可以包含在以下各项中：玉米、大豆粉、玉米干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦、小麦蛋白(包括谷蛋白)、小麦副产品、麦麸、玉米副产品(包括玉米蛋白粉)、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、全脂大豆、动物副产品膳食、醇可溶性蛋白质(优选玉米蛋白(例如黄色玉蜀黍玉米蛋白)和/或高粱醇溶蛋白(例如来自高粱))、来自油籽的蛋白质(优选来自大豆种子蛋白、向日葵种子蛋白、油菜籽蛋白、卡诺拉种子蛋白或其组合)或其组合。
在一个实施例中，蛋白质或其部分可以是蛋白质粉。在一个实施例中，这可以是来自鱼的蛋白质粉或来自动物(例如非人类哺乳动物)的蛋白质粉。
在一些实施例中，根据本发明使用的蛋白质或其部分可以是动物副产品。
此类副产品可以包括来自动物生产和加工的组织，其不用于人类食品并且被加工成用于动物饲料和宠物食品的大量蛋白质膳食。在一个实施例中，动物蛋白副产品可以是肉和骨粉、肉粉、血粉、家禽副产品粉、家禽粉、羽毛粉和鱼粉。
在另一个实施例中，用于本发明的蛋白质或其部分可以是微生物蛋白。微生物蛋白，例如像酵母提取物典型地通过从微生物培养物中提取细胞内容物来制备；它们可以用作食品添加剂或调味剂，或用作微生物培养基的营养素。
在又进一步的实施例中，用于本发明的蛋白质或其部分可以是无脊椎动物蛋白质，合适地是昆虫蛋白质。
昆虫/无脊椎动物具有巨大的生物多样性，并且代表了大的生物量(95％的动物界)，从而提供了替代性的蛋白质来源。
在一个实施例中，蛋白质或其部分可以是选自下组的一种或多种，该组由以下各项组成：小麦蛋白质、小麦蛋白质的部分、乳品蛋白质和乳品蛋白质的部分。
小麦蛋白质或其部分可以从小麦、小麦产品(例如小麦粉)、小麦副产品和/或麦麸获得。合适地，小麦蛋白质可以是选自下组的一种或多种，该组由以下各项组成：麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白的部分、谷蛋白和谷蛋白的部分。
乳品蛋白质或其一部分可以是乳蛋白。合适地，乳蛋白可以是选自下组中的一种或多种，该组由以下各项组成：β-酪蛋白、β-乳球蛋白和乳清蛋白。
关于用于制造水解产物的蛋白质或其部分的“其部分”可以是蛋白质的免疫原性片段。“免疫原性片段”是能够在敏感个体中引发免疫响应的任何部分。“免疫原性片段”或“其部分”是包含至少10个氨基酸、合适地至少20个氨基酸、更合适地至少30个氨基酸或由其组成的全长蛋白质的区域。
在一些实施例中，免疫原性片段或其部分可以是至少约50个氨基酸；更合适地至少约100个氨基酸、并且甚至更合适地至少约200个氨基酸。
如本文所使用的，“乳蛋白”涵盖在产后雌性哺乳动物的乳腺的正常分泌物或从其衍生的产物中的任何天然存在的蛋白质，例如其部分或从其或由其制备的组分。乳可以来自任何哺乳动物物种，包括但不限于牛、山羊、绵羊、水牛、牦牛、骆驼、美洲驼、羊驼和人类。来自其乳在商业上使用或广泛地用于各种文化和国家的那些哺乳动物的乳蛋白是优选的。应当注意的是，如本文所使用的，“乳蛋白”涵盖单词“蛋白质”的单数和复数，因此术语“乳蛋白”可以是指单个蛋白质，或一种或多种蛋白质的任何混合物，除非另有说明。
术语“乳清蛋白”涵盖在“乳清”中以任何量发现的任何蛋白质；制作乳酪的、与凝乳分离的液体副产品。从许多奶酪的生产中产生的乳清的胶束乳蛋白例如酪蛋白特别低，但是可溶性蛋白质例如α乳白蛋白和β-乳球蛋白相对富集。与上述“乳蛋白”一样，如本文所使用的，术语“乳清蛋白”涵盖单词“蛋白质”的单数和复数，因此术语“乳清蛋白”也可以是指单一的蛋白质或一种或多种乳清蛋白的任何混合物，除非另有说明。本领域技术人员将理解，乳清蛋白实际上是乳蛋白的亚类，因此术语“乳蛋白”可以包括一种或多种乳清蛋白，除非另有说明。乳清组合物可以包括例如乳、奶油和乳酪乳清。可以使用来自任何奶酪类型的乳清。乳清蛋白可以衍生自任何方法，例如奶酪乳清的过滤、透析、蒸发、和反渗透，或通过导致通常被描述为“乳清蛋白”的蛋白质的任何其他方法。
在一个优选的实施例中，通过本发明的方法可获得(例如获得)的水解产物可以是乳蛋白水解产物、小麦蛋白水解产物(例如麦醇溶蛋白和/或谷蛋白水解产物)、大豆蛋白水解产物或其组合。
因此，提供了至少一种内切蛋白酶和至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或含有脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物在制造水解产物中的用途，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任一种方法获得；该水解产物用于在倾向于对未处理的水解产物具有免疫反应的受试者中降低免疫原性。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：在P1处的脯氨酸；以及在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及在P1’处的脯氨酸；以及在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
如本文所使用的，“降低的免疫原性”是指可测量的免疫响应的任何降低、减少或改善。可以在体外或体内评估此类响应的测量。例如，响应可以在来自个体的生物样品中直接或间接地测量，该生物样品包括组织、细胞、或流体、或类似物、或其组合，或者可以直接或间接地在个体中进行评估。虽然在本文提供的各种实施例中，此类响应的任何数学减少(或降低)(无论是体外还是体内测量的)都将是足够的，但是优选的是该减少是更加实质性的减少。当然，本领域技术人员将会理解，诸如免疫响应的测量的生物学数据在个体内以及从个体到个体之间经受潜在的巨大变化。例如，在响应是在“敏感”个体中的情况下，免疫响应优选实质地降低(例如至少约50％、60％、或70％、或甚至约80％或更多)。更优选地，与来自对一种或多种蛋白质或其部分不敏感的个体的免疫响应的量度相比，在这样的敏感个体中使用本文所述的蛋白质水解产物观察到仅小的或最低限度的不同。在免疫响应被认为是不利的(例如过敏响应)的情况下，这是特别优选的。在这样的情况下，敏感个体的免疫响应(或其量度)的减少可以为至少约85％至约90％、更优选地约90％至约95％、或甚至更高。在一些情况下，敏感个体对本文所述的蛋白质水解产物的响应在统计学上与不敏感的个体的响应没有显著差异。而在其他情况下，免疫响应的降低可能是在“敏感”个体中使用未水解的蛋白质观察到的许多倍。例如，响应可能存在10倍至100倍或甚至1000倍的降低。更优选地是，与个体对未修饰的蛋白质的响应相比，来自消费或暴露于如本文披露的蛋白质水解产物组合物的个体的免疫响应的量度的约1000倍至10,000倍或甚至100,000倍的降低或更多的降低。
如本文所使用的，“敏感”个体是倾向于对处于非水解形式的蛋白质具有免疫响应或反应的个体。作为消费或暴露于例如一种或多种蛋白质或其部分的直接或间接结果的这种免疫响应或反应是那些蛋白质的免疫原性的量度。这样的蛋白质将在不倾向于对该蛋白质具有这样的免疫响应的个体中显示出很少免疫原性至不显示免疫原性，这样的个体在本文中有时被称为对一种或多种蛋白质或其部分“不敏感(insensitive)”或“无敏感(notsensitive)”。优选地，这样的个体对于暴露于或消费蛋白质将不具有显著的免疫反应(免疫学响应)。
对小麦蛋白(特别是谷蛋白和/或麦醇溶蛋白)具有反应的敏感个体可呈现乳糜泻(例如口炎性腹泻)症状。症状包括消化道的疼痛和不适、慢性便秘和腹泻、发育停滞(儿童)、贫血和疲劳，但是这些可能不存在，并且其他器官系统的症状已被描述。由于小肠适当地从食物中吸收营养素的能力下降，常常在患有乳糜泻的人中注意到维生素缺乏症。不希望受理论束缚，据信，一旦暴露于麦醇溶蛋白，酶组织转谷氨酰胺酶就修饰麦醇溶蛋白，导致免疫系统与肠组织的交叉反应，从而在受影响的个体中引起炎症反应。
对乳蛋白具有反应的敏感个体可能呈现乳过敏症状，该乳过敏是由对乳中的一种或多种蛋白质或其免疫原性片段的不良免疫反应引起的。该失调可以是抗体介导的或非抗体介导的。抗体介导的乳过敏通常发病迅速，并且可能导致个体显示胃肠的、皮肤病学的和/或呼吸的症状。此类症状可能进一步表现为：皮疹、荨麻疹、呕吐和胃部不适(例如腹泻、鼻炎、胃痛、气喘或过敏性反应)。非抗体介导的通常被认为是由T淋巴细胞介导的，而不是由抗体引起的。这种形式的症状典型地是胃肠的和皮肤病的。
其他敏感个体可能对大豆具有反应，这导致一系列症状，最严重的是过敏性反应。
水解产物和/或食品和/或饲料和/或包含此类水解产物或本发明的组合物可能特别适合于给予至患有乳糜泻、乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏的受试者。
有利地，内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合能够裂解与在患有例如乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏的疾病的敏感个体中引起免疫响应相关的蛋白质底物。
因此，在一个实施例中，提供了包含根据本发明的方法和/或用途生产的水解产物的食品添加剂或饲料添加剂组合物。
在本发明的另一个方面，还提供了至少一种内切蛋白酶和至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或含有脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物在制造用于降低水解产物的苦味的水解产物中的用途，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任何一种方法获得。
当用于水解产物生产的蛋白质或其部分底物富含疏水性L-氨基酸时，蛋白质水解产物可能具有苦味。不希望受理论束缚，据信肽的苦味取决于其肽长度和其中的L-氨基酸残基的平均疏水性。
可以使用被要求评价水解产物的苦味的个体品尝小组来客观地测量水解产物的“降低的苦味”。可以使用苦味指数来评价水解产物的苦味。例如，可以使用相对于奎宁(参比指数被给定为1)评价物质的苦味指数，可替代地可以使用具有从0(不苦)到10(苦)的数值范围的苦味指数。合适地，可以使用适当的对照(例如盲试)来进行水解产物的任何品尝。另外地或可替代地，可以经由LC-MS或本领域已知的其他合适的技术来监测已知苦味肽的裂解。
内切蛋白酶和脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以用于裂解苦味肽。
有利地，由于脯氨酸耐受性三肽基肽酶对位置P1、P2、P3、P1’、P2’和/或P3’处的多种氨基酸的耐受性，这可以被实现。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解具有序列GPFPIIV、VIPVPQK和/或GPFPVI的蛋白质。已知GPFPVI是高度苦的肽(Matoba等人(1970)，农业与生物化学(Agric.Biol.Chem.)34，321)。
令人惊奇的是，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够裂解在P1和/或P1’位置具有脯氨酸的肽，从而促进此类苦味肽的裂解。
在一个实施例中，去苦味的水解产物可以用于制备食品和或食物。
在一个实施例中，水解产物可以包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：
SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
试剂盒
在一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
或可通过本发明的任何一种方法获得；包含至少一种内切蛋白酶；以及将其共同给予的说明书。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；以及
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
更合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能能够从在位置P1处和在位置P1’处具有脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：(i)至少一种内切肽酶；
(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及(iii)一种或多种氨基肽酶，和用于将其共同给予的说明书
内切蛋白酶可以与脯氨酸耐受性三肽基肽酶单独分开，或者两种酶可以混合。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶能以本文所述或本领域技术人员已知的任何方式配制。
如本文所使用的，术语“共同给予”意指单独(例如顺序地)或一起(例如同时)给予一种或多种成分和/或酶。
活性和测定
用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性。
如本文所使用的，术语“外切肽酶”活性意指脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从底物(例如蛋白质和/或肽底物)的N末端裂解三肽。
如本文所使用的，术语“主要具有外切肽酶活性”意指三肽基肽酶没有或实质上没有内切蛋白酶活性。
“实质上没有内切蛋白酶活性”意指当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约100U内切蛋白酶活性。合适地，“实质上没有内切蛋白酶活性”意指当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定(EBSA)”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约100U内切蛋白酶活性。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的外切肽酶当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约10U内切蛋白酶活性，更优选地，当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，在本文教导的“内切蛋白酶测定”中具有少于约1U内切蛋白酶活性。甚至更优选地，当与在本文教导的“外切肽酶广泛特异性测定”中的1000nkat的外切肽酶活性相比时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶或外切三肽基肽酶在本文教导的“内切蛋白酶测定”中可以具有少于约0.1U内切蛋白酶活性。
“内切蛋白酶测定”
用于内切蛋白酶活性的偶氮酪蛋白测定
使用了由艾弗森(Iversen)和约根森
Figure BDA0001330130990000311
1995(生物技术技巧(Biotechnology Techniques)9,573-576)描述的内切蛋白酶测定的改良版本。将50μl的酶样品添加到的4倍稀释的麦基尔文(McIlvaine)缓冲液(pH5)中的250μl的偶氮酪蛋白(0.25％w/v；来自西格玛公司(Sigma))中，并且在40℃下在振摇(800rpm)下孵育15min。通过添加50μl的2M三氯乙酸(TCA)(来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，丹麦)并以20,000g离心5min来终止反应。向195μl上清液样品中添加65μl的1M NaOH，并且测量在450nm处的吸光度。将内切蛋白酶活性的一个单位定义为在40℃下在450nm处在15min内产生0.1的吸光度增加的量。
“外切肽酶测定”
测定有两个部分：
第1部分-“外切肽酶广泛特异性测定”(EBSA)
将10μL的发色肽溶液(溶解于二甲亚砜(DMSO)中的10mM H-Ala-Ala-Ala-pNA；MW＝387.82；巴赫姆公司(Bachem)，瑞士)添加到在微量滴定板中的130μl乙酸钠(20mM，用乙酸调节至pH 4.0)中，并且在40℃下加热5分钟。添加10μL的适当稀释的酶，并且在405nm处在MTP读数器(Versa max，分子装置公司(Molecular Devices)，丹麦)中测量吸收。将一开特的蛋白水解活性定义为每秒释放1摩尔对硝基苯胺所需的酶的量。
第2部分(i)-P1脯氨酸测定
(a)将底物H-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val(MW＝897.12；来自谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根)以1mg/ml浓度溶解于10倍稀释的麦基尔文缓冲液(pH＝4.5)中。
(b)在40℃下将1000μl的底物溶液与10μg的脯氨酸耐受性三肽基肽酶溶液一起孵育。
(c)在7个时间点(0、30、60、120、720和900min)取100μl样品，用50μl 5％TFA稀释，加热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析；
(d)使用衔接到LTQ轨道阱(Orbitrap)经典混合质谱仪(赛默科技公司(ThermoScientific)，德国不来梅港市)的安捷伦(Agilent)1100系列毛细管HPLC系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉市(Santa Clara，CA))进行LC-MC/MS分析；
(e)将样品加载到50mm FortisTM C18柱(内径为2.1mm，并且实际尺寸为1.7μm)
(f)使用2％-28％溶剂B(H2O/CH3CN/HCOOH(50/950/0.65v/v/v))的14min梯度，以200μL/min的流速进行分离至IonMAX源-LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行；
(g)通过轨道阱测量肽质量(在m/z 400下以60.000的分辨率获得MS扫描)，并且选择多达2个最强的肽m/z，并且在线性离子阱(LTQ)中使用CID进行片段化。启用动态排除，列表大小为500质量，持续时间为40s，相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm；
(h)使用开源程序Skyline 1.4.0.4421(获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss Lab Software,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th Ave NESeattle,Washington,US)来访问RAW文件并提取MS1强度以构建色谱图。将前体同位素输入过滤器设置为3个计数(M、M+1和M+2)，分辨率为60,000，并且使用最强电荷状态；
(i)将底物和裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品(0、30、60、120、720和900min水解)中计算强度。
(j)将一个活性单位定义为在本测定中将在720min内水解50％的底物同时释放Arg-Gly-Pro的酶的量。
第2部分(ii)-P1’脯氨酸测定
(a)将肽H-Ala-Ala-Phe-Pro-Ala-NH2(MW＝474.5；来自谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根)以0.1mg/ml浓度溶解于10倍稀释的麦基尔文缓冲液(pH＝4.5)中。
(b)在40℃下将1000μl的底物溶液与10μg的脯氨酸耐受性三肽基肽酶溶液一起孵育。
(c)在7个时间点(0、30、60、120、720和900min)取100μl样品，用50μl 5％TFA稀释，加热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析；
(d)使用衔接到LTQ轨道阱(Orbitrap)经典混合质谱仪(赛默科技公司(ThermoScientific)，德国不来梅港市)的安捷伦(Agilent)1100系列毛细管HPLC系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉市(Santa Clara，CA))进行LC-MC/MS分析；
(e)将样品加载到50mm FortisTM C18柱(内径为2.1mm，并且实际尺寸为1.7μm)
(f)使用2％-28％溶剂B(H2O/CH3CN/HCOOH(50/950/0.65v/v/v))的14min梯度，以200μL/min的流速进行分离至IonMAX源-LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行；
(g)通过轨道阱测量肽质量(在m/z 400下以60.000的分辨率获得MS扫描)，并且选择多达2个最强的肽m/z，并且在线性离子阱(LTQ)中使用CID进行片段化。启用动态排除，列表大小为500质量，持续时间为40s，相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
(h)使用开源程序Skyline 1.4.0.4421(获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss Lab Software,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th Ave NESeattle,Washington,US)来访问RAW文件并提取MS1强度以构建色谱图。将前体同位素输入过滤器设置为3个计数(M、M+1和M+2)，分辨率为60,000，并且使用最强电荷状态；
(i)将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
(j)将一个活性单位定义为在本测定中将在720min内水解50％的底物同时释放Ala-Ala-Phe的酶的量。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有至少50nkat的活性/mg蛋白质并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有至少100U活性/mg蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有约50-2000nkat之间的活性/mg蛋白质并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有约1-500单位活性/mg蛋白质。注意，在实例2中描述了蛋白质测量。
“P1和P1’脯氨酸活性测定”
合适地，用于本发明中的三肽基肽酶可能能够裂解在位置P1和P1’处具有脯氨酸的底物。这可以使用下面教导的测定来进行评估。
在该测定中，通过LC-MS和无标记定量检查三肽基肽酶水解合成的底物AAPPA的能力。
(a)将肽H-AAPPA-NH2(MW＝424.3，谢弗-N公司(Schafer-N)，哥本哈根)溶解于20mM MES缓冲液(pH＝4.0(1mg/ml))中；
(b)在室温下，将1000μl的H-AAPPA-NH2溶液与200μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶溶液(40ug/ml)(底物/酶100:0.8)一起孵育；
(c)在7个时间点(0、5、15、60、180、720和1440min)取100μl样品，用50μl 5％TFA稀释，加热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析；
(d)使用衔接到LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司(Thermo Scientific)，德国不来梅港市)的Easy LC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞市)进行纳米LC-MS/MS分析；
(e)使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μmo.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μmo.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))；
(f)使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离至纳米电喷雾离子源(赛默科技公司(ThermoScientific)，丹麦欧登塞)-以数据依赖的MS/MS模式操作LTQ轨道阱经典仪器；
(g)通过轨道阱测量肽质量(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)，并且选择多达2个最强的肽m/z，并且在线性离子阱(LTQ)中使用CID进行片段化。启用动态排除，列表大小为500质量，持续时间为40s，相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm；
(h)使用开源程序Skyline 1.4.0.4421(获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss Lab Software,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th Ave NESeattle,Washington,US))来访问RAW文件，该程序可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素输入过滤器设置为3个计数(M、M+1和M+2)，分辨率为60,000，并且使用最强电荷状态；
(i)将底物以及裂解产物的肽序列输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
(j)将一个活性单位定义为在本测定中将在24h内水解50％的底物同时释放AAP的酶的量。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有至少50nkat的活性/mg蛋白质并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有至少100U活性/mg蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文所教导的活性的第1部分中具有约50-2000nkat之间的活性/mg蛋白质(如在实例2中计算蛋白质浓度)并且在本文教导的测定的第2(i)部分或第2(ii)部分中具有约1-500单位活性/mg蛋白质(如在实例2中计算蛋白质浓度)。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中可以具有至少10U活性/mg蛋白质。
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中具有约1U-500U活性之间的活性/mg蛋白质。
除了上述之外，脯氨酸耐受性三肽基肽酶还可以具有根据上面教导的“外切肽酶活性测定”的第1部分的活性。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中可以具有至少10U的活性/mg蛋白质，并且在本文教导的“外切肽酶活性测定”的第1部分中可以具有至少50nkatal/mg蛋白质。
在另一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶在本文教导的“P1和P1’脯氨酸活性测定”中具有约1U-500U活性之间的活性/mg蛋白质，并且在本文教导的“外切肽酶活性测定”的第1部分中具有约50U-2000U开特之间的活性/mg蛋白质。
氨基酸和核苷酸序列
根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自任何来源，只要其具有本文所述的活性即可。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自木霉属(Trichoderma)。
合适地来自里氏木霉(Trichoderma reesei)，更合适地来自里氏木霉QM6A。
合适地来自绿木霉(Trichoderma virens)，更合适地来自绿木霉Gv29-8。
合适地来自深绿木霉(Trichoderma atroviride)。更合适地，来自深绿木霉IMI206040。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自曲霉属(Aspergillus)。
合适地来自烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)，更合适地来自烟曲霉菌CAE17675。
合适地来自川地曲霉(Aspergillus kawachii)，更合适地来自川地曲霉IFO4308。
合适地来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，更合适地来自构巢曲霉FGSC A4。
合适地来自米曲霉(Aspergillus oryzae)，更合适地来自米曲霉RIB40。
合适地来自赤曲霉(Aspergillus ruber)，更合适地来自赤曲霉CBS135680。
合适地来自土曲霉(Aspergillus terreus)，更合适地来自土曲霉NIH2624。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自离蠕孢属(Bipolaris)，合适地来自玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)，更合适地来自玉米小斑病菌C5。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自Togninia，合适地来自Togninia minima，更合适地Togninia minima UCRPA7。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自篮状菌属(Talaromyces)，合适地来自柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)，更合适地来自柄篮状菌ATCC 10500。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自节皮菌属(Arthroderma)，合适地来自苯黑末节皮真菌(Arthroderma benhamiae)，更合适地苯黑末节皮真菌CBS 112371。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自稻瘟菌属(Magnaporthe)，合适地来自稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)，更合适地稻瘟病菌70-1。
在另一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自镰刀菌属(Fusarium)。
合适地来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，更合适地来自尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种。
合适地来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，更合适地来自禾谷镰刀菌PH-1。
在进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自暗球腔菌属(Phaeosphaeria)，合适地来自小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)，更合适地来自小麦颖枯病菌SN15。
在又进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自伞菌属(Agaricus)，合适地来自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，更合适地来自双孢蘑菇burnettii变种JB137-S8。
在又进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自支顶孢属(Acremonium)，合适地来自支顶孢菌(Acremonium alcalophilum)。
在又进一步的实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自Sodiomyces，合适地来自Sodiomyces alkalinus。
在一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自青霉属(Penicillium)。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自指状青霉(Penicillium digitatum)，更合适地来自指状青霉Pd1。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自草酸青霉(Penicillium oxalicum)，更合适地来自草酸青霉114-2。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自娄地青霉(Penicilliumroqueforti)，更合适地来自娄地青霉FM164。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自鲁本斯青霉(Penicillium rubens)，更合适地来自鲁本斯青霉威斯康星(Penicillium rubens Wisconsin)54-1255。
在另一个实施例中，根据本发明使用的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得(例如获得)自新萨托菌属(Neosartorya)。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可获得自费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)，更合适地获得自费希新萨托菌NRRL181。
在一个实施例中，根据本发明使用的三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)不可获得(例如获得)自黑曲霉(Aspergillus niger)。
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至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99或其功能片段；
(b)包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段；
(c)由包含序列SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码；
(d)由与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.96或SEQ ID No.97具有至少约70％序列同一性的核苷酸序列编码；
(e)由在中等严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码；或
(f)由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ IDNo.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ IDNo.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以表达为进一步经历转录后和/或翻译后修饰的多肽序列。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.98或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.98具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.98或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.98具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段；
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以是已经经历转录后和/或翻译后修饰(例如翻译后裂解)的“成熟”脯氨酸耐受性三肽基肽酶。合适地，这样的修饰可能导致酶的活化。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.99或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
在又进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含氨基酸序列SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.99或其功能片段。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含与SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.99具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段；
术语“功能片段”是保留其肽酶酶活性的氨基酸序列的一部分。因此，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的功能片段是主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的一部分，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽
(i)(A)在P1处的脯氨酸；以及
(B)在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；和/或
(ii)(a’)在P1’处的脯氨酸；以及
(b’)在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。可替代地或另外地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的功能片段是主要具有外切肽酶活性并且能够从在P1和P1’处具有脯氨酸的肽的N末端裂解三肽的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的一部分。
“部分”是仍然具有如上述所定义的活性的任何部分；合适地一部分可以是具有50个，更合适地至少100个氨基酸的长度。在其他实施例中，该部分可以为约150个或约200个氨基酸的长度。
在一个实施例中，功能片段可以是转录后和/或翻译后修饰(例如裂解)后的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的部分。合适地，功能片段可以包含如以下各项所示的序列：SEQ IDNo.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ IDNo.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55或SEQ ID No.99。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.1的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.1具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.2的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.2具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.3的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.4的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.4具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.5的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.5具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.6的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.6具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.7的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.7具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.8的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.8具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.9的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.9具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.10的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.10具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.11的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.11具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.12的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.12具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.13的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.13具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.14的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.14具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.15的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.15具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.16的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.16具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.17的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.17具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.18的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.18具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.19的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.19具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.20的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.20具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.21的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.21具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.22的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.22具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.23的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.23具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.24的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.24具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.25的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.25具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.26的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.26具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.27的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.27具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.28的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.28具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.29的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.30的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.30具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.31的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.31具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.32的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.32具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.33的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.33具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.34的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.34具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.35的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.35具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.36的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.36具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.37的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.37具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.38的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.38具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.39的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.39具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.40的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.40具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.41的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.41具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.42的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.42具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.43的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.43具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.44的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.44具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.45的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.45具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.46的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.46具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.47的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.47具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.48的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.48具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.49的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.49具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.50的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.50具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.51的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.51具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.52的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.52具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.53的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.53具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.54的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.54具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.55的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.55具有至少70％同一性的氨基酸或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.98的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No：98具有至少70％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自SEQ ID No.99的氨基酸序列或其功能片段。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No：99具有至少70％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少80％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少85％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少90％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少95％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少97％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含与SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ IDNo.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ IDNo.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ IDNo.99具有至少99％同一性的氨基酸序列或其功能片段。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组的一个或多个的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98和SEQ ID No.99。
当用于食品应用时，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组的一个或多个的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.29和SEQ ID No.30，或与其具有至少70％同一性的序列；更合适地与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
在一些实施例中，可能合适地是脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30和SEQ IDNo.31，或与其具有至少70％同一性的序列。合适地是与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
有利地，这些特定的氨基酸序列可能特别适合于裂解富含赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的肽和/或蛋白质底物。特别是在P1位置存在赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的情况。
当用于饲料应用时，合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自下组的一个或多个的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.29、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQID No.98和SEQ ID No.99，或与其具有至少70％同一性的序列。合适地是与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以具有序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQID No.29。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含一个或多个选自下组的序列基序，该组由以下各项组成：xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含xEANLD。
x可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：G、T、S和V。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含y’Tzx’G。
y’可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：I、L和V。
z可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：S和T。
x’可以是选自下组的一个或多个氨基酸，该组由以下各项组成：I和V。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序QNFSV。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序xEANLD和y’Tzx’G或xEANLD和QNFSV。
在又进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序y’Tzx’G和QNFSV。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含序列基序xEANLD、y’Tzx’G和QNFSV。
一个或多个基序存在于用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶中。图25显示了这些基序的位置。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由如SEQ ID No.56、SEQ IDNo.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ IDNo.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ IDNo.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ IDNo.96、SEQ ID No.97所示出的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列编码。合适地是与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
优选地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ IDNo.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ IDNo.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ IDNo.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79或SEQ ID No.80具有至少95％序列同一性，更优选地与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97具有至少99％同一性的核苷酸序列编码。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由在中等严格条件下与SEQ IDNo.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ IDNo.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ IDNo.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ IDNo.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ IDNo.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码。合适地，在高严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ IDNo.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ IDNo.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ IDNo.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ IDNo.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
本发明还提供了一种分离的核酸，该分离的核酸包括：
(a)如本文中显示为SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97的核苷酸序列；
(b)与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ IDNo.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ IDNo.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ IDNo.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ IDNo.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ IDNo.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ IDNo.96或SEQ ID No.97具有至少约70％同一性的核苷酸序列；或
(c)在中等严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的序列；或
(d)归因于遗传密码的简并性而不同于以下各项的核苷酸序列
SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97。
合适地，核苷酸序列可以是与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97具有至少约80％同一性，更合适地与SEQ IDNo.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ IDNo.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ IDNo.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ IDNo.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ IDNo.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ IDNo.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ IDNo.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97具有至少约90％同一性的核苷酸序列。
核苷酸序列可以是与SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97具有至少约95％同一性、合适地至少约99％同一性的核苷酸序列。
在一个实施例中，分离的核酸可以包含在高严格条件下与SEQ ID No.56、SEQ IDNo.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ IDNo.63、SEQ ID No.64、SEQ ID No.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ IDNo.69、SEQ ID No.70、SEQ ID No.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ IDNo.75、SEQ ID No.76、SEQ ID No.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ IDNo.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ IDNo.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ IDNo.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列。
在一个实施例中，包含如SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ IDNo.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、SEQ ID No.64、SEQ IDNo.65、SEQ ID No.66、SEQ ID No.67、SEQ ID No.68、SEQ ID No.69、SEQ ID No.70、SEQ IDNo.71、SEQ ID No.72、SEQ ID No.73、SEQ ID No.74、SEQ ID No.75、SEQ ID No.76、SEQ IDNo.77、SEQ ID No.78、SEQ ID No.79、SEQ ID No.80、SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95、SEQ ID No.96或SEQ ID No.97所示出的核苷酸序列的分离的核苷酸序列可以是DNA、cDNA、合成的DNA和/或RNA序列。
优选地该序列是DNA序列，更优选地是编码本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的cDNA序列。
合适地，本发明还提供了一种分离的核酸，该分离的核酸包括：
(a)如本文中显示为SEQ ID No.56的核苷酸序列
(b)与SEQ ID No.56具有至少约70％同一性的核苷酸序列；或
(c)在中等严格条件下与SEQ ID No.56杂交的序列；或
(c)归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.56的核苷酸序列。
合适地，该核苷酸序列可以是与SEQ ID No.56具有至少约80％同一性、更合适地与SEQ ID No.56具有至少约90％同一性的核苷酸序列。
该核苷酸序列可以是与SEQ ID No.56至少具有至少约95％同一性、合适地至少约99％同一性的核苷酸序列。
在一个实施例中，该分离的核酸可以包含在高严格条件下与SEQ ID No.56杂交的核苷酸序列。
合适地，该分离的核酸可以包含在载体(例如质粒)中。
本发明还提供了包含根据本发明的分离的核酸序列或载体的宿主细胞。
合适地，该宿主细胞可以是木霉属宿主细胞，优选是里氏木霉宿主细胞。
在一个方面，优选地，用于本发明的氨基酸和/或核苷酸序列是处于分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少实质上不含与该序列在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。用于本发明的氨基酸和/或核苷酸序列能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可能实质上不含一种或多种潜在污染的多肽和/或核酸分子。
在一个方面，优选地，用于本发明的氨基酸和/或核苷酸序列是处于纯化的形式。术语“纯化的”意指给定的组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。
酶
在一个实施例中，根据本发明使用的三肽基肽酶或S53家族的外切三肽基肽酶可以选自下面选择的任何酶序列。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.1、其功能片段、或与SEQID No.1具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.2、其功能片段、或与SEQID No.2具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.3、其功能片段、或与SEQID No.3具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.4、其功能片段、或与SEQID No.4具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.5、其功能片段、或与SEQID No.5具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.6、其功能片段、或与SEQID No.6具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.7、其功能片段、或与SEQID No.7具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.8、其功能片段、或与SEQID No.8具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.9、其功能片段、或与SEQID No.9具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.10、其功能片段、或与SEQ ID No.10具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.11、其功能片段、或与SEQ ID No.11具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.12、其功能片段、或与SEQ ID No.12具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.13、其功能片段、或与SEQ ID No.13具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.14、其功能片段、或与SEQ ID No.14具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.15、其功能片段、或与SEQ ID No.15具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.16、其功能片段、或与SEQ ID No.16具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.17、其功能片段、或与SEQ ID No.17具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.18、其功能片段、或与SEQ ID No.18具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.19、其功能片段、或与SEQ ID No.19具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.20、其功能片段、或与SEQ ID No.20具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.21、其功能片段、或与SEQ ID No.21具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.22、其功能片段、或与SEQ ID No.22具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.23、其功能片段、或与SEQ ID No.23具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.24、其功能片段、或与SEQ ID No.24具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.25、其功能片段、或与SEQ ID No.25具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.26、其功能片段、或与SEQ ID No.26具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.27、其功能片段、或与SEQ ID No.27具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.28、其功能片段、或与SEQ ID No.28具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.29、其功能片段、或与SEQ ID No.29具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.30、其功能片段、或与SEQ ID No.30具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.31、其功能片段、或与SEQ ID No.31具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.32、其功能片段、或与SEQ ID No.32具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.33、其功能片段、或与SEQ ID No.33具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.34、其功能片段、或与SEQ ID No.34具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.35、其功能片段、或与SEQ ID No.35具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.36、其功能片段、或与SEQ ID No.36具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.37、其功能片段、或与SEQ ID No.37具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.38、其功能片段、或与SEQ ID No.38具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.39、其功能片段、或与SEQ ID No.39具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.40、其功能片段、或与SEQ ID No.40具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.41、其功能片段、或与SEQ ID No.41具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.42、其功能片段、或与SEQ ID No.42具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.43、其功能片段、或与SEQ ID No.43具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.44、其功能片段、或与SEQ ID No.44具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.45、其功能片段、或与SEQ ID No.45具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.46、其功能片段、或与SEQ ID No.46具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.47、其功能片段、或与SEQ ID No.47具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.48、其功能片段、或与SEQ ID No.48具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.49、其功能片段、或与SEQ ID No.49具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.50、其功能片段、或与SEQ ID No.50具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.51、其功能片段、或与SEQ ID No.51具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.52、其功能片段、或与SEQ ID No.52具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.53、其功能片段、或与SEQ ID No.53具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.54、其功能片段、或与SEQ ID No.54具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.55、其功能片段、或与SEQ ID No.55具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.98、其功能片段、或与SEQ ID No.98具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是包含SEQ ID No.99、其功能片段、或与SEQ ID No.99具有至少70％同一性的序列的三肽基肽酶。合适地该酶可以与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.56所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.57所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.58所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.59所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.60所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.61所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.62所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.63所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.64所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.65所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.66所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.67所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.68所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.69所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.70所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.71所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.72所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.73所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.74所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.75所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。
合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.76所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。
合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.77所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。
合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.78所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.79所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.80所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.81所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.82所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.83所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.84所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.85所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.86所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.87所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.88所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.89所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.90所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.91所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.92所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.93所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.94所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.95所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.96所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
在一个实施例中，用于本发明的酶可以是由包含如SEQ ID No.97所示出的序列或与其具有至少70％同一性的序列的核苷酸序列编码的三肽基肽酶。合适地由以下的序列编码：该序列与其具有至少80％或85％同一性。优选地与其具有至少90％或95％同一性。更优选地与其具有至少97％或99％同一性。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所定义的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。
如本文所使用的，术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在一个优选的实施例中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括当处于其天然环境中时或当其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为了易于指代，我们称该优选的实施例为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且当可操作地连接至其天然与之结合的整个启动子(该启动子也处于其天然环境中)时的整个核苷酸序列。然而，可以在核苷酸序列在其天然生物体中表达之后分离和/或纯化由本发明的范围所涵盖的氨基酸序列。优选地，然而，可以由在其天然生物体中的核苷酸序列表达本发明的范围所涵盖的氨基酸序列，但其中该核苷酸序列不在该生物体中与其天然结合的启动子的控制之下。
典型地，使用重组DNA技术(即重组DNA)制备由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列。然而，在本发明的替代性实施例中，可以使用本领域所熟知的化学方法整体或部分地合成该核苷酸序列(参见卡拉瑟斯(Caruthers MH)等人，(1980)核酸研究研讨会系列(NucAcids Res Symp Ser)，215-23；以及霍恩(Horn T)等人，(1980)核酸研究研讨会系列，225-232)。
核苷酸序列的制备
编码具有如本文所定义的特定性质的蛋白质或适合于修饰的蛋白质的核苷酸序列可以从生产所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的各种方法是领域内所熟知的。举例来说，一旦已鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列就可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。
进一步举例来说，可以使用来自生产酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别编码酶的克隆。可替代地，可将含有与另一个已知的酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
可替代地，编码酶的克隆可以通过这样来鉴定：将基因组DNA的片段插入表达载体(例如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌涂板于含有酶的底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而允许表达该酶的克隆能被鉴定出。
在又进一步的替代方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已建立的标准方法(例如，由Beucage S.L.等人(1981)四面体快报(Tetrahedron Letters)22，p 1859-1869或马瑟斯(Matthes)等人(1984)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3，p 801-805描述的亚磷酰胺方法)合成制备。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。也可以使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA序列，例如在US 4,683,202或在佐伯(Saiki R K)等人(科学(Science)(1988)239，pp 487-491中所描述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有如本文所定义的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可以从合适的来源制备/分离，或者其可以通过合成制得或者其可以通过利用重组DNA技术制备。
在本发明中涵盖的蛋白质可以与其他蛋白质(特别是酶)一起使用。因此，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白质/酶和另一种蛋白质/酶(其可以是根据本发明的另一种蛋白质/酶)。这个方面在后面部分讨论。
优选地，当与本发明的范围本身有关或当由本发明的范围本身所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且当其已经由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
分离的
在一个方面，优选地，根据本发明的氨基酸序列或核酸或酶是处于分离的形式。术语“分离的”意指序列或酶或核酸至少实质上不含与该序列、酶或核酸在自然界中天然结合或在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的序列、酶或核酸能以实质上不含该物质原本可能与之相结合的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。
纯化的
在一个方面，优选地，根据本发明的序列、酶或核酸是处于纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约80％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。合适地，其可能以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来确定的。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所定义的特定性质的多肽的一个或多个氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这样的多肽的任何核苷酸序列(下文称为“一个或多个同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在本发明上下文中，同源序列意在包括与主题序列可以具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的氨基酸或核苷酸序列。典型地，同源物将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
在一个实施例中，同源序列意在包括与主题序列相比具有一个或若干个添加、缺失和/或取代的氨基酸序列或核苷酸序列。
在一个实施例中，本发明涉及其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。
合适地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上、优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上确定。
在一个实施例中，本发明涉及一种核酸序列(或基因)，该核酸序列(或基因)编码其氨基酸序列在本文中被描绘的蛋白质，或编码通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并且具有亲本蛋白质的活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或若干个氨基酸(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个氨基酸)或更多个氨基酸(例如10个或多于10个氨基酸)。
在本发明上下文中，同源序列意在包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)具有至少75％、85％或90％同一性、优选至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以按照相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的上下文中优选的是按照序列同一性来表达同源性。
同源性比较可以通过眼睛，或更通常地借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的％同源性。
可以在连续序列上计算％同源性，即将一个序列与其他序列进行比对，并且将一个序列中的每个氨基酸与其他序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，此类无空位比对仅在相对短数目的多个残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其没有考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而当进行全局比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计来产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋予“空位罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对-反映两个比较序列之间更高的相关性-将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(affinegap cost)”，其对空位的存在索取相对高的成本，而对空位中每一个后续的残基索取较小的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。当然，高的空位罚分将会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许待修饰的空位罚分。然而，优选的是当使用此类软件进行序列比较时使用默认值。
因此，最大％同源性或％同一性的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这样的比对的合适的计算机程序是Vector NTI(英杰公司(Invitrogen))。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于：例如，BLAST程序包(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，简明分子生物学试验方案(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)1999，174(2):247-50；FEMS微生物通讯(FEMS Microbiol Lett)1999，177(1):187-8；以及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(阿特休尔(Altschul)等人，1990，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)403-410)以及AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见奥苏贝尔(Ausubel)等人，1999，第7-58页至7-60页)，例如像在基因组查询(GenomeQuest)搜索工具(www.genomequest.com)中。
尽管最终的％同源性可以按照同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarityscore matrix)，其基于化学相似性或进化距离对各个成对比较赋予分数。通常使用的这样的矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用Vector NTI程序包的默认值。
可替代地，基于类似于CLUSTAL的一种算法，可以使用Vector NTI(英杰公司(Invitrogen Corp.))中的多重比对功能计算同源性百分比(希金斯(Higgins DG)和夏普(Sharp PM)(1988)，基因(Gene)73(1)，237-244)。
一旦软件已经产生最佳比对就可以计算％同源性，优选地％序列同一性。典型地，作为序列比较的一部分软件进行此计算，并且生成数值结果。
当确定序列同一性时应该使用空位罚分，然后优选地使用如下参数用于成对比对：
对于BLAST
空位开始 9
空位延伸 2
对于CLUSTAL DNA 蛋白质
重量矩阵 IUB Gonnet 250
空位开始 15 10
空位延伸 6.66 0.1
在一个实施例中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上、优选在至少30个连续核苷酸上、优选在至少40个连续核苷酸上、优选在至少50个连续核苷酸上、优选在至少60个连续核苷酸上、优选在至少100个连续核苷酸上确定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上、优选在至少200个连续核苷酸上、优选在至少300个连续核苷酸上、优选在至少400个连续核苷酸上、优选在至少500个连续核苷酸上、优选在至少600个连续核苷酸上、优选在至少700个连续核苷酸上、优选在至少800个连续核苷酸上确定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可以在整个序列上确定。
合适地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上确定。
合适地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可以在本文教导的整个序列上确定。
在本发明的上下文中，术语“查询序列”意指与主题序列比对以便看看其是否属于本发明的范围内的同源序列或外源序列。因此，这样的查询序列可以例如是现有技术序列或第三方序列。
在一个优选的实施例中，序列通过全局比对程序进行比对，并且通过将由程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
在一个实施例中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认打分矩阵和默认空位罚分，将该两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以主题序列的长度。
在又进一步的优选实施例中，全局比对程序选自下组，该组由以下各项组成：CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，并且通过程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
序列还可以具有产生沉默改变和导致功能上等价的物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要保留物质的二级结合活性，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有类似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如根据下表，可以进行保守取代。第二列相同框中的氨基酸，优选第三列相同行的氨基酸可以彼此取代。
Figure BDA0001330130990001281
本发明还涵盖可能出现的同源取代(取代和替换两者在本文中用于意指现有氨基酸残基与替代性残基的互换)，即对等取代，例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等。也可能发生非同源取代，即从一类残基至另一类氨基酸或可替代地包含非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡喃丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯基甘氨酸。
替换也可以通过合成氨基酸(如非天然氨基酸)进行，包括；α*和α-二取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Br-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-戊氨酸*、缬氨酸，对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(苄基)*。出于上面论述的目的(与同源性或非同源性取代相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可以包括适合的可插入在该序列的任何两个氨基酸残基之间的间隔基团，包括除了氨基酸间隔物(例如甘氨酸或β-丙氨酸残基)之外的烷基基团，例如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为避免疑义，“该类肽形式”用来指代变体氨基酸残基，其中该α-碳取代基团在该残基的氮原子上，而不是在该α-碳上。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如西蒙·RJ(Simon RJ)等人，美国国家科学院院刊(PNAS)(1992)89(20),9367-9371以及奥尔韦尔·DC(Horwell DC)，生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)(1995)13(4),132-134。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行此类修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列。
不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且此类同源物及其片段通常将能够选择性杂交至本文序列表中所示的序列。此类序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格条件下用包含于随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针来探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG威斯康星PileUp程序是广泛使用的。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格条件低的严格条件下使用。
可替代地，此类多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是希望的以便引入限制性酶识别位点，或以便改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、替代性的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealing label)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。此类引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
一般地，引物可以通过合成方法制备，包括一次一个核苷酸地逐步制备希望的核酸序列。利用自动化技术完成该工艺的技术是本领域轻易获得的。
较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。
如本文所使用的，术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在中严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。
也包括在本发明范围内的是能够在中等到最大严格条件下与本文提供的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明涵盖在中等严格条件下(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})可与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在更优选的方面，本发明涵盖在高严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})可与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
优选地，杂交在本文教导的整个序列上进行分析。
分子进化
作为非限制性实例，可以在体内或体外产生许多位点定向或随机突变到核苷酸序列中，并随后通过各种方式筛选编码多肽的改善的功能。
此外，多核苷酸序列的突变或天然变体可以与野生型或其他突变或天然变体重组以产生新的变体。也可以筛选此类新变体以改善编码的多肽的功能。新的优选变体的生产可以通过本领域已建立好的各种方法来实现，例如错误阈值诱变(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)、DNA改组(US 5,605,793)、外显子介导的基因组装WO 00/58517。这些和类似的随机定向分子进化方法的应用允许鉴定和选择具有优选特征的本发明的酶的变体，而没有蛋白质结构或功能的任何先验知识，并且允许产生不可预测但有益的突变或变体。在本领域中有许多用于优化或改变酶活性的分子进化的应用的实例，这样的实例包括但不限于以下的一个或多个：在宿主细胞中或体外优化的表达和/或活性、增加的酶活性、改变的底物和/或产物特异性、增加或降低的酶或结构稳定性、在优选的环境条件下(例如温度、pH、底物)改变的酶活性/特异性。
定点诱变
一旦已经分离出编码蛋白质的核苷酸序列，或者已经鉴定了推定的编码蛋白质的核苷酸序列，就可能希望突变该序列以制备本发明的蛋白质。
可以使用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包括侧接希望突变的位点的核苷酸序列。
森永(Morinaga)等人(生物技术(Biotechnology)(1984)2，p646-649)中披露了一种合适的方法。在纳尔逊(Nelson)和朗(Long)(分析生物化学(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了将突变引入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
重组
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列-即使用重组DNA技术已经制备的序列。
这些重组DNA技术在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术解释在文献中，例如，萨姆布鲁克(J.Sambrook)、弗里奇(E.F.Fritsch)、马尼亚蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中。
合成
在一个方面，用于本发明的序列是合成序列-即通过体外化学或酶促合成已经制备的序列。它包括但不限于用宿主生物体的最佳密码子使用产生的序列，例如甲基营养酵母毕赤酵母和汉逊酵母。
用于本发明的蛋白质和/或肽也可以是合成来源的。
酶的表达
本发明还提供了用于表达主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的方法，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下共有序列裂解位点的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；
所述方法包括：
(a)用包含编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的核苷酸序列的核酸或载体转化宿主细胞；
(b)表达步骤(a)的核酸序列或载体；并且
(c)获得脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物。
合适地，该方法可以进一步包括分离和/或纯化和/或封装脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
核酸可以是编码具有本文详述的活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的任何核酸。合适地，核酸可以是本文详述的任何核酸。合适地，核酸可以是本发明的分离的核酸。
如本文所使用的，术语“发酵物”是指在包括三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)和/或S53家族的外切三肽基肽酶的宿主细胞培养后(例如，在最后)存在的成分的混合物。发酵物可以包含根据本发明的三肽基肽酶，以及其他组分例如颗粒物质、固体、在培养期间未利用的底物、碎片、培养基、细胞废物等。在一个方面，将细菌细胞(和，优选地孢子)从发酵物中除去和/或灭活以提供无细胞的发酵物。
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。
可用控制序列(例如调控序列)控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。
在一个实施例中，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以由载体编码。换句话说，载体可以包含编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的核苷酸序列。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖基因组中的稳定掺入。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列可操作地连接至调控序列，该调控序列能够在由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列中发挥作用。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。可替代地，该选择可通过共转化来完成(如WO 91/17243中所描述的)。
载体可在体外用于例如产生RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在进一步的实施例中，本发明提供通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体内，将该载体引入相容的宿主细胞内，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。此类序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以在特定宿主生物体中表达。
编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在原核或真核细胞中表达。合适地，编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的核苷酸序列和/或载体可以被密码子优化以用于在真菌宿主生物体(例如木霉，优选里氏木霉)中表达。
密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如至少约多于1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、60个、70个、80个或100个密码子)同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的过程。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏好性。密码子偏好性(生物体之间密码子使用的差异)常常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可获得性。细胞中选择的tRNA的优势度通常是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。
因此，基因可以被定制为基于密码子优化在给定生物体中的最佳基因表达。因此，经过这种定制的核苷酸序列和/载体可以被称为“密码子优化的”核苷酸序列和/或载体。
密码子使用表可以容易地获得，例如在密码子使用数据库(“Codon UsageDatabase”)中，并且这些表可以不同的方式调整适用。参见，纳卡穆拉(Nakamura,Y.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态(Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for the year 2000)”核酸研究(Nucl.Acids Res.)28:292(2000)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，例如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；宾夕法尼亚州雅各布斯)。在一些实施例中，在用于本发明的编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的序列中的一个或多个密码子(例如1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在一个实施例中，编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的核苷酸序列可以是已经密码子优化用于在里氏木霉中表达的核苷酸序列。
在一个实施例中，密码子优化的序列可以包含如SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ IDNo.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ IDNo.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.97所示的核苷酸序列或与其具有至少70％同一性的核苷酸序列。合适地是与其具有至少80％或与其具有至少90％同一性的序列。
优选地，密码子优化的序列可以包含与SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ IDNo.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95具有至少95％序列同一性，更优选与SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ IDNo.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ IDNo.95或SEQ ID No.97具有至少99％同一性的核苷酸序列。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由在中等严格条件下与SEQ IDNo.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ ID No.86、SEQ IDNo.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ ID No.92、SEQ IDNo.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95、SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列编码。合适地，是在高严格条件下与SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ IDNo.85、SEQ ID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ IDNo.91、SEQ ID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97杂交的核苷酸序列。
在进一步的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以由归因于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQID No.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQID No.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97的核苷酸序列编码。
还提供了包含选自下组的一个或多个序列的载体(例如质粒)，该组由以下各项组成：SEQ ID No.81、SEQ ID No.82、SEQ ID No.83、SEQ ID No.84、SEQ ID No.85、SEQ IDNo.86、SEQ ID No.87、SEQ ID No.88、SEQ ID No.89、SEQ ID No.90、SEQ ID No.91、SEQ IDNo.92、SEQ ID No.93、SEQ ID No.94、SEQ ID No.95或SEQ ID No.97。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作地连接至调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举例来说，本发明涵盖包含可操作地连接至这样的一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“可操作地连接”的指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。调控序列“可操作地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌引导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列可操作地连接至至少一个启动子。
其他启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的示例是本领域所熟知的。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”-其与术语例如“结合物”、“盒”和“杂交体”同义-包括直接或间接附接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接附接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团例如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
构建体可甚至含有或表达标记，该标记允许该遗传构建体的选择。
对于某些应用，优选的是，本发明的构建体至少包含可操作地连接至启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括含有该核苷酸序列或表达载体并用于重组产生具有本文所定义的特定性质的蛋白质的任何细胞。
因而，本发明的另一个实施例提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。可以对细胞进行选择以便和所述载体相容，这些细胞可以是例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌物种。
取决于编码本发明多肽的核苷酸序列的性质和/或进一步加工表达的蛋白质的需要，可以优选真核宿主例如酵母或其他真菌。一般地，酵母比真菌细胞更为优选，这是因为它们更易于操作。然而，一些蛋白质从酵母分泌不佳，或在某些情况下不能适当地加工(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应当选择不同的真菌宿主微生物。
合适宿主细胞-例如酵母、真菌和植物宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。
宿主细胞可能是蛋白酶缺陷或蛋白酶不足的菌株。上述可以是例如蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL 125，该米曲霉JaL 125具有缺失的称作“alp”的碱性蛋白酶基因。该菌株描述于WO 97/35956中。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许当存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。适宜的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
在原核宿主的转化的教导在本领域中是有据可查的，例如参见萨姆布鲁克(Sambrook)等人(分子克隆：实验室手册，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞-例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉属作为宿主微生物描述在EP0 238 023中。
另一种宿主生物可以是植物。用于转化植物的通用技术的综述可以在波特里库斯(Potrykus)(植物生理学和植物分子生物学年鉴(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol)[1991]42:205-225)和克里斯托(Christou)(农业食品工业高科技(Agro-Food-Industry Hi-Tech)1994年3月/4月，17-27)的文章中找到。关于植物转化的进一步的教导可以在EP-A-0449375中找到。
关于真菌、酵母和植物的转化的通用教导在以下部分中提供。
转化的真菌
宿主生物体可以是真菌例如霉菌。适合的这样的宿主的实例包括属于嗜热真菌属、支顶孢属、曲霉属、青霉属、毛霉属、脉孢菌属、木霉属等属的任何成员。
在一个实施例中，宿主生物体可以是丝状真菌。
在US-A-5741665中讨论了转化丝状真菌，其中说明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域熟知的。发现适用于粗糙脉孢菌(N.crassa)的技术的广泛综述，例如在戴维斯(Davies)和塞瑞斯(de Serres)，酶学方法(Methods Enzymol)(1971)17A:79-143中。
也可用于转化丝状真菌的进一步的教导在US-A-5674707中进行了综述。
此外，丝状真菌中的基因表达在蓬特(Punt)等人(2002)生物技术趋势(TrendsBiotechnol)2002年5月；20(5):200-6，阿彻(Archer)和皮博迪(Peberdy)生物技术关键评论(Crit Rev Biotechnol)(1997)17(4):273-306中教导。
本发明涵盖使用这些标准技术制备的根据本发明的转基因的丝状真菌的生产。
合适地，该宿主生物体可以是木霉属宿主生物体，优选是里氏木霉宿主生物体。
在另一个实施例中，宿主生物体可以属于曲霉属，例如黑曲霉(Aspergillusniger)。
根据本发明的转基因的曲霉菌也可以通过以下例如特纳(Turner G.)1994(用于遗传操作的载体(Vectors for genetic manipulation)，在：马蒂内利(Martinelli)，S.D.，金霍恩(Kinghorn J.R.)(编辑)曲霉属：在工业微生物学中的进展的50年，第29卷，阿姆斯特丹爱思唯尔(Elsevier)1994.pp.641-666)的教导来制备。
转化的酵母
在另一个实施例中，转基因的生物体可以是酵母。
在例如分子生物学方法(Methods Mol Biol)(1995)，49:341-54和生物技术新见(Curr Opin Biotechnol)(1997)10月；8(5):554-60中提供了酵母中异源基因表达的原理的综述。
在这方面，酵母-例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS微生物评论(FEMS Microbiol Rev)(2000，24(1):45-66)可用作异源基因表达的运载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达的原理和基因产物分泌的综述由欣奇克利夫(EHinchcliffe)、肯尼(E Kenny)(1993，“酵母作为异源基因表达的运载体(Yeast as avehicle for the expression of heterologous genes)”，酵母(Yeasts)，第5卷，安东尼H罗斯、和J斯图尔特哈里森，编辑，第2版，学术出版社)给出。
对于酵母的转化，已经开发了若干种转化方案。例如，根据本发明的转基因的酵母菌可以通过以下教导来制备：Hinnen等人(1978，美国国家科学院院刊(Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA)75，1929)；贝格斯(Beggs，J D)(1978，自然，伦敦，275，104)；和伊图(Ito,H)等人(1983，细菌学杂志(J Bacteriology)153,163-168)。
转化的酵母细胞可以使用各种选择性标记(例如营养缺陷型标记显性抗生素抗性标记)来选择。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可呈现在细胞的表面。
蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的上下文中。
异源分泌前导序列的典型实例是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如来自曲霉属的glaA-，18个和24个氨基酸型两者)、α-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的那些。
举例来说，在酶学方法(Methods Enzymol)(1990)182:132-43中综述了异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌。
转录后和翻译后修饰
合适地，用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶可以由本文教导的任何一种核苷酸序列编码。
取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。设想用于本发明方法和/或用途的酶(例如，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)涵盖已经经历转录后(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)和/或翻译后修饰的酶。
转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶的)“剪切”或“裂解”。
在一些实施例中，多肽(例如本发明的三肽基肽酶，例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)可以被剪切或裂解。这可能导致脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶从无活性或实质上无活性状态转化为活性状态(即能够进行本文所述的活性)。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以是对成熟肽进一步进行翻译后修饰的前肽，即具有脯氨酸耐受性三肽基肽酶活性的多肽。
仅通过举例的方式，SEQ ID No.1与SEQ ID No.29相同，除了SEQ ID No.1经历了翻译后和/或转录后修饰以除去一些氨基酸，更具体地自N末端除去197个氨基酸。因此，在某些情况下(即在一些宿主细胞中)可以考虑作为前肽的如SEQ ID No.1所示的多肽-其通过翻译后和/或转录后修饰进一步加工成成熟肽(SEQ ID No.29)。关于翻译后和/或转录后修饰的精确的修饰，例如一个或多个裂解位点可以根据宿主物种略有不同。在一些宿主物种中可能没有翻译后和/或转录后修饰，因此前肽将等同于成熟肽(即具有本发明的三肽基肽酶活性的多肽)。不希望受理论束缚，与通过参考SEQ ID No.29与SEQ ID No.1相比所示的裂解位点相比，一个或多个裂解位点可以在任一方向上移位几个残基(例如1个、2个或3个残基)。换句话说，例如，不是在位置197(R)处裂解，例如，裂解可以在位置196-A、195-A、194-A、198Q、199E、200P处发生。另外或可替代地，裂解可导致约197个氨基酸的去除，在一些实施例中，裂解可能导致194个和200个之间残基的去除。
转录后和/或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将理解，蛋白质(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)可能发生的转录后和/或翻译后修饰的类型可以取决于其中蛋白质(例如，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶)被表达的宿主生物体。
检测
用于检测和测量氨基酸序列表达的各种方案是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。
各种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，并且可以用于各种核酸和氨基酸测定。
许多公司，例如Pharmacia Biotech(新泽西州皮斯卡塔韦)，威斯康辛州麦迪逊普洛麦格公司(Promega，Madison，WI)和俄亥俄州克利夫兰美国生物化学公司(BiochemicalCorp，Cleveland，OH)提供用于这些程序的商业试剂盒和试验方案。
合适的报告分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。教导使用这些标记的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
而且，可以如US-A-4,816,567所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
根据本发明使用的氨基酸序列可以作为融合蛋白产生，例如有助于提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和(β-半乳糖苷酶)。还可方便地在融合蛋白伴侣和感兴趣的蛋白序列之间包括进蛋白水解切割位点，以允许除去融合蛋白序列。
优选地，融合蛋白将不妨碍蛋白序列的活性。
在大肠杆菌中的基因融合表达系统已经在生物技术新见(Curr OpinBiotechnol)(1995)6(5):501-6中进行了综述。
在本发明的另一个实施例中，氨基酸序列可以连接到异源序列以编码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽文库，编码表达由可商购的抗体识别的异源表位的嵌合物质可能是有用的。
通用重组DNA方法技术
除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见，例如，萨姆布鲁克(J.Sambrook)、弗里奇(E.F.Fritsch)、马尼亚蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，第1-3册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；奥苏贝尔(Ausubel,F.M.)等人(1995和定期补充；分子生物学现代方法(Current Protocols in MolecularBiology)，第9、13和16章，纽约州约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.，NY)；罗(B.Roe)、瑰柏翠(J.Crabtree)、卡恩(A.Kahn)，1996，DNA分离和测序：基本技术(DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)；盖特(M.J.Gait)(编辑)，1984年，寡核苷酸合成：实用方法(OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach)，Irl出版社；以及，利利(D.M.J.Lilley)和达尔伯格(J.E.Dahlberg)，1992，酶学方法：DNA结构，部分A：DNA的合成和物理分析(Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA)，酶学方法(Methods in Enzymology)，学术出版社。
剂量
用于本发明方法和/或用途的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶可能以任何合适的量给药。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶可能以约5mg至3g酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量进行给药。
合适地，在水解产物的制备中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶可能以5mg至3g酶/kg蛋白质底物的量给药。
在一个实施例中，合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶可能以25mg至1000mg酶/kg蛋白质底物的量给药。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约0.01mg-100mg；0.5mg-100mg；1mg-50mg；5mg-100mg；5mg-20mg，10mg-100mg；0.05mg-50mg；或0.10mg-10mg的酶/kg饲料添加剂组合物的量给药。
在某些实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约0.01g至1000g的酶/kg饲料添加剂组合物的量给药，例如0.1g至500g，例如0.5g至700g，例如以约0.01g-200g，0.01g-100g；0.5g-100g；1g-50g；5g-100g；5g-20g，5g-15g，10g-100g；0.05g-50g；或0.10g-10g的酶/kg饲料添加剂组合物的量。
在一个优选的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能以约5mg-20mg酶/kg饲料添加剂组合物的量给药，
确切的量将取决于所使用的组合物的具体类型和取决于特定蛋白酶活性/mg蛋白质。
在另一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶可能以约1mg至约1kg酶/kg食品和/或饲料和/或喂养料和/或预混物的量给药。合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶可能以约1mg至约250g/kg食品和/或饲料和/或喂养料和/或预混物给药。优选地，以约1mg至约100g(更优选地约1mg至约1g)/kg食品和/或饲料和/或喂养料和/或预混物给药。
内切蛋白酶可能以约50至约3000mg酶/kg蛋白质底物的量给药，例如，0.053g至3g酶/公吨(MT)蛋白质底物。
合适地，内切蛋白酶可能以小于约4.0g酶/MT蛋白质底物的量来给药。
在另一个实施例中，内切蛋白酶可能以约0.5g至约5.0g之间的酶/MT蛋白质底物给药。合适地，内切蛋白酶可能以约0.5g至约3.0g之间的酶/MT蛋白质底物给药。更合适地，内切蛋白酶可能以约1.0g至约2.0g的酶/MT蛋白质底物给药。
在一个实施例中，氨基肽酶可能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。合适地，氨基肽酶可能以在约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。更合适地，以在约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物和/或食品和/或饲料添加剂组合物的量给药。
在水解产物的制备中，氨基肽酶可能以约0.5mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。合适地，氨基肽酶可能以约1mg至约2g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。更合适地，以约5mg至约1.5g之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。
在一个实施例中，氨基肽酶可能以约5mg至约500mg之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。合适地，氨基肽酶可能以约50mg至约500mg之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。合适地，氨基肽酶可能以约100mg至约450mg之间的酶/kg蛋白质底物的量给药。
受试者
术语“受试者”可用于指“动物”或“人类”。
合适地，受试者可以是倾向于对包含一种或多种特定蛋白质或其部分的未处理的水解产物具有免疫反应的“敏感个体”。例如，受试者可以是敏感的个体，该个体具有：谷蛋白(例如麦醇溶蛋白)过敏、乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏。
本文所用的术语“动物”是指要给予或已经给予根据本发明的饲料添加剂组合物或包括根据本发明的所述饲料添加剂组合物的喂养料的动物。
优选地，动物为哺乳动物、反刍动物、单胃动物、鱼或甲壳类动物，包括诸如牲畜或驯养动物(例如宠物)。
在一个实施例中，“动物”为牲畜。
如本文所使用的，术语“家畜”是指任何农场动物。优选地，牲畜是以下各项中的一种或多种：乳牛或公牛(包括小牛)、猪(包括仔猪、生猪、生长猪、母猪)、家禽(包括肉鸡、小鸡、蛋鸡和火鸡)、鸟、鱼(包括淡水鱼，例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤)和海鱼(例如黑鲈)、甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。
在另一个实施例中，“动物”为驯养动物或宠物或动物园环境中饲养的动物。
如本文所使用的，术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。
在一个实施例中，动物为单胃动物。在一个优选的实施例中，单胃动物可为家禽或猪(或其组合)。
在另一个实施例中，动物为反刍动物。
术语动物不旨在是指人类。
组合物
本发明提供一种包含至少一种主要具有外切肽酶的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的通用组合物，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
在一个实施例中，提供了包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶的食品添加剂组合物，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
还提供了包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶的饲料添加剂组合物，其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有以下各项的肽的N末端裂解三肽：
(i)在P1处的脯氨酸；以及
在P1处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸；或
(ii)在P1’处的脯氨酸；以及
在P1’处的选自以下各项的氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或合成氨基酸。
可替代地或另外地，组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物可以包含可通过本发明的任何一种方法获得的脯氨酸耐受性三肽基肽酶。
在另一个实施例中，提供了包含本发明的水解产物的组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物。合适地，这样的食品和/或饲料添加剂组合物可以进一步包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)。
本发明的酶，例如用于本发明的方法和/或用途的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或外切三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以本领域已知的任何适当方式进行配制。
在一些实施例中，另外的成分可以与三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)混合，例如盐例如Na2SO4、麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、淀粉、滑石、PVA、多元醇(例如山梨糖醇和甘油)、苯甲酸盐、山梨酸盐、糖(例如蔗糖和葡萄糖)、丙二醇、1,3-丙二醇、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、乙酸钠、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其混合物。
在优选的实施例中，根据本发明的食品添加剂组合物或饲料添加剂组合物包含根据本发明的三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)或根据本发明的发酵物，并且进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：盐、多元醇(包括山梨糖醇和甘油)、小麦或小麦组分、乙酸钠、乙酸钠三水合物、山梨酸钾、滑石、PVA、苯甲酸盐、山梨酸盐、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐或其组合。
在一个实施例中，该盐选自下组，该组由以下各项组成：Na2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、(NH4)H2PO4、K2HPO4、KH2PO4、K2SO4、KHSO4、ZnSO4、MgSO4、CuSO4、Mg(NO3)2、(NH4)2SO4、硼酸钠、醋酸镁、柠檬酸钠或其组合。
食品级酶的典型液体配制品可以包括以下组分(％是以w/w计)：0.2％-30％的感兴趣的酶，优选2％-20％。
通过使用浓度从约0.1％至约20％(合适地从约0.1％至约5％)的盐，如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐，也可以增加酶配制品的稳定性。不希望受理论束缚，据信高盐浓度可能再次成为单独或与另外的成分组合实现微生物稳定性的方式。作用机理可能是由于水活度较低或某种酶和盐之间的特异性作用。因此，在一些实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以与至少一种盐混合。
合适地，防腐剂可以是苯甲酸钠和/或山梨酸钾。典型地，这些防腐剂可能以约0.1％-1％(合适地约0.2％-0.5％)的组合浓度使用。苯甲酸钠在pH<5.5时是最有效的，而山梨酸钠在pH<6时是最有效的。
合适地，糖是山梨糖醇。
合适地，盐是硫酸钠。
在一个实施例中，一种或多种成分(例如用于组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物的配制)可以选自下组，该组由以下各项组成：多元醇，例如甘油或山梨糖醇；糖类，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；盐，例如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐；防腐剂，例如苯甲酸钠和山梨酸钾；或其组合。
合适地，一种或多种成分(例如用于组合物和/或食品添加剂组合物和/或饲料添加剂组合物的配制)可以选自下组，该组由以下各项组成：小麦载体、山梨糖醇和硫酸钠。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以与小麦载体混合。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以与山梨糖醇混合。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以与硫酸钠混合。
在优选的实施例中，组合物和/或食品添加剂和/或饲料添加剂组合物可以进一步包含本文详述的任何内切蛋白酶。
形式
可以任何适宜的形式使用本发明的饲料添加剂组合物和其他组分和/或包括该饲料添加剂组合物和其他组分的喂养料。
本发明的饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其替代形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、混悬液和乳剂。
在一些应用中，本发明的饲料添加剂组合物可与饲料混合，或施用于饮用水中。
针对速释型、迟释型、调释型、缓释型、脉冲释放型或控释型应用，形式的合适的实例包括粉剂、糊剂、大丸剂、粒剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、珠剂、溶液或悬浮液中的一种或多种，其可包含调味剂或染色剂。
举例来说，如果本发明的组合物以固体(例如颗粒)形式使用，那么它也可以包含以下各项中的一种或多种：辅料，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选是玉米、马铃薯、木薯淀粉)，乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐；造粒粘结剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石可以包括在内。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的实例包括(例如)水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟基甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、牛奶糖或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本发明的组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油及其组合)进行组合。
与其他组分的组合
脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物和/或组合物和/或食品和/或饲料添加剂组合物和/或本发明的水解产物可以与其他组分组合使用。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物和/或组合物和/或食品和/或饲料添加剂组合物和/或本发明的水解产物和另一种组分适合于动物消费并且能够为消费者提供医疗或生理益处。
在一个实施例中，“另一种组分”可为一种或多种酶。
合适地，用于本发明中的另外的酶可以是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣聚糖酶(E.C.3.1.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂肪酰基转移酶(通常分类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、木聚糖酶(E.C.3.2.1.8，E.C.3.2.1.32，E.C.3.2.1.37，E.C.3.1.1.72，E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
合适地，其他组分可以是植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8))。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、形成G4的淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))；和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是
淀粉酶(例如，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂肪酰基转移酶(通常分类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)，合适的是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分可以是蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在另一个实施例中，用于与脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶)组合和/或与内切蛋白酶组合、与S53家族的外切三肽基肽酶和氨基肽酶组合的其他组分可以是另外的蛋白酶。合适地，进一步的蛋白酶可以选自下组，该组由以下各项组成：氨基肽酶和羧肽酶。
如本文所使用的，术语“羧肽酶”具有在本领域中的通常含义，并且是指能够从肽和/或蛋白质底物的C末端裂解n个氨基酸的外切肽酶。在一个实施例中，n可以是至少1，合适地，n可以是至少2。在其他实施例中，n可以是至少3，合适地至少4。
在其他实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶组合)和/或三酶组合物可以与一种或多种另外的外切肽酶一起使用。
在一个实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选与内切蛋白酶组合)和/或三酶组合物不与脯氨酸特异性外切肽酶组合。
在特别优选的实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和/或三酶组合物不能与具有以下多肽序列的酶组合：
MRTAAASLTLAATCLFELASALMPRAPLIPAMKAKVALPSGNATFEQYIDHNNPGLGTFPQRYWYNPEFWAGPGSPVLLFTPGESDAADYDGFLTNKTIVGRFAEEIGGAVILLEHRYWGASSPYPELTTETLQYLTLEQSIADLVHFAKTVNLPFDEIHSSNADNAPWVMTGGSYSGALAAWTASIAPGTFWAYHASSAPVQAIYDFWQYFVPVVEGMPKNCSKDLNRVVEYIDHVYESGDIERQQEIKEMFGLGALKHFDDFAAAITNGPWLWQDMNFVSGYSRFYKFCDAVENVTPGAKSVPGPEGVGLEKALQGYASWFNSTYLPGSCAEYKYWTDKDAVDCYDSYETNSPIYTDKAVNNTSNKQWTWFLCNEPLFYWQDGAPKDESTIVSRIVSAEYWQRQCHAYFPEVNGYTFGSANGKTAEDVNKWTKGWDLTNTTRLIWANGQFDPWRDASVSSKTRPGGPLQSTEQAPVHVIPGGFHCSDQWLVYGEANAGVQKVIDEEVAQIKAWVAEYPKYRKP
在一个实施例中，附加组分可以是稳定剂、或乳化剂、或粘结剂、或载体、或赋形剂、或稀释剂、或崩解剂。
如本文所使用的，术语“稳定剂”被定义为保持产品(例如饲料产品)免于随时间而变化的成分或成分的组合。
如本文所使用的，术语“乳化剂”是指防止乳剂分离的成分(例如饲料成分)。乳剂是两种不混溶的物质，一种以小滴形式存在，包含于另一者中。乳剂可以由以下各项组成：水包油(其中液滴或分散相是油并且连续相是水)；或油包水(其中水成为分散相并且连续相是油)。也可通过使用乳化剂而使泡沫(即气体分散于液体中)和悬浮液(即固体分散于液体中)稳定。
如本文所使用的，术语“粘合剂”是指经通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分(例如饲料成分)。例如，在“胶凝”期间，水被吸收，从而提供结合效果。然而，粘合剂可吸收其他液体(例如油)，从而将其保持在产品中。在本发明的上下文中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等)中。造粒粘合剂的实例包括如下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯树胶。
“载体”意指适合于给予酶的材料且包括本领域已知的任何这样的材料，例如像任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等，这些材料是无毒的并且并不以有害方式与组合物的任何组分相互作用。
本发明提供了制备组合物(例如饲料添加剂组合物)的方法，该方法包括将本发明的饲料添加剂(以及优选地玉米或玉米副产物)与至少一种生理上可接受的载体混合，该载体选自以下各项中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
“赋形剂”的实例包括以下各项中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、牛奶糖和高分子量聚乙二醇。
“崩解剂”的实例包括以下各项中的一种或多种：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐。
“稀释剂”的实例包括以下各项中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及其组合。
其他组分可同时(例如当它们一起存在于混合物中或者甚至当它们通过不同途径递送时)或依次(例如它们可通过不同途径递送)用于饲料添加剂组合物或饲料添加剂组合物或本发明的水解产物中。
在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物不包含铬或有机铬。
在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或喂养料、或预混物不包含山梨酸。
封装
在一个实施例中，根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物和/或组合物和/或食品和/或饲料添加剂组合物和/或水解产物和/或食物和/或喂养料被封装。
在一个优选实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物和/或组合物和/或食品和/或饲料添加剂组合物和/或水解产物和/或食物和/或喂养料被封装在袋(例如纸袋)中。
在一个替代性实施例中，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或S53家族的外切三肽基肽酶和/或三酶组合物和/或组合物和/或食品和/或饲料添加剂组合物和/或水解产物和/或食物和/或喂养料可以被密封在容器中。可使用任何合适的容器。
食物
术语“食物(foodstuff)”在本文中与“食品(food)”同义。
在这里，术语“食物”是指人类的食品。
食品可以是处于溶液或如固体的形式-取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
当用作食品(例如功能食品)或用于食品(例如功能食品)的制备时，本发明的水解产物和/或组合物和/或食品添加剂组合物可以与以下各项中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
在一个实施例中，本发明提供了包含根据本发明的水解产物的食物。该食物可以另外地包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如可通过本文的任何方法获得的)，任选地与内切蛋白酶组合。
任选地，该食物可以进一步包含至少一种食品成分。
合适地，该食物可以包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其包含选自以下各项的氨基酸序列：
SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
本发明还涉及一种用于生产食物的方法，该方法包括使食品组分与本发明的水解产物或本发明的组合物和/或食品添加剂组合物接触。
在食品组分与组合物和/或食品添加剂组合物接触的情况下，合适地，食品组分也可与内切蛋白酶接触。
本发明的组合物可以用于食物产品的制备中，该食物产品例如是以下各项中的一种或多种：果酱、桔子酱、果冻、奶产品(例如牛奶或奶酪)、肉类产品、禽肉产品、鱼产品、和烘焙产品。
在一个实施例中，本发明的组合物可用于制备富含蛋白质的废物流(wastestream)。如本文所使用的“富含蛋白质的废物流”可以包括作为来自植物或动物加工(大豆加工)的副产品、来自提炼设施(例如来自屠宰场和/或鱼加工设施的废物)的副产品的底物。
举例来说，本发明的组合物可以用作软饮料、果汁或饮料的成分，这些软饮料、果汁或饮料包括乳清蛋白、健康茶、可可饮料、乳饮料和乳酸菌饮料、酸奶和饮用酸奶、奶酪、冰淇淋、冰糕和甜点、糕点糖果、饼干蛋糕和蛋糕混合物、小吃食品、早餐谷物、方便面和杯面、速溶汤和杯汤、均衡的食物和饮料、甜味剂、质地改善的小吃棒、纤维棒、烘烤稳定的水果馅料、保健釉、巧克力面包馅料、奶酪蛋糕调味馅料、水果口味蛋糕馅料、蛋糕和甜甜圈糖衣、热稳定的面包馅料、即时面包馅料、饼干馅料、即食面包馅料、减少热量馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、无菌/蒸馏巧克力饮料、酒吧混合物、饮料粉剂、钙强化大豆/酸奶和巧克力奶、钙强化咖啡饮料、粉状奶昔(例如、蛋白质补充奶昔、健康奶昔或运动奶昔或老年人奶昔))、运动营养产品、性能食品、婴儿食品、老人食物、医疗保健人员的食品、饱腹感补品。
根据本发明的组合物可以进一步用作食物产品中的成分，这些食物产品例如是美国奶酪酱、用于磨碎和切碎的干酪的抗结块剂、点心盘、奶油干酪、干混鞭打无脂肪酸奶油、冷冻/解冻动物性鲜奶油、冷冻/解冻稳定的喷射奶油、低脂肪和清淡的自然切达干酪、低脂瑞士式酸奶、充气冷冻甜点和新奇棒、硬盒冰淇淋、标签友好的改善经济和放纵的硬盒冰淇淋、低脂冰淇淋：软冰淇淋、烧烤酱、奶酪蘸酱、松软干酪敷料、干混阿尔弗雷多(Alfredo)酱、混合奶酪酱、干混番茄酱等。
对于某些方面，优选地食物是饮料。
优选地，食物可以是烘焙产品，例如面包、丹麦甜糕饼、小面包或饼干。
本发明还提供了制备食品或食品成分的方法，该方法包括将通过本发明的方法制备的5-KGA或根据本发明的组合物与另一种食品成分混合。用于制备的方法或食品成分也是本发明的另一个方面。
根据本发明的食物可以是奶产品、乳清蛋白产品、烘焙产品、发酵产品、性能食品、婴儿食品、饮料、奶昔、外壳、运动营养产品、性能食品、婴儿食品、老人食品、或医疗保健人员的食品。
合适地，奶产品可以是基于乳的产品。这样的基于乳的产品可以包含一种或多种乳蛋白或其片段。
优选地，乳制品(例如基于乳的产品)可以是婴儿配方食品。
合适地，烘焙产品可以是面包产品。
合适地，发酵产品可以是基于大豆的发酵产品。
合适地，外壳可以是饮料(优选地是用于啤酒的外壳)或乳制品外壳。
食品成分
本发明的组合物和/或食品添加剂组合物可以用作食品成分。
如本文所使用的，术语“食品成分”包括作为或者可以作为营养补充剂和/或纤维补充剂添加到功能食品或食物中的配制品。如本文所使用的，术语食品成分还是指可以在需要胶凝化、结构化、稳定化、悬浮、成膜和结构化、保持多汁、改善口感、改善肽含量、营养成分的改善、不增加粘度的多种产品中以低水平使用的配制品。
食品成分可以是处于溶液或如固体的形式-取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
食品补充剂
本发明的水解产物和/或组合物和/或食品添加剂组合物可以是食品添加剂或可以添加到食品添加剂中。
功能食品
本发明的组合物可以是功能食品或可以添加到功能食品中。
如本文所使用的，术语“功能食品”意指不仅能够提供营养效果和/或味道满足，还能够向消费者递送另外的有益效果的食品。
因此，功能食品是具有掺入其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食品，这些组分或成分赋予该食品特定的功能性-例如医疗或生理益处-除了纯粹的营养作用之外。
虽然对于功能性食物没有法律定义，大多数关注此领域的方面都同意的是，它们是作为具有特定健康效果而面市的食物。
一些功能食品是保健营养品。因此，术语“保健营养品”意指不仅能够提供营养效果和/或味道满足，还能够向消费者递送治疗(或其他有益)效果的食品。保健营养品跨越了在食品和药物之间的传统分界线。
调查已经表明，消费者最重视声称与心脏疾病有关的功能食品。预防癌症是营养品的另一个方面，其引起了消费者极大的兴趣，但有趣的是，这是消费者觉得他们可以最少地施加控制的区域。事实上，据世界卫生组织，至少有35％的癌症病例与饮食有关。此外，涉及骨质疏松症、肠道健康和肥胖影响的主张也是可能煽动功能食品购买和推动市场开发的关键因素。
饲料
本发明的饲料添加剂组合物可用作饲料，或者可用于饲料的制备中。
在一个实施例中，本发明提供了包含根据本发明的水解产物的喂养料。喂养料可以另外地包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶(例如可通过本文的任何方法获得的)，任选地与内切蛋白酶组合。
任选地，喂养料可以进一步包含至少一种饲料成分。
合适地，喂养料可以包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该脯氨酸耐受性三肽基肽酶包含选自以下各项的氨基酸序列：
SEQ ID No.29、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ IDNo.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ IDNo.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
合适地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以包含选自以下各项的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43、SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ IDNo.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.98、SEQ ID No.99，或其功能片段，或与其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
本发明还涉及一种用于生产喂养料的方法，该方法包括使饲料组分与本发明的水解产物或本发明的组合物和/或饲料添加剂组合物接触。
在饲料组分与组合物和/或饲料添加剂组合物接触的情况下，合适地，饲料组分也可与内切蛋白酶接触。本文所用的术语“饲料”与“喂养料”同义。
饲料可以是处于溶液或如固体的形式-取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
当用作饲料(例如功能饲料)或用于饲料(例如功能饲料)的制备时，本发明的组合物可以与以下各项中的一种或多种组合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
在一个优选的实施例中，将本发明的饲料添加剂组合物与饲料组分混合形成喂养料。
本文所用的术语“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。
在一个实施例中，包括脯氨酸耐受性三肽基肽酶和选自下组的一种或多种成分(该组由以下各项组成：多元醇，例如甘油或山梨糖醇；糖类，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；盐，例如NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4或其他食品级盐；防腐剂，例如苯甲酸钠和/或山梨酸钾；或其组合(任选地与内切蛋白酶组合))的饲料添加剂组合物可以与至少一种蛋白质或其部分混合，该蛋白质或其部分是动物蛋白和植物蛋白(例如选自以下各项中的一种或多种：麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白、胶原蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白、肉蛋白、蛋类蛋白、大豆蛋白、大麦醇溶蛋白或谷物蛋白)，优选地包含于玉米、大豆粉、玉米干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦、小麦蛋白(包括谷蛋白)、小麦副产品、麦麸、玉米副产品(包括玉米蛋白粉)、大麦、燕麦、黑麦、黑小麦、全脂大豆、动物副产品粉、醇溶性蛋白(优选是玉米蛋白(例玉蜀黍玉米蛋白)和/或高粱醇溶蛋白(例如来自高粱))、来自油料种子的蛋白质(优选来自大豆种子蛋白质、向日葵种子蛋白、油菜籽蛋白、卡诺拉(油菜籽)种子蛋白质或其组合中)或其组合。
优选地，饲料可以是草料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料、草料组分或草料的预混物中。
本文所用的术语‘秣料’是指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。草料涵盖已经切下的植物。
术语‘秣料’包括干草、秸秆、青贮饲料、压缩饲料和颗粒饲料、油和混合给养，也包括发芽谷物和豆类。
秣料可得自选自以下的一种或多种植物：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、Chaumoellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自自然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、谷子、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于配合饲料的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、裸麦、玉蜀黍、大豆、高粱、燕麦、和大麦。
合适地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，该微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
本发明的任何喂养料可以包括一种或多种选自下组的饲料材料，该组由以下各项组成：a)谷物例如小谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大谷物例如玉米或高粱；b)来自植物的副产品，例如干酒糟颗粒可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦粉头、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘果肉、玉米纤维、玉米胚芽粉、玉米麸皮、碾碎的玉米饲料、玉米谷蛋白饲料、谷蛋白粉、小麦粉头、小麦粗粉或其组合；c)从以下来源获得的蛋白质，例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉(油菜籽)、鱼粉、血浆蛋白粉、肉骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、椰干、芝麻；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
本发明的喂养料可含有至少30％、至少40％、至少50％或至少60％以重量计的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
另外或可替代地，本发明的喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、裸麦、燕麦、来自植物(例如谷类)的副产物(诸如干酒糟可溶物(DDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦粉头、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、玉米纤维、玉米胚芽粉、玉米麸皮、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、谷蛋白粉、小麦粉头、小麦粗粉或其组合。一些蛋白质源也可视为高纤维：获自例如以下来源的蛋白质：向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花。
在本发明中，饲料可能是下列中的一种或多种：配合饲料和预混料，包括丸、核或(喂牛的)饼状饲料；作物或作物残茬：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新鲜剪草和其他饲料植物；肉骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；保存的饲料植物：干草和青贮饲料；海藻；整株或通过破碎、碾磨等制备的种子和谷物；发芽谷物和豆类；酵母提取物。
在本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物消费的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以干燥形式(例如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖鱼食。鱼食物通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(例如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
如本文所使用的，术语“接触”指的是间接或直接将本发明的组合物应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。
在一个实施例中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如饲料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。
对于一些应用，重要的是使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这允许组合物赋予以下有利特征中的一种或多种：生物物理特性选自下组中一种或多种，该组由以下各项组成：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养消化率，包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响、例如粪肥输出和/或氮排泄。
可将本发明的饲料添加剂组合物和受控量的一种或多种酶散布、涂布和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原材料)。
优选地，本发明的饲料添加剂组合物将是热稳定的以便进行高达约70℃；高达约85℃；或高达约95℃的热处理。该热处理可能进行长达约1分钟；长达约5分钟；长达约10分钟；长达约30分钟；长达约60分钟。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至特定温度之前添加剂中存在且有活性的酶组分的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。
在一个特别优选的实施例中，将饲料添加剂组合物均化，以制成粉末。
在一个替代性优选实施例中，将饲料添加剂组合物配制成如WO2007/044968中所述的颗粒剂(称为TPT颗粒剂)。
在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。这样的盐包衣的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。
优选地，用于盐包衣的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。
优选地，盐涂层包含Na2SO4。
制备饲料添加剂组合物的方法也可包括将粉末制成粒料的进一步步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的粒料。
任选地，制粒步骤可包括在粒料形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。混合物在达到规定的温度(例如从60℃-100℃)的调节器中加热，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、95℃。停留时间可以从几秒钟到几分钟甚至几小时变化。例如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应当理解，本发明的饲料添加剂组合物适于加入至任何适宜的饲料材料中。
如本文所使用的，术语“饲料材料”是指由动物消费的基础饲料材料。进一步应当理解，饲料材料可能包括，例如至少一种或多种未加工的谷物和/或加工过的植物和/或动物材料(例如大豆粉或骨粉)。
如本文所使用的，术语“喂养料”是指已添加一种或多种饲料添加剂组合物的饲料材料。
技术人员会认识到，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养该动物的目的。
优选地，喂养料可包含以下的饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、水稻、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的组分，如大豆粉、油菜籽粉、卡诺拉粉、棉籽粉、向日葵籽粉、动物副产物粉及其混合物。更优选地，喂养料可包括动物脂肪和/或植物油。
任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(例如钙)和/或另外的维生素。
优选地，喂养料为玉米大豆粉混合物。
喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。接下来，可将喂养料制成糊状或粒状，后者通常涉及这样的方法，通过该方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而制备出特定大小的粒料。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，该步骤包括制粒之前的挤出或膨化，尤其是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
喂养料可为饲喂单胃动物的喂养料，诸如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭子、鹅、水禽)、生猪(所有年龄段)、宠物(例如狗、猫)或鱼，优选地，喂养料为家禽喂养料。
仅通过举例的方式，鸡(如肉鸡)的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
Figure BDA0001330130990001591
Figure BDA0001330130990001601
仅通过举例的方式，鸡(例如肉鸡)的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 23.00 20.40
家禽代谢能(kcal/kg) 2950 3100
钙(％) 0.85 0.85
有效磷(％) 0.38 0.38
钠(％) 0.18 0.19
可消化的赖氨酸(％) 1.21 1.07
可消化的甲硫氨酸(％) 0.62 0.57
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.86 0.78
可消化的苏氨酸(％) 0.76 0.68
仅通过举例的方式，蛋鸡的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
Figure BDA0001330130990001602
Figure BDA0001330130990001611
仅通过举例的方式，蛋鸡的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 16.10
家禽代谢能(kcal/kg) 2700
赖氨酸(％) 0.85
甲硫氨酸(％) 0.42
甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.71
苏氨酸(％) 0.60
钙(％) 3.85
有效磷(％) 0.42
钠(％) 0.16
仅通过举例的方式，火鸡的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
Figure BDA0001330130990001612
仅通过举例的方式，火鸡的饮食规格可能如在下表中列出：
Figure BDA0001330130990001613
Figure BDA0001330130990001621
仅通过举例的方式，仔猪的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
成分 阶段1(％) 阶段2(％)
玉蜀黍 20.0 7.0
小麦 25.9 46.6
黑麦 4.0 10.0
小麦粗粉 4.0 4.0
玉蜀黍DDGS 6.0 8.0
大豆粉48％CP 25.7 19.9
乳清粉 10.0 0.0
大豆油 1.0 0.7
L-赖氨酸HCl 0.4 0.5
DL-甲硫氨酸 0.2 0.2
L-苏氨酸 0.1 0.2
L-色氨酸 0.03 0.04
石灰岩 0.6 0.7
磷酸氢钙 1.6 1.6
猪维生素和微量矿物质 0.2 0.2
盐 0.2 0.4
仅通过举例的方式，仔猪的饮食规格可能如在下表中列出：
Figure BDA0001330130990001622
Figure BDA0001330130990001631
仅通过举例的方式，生长猪/成猪的喂养料可以由在下表中列出的一种或多种成分组成，例如在下表中以％给出的：
成分 生长猪/成猪(％)
玉蜀黍 27.5
大豆粉48％CP 15.4
玉蜀黍DDGS 20.0
麦麸 11.1
米糠 12.0
卡诺拉种子粉 10.0
石灰岩 1.6
磷酸氢钙 0.01
盐 0.4
猪维生素和微量矿物质 0.3
赖氨酸-HCl 0.2
植物油 0.5
仅通过举例的方式，生长猪/成猪的饮食规格可能如在下表中列出：
饮食规格
粗蛋白质(％) 22.60
猪代谢能(kcal/kg) 3030
钙(％) 0.75
有效磷(％) 0.29
可消化赖氨酸(％) 1.01
可消化的甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.73
可消化苏氨酸(％) 0.66
基于肉类的食品/饲料产品
脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶和/或组合物和/或食品/饲料组合物和/或水解产物可用于制造基于肉类的食品/饲料产品。
根据本发明的“基于肉类的食物产品”和“基于肉类的饲料产品”是基于肉类的任何产品。
基于肉类的食物产品适合作为食品和/或饲料用于人和/或动物消费。在本发明的一个实施例中，基于肉类的食物产品是用于饲喂动物的饲料产品，例如像宠物食物产品。在本发明的另一个实施例中，基于肉类的食物产品是用于人类的食物产品。
基于肉类的食品/饲料产品可以包括非肉类成分，例如像水、盐、面粉、乳蛋白、植物蛋白、淀粉、水解蛋白、磷酸盐、酸、调味料、调色剂和/或调质剂。
根据本发明的基于肉类的食品/饲料产品优选包含在5％-90％(重量/重量)之间的肉。在一些实施例中，基于肉类的食物产品可以包含至少30％(重量/重量)的肉类，例如至少50％、至少60％或至少70％的肉类。
在一些实施例中，基于肉类的食品/饲料产品是熟肉，例如像火腿、里脊、猪肩肉、培根和/或五花肉。
基于肉类的食品/饲料产品可以是以下各项中的一种或多种：
干的或半干的腌肉，例如发酵产品(使用发酵剂的干熏和发酵的产品)，例如干香肠、意大利蒜味腊肠(salami)、意大利辣香肠和干火腿；
乳化的肉类产品(例如用于冷或热消费)，例如摩泰台拉香肚、法兰克福香肠、午餐肉和肉酱；
鱼和海鲜，例如虾，鲑鱼，再生(reformulated)鱼产品，冷冻的低温装罐鱼；
鲜肉肌肉，例如全充血的肌肉，例如里脊、肩肉火腿、卤水肉；
研磨和/或改组的新鲜肉类或再生肉类，例如通过冷凝固凝胶或粘合的升级的切割肉，例如生的、未煮熟的猪腰排、牛排、烤肉、新鲜香肠、牛肉汉堡、肉丸、俄罗斯饺子；
家禽产品-例如鸡或火鸡胸脯肉或再生家禽产品，例如鸡块和/或鸡肉香肠；
蒸煮产品-蒸压肉类产品，例如野餐火腿、午餐肉、乳化产品。
在本发明的一个实施例中，基于肉类的食品/饲料产品是加工肉类产品，例如像香肠、大腊肠、肉糜卷、碎肉产品、绞肉、培根、猪肉香肠、意大利蒜味腊肠或肉酱。
加工的肉类产品可以是例如从基于肉类的乳液制成的乳化的肉类产品，例如像摩泰台拉香肚、大腊肠、意大利辣香肠、肝肠、鸡肉香肠、维也纳香肠、法兰克福香肠、午餐肉、肉干。
基于肉类的乳液可以被煮熟、灭菌或烘烤，例如处于烘烤形式或在填充到肠衣(例如塑料、胶原、纤维素或天然肠衣)中之后。加工的肉类产品也可以是改组的肉类产品，例如像改组的火腿。本发明的肉类产品可能经历加工步骤，例如像本发明的肉制品可经历加工步骤，例如盐析，例如干盐渍；腌制，例如盐水腌制；烘干；烟熏；发酵；烹饪；罐头；蒸煮；切片和/或切碎。
在另一个实施例中，食品/饲料产品可以是乳化的肉类产品。
肉类
如本文所使用的，术语“肉类”意指来源于任何种类的动物的任何种类的组织。
如本文所使用的术语肉类可以是包含来源于动物的肌肉纤维的组织。肉类可以是动物肌肉，例如整个动物肌肉或从动物肌肉切下的片。
在另一个实施例中，肉类可以包括动物的内部器官，例如像心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和脑。
术语肉类涵盖通过本领域已知的任何其他适当方法研磨、切碎或切割成较小片的肉。
肉类可以来源于任何种类的动物，例如来自牛、猪、羔羊、绵羊、山羊、鸡、火鸡、鸵鸟、野鸡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、野牛、羚羊、骆驼、袋鼠；任何种类的鱼，例如鲱属小海鱼、鳕鱼、黑线鳕、金枪鱼、海鳗、鲑鱼、鲱、沙丁鱼、鲭鱼、竹荚鱼、秋刀鱼、圆腹鲱、绿鳕、比目鱼、鳀鱼、沙丁鱼、蓝鳕鱼、太平洋鳕鱼、鳟鱼、鲶鱼、鲈鱼、毛鳞鱼、枪鱼、红鲷鱼、挪威鳕和狗鳕；任何种类的贝类，例如蛤蜊、贻贝、扇贝、鸟蛤、海螺、蜗牛、牡蛎、虾、龙虾、海螯虾、螃蟹、小龙虾、墨鱼、鱿鱼和/或章鱼。
在一个实施例中，肉类是牛肉、猪肉、鸡肉、羊肉和/或火鸡。
生物物理特性
饲喂动物三肽基肽酶(任选地与内切蛋白酶组合)和/或本发明的喂养料和/或饲料添加剂组合物和/或组合物可以改善如此饲喂的动物的生物物理特征。
合适地，该方法和/或用途可以进一步包括向动物给予至少一种饲料组分、至少一种矿物质、至少一种维生素或其组合。
可替代地或另外地，该方法和/或用途可以进一步包括向动物给予至少一种内切蛋白酶。
如本文所使用的，“生物物理特性”意指改善动物健康和/或性能以及/或者产量的动物的任何生物物理性质。
举例来说，生物物理特性可以是选自下组的一种或多种，该组由以下各项中的一种或多种组成：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、消化原料的能力(例如营养消化率、包括淀粉、脂肪、蛋白质、纤维消化率)、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)、氮保留、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋大小、蛋重、蛋质量、产蛋率、瘦肉增加、骨灰％、骨灰mg、背脂％、乳产量、乳脂％、繁殖产量例如同窝生仔数、同窝生存能力、孵化率％和环境影响，例如粪肥输出和/或氮排泄。
合适地，生物物理特性可以是选自下组的一种或多种，该组由以下各项组成：饲料转化率、氮消化率(例如回肠氮消化率)和消化能(例如回肠消化能)。
在优选的实施例中，生物物理特性可以是消化蛋白质的能力。
在一个实施例中，动物的生物物理特性是指动物性能。
合适地，当与未喂食饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或本发明的预混物的动物相比时，向动物给予饲料添加剂组合物和/或饲料和/或喂养料和/或饲料成分和/或本发明的预混物可能不会实质上增加动物的坏死性肠炎的发病率。
如本文所使用的，术语“实质上增加坏死性肠炎的发生率”意指发病率不会增加超过约20％、合适地不会增加超过约10％。优选地，意味着坏死性肠炎的发生率不会增加超过约5％、更优选地不会增加超过约1％。
性能
如本文所使用的，“动物性能”可通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率和/或通过饲料中营养物的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中消化能或代谢能和/或氮保留来确定。
优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。
“改善的动物性能”意指与给动物饲喂不包含根据本发明制备的水解产物或组合物的饲料相比，由使用本发明的水解产物或组合物(例如食品或饲料添加剂组合物)引起的在受试者中存在增加的饲料效率、和/或增加的增重、和/或降低的饲料转化率、和/或饲料中改善的营养物的消化率或能量和/或改善的氮保留。
优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率和/或增加的增重和/或降低的饲料转化率。
如本文所使用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。
“增加的饲料效率”意指与没有饲喂根据本发明制备的水解产物或组合物的动物相比，在饲料中使用本发明的水解产物或本发明的组合物(例如食品或饲料添加剂组合物)导致每单位饲料摄入量中增重增加。
饲料转化率(FCR)
如本文所使用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用本发明的水解产物或组合物(例如食品或饲料添加剂组合物)导致动物体重增加指定量饲喂给动物的饲料量低于在该饲料不含所述根据本发明制备的水解产物或组合物情况下使动物体重增加相同量时所需的饲料量。
营养物质消化率
本文所用的营养物质消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养物质的比率。营养物消化率可测量为所给予至受试者的营养物与受试者粪便中所排出来的营养物之间的差值、或给予至受试者的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养物之间的差值。
如在此使用的，营养物消化率可通过在一段时间期间收集总排泄物，测量所摄入营养物与所排泄的营养物之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养的量的惰性标记物来测量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养物的百分比，或表示为可消化的营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。
如本文所使用的营养物消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
合适地，根据本发明的方法和/或用途或任何方面使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与至少一种内切蛋白酶组合)增加饲喂饲料添加剂组合物和/或饲料成分和/或饲料和/或喂养料和/或预混物和/或水解产物的动物中的蛋白质和/或氨基酸消化率。
如本文所使用的能量消化率意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所使用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消费的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。可使用与测定营养物质消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
氮保留率
如本文所使用的氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。
氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。
屠体收率和产肉量
本文所用的术语‘屠体收率’是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语‘屠体’是指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。本文所用的术语‘产肉量’是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。
增重
本发明还提供了增加受试者(如家禽或生猪)体重的方法，该方法包括向所述受试者饲喂包括根据本发明的饲料添加剂组合物的喂养料。
“增加的增重”是指与不饲喂包括根据本发明制备的水解产物或组合物的饲料的动物相比，在饲喂包含本发明的水解产物或根据本发明的组合物(例如食品或饲料添加剂组合物)的饲料的动物具有增加的体重。
非食品产品
本发明提供了包含本发明的水解产物的非食品产品。
可获得的(例如获得的)水解产物可用于制造局部施用的产品，例如洗剂、霜剂、软膏剂、擦拭剂、清洁剂等。因此，本文考虑了包含本文所述的水解蛋白质组合物的这样的产品。这样的产品例如用于治疗目的，例如提供对于干性皮肤、瘙痒、不适等的缓解是有用的。
除了水解的蛋白质组分之外，这些产品优选包含脂质、蜡、油、油包水乳液、水包油乳液等作为基质。典型地，它们可以进一步包含一种或多种香味成分以及其他成分，例如表面活性剂或乳化剂。
还提供了包含本文所述的乳或乳清蛋白水解产物的化妆产品和其他外用助剂或美容助剂。
在一个实施例中，化妆产品可以施用于人的面部、脸颊、嘴唇或眼睛。在另一个实施例中，产品可以用于身体的任何地方以帮助改善皮肤的美容外观，或者例如以减少皱纹痣、雀斑、疤痕、瑕疵等的外观。
优点
诸位发明人首次提出根据本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶对于用于制备水解产物非常有利，并且向进食水解产物、或包含水解产物的食品和/或饲料、和/或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶(任选地与至少一种内切蛋白酶组合)的食品或饲料添加剂组合物的受试者提供益处。
可替代地或另外地，当与未处理的水解产物相比时，使用内切蛋白酶和三肽基肽酶产生的水解产物也可以具有降低的苦味。
有利地，教导用于本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够作用于宽范围的肽和/或蛋白质底物，并且由于具有这样的广泛的底物特异性而不容易被富含某些氨基酸(例如脯氨酸和/或赖氨酸和/或精氨酸和/或甘氨酸)的底物的裂解抑制。因此，此类脯氨酸耐受性三肽基肽酶的使用可以有效地和/或快速地分解蛋白质底物(例如存在于用于制备水解产物的底物中)。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以对在P1位置具有一个或多个赖氨酸、精氨酸或甘氨酸的肽和/或蛋白质具有优先活性。在不希望受理论束缚的情况下，在P1位置包含这些氨基酸的肽和/或蛋白质底物对于许多三肽基肽酶和/或蛋白酶而言通常难以消化，并且一旦遇到这样的残基就可能停止或减缓通过三肽基肽酶和/或蛋白酶进行的肽和/或蛋白质底物的裂解。有利地，通过使用本发明的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，可能有效地消化在P1处包含赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的蛋白质和/或肽底物和/或不会显著减缓裂解反应。
本发明还提供了脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该脯氨酸耐受性三肽基肽酶除了具有如上所述的活性之外可以耐受在位置P2、P2'、P3和P3'处的脯氨酸。这是有利的，因为其允许具有脯氨酸延伸的肽和/或蛋白质底物的有效裂解并允许宽范围的肽和/或蛋白质底物的裂解。
有利地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可能对在P1位置处具有赖氨酸的肽和/或蛋白质具有优先的活性，这允许有效裂解具有高赖氨酸含量的底物，例如乳清蛋白。
本发明还提供了热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，该热稳定的脯氨酸耐受性三肽基肽酶与非热稳定的变体相比更不容易变性和/或将因此保持更长时间的活性。
有利地，脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以在约pH 7的pH范围内具有活性，因此可以与碱性内切蛋白酶一起使用。这意味着在酶处理之间不需要改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶同时添加到反应中，这可以使生产水解产物的过程更快和/或更有效和/或更具成本效益。此外，这允许更有效的反应，因为在较低的pH值下，底物可能从溶液中沉淀出来，因此不会被裂解。
在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶可以与酸性内切蛋白酶组合使用，并且有利地不需要在酶处理之间改变包含用于水解产物生产的蛋白质和/或肽底物的反应介质的pH。换句话说，它允许脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶同时添加到反应中，这可以使生产水解产物的过程更快和/或更有效和/或更具成本效益。
有利地，内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合能够裂解与在患有例如乳蛋白过敏和/或大豆蛋白过敏的疾病的敏感个体中引起免疫响应相关的蛋白质底物。
有利地，使用内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合可以增加底物裂解的效率。不希望受理论束缚，据信内切蛋白酶能够在远离C末端或N末端的多个区域裂解肽和/或蛋白质底物，从而产生用于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的更多的N末端以用作底物，从而有利地增加反应效率和/或减少反应时间。
许多当前的饲喂实践涉及在高pH(例如pH 8)下向动物给予有活性的碱性蛋白酶。因此，碱性蛋白酶仅在胃肠道变得更碱性(例如在小肠和大肠和盲肠的较后部分)的动物的胃肠道中较低(例如较后)处有活性。不希望受理论束缚，据信在胃肠道的较后部分产生寡肽增加利用寡肽的微生物群体，这些微生物群体进而可以导致肠道疾病挑战和/或可用于动物摄取的营养物减少。此外，在胃肠道较后(即较低)处，粘膜比在较上部份(例如，喉咙、前胃或胃)的保护性更差，因此更容易受损，导致炎症。有利地，在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的使用减轻了这个问题，因为它能够消化上消化道中的底物，从而不实质上增加微生物群体和/或增加可用于动物摄取的营养物(例如氨基酸/肽)的量和/或减少炎症。
有利地，使用内切蛋白酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶的组合可以增加底物裂解的效率。不希望受理论束缚，据信内切蛋白酶能够在远离C末端或N末端的多个区域裂解肽和/或蛋白质底物，从而产生用于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的更多的N末端以用作底物，从而有利地增加反应效率和/或减少反应时间。
使用酸性内切蛋白酶和在酸性pH下具有活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶是非常有利的，因为这两种酶可以协同消化在动物的上消化道(例如喉咙、前胃或胃)中的肽和/或蛋白质底物，并且可以与存在于动物中的其他内源性蛋白酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)组合起作用。
有利地给动物饲喂脯氨酸耐受性三肽基肽酶导致增加的增重和/或降低的饲料转化率和/或增加的氮消化率(例如回肠氮消化率)和/或增加的能量消化(例如回肠能量消化)。
使用内切蛋白酶、S53家族的外切三肽基肽酶(例如像脯氨酸耐受性三肽基肽酶)和氨基肽酶任选地与一种或多种其他组分组合具有许多优点：
·它允许有效地生产可有效地被受试者吸收(例如由于具有更好的吸收渗透势)的单个氨基酸和/或二肽和/或三肽；
·可以更有效地和/或更快地消化蛋白质和/或肽底物；
·脯氨酸耐受性三肽基肽酶的终点抑制(即其反应产物的抑制)降低，特别是当体外使用时，例如通过将三肽消化成单个氨基酸和/或二肽来制造水解产物；和/或
·对含有高水平的脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的底物具有协同和/或加成的活性。
另外的定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本披露所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。辛格尔顿(Singleton)等人，微生物学和分子生物学词典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)，第20版，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons)，纽约(1994)；以及黑尔(Hale)和迈尔哈姆(Marham)，哈珀柯林斯生物学词典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)，哈珀永久出版社(HarperPerennial)，纽约州(1991)为技术人员提供了本披露中所使用的许多术语的通用词典。
本披露并不受本文披露的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本披露的实施例的实践或测试。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另外指明，任何核酸序列均以5'至3'取向从左到右书写，氨基酸序列以氨基至羧基取向从左到右书写。
本文提供的标题并不是对本披露的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可以通过将本说明书作为一个整体来参考而得到。因此，把说明书作为一个整体参考时，下面立即定义的术语得以更全面地定义。
在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。
如本文所使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
如本文所使用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本披露和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，归因于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施例之前，应理解本披露并不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而并不意图是限制性的，因为本披露的范围仅由所附权利要求限定。
在提供数值范围的情况中，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体披露。在所陈述的范围中的任何规定值或中间值与该所陈述的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本披露内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个极限值被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本披露中，但依据该所陈述的范围中的任何被具体排除的极限值而定。在所陈述的范围包含极限值的一个或两个的情况下，将那些所包含的极限值的一个或两个排除在外的范围也包含在本披露中。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在此和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“脯氨酸耐受性三肽基肽酶”、“内切蛋白酶”、“S53家族的外切三肽基肽酶”、“氨基肽酶”或“酶”)包括多种这样的候选试剂，并且提及“饲料”、“喂养料”、“预混物”或“饲料添加剂组合物”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种饲料、喂养料、预混物及其等同物等。
本文讨论的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的披露内容而提供。本文中的内容都不应理解为承认此类出版物构成所附权利要求书中的现有技术。
现仅以举例的方式参照以下附图和实例来描述本发明。
实例
实例1
脯氨酸耐受性三肽基肽酶在里氏木霉中的克隆和表达。
使用用于在里氏木霉中表达的优选密码子产生编码脯氨酸耐受性三肽基肽酶的合成基因，除了作为基因组序列产生的TRI079(SEQ ID No.55)和TRI083(SEQ ID No.56)之外。预测的分泌信号序列(SignalP 4.0：鉴别来自跨膜区的信号肽，托马斯·诺达尔·彼得森(Thomas Nordahl Petersen)、索伦·布鲁纳克(
Figure BDA0001330130990001721
Brunak)、贡纳·冯海耶(Gunnarvon Heijne)和亨里克·尼尔森(Henrik Nielsen)自然方法(Nature Methods)，8:785-786，2011)被来自里氏木霉酸性真菌蛋白酶(AFP)的分泌信号序列和来自里氏木霉葡糖淀粉酶基因(TrGA1)的内含子替换(TRI079和TRI083除外)(参见图7下小图)。
使用LR ClonaseTM酶混合物(生命技术公司(Life Technologies))，将合成基因导入目的载体pTTT-pyrG13(如在US 8592194B2中所述，其教导内容通过引用结合在此)，导致用于本文的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的表达载体pTTT-pyrG13的构建。编码SEQ ID No 1、2和29的表达载体显示在图1中，编码SEQ ID No 12和39的表达载体显示在图7中。编码SEQID No 96或97(TRI045)的表达载体显示在图2中。使用PEG介导的原生质体转化，将5-10μg的表达载体单独地转化到合适的里氏木霉菌株中，基本上如在(US 8592194 B2)中所述的。将发芽孢子通过离心收获，洗涤并用45mg/ml的裂解酶溶液(哈茨木霉(Trichodermaharzianum，西格玛公司L1412))处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备，如通过
Figure BDA0001330130990001731
等人(基因(Gene)61(1987)155-164)所述的。
使用0.85％NaCl、0.015％Tween 80的溶液收获孢子。将孢子悬浮液用于接种液体培养物
将培养物在28℃和80％湿度下生长7天，并在180rpm下振摇。通过真空过滤收获培养物上清液，并且用于测量表达和酶性能。
实例2
纯化和表征
A.脯氨酸耐受性三肽基肽酶的纯化
在用20mM乙酸钠(pH 4.5，缓冲液A)平衡的PD10柱(GE生命科学公司(GE LifeSciences)，美国)上进行样品脱盐。对于源S15HR25/5(GE生命科学公司(GE LifeSciences)，美国)上的离子交换层析，柱用缓冲液A平衡。将脱盐样品(7ml)以6ml/min的流速应用到柱上，并且柱用缓冲液A洗涤。用在20mM乙酸钠(pH 4.5)中的0-0.35M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质(35分钟)。在整个运行过程中，收集10ml级分。如下所述针对三肽基氨基活性对收集的样品进行测定。基于在280nm处的吸光度测量和使用ExPASy ProtParam工具(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)计算的蛋白质的理论吸光度来计算蛋白质浓度。
B.脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切肽酶活性的确定
将发色肽H-Ala-Ala-Ala-pNA(MW＝387.82；巴赫姆公司，瑞士)用于确定如上所述产生的样品中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶的活性。如下进行测定：在微量滴定板中将10μL的发色肽溶液(10mM溶解在二甲亚砜；DMSO中)添加到130μl醋酸钠(20mM，用乙酸调节至pH4.0)中，并在40℃下加热5分钟。添加10μL适当稀释的酶，并在405nm处在MTP读数器(Versamax，分子器件公司(Molecular Devices)，丹麦)中测量吸收。将一开特的蛋白水解活性定义为每秒释放1摩尔对硝基苯胺所需的酶的量。
用于内切蛋白酶活性的偶氮酪蛋白测定。
使用由艾弗森(Iversen)和约根森
Figure BDA0001330130990001732
(1995)描述的内切蛋白酶测定的改良版本。将50μl的酶样品添加到的4倍稀释的麦基尔文(McIlvaine)缓冲液(pH 5)中的250μl的偶氮酪蛋白(0.25％w/v；来自西格玛公司(Sigma))中，并且在40℃下在振摇(800rpm)下孵育15min。通过添加50μl的2M TCA终止反应，并以20,000g离心5min。向195μl上清液样品中添加65μl的1M NaOH，并且测量在450nm处的吸光度。将内切蛋白酶活性的一个单位定义为在40℃下在15min内产生0.1的吸光度增加的量。
发现如在实例1中所描述产生的脯氨酸耐受性三肽基肽酶样品实质上不含内切肽酶副活性。如在实例2A中所描述进行纯化后，实质上没有检测到内切肽酶副活性。
C.pH特征曲线
使用上述采用H-Ala-Ala-Ala-pNA底物描述的脯氨酸耐受性三肽基肽酶测定(其中改良是使用缓冲液20mM甘氨酸钠(pH 2.0、2.5、3.0、3.5和4.0)或20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0、4.5和5.5))来确定脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083(图2)和TRI045(图24)的pH特征曲线。观察到TRI083和TRI045的最佳pH为4.0。
D.温度特征曲线
在25℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和85℃温度下使用上述脯氨酸耐受性三肽基肽酶测定。发现脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083的最佳温度为50℃，而发现在70℃和更高温度下没有活性(图3)。
使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切蛋白酶(
Figure BDA0001330130990001741
AFP)组合进行蛋白质水解
酶：
Figure BDA0001330130990001742
AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083如实例1中所述进行表达。
测定缓冲液：50mM NaOAc、pH 4.0、3％二甲基血红蛋白(西格玛-奥德里奇公司(Sigma Aldrich))，37℃，孵育1小时(每MTP孔中100μl反应混合物)。
终止/显色试剂：0.05％三硝基苯磺酸在125mM硼酸钠pH 8.6(每孔200μl)中。
在与终止/显色试剂孵育约20min之后，使用Versa max酶标仪(分子器件公司)在450nm处读板。当内切蛋白酶(
Figure BDA0001330130990001743
AFP)与脯氨酸耐受性三肽基肽酶组合使用时，测定的结果显示出协同效应(图4)。
使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切肽酶的组合水解乳清蛋白(WPI)
对于乳清蛋白水解，使用Lacprodan-9224(Arla食品成分公司，丹麦)。在H2Od中制备20％(w/w)WPI悬浮液，并用乙酸(西格玛-奥德里奇公司，丹麦)将其调节至pH 4.0。为了防止微生物生长，添加0.0285％(w/w)NaN3。将200μl的WPI悬浮液的体积转移到96孔微量滴定板(MTP；VWR公司，丹麦)的每一个孔中。随后，向每个孔中添加5μl的每一种连续稀释的肽酶、
Figure BDA0001330130990001744
FP2和脯氨酸耐受性三肽基肽酶(3PP＝TRI083；在添加的储备溶液中0-8750nkat H-Ala-Ala-Ala-pNA/mL活性)，得到如表1中所示的剂量。将MTP密封并置于40℃的iEMS孵化器/振摇器(赛默科技公司(Thermo Scientific)，丹麦)中。孵育24h并以400rpm振摇后，通过添加20μl的2M三氯乙酸(TCA；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)来终止水解。作为参考，使用简单的20％WPI(w/w)悬浮液，其以与WPI水解相同的方式处理。通过过滤(0.22μm)除去未水解的、沉淀的WPI。在过滤的WPI水解产物邻苯二甲醛(OPA)上根据尼尔森(Nielsen)等人(2001)(稍作修改)进行衍生化。将25μl的样品体积转移到孔中，随后添加175μl的溶解于pH 11的磷酸盐缓冲液的OPA试剂中。将在MTP读数器(分子器件公司，丹麦)中在340nm处测量的吸收转化为以百分比计的相对水解度(DH)。
在100℃下在6M HCl(西格玛-奥德里奇公司，丹麦)中水解24h的20％(w/w)WPI悬浮液作为参考(100％DH)。
如在表1中所示，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切肽酶
Figure BDA0001330130990001751
FP2的组合给出了最好的水解度。通常，补充内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶比不添加TRI083(SEQID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.29)产生更高的DH。例如，添加5μl 2,188nkat/mlTRI083至0.6％
Figure BDA0001330130990001752
FP2导致25.0％的水解度增加，而补充1.2％(w/w)
Figure BDA0001330130990001753
FP2与5μl 8,375nkat/ml TRI083导致21.4％的DH增加。
表1：使用内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶(3PP)组合水解的20％(w/w)WPI的水解度
Figure BDA0001330130990001754
33聚体麦醇溶蛋白肽的水解
通过LC-MS和无标记定量，检测脯氨酸耐受性三肽基肽酶水解来自α-麦醇溶蛋白(α-2-麦醇溶蛋白)的合成底物的能力。发现将底物裂解成三肽，而与底物中的高脯氨酸含量无关。
实验设置
将麦醇溶蛋白(α-2-麦醇溶蛋白)(aa56-88)H-LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF-OH的33聚体(Zedira股份有限公司；德国达姆施塔特D-64293号)C190H273N43O47(MW＝3911.46)(1mg/ml；0.26mM)在脯氨酸耐受性三肽基肽酶(0.01mg/ml TRI083)的存在下，在总体积为1000μl的缓冲液(pH＝4.5)(底物/酶比例100:1，w/w)中、于24℃下孵育。分别在0、1、3、5、10、15和30分钟后，用20μl 5％三氟乙酸(TFA)终止酶反应的等分试样(100μl)。然后将样品转移到新小瓶中，并且在LTQ轨道阱质谱仪上进行分析。
数据采集、无标记定量和MS/MS数据分析
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421(可获自MacCoss实验室软件公司，华盛顿大学基因组科学系，美国华盛顿州西雅图市NE第15大道3720号(MacCoss LabSoftware,University of Washington,Department of Genome Sciences,3720 15th AveNE Seattle,Washington,US))访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将两个底物的肽序列及其裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
使用GPMAW来手动注释LC-MS/MS数据以计算片段化的理论值。
分离完整的α-2-麦醇溶蛋白肽的三重带电质量并随着时间进行跟踪。完整的肽在3min后不可检出，并且非常快速地水解(表2)。33聚体α-2-麦醇溶蛋白肽的完全水解将给出以下三肽：LQL′QPF′PQP′QLP′YPQ′PQL′PYP′QPQ′LPY′PQP′QPF。由从α-2-麦醇溶蛋白底物裂解四种三肽LQL、QPF、PQP和QLP产生的中间产物YPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF发现累积并随后减少(表2)。
表2：α-2-麦醇溶蛋白和衍生的肽的相对MS峰强度
Figure BDA0001330130990001761
Figure BDA0001330130990001771
检测到大部分预期的三肽的积累。基于其MS/MS片段化，发现并证实了加下划线的三肽：LQL′QPF′PQP′QLP′YPQ′PQL′PYP′QPQ′LPY′PQP′QPF，而QPF三肽仅基于其质量被发现。
总之，发现脯氨酸耐受性三肽基肽酶将底物α-2-麦醇溶蛋白连续裂解成三肽，而与高脯氨酸含量无关。在水解期间，脯氨酸分别存在于P3、P2、P1、P1’、P2′和P3'位置。
这与先前的发现三肽基肽酶不会裂解在P1或P1'位置的脯氨酸相反(US7972808B2、US 5821104，赖卡德(Reichard)等人，2006，应用与环境微生物(Applied andEnvironmental Microbiology)72,1739-1748)。
AAPPA肽的裂解
通过LC-MS和无标记定量，检测脯氨酸耐受性三肽基肽酶水解合成底物AAPPA的能力。将肽H-AAPPA-NH2(MW＝424.49，来自谢弗-N公司，哥本哈根)溶解于20mM MES缓冲液(pH＝4.0(1mg/ml))中。在室温下将1000μl的H-AAPPA-NH2溶液与200μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)溶液(40ug/ml)(底物/酶100:0.8)一起孵育。在七个时间点(0、5、15、60、180、720和1440min)取出100μl样品，用50ul 5％TFA进行稀释，热灭活(在80℃下10min)并保持在-20℃直到LC-MS分析。
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物的肽序列以及裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
分析显示，脯氨酸耐受性三肽基肽酶随着时间能够降解肽AAPPA(图5)并产生产物AAP(图6)，表明AAPPA中的PP肽键被脯氨酸耐受性三肽基肽酶水解。
使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶来降低β-乳球蛋白变应原性
使用以下试剂盒来进行实验：由MIoBS(Morianga生物科学研究院有限公司(Morianga Institute of Biological Sciences,Inc.)，日本横滨市，目录号171LG)供应的试剂盒“乳蛋白试剂盒(β-乳球蛋白)”)。
通过使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶、内切蛋白酶以及脯氨酸耐受性三肽基肽酶和内切蛋白酶的组合处理β-乳球蛋白溶液来研究潜在的变应原性的降低。
缓冲液：50mM乙酸盐，pH 4.5
β-乳球蛋白溶液：在缓冲液中100μg/ml
酶：脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083(在缓冲液中40000nkat/ml)和
Figure BDA0001330130990001781
AFP(在缓冲液中100SAPU/ml)
将β-乳球蛋白溶液(1000μL)置于埃普多夫(Eppendorf)管中并加热至40℃。添加20μL缓冲液和50μL脯氨酸耐受性三肽基肽酶(t＝0)，并且用移液管吸取来将溶液混合。在添加酶后立即将50μL的等分试样转移到950μL冰冷的样品提取溶液(通过试剂盒提供)中。取出随后的等分试样，并且在1h、3h、6h和24h之后以相同的方式进行处理。将所有样品储存在冰上直到进一步分析。使用20μl
Figure BDA0001330130990001784
AFP+50μl缓冲液；20μl
Figure BDA0001330130990001782
AFP+50μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶或70μl缓冲液(无酶)重复实验。使用试剂盒中提供的方案分析所有样品(包括在室温下将在提取溶液中的所有样品孵育24h作为程序的初始步骤)。
使用乳蛋白ELISA试剂盒(β-乳球蛋白)，发现脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切蛋白酶组合能够降低测定响应，从而潜在的变应原性显著地超过单独的
Figure BDA0001330130990001783
AFP实现的。单独的脯氨酸耐受性三肽基肽酶对测定响应具有很小的影响。
实例3
材料和方法
1.玉米大豆饲料的酶处理
将饲料面粉筛分至小于212μm的粒度，并且悬浮在水中至10％(w/w)浆液，并且将pH调至pH 3.5。然后，使用带有Biomeck NX机器人的安捷伦(Agilent)0.5mL仪器，将138μL的10％浆液添加到96孔MTP孔板中的每个孔中。使用大口径吸头。然后添加在20mM乙酸盐(pH 3.5)中含有待测试的蛋白酶的20μl酶溶液，然后添加溶解于水中的10μL(1.14U/μL)胃蛋白酶。在iEMS孵化器/振摇器中(以1150rpm)，在40℃下将板孵育45分钟。然后添加34μL在1M碳酸氢钠中的胰蛋白酶(1.126mg/mL)，并且在iEMS(以1150rpm)中在40℃下将板孵育60分钟。然后在5℃、4000rpm下将板离心15min，将10μL上清液转移至在每个孔中含有190μL水的新板(康宁板(corning plate)#3641未结合)以进行20x稀释。将获得的板(母版)储存在-20℃的冰箱中。
2.水解度测量。
可溶性蛋白质的水解度(DH)的分析方法是基于使用邻苯二醛的伯胺基团的反应(OPA-测定)。参考：尼尔森(P.M.Nielsen)、彼得森(D.Petersen)和丹布曼(C.Dambmann)，用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(Improved Method for Determining FoodProtein Degree of Hydrolysis)，食品科学杂志(Journal of Food Science)，66(2001)642-646。
对于OPA测定，进行以下程序。将来自母板通过酶处理的10-25μl饲料样品转移到新板中，然后向板中添加175μl含有硼酸钠、十二烷基硫酸盐和二硫苏糖醇的OPA试剂。就在2分零5秒混合之后，进行在340nm处的光密度的终点测量。
在胃蛋白酶和胰液素存在下，
Figure BDA0001330130990001791
AFP(酸性蛋白酶)对玉米大豆饲料的影响。体外研究。
玉米大豆饲料的组成提供在下表中(植酸盐和肌醇磷酸盐(IP1-5)的相互作用，包括IP5异构体与膳食蛋白质和铁的相互作用，以及胃蛋白酶的抑制。余(S.Yu)、A.Cowieson、吉尔伯特(C.Gilbert)、普林斯迪(P.Plumstead)和达尔斯加德(S.Dalsgaard)，动物科学杂志(J.Anim.Sci.)90(2012)1824-1832，补充信息)。
成分 量，％
玉米 60.01
大豆粉 31.52
大豆油 4.00
盐 0.40
DL-甲硫氨酸 0.20
石灰岩 1.16
磷酸氢钙 1.46
维生素和矿物质混合物 1.25
在胃蛋白酶和胰液素存在下，用不同浓度(相对于玉米大豆饲料的450ppm、1000ppm和1500ppm)的
Figure BDA0001330130990001792
AFP(NSP24，可获自杰能科公司食品酶部门(GenencorDivision，Food Enzymes))(本文中称为“AFP”)处理玉米大豆饲料(图8)。结果提供如下：玉米大豆饲料DH的改善的水平分别为4.5％、6.3％和9.0％。
实例4
在
Figure BDA0001330130990001807
AFP存在和不存在下，并且在胃蛋白酶和胰液素存在下，脯氨酸耐受性三肽基肽酶对玉米大豆饲料的影响。体外研究。
在这些研究中，
Figure BDA0001330130990001808
AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶仅分别以1000ppm和450ppm的剂量使用。结果提供于表3中。在对照实验中，仅使用胃蛋白酶和胰液素。水解的改善是处理和对照之间的比率。
表3.脯氨酸耐受性三肽基肽酶和
Figure BDA0001330130990001809
AFP对玉米大豆饲料的水解的影响。
对照 3PP AFP AFP+3PP
水解度，％ 24.5±2.0 25.5±1.6 28.6±3.6 32.3±2.6
水解的改善，％。 100±8.2 104±6.5 117±14.7 132±10.7
从表3可以看出，脯氨酸耐受性三肽基肽酶本身不能在玉米大豆蛋白水解中产生足够的益处。
Figure BDA0001330130990001801
AFP的表现与在实例3中提供的结果类似。然而，脯氨酸耐受性三肽基肽酶和
Figure BDA0001330130990001802
AFP的组合给出了最大的结果，并且可以与内切和外切蛋白酶的协同作用相关联。
实例5
在胃蛋白酶和胰液素不存在下，验证脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切蛋白酶组合对玉米大豆饲料水解的剂量响应。
该工作的目的是鉴定酶性能的起源，并且真正地监测内切和外切蛋白酶的可能添加剂或协同表现。由于这个原因，在胃蛋白酶和胰液素不存在下进行这些实验，并且将结果总结在图9中。
从图9可以看出，当脯氨酸耐受性三肽基肽酶与内切蛋白酶一起使用时水解度是非常显著的。很明显，这种现象是协同作用的，因为剂量响应取决于脯氨酸耐受性三肽基肽酶的水平和内切蛋白酶的性质。在
Figure BDA0001330130990001803
AFP的情况下，效果更加显著。
实例6
在胃蛋白酶和胰液素存在下，验证脯氨酸耐受性三肽基肽酶与不同剂量的
Figure BDA0001330130990001804
AFP内切蛋白酶组合对玉米大豆饲料水解的剂量响应。
为了估计
Figure BDA0001330130990001805
AFP和脯氨酸耐受性三肽基肽酶之间的协同作用水平，进行了使用不同剂量的酶和在胃蛋白酶和胰液素的存在下的实验。
从图10可以看出，水解度不依赖于脯氨酸耐受性三肽基肽酶和
Figure BDA0001330130990001806
AFP在组合物中的浓度。可能对于两种酶，浓度1000ppm和2000ppm对应于饱和水平。然而，当处理时间从100min增加到200min时，水解度显著增加。
实例7
分析20个三肽基肽酶在pH 2.5、40℃下60min的低pH稳定性
作为对单胃动物饲料中酶的使用的要求，酶应当在较低pH下具有活性。由于这个原因，已经在pH 2.5下使用在合成底物AAF(H-Ala-Ala-Phe-pNA，巴赫姆公司，L-1095)上的反应来测试三肽基肽酶的数目。
在DMSO中以2.5mg/ml制备三肽底物AAF。三肽基肽酶用作肉汤。在96孔孵育板中制备含有2.5μl酶和90μL甘氨酸乙酸Tris缓冲液(每种缓冲液成分为50mM，pH 2.5)的反应混合物。
将孵育板混合并在40℃下孵育60min。然后向每个孔中添加50μl 0.2M Mes-NaOHpH 6.0，以600rpm混合2min。然后，将5ul孵育混合物置于96孔测定板中，该测定板已经填充有85μl 0.1M乙酸缓冲液(pH 4.0)和5μl 2.5mg/ml AAF底物溶液。
将反应混合物在600rpm下搅拌2min，并在酶标仪中(分子器件公司，丹麦)在30℃下在410nm处每30秒钟直接读取一次持续15min。
为了测量初始酶活性，除了在40℃下酶孵育60min的步骤之外，进行类似的程序。
用活性恢复测量的初始和最终活性的结果提供于表4中。
表4.对三肽基肽酶的初始、最终活性及其恢复。
Figure BDA0001330130990001811
Figure BDA0001330130990001821
从表4可以看出，20个三肽基肽酶的样品中有11个在pH 2.5和40℃下持续60min相当稳定，因为保留了70％以上的活性。记住最后四个样品是相同的分子(TRI071)，并且2个样品是阴性对照。从这些结果可以得出结论，脯氨酸耐受性三肽基肽酶在低pH下是稳定的。
结论
这项工作证明丝氨酸外切肽酶脯氨酸耐受性三肽基肽酶与丝氨酸内切蛋白酶
Figure BDA0001330130990001822
30L以及还有天冬氨酸蛋白酶
Figure BDA0001330130990001823
AFP在模拟单胃消化系统的条件下对基于玉米大豆饲料的水解的协同效应。还显示许多三肽基肽酶在低pH下是稳定的，并且可以考虑用于饲料应用。
实例8
在动物饲料中的脯氨酸耐受性三肽基肽酶
总共有288只一天大的Ross 308雄性肉仔鸡从商业孵化场购买。在研究开始时，根据通过分区进行的各自的处理，将8只禽随机分配到层架式笼子中。仅选择健康的禽用于实验，并且在整个研究过程中没有禽被更换。该研究由以下处理组成(表5)：
表5-实验设计
Figure BDA0001330130990001824
在研究开始(d0)第14天和在研究终止(d21)时记录禽重量。笼子是实验单位。饮食以糊状形式喂养，并且配制成符合或超过NRC标准，除了Ca和AvP外(表5)。使用戴维斯(Davies)S-20混合器将所有饲料混合，在每个处理之间冲洗混合器以防止口粮之间的交叉污染。在每个批次的开始、中间和结束时从每个处理饮食中收集样品，并且一起切碎用于分析饲料中的酶活性。
所有的禽都饲喂玉米大豆基础口粮直到第14天；从第14天起饲喂处理口粮。将植酸酶添加到所有的处理口粮中。在饲料更换时，将饲养者从笼子中移走、反向称重、清空、并用适当的处理饮食重新填充。在研究的最后一天(d21)，称重饲料和禽以确定实验期间的摄食量(FI)和增重(BWG)。每天针对死亡率对围栏进行检查。当禽被剔除或发现死亡时，记录日期和移除重量(kg)。对所有死亡或被剔除的禽进行了肉眼尸检，以确定死亡的可能原因。确定针对死亡率进行了校正的饲料转化率(FCR)。
在d21时，通过心脏内注射戊巴比妥钠将每个笼子中的所有禽进行安乐死，并用蒸馏水轻轻冲洗来呈现回肠较下部分的内容物。合并笼子内的禽的消化物，产生8个样品/饮食处理。收集后，立即将消化物样品冷冻、干燥并加工。分析饮食和消化物样品的标记、氮(N)和总能量以便计算消化率系数。
表6-饮食配制品
成分％ 0-14天 14-21天
玉蜀黍 48.78 57.09
大豆粉48％CP 40.06 34.7
卡诺拉粉 4 4
大豆油 3 1.35
L-赖氨酸HCl 0.13 0.07
DL-甲硫氨酸 0.28 0.22
L-苏氨酸 0.03 0
盐 0.33 0.33
石灰岩 1 0.98
磷酸氢钙 2.09 0.97
家禽Vits/TE's 0.3 0.3
计算分析
蛋白质％ 24.98 22.97
MEP MJ/KG 12.4 12.34
钙％ 1.05 0.76
AV PHOS％ 0.5 0.3
ALYS％ 1.27 1.1
AM+C％ 0.94 0.84
ATHRE％ 0.83 0.73
ATRYP％ 0.26 0.23
统计分析
使用ANOVA分析数据，并且进行平均值分离以测试不同酶和酶剂量之间的差异。将笼子用作实验单位。
结果
表7-性能和消化率结果
Figure BDA0001330130990001841
每个值代表9个重复的平均值(每个重复8只禽)。
ab不共享上标的列中的平均值不同(P<0.05)。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶的补充导致与阴性对照和商业蛋白酶B相比FCR的显著降低以及与商业蛋白酶A相比数值的降低。
与NC相比，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的补充显著增加了BWG，对于商业蛋白酶A或商业蛋白酶B而言并不是这种情况。
脯氨酸耐受性三肽基肽酶与对照和商业蛋白酶A相比显著增加了回肠N消化率(图11)。脯氨酸耐受性三肽基肽酶也显著增加了显著大于阴性对照和数值上大于两种商业蛋白酶的水平的被消化的能量(图12)。
结论
总之，在FCR和BWG方面，脯氨酸耐受性三肽基肽酶的补充导致比NC和商业蛋白酶B显著更好的禽表现。当与商业蛋白酶A相比，当脯氨酸耐受性三肽基肽酶被补充时，存在BWG数值增加和FCR降低。
与商业蛋白酶相比，我们通过改善能量和蛋白质(N)消化率而推动禽表现的改善。
实例9
脯氨酸耐受性三肽基肽酶、氨基肽酶和内切肽酶活性的确定
对于脯氨酸耐受性三肽基肽酶，使用发色肽H-Ala-Ala-Ala-pNA。如下进行测定，将27.5μL适当稀释的酶添加到200μl麦基尔文缓冲液(20mM，pH 4.0)中。在50℃下孵育5min后，将12.5μL发色肽溶液(5mg/mL溶解于二甲亚砜(DMSO)；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)添加到反应混合物中。通过添加50μL的0.5M三氯乙酸(TCA；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)来终止反应。离心(15,000x g，5min)后，将240μL的溶液转移至微量滴定板(MTP；基斯克尔(Kisker)生物技术，德国)，并且在MTP读数器(分子器件公司，丹麦)中在405nm下测量吸收。将一开特的蛋白水解活性定义为每秒释放1mol对硝基苯胺所需的酶的量。
测量氨基肽酶活性，如在斯蒂勒(Stressler)、艾西尔(Eisele)等人，2013中所描述的。
如在实例2中所述，用偶氮酪蛋白测量内切肽酶副活性。
实例10
使用内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶和通用氨基肽酶组合进行的乳清蛋白水解
将来自瑞士乳杆菌ATCC 12046的重组的在大肠杆菌中表达的和His标签纯化的通用氨基肽酶(PepN)用于乳清蛋白分离(WPI)水解(斯蒂勒(Stressler)、艾西尔(Eisele)等人，2013)。应用的PepN具有与科学文献中的其他PepN可比拟的生物化学参数，例如pH最适宜条件、温度范围和序列特异性(表8)，因此代表了来自原核和真核物种的通用氨基肽酶。
表8：来自不同来源的通用氨基肽酶(PepN)的生物化学参数和序列特异性
Figure BDA0001330130990001851
(Stressler)、艾西尔(Eisele)等人，2013)
在WPI水解中应用的PepN不含内切肽酶和X-脯氨酰基-二肽基(PepX)的副活性，其已经通过偶氮酪蛋白测定或用H-Ala-Pro-pNA作为PepX的底物分别进行了测定。
对于乳清蛋白水解，使用Lacprodan-9224(Arla食品成分公司，丹麦)，在H2Od中制备15％(w/w)WPI悬浮液，并用乙酸(西格玛-奥德里奇公司，丹麦)调节至pH 4.5。为了防止微生物生长，添加0.0285％(w/w)NaN3。在外切肽酶水解之前，添加1％(w/w应用的WPI)
Figure BDA0001330130990001861
FP2以引发WPI的水解，以便产生用于外切肽酶(三肽基肽酶和通用氨基肽酶)的底物。将200μl的WPI悬浮液的体积转移到96孔微量滴定板(MTP；VWR公司，丹麦)的每一个孔中。随后，向每个孔中添加5μl连续稀释的PepN(0-1572nkatH-Ala-pNA/mL)和脯氨酸耐受性三肽基肽酶(0-70,000nkatH-Ala-Ala-Ala-pNA/mL)。然后，将MTP密封并置于孵化器(iEMS孵化器/振摇器HT，赛默科技公司，丹麦)中，将其在40℃下孵育。在400rpm下孵育24h后，通过添加20μl的2M三氯乙酸(TCA；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)终止水解，除了参比(0h)，在该参比中在内切肽酶和外切肽酶添加之前添加TCA。通过过滤(0.22μm；康宁3504过滤板，美国康宁公司(Corning Incorporated))除去未水解的、沉淀的WPI。将过滤的WPI水解产物用于邻苯二甲醛(OPA)衍生化(尼尔森(Nielsen)、彼得森(Petersen)等人，2001)。根据尼尔森(Nielsen)等人(2001)(具有小的修改)进行OPA衍生化。将25μl的样品体积转移到孔中，并且添加含有磷酸三钠十二水合物的175μl的OPA试剂。将在MTP读数器(分子器件公司，丹麦)中在340nm处测量的吸收任选地转化为以百分比计的相对水解度(DH)，而在6M HCl(西格玛-奥德里奇公司，丹麦)中制备15％(w/w)WPI悬浮液并在100℃下保持24h。将15％(w/w)WPI的酸性水解产物用作计算水解度的参比(100％DH)。
图13显示了使用不同的内切肽酶和外切肽酶组合的24h后以丝氨酸当量(SE)表示的游离α氨基基团的增加。通过单独添加内切肽酶，然后添加内切肽酶和脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)的组合(其从肽的N末端释放三肽)来确定SE的最低增加。由于脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083是被其释放的三肽抑制的产物的事实，所以SE的增加不是很高。由于游离氨基酸的释放，内切肽酶与来自瑞士乳杆菌ATCC12046的、重组表达的和His标签纯化的通用氨基肽酶(PepN)的补充导致SE的显著增加(图13)。与内切肽酶和TRI083以及内切肽酶和43.5％的PepN相比，内切肽酶、TRI083和PepN的组合应用导致游离α氨基的释放显著更高(图13)。
内切肽酶、脯氨酸耐受性三肽基肽酶和通用氨基肽酶(PepN)的另外的影响的总结显示于表9中。
表9：在24h后，在15％WPI水解中，内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)和通用氨基肽酶(PepN)的组合的另外的影响的总结。
Figure BDA0001330130990001871
实例11
使用内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)和通用氨基肽酶(PepN)组合的酪蛋白水解
除了应用了5％(w/w)酪蛋白酸钠(Arla食品公司，丹麦)，在与实例2中的乳清蛋白水解所述相同的装配中进行5％(w/w)酪蛋白酸钠溶液的水解。如在表10中所示，不依赖PepN或TRI083的应用活性，可以通过向内切肽酶中添加TRI083或通过向内切肽酶中添加PepN来增加所确定的丝氨酸当量(SE)。
此外，观察到高PepN和高TRI083剂量的协同效应(表11)。PepN活性从786nkat/mL至1572nkat/mL的加倍导致10mM的丝氨酸当量相当小的增加，而17,500nkat/mL TRI083的应用将SE增加18mM。TRI083和PepN两者以17,500nkat/mL和1,572nkat/mL的应用导致97mMSE的增加。与在内切肽酶之上单独添加TRI083和PepN的总和相比，这相对于21％的SE值增加。
表10：使用内切肽酶与不同活性的TRI083和PepN组合的5％(w/w)酪蛋白酸钠水解在24h的水解之后的剂量响应，其以丝氨酸当量(SE)定量
Figure BDA0001330130990001872
实例12
使用内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶和部分灭活的风味酶500组合的酪蛋白水解
如在实例10中所述进行酪蛋白酸钠水解，除了应用部分灭活的风味酶500(FZ500；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)代替纯化的PepN外。为了灭活内切肽酶，将FZ500进行热处理(55℃，24h)。内切肽酶活性显著降低(96％灭活，4％残留活性)。在FZ 500的热处理后，确定约97％的残留PepN活性。
表11：使用内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)和部分失活的FZ500组合的5％(w/w)酪蛋白酸钠水解在24h的水解之后的剂量响应，其以丝氨酸当量(SE)定量。
Figure BDA0001330130990001881
如在表11中所示，向内切肽酶、或已经补充了几种外切肽酶(风味酶500(FZ500；西格玛-奥德里奇公司，丹麦))的内切肽酶中添加TRI083，对于这两者导致了丝氨酸当量值的增加，表明使用外切肽酶(例如FZ500)的复杂混合物产生的水解产物的水解度可以通过应用三肽基肽酶(例如脯氨酸耐受性三肽基肽酶)来增加。
实例13
使用内切肽酶与脯氨酸耐受性三肽基肽酶同源物组合的乳清蛋白水解(WPI)。
对于WPI水解，使用Lacprodan-9224(Arla食品成分公司，丹麦)，在H2Od中制备15％(w/w)WPI悬浮液，并用乙酸(西格玛-奥德里奇公司，丹麦)调节至pH 4.5。为了防止微生物生长，添加0.0285％(w/w)NaN3。随后，添加1％(w/w)
Figure BDA0001330130990001882
FP2，并且将200μl的WPI悬浮液的体积转移到96孔微量滴定板(MTP；VWR公司，丹麦)的每一个孔中。此后，将5μl的含有0或4375nkatH-Ala-Ala-Ala-pNA/mL的每种脯氨酸耐受性三肽基肽酶同源物添加到MTP的特定孔中。然后，将MTP密封并在40℃下置于孵化器(iEMS孵化器/振摇器HT，赛默科技公司(ThermoScientific)，丹麦)中。
在400rpm下孵育并振摇24h后，通过添加20μl的2M三氯乙酸(TCA；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)终止水解，除了参比(0h)，在该参比中在内切肽酶和外切肽酶添加之前添加TCA。通过过滤(0.22μm；康宁3504过滤板，美国康宁公司(Corning Incorporated))除去未水解的、沉淀的WPI。将过滤的WPI水解产物用于邻苯二甲醛(OPA)衍生化(尼尔森(Nielsen)、彼得森(Petersen)等人，2001)。根据尼尔森(Nielsen)等人(2001)(具有小的修改)进行OPA衍生化。将25μl的样品体积转移到孔中，并且随后添加溶解于磷酸三钠十二水合物中的175μl的OPA试剂。使用丝氨酸校准曲线(0-2mM)将在MTP读数器(VersaMax，分子器件公司，丹麦)中在340nm处测量的吸收转变为丝氨酸当量。
与参比(内切肽酶)相比，脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI071(SEQ ID No.12或SEQID No.39)随时间显著增加测量的丝氨酸当量。在水解7h后，对于TRI071，SE的相对增加为约64％(图14)。
实例14
用天然三肽(H-Ala-Ala-Ala-OH)进行脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)的产物抑制
在实例8中描述的测定中，使用TRI083和Ala-Ala-Ala-pNA(0-2000nM)作为底物进行抑制实验。使用抑制剂、使用3.6mM三肽(H-Ala-Ala-Ala-OH；巴赫姆公司，瑞士)、18mM二肽(H-Ala-Ala-OH；巴赫姆公司，瑞士)或18mM丙氨酸(西格玛-奥德里奇公司，丹麦)进行该测定。使用用于Windows的图板棱柱(GraphPad Prism)版本6.02(图板软件公司(GraphPadSoftware)，美国加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla California USA)，www.graphpad)，通过将H-Ala-Ala-Ala-OH、H-Ala-Ala-OH和丙氨酸作为竞争性抑制剂进行曲线拟合和抑制分析。
对于三肽H-Ala-Ala-Ala-OH，发现Ki为0.34mM的强抑制，而二肽H-Ala-Ala-OH仅显示非常弱的抑制(Ki为40mM)。丙氨酸根本没有显示抑制。
实例15
用通用氨基肽酶(PepN)预水解的天然三肽(H-Ala-Ala-Ala-OH)降低脯氨酸耐受性三肽基肽酶(TRI083)的产物抑制
如在实例14中所述建立抑制实验。此外，在12.5倍稀释的麦基尔文缓冲液(pH4.0)中，在40℃下将1mg/mL H-Ala-Ala-Ala-OH(巴赫姆公司，瑞士)经受通用氨基肽酶(PepN)水解持续24h。为此，将1.2mg/mL H-Ala-Ala-Ala-OH溶解于8mL 10倍稀释的麦基尔文缓冲液(pH 4.0)中，并用纯化的PepN(1,572nkat/mL[pH 6.5])填充至10mL。在水解24h后，通过PepN的热灭活终止PepN水解(90℃；10min)。通过气相色谱法确定H-Ala-Ala-Ala-OH的预水解度(赫塞克(Husek)，1991；FEBS通讯(FEBS-Letters)280，354-356)。测量约0.18mg/mL丙氨酸，其对应于最初应用的H-Ala-Ala-A1a-OH的约54％的水解。
随后，对于不使用抑制剂、使用1mg/mL H-Ala-Ala-Ala-OH以及使用PepN预水解的H-Ala-Ala-Ala-OH(1mg/mL)的产物抑制，对TRI083进行分析。
如在图15中所示，发现预水解的H-Ala-Ala-Ala-OH具有0.8mM的Ki。这与先前确定的H-Ala-Ala-Ala-OH Ki为0.34mM非常一致，因为略多于一半的H-Ala-Ala-Ala-OH被预水解成H-Ala-Ala-OH和丙氨酸。这表明通用氨基肽酶可以通过将三肽裂解成二肽和游离氨基酸来降低脯氨酸耐受性三肽基肽酶的产物抑制。
实例16
脯氨酸耐受性三肽基肽酶降低在牛奶变应性(CMA)中β-乳球蛋白肽的免疫原性
水解程序的描述
使用胰蛋白酶(10μg/ml)，将在10mM Tris-HCl(pH 8.0)中的β-乳球蛋白(1mg/ml)在25℃下水解24h。24h后，通过升温至80℃持续15分钟使胰蛋白酶失活。
所使用的β-乳球蛋白具有如下氨基酸序列：
>sp|P02754|LACB_BOVIN β-乳球蛋白OS＝牛(Bos taurus)GN＝LGB PE＝1 SV＝3
MKCLLLALALTCGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVYVEELKPTPEGDLEILLQKWENGECAQKKIIAEKTKIPAVFKIDALNENKVLVLDTDYKKYLLFCMENSAEPEQSLACQCLVRTPEVDDEALEKFDKALKALPMHIRLSFNPTQLEEQCHI
将10mM TRIS HCL-pH 4.0中的胰蛋白酶β-乳球蛋白水解产物(1mg/ml)在20mMMES缓冲液pH 4.0中稀释5倍。水解通过向1ml的5倍稀释的β-乳球蛋白溶液(200μg/ml)中添加在20mM MES缓冲液(pH 4.0)中的100μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083溶液(80μg/ml)来引发并且在室温下孵育。
在1、5、15、30、60、120和180min以及24h后，通过向100μl的β-乳球蛋白溶液中添加5％TFA(50μl)来终止由脯氨酸耐受性三肽基肽酶进行的蛋白水解。将脯氨酸耐受性三肽基肽酶在80℃下持续10分钟来进行热灭活。将溶液储存在-20℃直到进一步的LC-MS/MS分析。
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μmo.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物的肽序列以及裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
结果
胰蛋白酶处理的β-乳球蛋白由脯氨酸耐受性三肽基肽酶有效地水解，如图16-21中所示。值得注意的是，脯氨酸耐受性三肽基肽酶具有非常宽的底物特异性，并且能够裂解在P1处具有脯氨酸(图17)和在P1处具有甘氨酸(图21)的肽。
实例17
通过脯氨酸耐受性三肽基肽酶进行的β-酪蛋白的水解
在用脯氨酸耐受性三肽基肽酶进行裂解之前，首先用胰蛋白酶水解β-酪蛋白。将在10mM Tris-HCl pH＝8.0中的β-酪蛋白(1mg/ml)在室温下用胰蛋白酶(10ug/ml)水解24h，然后通过温热至80℃持续15分钟灭活。
将10mM TRIS HCL-pH 4.0中的胰蛋白酶β-酪蛋白水解产物(1mg/ml)在20mM MES缓冲液pH 4.0中稀释5倍。水解通过向1ml的5倍稀释的β-酪蛋白溶液(200μg/ml)中添加在20mM MES缓冲液(pH 4.0)中的100μl脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083溶液(80μg/ml)来引发并且在室温下孵育。
在1、5、15、30、60、120和180min以及24h后，通过向100μl的β-酪蛋白溶液中添加5％TFA(50μl)来终止由脯氨酸耐受性三肽基肽酶进行的蛋白水解。将脯氨酸耐受性三肽基肽酶在80℃下持续10分钟来进行热灭活。将溶液储存在-20℃直到进一步的如实例16中所述进行的LC-MS/MS分析。
所用的β-酪蛋白具有以下氨基酸序列：
>sp|P02666|CASB_BOVINβ-酪蛋白OS＝牛(Bos taurus)GN＝CSN2PE＝1SV＝2MKVLILACLVALALARELEELNVPGEIVESLSSSEESITRINKKIEKFQSEEQQQTEDELQDKIHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSKVKEAMAPKHKEMPFPKYPVEPFTESQSLTLTDVENLHLPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV
结果
由β-酪蛋白的胰蛋白酶消化产生的肽GPFPIIV是非常疏水的并且具有非常苦的味道。图22显示脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够有效地消化在P1’位置和在P2位置上具有脯氨酸的这种肽。图23显示肽HKEMPFPK也被脯氨酸耐受性三肽基肽酶有效地消化。
实例18
脯氨酸耐受性三肽基肽酶对缓激肽的降解
将缓激肽(RPPGFSPFR；MW 1660，21；B2259，来自西格玛-奥德里奇公司)以1mg/ml溶解于20mM麦基尔文缓冲液(pH 4.5)中。将脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI083(10ug)添加到肽溶液中。在1、3、5、15、30和60min以及20h后，通过向100μl的溶液中添加5％TFA(50μl)来终止水解。将脯氨酸耐受性三肽基肽酶在80℃下持续10分钟来进行热灭活。将溶液储存在-20℃直到进一步的如实例16中所述进行的LC-MS/MS分析。
结果
脯氨酸耐受性三肽基肽酶有效地消化具有氨基酸序列RPPGFSPFR的缓激肽(参见图24)。这表明脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够降解在P1和P2位置处具有脯氨酸的底物，这是三肽基肽酶非常令人惊奇的特征。
实例19
脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI079对AAXF-NH2底物的水解
水解程序和LC-MS分析的描述
将AAXF-NH2底物文库(由谢弗公司(Schaefer)，哥本哈根合成)(其中X代表除Cys和Met之外的所有氨基酸)溶解于20mM麦基尔文缓冲液(pH 4.5，1mg于1ml中)中。肽溶液在25℃下用TRI079(SEQ ID NO：57)(如实例1所述产生10μl的1mg/ml)水解持续1h或2h。随后，通过向50μl的肽溶液中添加5％TFA(50μl)来终止水解。将溶液储存在-20℃直到进一步的LC-MS/MS分析。
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μmo.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物的肽序列以及裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
结果
LC-MS分析显示，TRI079可以将所有的AAXF-NH2肽裂解成三肽，而与哪个氨基酸处于P1处无关。当脯氨酸存在于P1处时，观察到裂解产物AAP随时间增加，表明TRI079耐受在P1位置处的脯氨酸。
实例20
使用脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI079与内切肽酶和通用氨基肽酶PepN的组合进行的乳清蛋白水解(WPI)
对于WPI水解，使用Lacprodan-9224(Arla食品成分公司，丹麦)，在H2Od中制备15％(w/w)WPI悬浮液，并用氢氧化钠调节至pH 6。为了防止微生物生长，添加0.0285％(w/w)NaN3。随后，添加0.5％(w/w，蛋白质底物上)Food
Figure BDA0001330130990001932
碱性蛋白酶和0.5％(w/w，蛋白质底物上)Food
Figure BDA0001330130990001931
PNL，并且将200μl的WPI悬浮液的体积转移到96孔微量滴定板(MTP；VWR公司，丹麦)的每一个孔中。此后，向MTP的特定孔中添加5μl的脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI079(含有0nkat/mL或2188nkat/mL)和5μl的PepN(含有0nkat/mL、197nkat/mL或393nkat/mL，描述于实例10中)。然后，将MTP密封并在50℃下置于孵化器(iEMS孵化器/振摇器HT，赛默科技公司(Thermo Scientific)，丹麦)中。
在400rpm下孵育并振摇24h后，通过添加20μl的2M三氯乙酸(TCA；西格玛-奥德里奇公司，丹麦)终止水解，除了参比(0h)，在该参比中在内切肽酶和外切肽酶添加之前添加TCA。通过过滤(0.22μm；康宁3504过滤板，美国康宁公司(Corning Incorporated))除去未水解的、沉淀的WPI。将过滤的WPI水解产物用于邻苯二甲醛(OPA)衍生化(尼尔森(Nielsen)、彼得森(Petersen)等人，2001)。根据尼尔森(Nielsen)等人(2001)(具有小的修改)进行OPA衍生化。将25μl的样品体积转移到孔中，并且随后添加溶解于磷酸三钠十二水合物中的175μl的OPA试剂。使用丝氨酸校准曲线(0-2mM)将在MTP读数器(VersaMax，分子器件公司，丹麦)中在340nm处测量的吸收转变为丝氨酸当量。
如在表12中所示，与仅使用内切肽酶的参比相比，三肽基氨基肽酶TRI079(SEQ IDNo.57)以及PepN强有力地增加了测量的水解度。当将TRI079和PepN组合时，获得了水解度的另外的增加。
表12.使用TRI079和PepN的组合，在50℃、pH 6.0下制备24h的WPI水解产物的DH(以％计)的分析
Figure BDA0001330130990001941
实例21
脯氨酸耐受性三肽基肽酶TRI079对AAFPA-NH2底物的水解
对水解程序和LC-MS分析的描述
将AAFPA-NH2底物(由哥本哈根的谢弗公司(Schaefer)合成)溶解于20mM麦基尔文缓冲液(pH 4.5，1mg在1ml中)中，并且使用如在实例1中所述生产的TRI079(10μl的1mg/mlTRI079溶液)在25℃下水解长达8h。随后，通过向50μl的肽溶液中添加5％TFA(50μl)来终止水解。将溶液储存在-20℃直到进一步的LC-MS/MS分析。
使用与LTQ轨道阱经典混合质谱仪(赛默科技公司，德国不来梅港市)衔接的EasyLC系统(赛默科技公司，丹麦欧登塞)进行纳米LC-MS/MS分析。使用钢针将样品加载到定制的2cm阱柱(trap column)(100μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，5μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司(Dr.Maisch GmbH)，德国阿梅尔布(Ammerbuch)-Entringen))，该阱柱连接到10cm分析柱(75μm i.d.，375μm o.d.，填充有Reprosil C18，3μm反相颗粒(梅斯奇博士股份有限公司，德国阿梅尔布-Entringen))。使用0-34％溶剂B(H2O/CH3CN/TFE/HCOOH(100/800//100/1v/v/v/v))的10min梯度，以300nL/min的流速进行分离进入纳米电喷雾离子源(赛默科技公司，丹麦欧登塞)。LTQ轨道阱经典仪器以数据依赖的MS/MS模式运行。通过轨道阱(在m/z 400下以60 000的分辨率获得MS扫描)测量肽质量，并且选择多达2个最强的肽m/z，并使用线性离子阱(LTQ)中的CID对其进行片段化。启动动态排除，列表大小为500个质量，持续时间为40s，并且相对于列表上的质量的排除质量宽度为±10ppm。
RAW文件使用开放源程序Skyline 1.4.0.4421访问，其可以使用MS1强度来构建色谱图。将前体同位素导入过滤器设置为3个(M、M+1和M+2)计数，分辨率为60,000，并且使用最强的电荷状态。将底物的肽序列以及裂解产物输入到Skyline中，并在每个样品中计算强度。
结果
LC-MS分析显示随着时间增加AAFPA-NH2减少且AAF累积，表明TRI079可以水解AAFPA-NH2并且耐受在P1'位置处的脯氨酸。
实例22
在胃蛋白酶存在下TRI045(SEQ ID No.99)三肽基肽酶的稳定性
材料和方法
胃蛋白酶溶液：在该实例中使用来自西格玛公司的猪胃蛋白酶(P7000，674个西格玛单位/mg，www.sigma.com)，并以10000个西格玛单位/ml制备于MilliQ水中
预孵育混合物包含：在96孔康宁MTP的半底部区域中的2.5μl TRI045样品、95μlGAT缓冲液(50mM甘氨酸-50mM乙酸-50mM Tris，PH 3.5)、在milliQ水中的5μL胃蛋白酶(10000个西格玛单位/ml)(最终胃蛋白酶浓度单位：500个西格玛单位/ml反应混合物)。对于对照，预孵育混合物含有5μl水而不是5μl胃蛋白酶。将混合物在40℃下孵育60min，然后保存在冰上。为了测定残留活性，测定混合物含有5μl预孵育混合物、85μl的0.1M乙酸-乙酸钠(pH 4.0)、5μl的H-Ala-Ala-Phe-pNA(2.5mg/ml，来自BACHEM.com，L-1095.0250)。在30℃下每0.5min在酶标仪上跟进410nm读数。N＝2。
结果
在测定条件下并在40℃下预孵育60min，在500个单位胃蛋白酶/mL预孵育混合物存在下，对于TRI045发现残留活性超过90％。
实例23
TRI045(SEQ ID No.99)作为饲料酶促进饲料蛋白水解
动物产生并将蛋白酶分泌到消化道中用于饲料消化。这些蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的内切蛋白酶以及羧肽酶A和B等的外切肽酶。然而，动物不产生氨基肽酶作为消化酶或至少不是适当的量。如在本实例中所示，三肽基肽酶TRI045(sedolisin)的添加在基于玉米大豆饲料的体外系统中促进蛋白质消化。该实例显示TRI045在pH 4和6.5之间具有高活性
材料和方法
在DMSO中以2.5mg/ml制备用于sedolisin的三肽底物H-Ala-Ala-Phe-pNA(来自BACHEM.com，L-1095.0250)。通过混合8.5μl AAF-pNA、7μl DMSO、32μl水和50μl缓冲液(pH4.14-6.57)和0.8μl或1.5μl TRI045来制备反应。通过添加酶TRI045在30℃下开始反应。使用酶标仪在96孔板中每隔0.5min间隔在410nm处记录初始反应速率。
结果
表13显示TRI045在pH 5.0附近具有最佳活性，但在pH 4和pH 6.5附近仍具有约50％活性，这对于胃部饲料消化是理想的。图22进一步显示在pH 5、pH 5.5和pH 6达到的最终反应度非常相似。高pH最适宜条件对于动物饲料是理想的，因为在这种情况下，胰液素将有时间为TRI045制备更多的寡肽底物。
表13.使用H-Ala-Ala-Phe-pNA作为底物时pH对TRI045活性的影响(值是使用0.8μl TRI045(n＝2)的一项测试和使用1.5μl TRI045剂量(n＝1)的一项测试的平均值)。
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实例24
TRI045(SEQ ID No.99)加胃蛋白酶和胰液素对玉米大豆饲料底物的水解的影响。
体外反应体系含有140μl 10％(w/v)玉米大豆饲料浆料(14mg玉米大豆饲料)、在50mM MES-NaOH(pH 6.0)中的10μl TRI045、10μl猪胃蛋白酶(在水中1,14U/μL)。将反应物在40℃下振摇孵育45min，然后添加34μl猪胰液素(0.4636mg/mL，在1M碳酸氢钠中)，并且进一步孵育另外的60min。孵育后，将96孔板离心，并将上清液用于残留TRI045活性测定和用于OPA和BCA测定(见下文)。
可溶性蛋白质的水解度测量是基于伯胺基团与邻苯二甲醛(OPA-测定)的反应。参考：尼尔森(P.M.Nielsen)、彼得森(D.Petersen)和丹布曼(C.Dambmann)，用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(Improved Method for Determining Food Protein Degree ofHydrolysis)，食品科学杂志(Journal of Food Science)，66(2001)642-646。
对于OPA测定，进行以下程序。将来自母板通过酶处理的10-25μl饲料样品转移到新板中，然后向板中添加175μl含有硼酸钠、十二烷基硫酸盐和二硫苏糖醇的OPA试剂。就在2分钟和5秒钟混合之后，进行在340nm处的光密度的终点测量。
为了定量每个蛋白酶样品的蛋白质浓度，使用皮尔斯公司(Pierce)BCA蛋白测定试剂试剂盒(赛默科技公司，目录号23228)。定量之前未纯化TRI045样品。皮尔斯公司BCA蛋白测定试剂盒是一种基于二喹啉甲酸(BCA)的洗涤剂兼容配制品，用于比色检测和总蛋白定量。该方法将通过在碱性介质中的蛋白质进行的从Cu2+至Cu1+的熟知的还原反应与使用含有二喹啉甲酸的独特试剂对亚铜阳离子(Cu+1)的高灵敏度和选择性比色检测相结合。该测定的紫色反应产物通过BCA的两个分子与一个亚铜离子的螯合来形成。这种水溶性复合物在562nm处显示出强烈的吸光度，其与在宽的工作范围(20-2000μg/mL)下增加的蛋白质浓度几乎成线性关系。据报道，蛋白质的大分子结构、肽键的数目和四种特定氨基酸半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸的存在负责BCA的颜色形成。
对于OPA(释放的总氨基基团)和BCA(在可溶性级分中的总蛋白)确定，将上清液稀释20倍，并使用10ul进行。
在含有1000ppm的TRI045的系统中，在猪胃蛋白酶和胰液素的存在下，游离氨基基团从玉米大豆饲料中的释放(作为蛋白质水解(OPA值)的量度)增加了9％并且蛋白质溶解度增加了5％。
为了测试TRI045在上述体外测定条件下的稳定性(在胃蛋白酶存在下在pH 3、40℃下孵育45min，随后在40℃下在胰液素存在下孵育60min)。随后测定TRI045的残留活性。反应混合物含有50μl缓冲液0.1M HAC-NaAC(pH 5.0)、10μl上清液和5μl AAF-pNA(5mg/ml在DMSO中)。使用酶标仪，每30秒在410nm和30℃下跟踪反应速率。作为对照，使用相同浓度的1000ppm的商业蛋白酶。
实例22-24的结论
对照(仅胃蛋白酶和胰液素)的反应速率为4.3mOD/min，商业蛋白酶的反应速率为11.0mOD/min，并且TRI045的反应速率为19.3mOD/min。在减去对照(4.3mOD/min)后，TRI045对AAF-pNA底物的残留活性比商业蛋白酶高2.2倍。这些结果表明TRI045在40℃下对胃蛋白酶和胰液素稳定至少100分钟。
总之，该实例表明，当在3至7的pH范围下、在玉米大豆饲料存在下、在40℃下孵育105min时，TRI045对胃蛋白酶和胰液素稳定。当在模拟单胃消化系统的条件下将玉米大豆饲料用作底物时，在胃蛋白酶和胰液素的存在下还存在增加蛋白质溶解和蛋白质水解的另外的效果(贝德福德(BEDFORD，M.R.)和克拉森(CLASSEN，H.L.)(1993)“当在外源酶存在下饲喂基于黑麦的饮食时用于预测肉鸡肠粘度和生长的体外测定”，家禽科学(PoultryScience)，72:137-143)，即反应在40℃、pH 3.0-3.3下、在胃蛋白酶存在下进行45min，然后将pH升至pH 6.5-7.0，并且添加胰液素用于另外60min孵育，
文献
尼尔森(Nielsen,P.M.),等人(2001)."用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis)".食品科学杂志(Journal of Food Science)66(5):642-646。
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在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域的技术人员将是显而易见的。尽管本发明已经结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解要求保护的本发明不应该不当地受限于此类特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的、用于执行本发明的所描述的实施例的各种修改旨在落入如下权利要求书的范围内。
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Claims (45)

1.一种用于生产水解产物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(A)至少一种内切蛋白酶；以及
(B)至少一种主要具有外切肽酶活性的脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物，
其中一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且
a’)所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有在P1处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；或
b’)所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；并且
(b)回收该水解产物。
2.一种用于生产水解产物的方法，该方法包括：
(a)将至少一种选自由植物蛋白质、基于乳的蛋白质或蛋类蛋白质组成的组的蛋白质或其一部分与以下各项混合：
(i)至少一种内切蛋白酶；
(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及
(iii)一种或多种氨基肽酶，并且
(b)回收该水解产物；
其中在(ii)中的三肽基肽酶是脯氨酸耐受性三肽基肽酶，且该脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性，其中一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且所述肽酶
a’能够从具有在P1处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；或
b’)能够从具有在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
3.(i)至少一种内切蛋白酶、(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶、以及(iii)一种或多种氨基肽酶在从选自下组的至少一种蛋白质或其一部分制造水解产物中的用途，该组由以下各项组成：植物蛋白质、基于乳的蛋白质或蛋类蛋白质，该水解产物用于在倾向于对未处理的水解产物具有免疫反应的受试者中降低免疫原性或用于降低该未处理的水解产物的苦味；
其中在(ii)中的三肽基肽酶是脯氨酸耐受性三肽基肽酶，且该脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且
其中所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且所述肽酶
a’)能够从具有在P1处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；或
b’)能够从具有在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
4.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该至少一种蛋白质选自植物蛋白质。
5.根据权利要求4的方法或用途，其中所述植物蛋白质是麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白的免疫原性片段、谷物蛋白、谷蛋白、大豆蛋白中的一种或多种。
6.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该至少一种蛋白质基于乳的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的方法或用途，其中基于乳的蛋白质是酪蛋白；乳球蛋白；或乳清蛋白中一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法或用途，其中酪蛋白是β-酪蛋白和/或乳球蛋白是β-乳球蛋白。
9.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该至少一种蛋白质是蛋类蛋白质。
10.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)中混合的顺序以特定顺序进行，即在(ii)和/或(iii)之前进行(i)。
11.根据权利要求2-3中任一项所述的方法或用途，其中所述氨基肽酶是获自乳杆菌属的氨基肽酶。
12.根据权利要求11所述的方法或用途，其中所述氨基肽酶是获自瑞士乳杆菌的氨基肽酶。
13.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中所述至少一种三肽基肽酶或S53家族的至少一种外切三肽基肽酶能够从在P1处具有一个或多个氨基酸的肽的N末端裂解三肽，该一个或多个氨基酸选自下组，该组由以下各项组成：赖氨酸、精氨酸和甘氨酸。
14.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的至少一种外切三肽基肽酶进一步能够从在P1处具有脯氨酸且在P1’处具有脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
15.根据前述权利要求1或2所述的方法，其中该方法进一步包括将所回收的水解产物与至少一种饲料或食品成分混合。
16.根据权利要求1所述的方法，其中同时进行步骤(A)和步骤(B)。
17.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该至少一种内切蛋白酶和至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或S53家族的至少一种外切三肽基肽酶在相似的pH范围内是有活性的。
18.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该内切蛋白酶是酸性内切蛋白酶。
19.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该至少一种内切蛋白酶是碱性内切蛋白酶。
20.根据权利要求19所述的方法或用途，其中所述碱性内切蛋白酶选自以下各项中的一种或多种：胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
21.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法或用途，其中该水解产物在倾向于对该至少一种蛋白质或其部分具有免疫响应的受试者中具有降低的免疫原性。
22.根据权利要求1所述的方法，其中该至少一种蛋白质是动物蛋白质或植物蛋白质。
23.根据权利要求22所述的方法，其中该蛋白质是以下各项中的一种或多种：麦醇溶蛋白，β-酪蛋白，β-乳球蛋白或麦醇溶蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白的免疫原性片段，乳清蛋白，鱼蛋白，肉类蛋白，蛋类蛋白，大豆蛋白，大麦醇溶蛋白或谷物蛋白。
24.至少一种内切蛋白酶和至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶或包含脯氨酸耐受性三肽基肽酶的发酵物在制造水解产物中的用途，其中一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有在P1处的脯氨酸或在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；
该水解产物用于在倾向于对未处理的水解产物具有免疫反应的受试者中降低免疫原性或用于降低该未处理的水解产物的苦味。
25.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括添加一种或多种选自下组的另外的蛋白酶，该组由以下各项组成：氨基肽酶和羧肽酶。
26.根据权利要求25所述的方法，其中另外的蛋白酶是氨基肽酶。
27.根据权利要求26所述的方法，其中该氨基肽酶是获自乳杆菌属的氨基肽酶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该氨基肽酶是获自瑞士乳杆菌的氨基肽酶。
29.根据权利要求1所述的方法，其中在添加该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶之前，该至少一种蛋白质或其一部分与该至少一种内切蛋白酶混合。
30.根据权利要求25所述的方法，其中在添加该至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶和另外的蛋白酶之前，该至少一种蛋白质或其一部分与该至少一种内切蛋白酶混合。
31.根据前述权利要求1-3或24-30中任一项所述的方法或用途，其中该水解产物实质上富含一种或多种三肽。
32.根据前述权利要求1-3或24-30中任一项所述的方法或用途，其中该水解产物是乳蛋白水解产物、麦醇溶蛋白水解产物或大豆蛋白水解产物。
33.一种用于生产水解产物的组合物，其中该组合物包含至少一种主要具有外切肽酶的脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶能够从具有在P1处的脯氨酸或在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；并且该组合物包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：多元醇；糖类；盐；防腐剂；或其组合。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述多元醇为甘油和/或山梨糖醇；糖类为葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和/或海藻糖；盐为NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4和/或其他食品级盐；和/或防腐剂为苯甲酸钠和/或山梨酸钾。
35.根据权利要求33或34所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种内切蛋白酶。
36.一种用于生产喂养料或食物的方法，该方法包括使饲料组分或食品组分与根据权利要求33-35中任一项所述的组合物接触。
37.一种用于生产水解产物的食品添加剂组合物或饲料添加剂组合物，该组合物包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中
一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有在P1处的脯氨酸或在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；并且任选地该组合物进一步包含一种或多种选自下组的成分，该组由以下各项组成：多元醇；糖类；盐；防腐剂；或其组合。
38.根据权利要求37所述的食品添加剂组合物或饲料添加剂组合物，其中所述多元醇为甘油和/或山梨糖醇；糖类为葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和/或海藻糖；盐为NaCl、KCl、CaCl2、Na2SO4和/或其他食品级盐；和/或防腐剂为苯甲酸钠和/或山梨酸钾。
39.根据权利要求37或38所述的食品添加剂组合物或饲料添加剂组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种内切蛋白酶。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述喂养料或食物包含至少一种食品或饲料成分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该饲料成分、喂养料、食物或食品成分是奶产品、乳清蛋白产品、烘焙产品、发酵产品、运动营养产品、性能食品、饮料、婴儿食品、老年人食品、医疗保健人员的食品或外壳。
42.根据权利要求41所述的方法，其中奶产品是基于乳的产品、烘焙产品是面包产品、发酵产品是基于大豆的发酵产品、和/或外壳是用于啤酒或奶的外壳。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述奶产品是奶昔。
44.一种用于生成水解产物的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且其中所述脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有在P1处的脯氨酸或在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽；并且包含至少一种内切蛋白酶；和将其共同给予的说明书。
45.一种用于生成水解产物的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
(i)至少一种内切蛋白酶；
(ii)S53家族的至少一种外切三肽基肽酶；以及
(iii)一种或多种氨基肽酶，以及将其共同给予的说明书，
其中在(ii)中的三肽基肽酶是脯氨酸耐受性三肽基肽酶，其中一种所述肽酶
(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.57所示的核苷酸序列编码；
以及任选地另一种所述肽酶
(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No：29所示的氨基酸序列组成；或(b)由SEQ ID No.56所示的核苷酸序列编码；
并且该脯氨酸耐受性三肽基肽酶主要具有外切肽酶活性并且能够从具有在P1处的脯氨酸或在P1’处的脯氨酸的肽的N末端裂解三肽。
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